JPH03504721A - 腫瘍壊死因子配合物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ６八 且」υ辷賢 本発明は、一般的に免疫学の分野、及びより詳しくは、患者への投与のために医 薬的に許容されるシトキンの配合物に関する。より特定には、それは非経口投与 のための腫瘍壊死因子の医薬配合物に関する。

且歪ｉ景 ！ｌ瘍壊死因子（ＴＮＦ）は、約３９．０００の分子量を有するタンパク質であ る。それは多くの種からクローンされ、そしていくつかの発現系に発現されて来 た。さらに、分子のＮ−末端からのアミノ酸を欠き、又はシスティンを欠くか又 はほとんど減じられたシスティン含有量を有する組換え体ＴＮＦの突然変異体が 構成された。ＴＮＦの生物学的効果は、最初に、内毒素により誘発され、そして 一定タイブの腫瘍の壊死を引き起こす血清中に存在する因子としてＣａｒｓｗｅ ｌなど、、　（ＰＮＡＳ（Ｕ、Ｓ、Ａ、）　（１９７５）７２　：　３６６６） により説明された。最近、組換え的に製造されたヒトＴＮＦがまた、効果的な抗 癌剤であることが示された（Ｐａｎｎｉｃａなと、　、　（Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏ ｎｄｏｎ＞　（１９８４）３１２　ニア２４〜７２９）　、　５ｈｉｒａｉなど 、　、　（Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）　（１９８５）３１３　：　８０３） 　。

Ｗａｎｇなど、、　（Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８５）２２８　：　１４９）　）　 、　Ｔ　Ｎ　Ｆはまた、単独で又は他のリンホカイン又はシトキンと組合して、 種々の細菌又はウィルス感染を阻害することが報告されている。

ＴＮＦに関する他の活性は、多形核白血球の活性（Ｓｈａｌａｂｙなど＋ｌ　Ｊ ｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｏ＋ｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９８５）、　１３５　：　２ ０６９）、骨吸収の刺激及び骨形成の阻害（Ｂｅｒｔａｌｉｎｉなど、、　Ｎａ ｔｕｒｅ＋　３１９　：５１６）、リポタンパク質リパーゼの阻害（Ｂｅｕｔｌ ｅｒなと、。

Ｎａｔｕｒｅ、　３１６　：　５５２（１９８５））及びコラ−ゲナーゼ及びプ ロスタグラシンＥｘ生成の刺激（Ｄａｙｅｒなど、ｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　Ｅｘ　 ｅｒｉ−ｍｅｎｔａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、　１６２　：　２１６３（１９８５ ））を包含する。ＴＮＦはまた、線維芽細胞増殖を刺激しくＳｕｇａｒＩＩａｎ など、、　５ｃｉｅｎｃｅ＋％曵：　９４３（１９８５））　、そしてインター ロイキン−１を誘発する（Ｎａｗｒｏｔｈなど＋、　Ｊｏｕｒｎａｌ　Ｅｘ　ｅ ｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、　１６３　：１３６３（１９８６）と思 われる。

ＴＮＦのばく大な臨床学的可能性にもかかわらず、その分子の適切な予防又は治 療配合物は記載されていない、この事については、ＴＮＦの生物学的活性を安定 化し又は維持し、そしてＴＮＦの凝集体又はオリゴマーの凝集体の形成を妨げ又 は遅らせる配合物を存することが所望される。生物学的活性が凝集と無関係であ り、そして凝集により影響されないことのこれらの２つの現象は一般的に無関係 である。しかしながら、凝集された生物分子は、高められた免疫原性の所望しな い性質を有することが知られている。　Ｂａｃｈ、　Ｊ−Ｆ。

工神見す旦序ｌ江二し士ぜμ匹見」１」μ時μ旦ｇ、ｙ　Ｉｍｎ＋ｕｎｏｌｏｇ ｙ第２版＼チャプター２０．５７５〜５９０ページ（Ｅｄ　Ｊ−Ｆ　Ｂａｃｈ、 　Ｒ，Ｓ、５ｃｈＩＩＩａｒｔｚ。

１９８２）。

さらに、臨床学的設定における視的な透明度が、配合物がＵ、Ｓ、Ｐ、基準を満 たず確認として医者によりしばしば考慮されるように、粒状物質を含まないＴＮ Ｆ配合物を開発することが所望される。注射により投与される配合物は、それら がそれぞれ２５趨及び１．０ｓｒの粒度を存する１０００又は１０．０００個以 上の粒子を含むべきでないように眼に見える粒状物質を含むべきでない。さらに 、明らかな経済学的理由のために、配合物の保存寿命のために粒状物質を含まな い配合物を開発することが特に重要である。

最後に、比較的温度感受性でなく、そして有意な温度範囲にわたって上記の性質 をすべて示す配合物を有することが所望されることは明らかである。

ＴＮＦ活性を安定化する配合物は、ヨーロッパ特許出願第８３３０１７４０．３ 号（発明者Ｓａｋａｍｏｔｏなど、、）及びヨーＣ７７バ特許出願第８５１０６ ９１５．３号（発明者５ａｋａ＊ｏｔｏなど、、）に示されている。前者は、ア ルブミン、ゼラチン、グロブリン、プロタミン及びそれらの塩の組合せを用いて 、溶液中で又は固体形でＴＮＦを安定化するための方法を示す。ＴＮＦの活性を 高めながら、この方法はＴ　Ｎ　Ｆオリゴマー形成を減じないことを注目するこ とが重要である。ヨーロッパ特許出願第８５１０６９１５．３は同様に、ＴＮＦ の生物学的活性を安定化する組成物を示す。

この方法は、固体形又は液体形でのＴＮＦと溶解されたアルブミンを含む溶液と の組合せから成る。その得られたＴＮＦの配合物は、凍結、融解又は凍結乾燥に ゆだねられる場合、短い期間の間のみ安定していることが示されている。これに 関しては、ＴＮＦオリゴマー形成に関する問題が同様に提供されない、さらに、 これらの引例のいづれも、粒状物質を含まない配合物を示さないことを指摘する ことは重要である。

３貝二！ｈ 従って、本発明の１つの観点は、長期間及び有意な範囲の温度にわたって、液体 又は固体形でＴＮＦの活性を維持する、非経口投与のために適切なＴＮＦ配合物 である。

本発明の第２の観点は、ＴＮＦオリゴマー形成を遅くし又はひじょうに減じ、そ れによってそのようなＴＮＦ配合物の低い免疫原性及び生物学的活性の維持を付 与する比較的温度不惑受性ＴＮＦ配合物である。

本発明の追加の観点は、ＴＮＦの生物学的活性を維持しながら、長時間、有意な 範囲の温度にわたって、滅しられた粒状物質を有し、そして／又は粒状物質の形 成を妨げるＴＮＦ配合物である。

本発明のさらに追加の観点は、サンプルの凍結乾燥、撹拌又は取扱いに起因する オリゴマーの形成を妨げるＴＮＦ配合物である。

本発明の追加の観点は、種々の温度での長期間の保存の後、低い湿分を有し、そ して非晶質材料、多糖及び非結晶性の生理学的に許容できる緩衝液から成る凍結 乾燥されたＴＮＦ配合物である。

本発明のさらに追加の観点は、非晶質材料、多糖及び生理学的に許容できる緩衝 液から成る液体ＴＮＦ配合物である。

図ｆｆγ礼所 第１表は、５種のＴ　Ｎ　Ｆ配合物及び対照の配合物Ｍ／Ｐの組成物を示す。

第■表は、種々の温度で種々の時間の貯蔵の後のＴＮＦ配合物の生物活性を示す 。

第■表は、配合物が凍結乾燥され、そして水により再構成された後、配合物に存 在する粒状物質の大きさを比較する。

第■表は、再構成の前、種々の温度で６力月間、前もって貯蔵された凍結乾燥再 構成配合物の光散乱データーを示す。

第Ｖ表は、配合物が種々の時間及び種々の温度で凍結乾燥貯蔵され、そして次に 水により再構成された後、その配合物に存在する％ＴＮＦオリゴマーを示す。

第■表は、いくつかの配合物の％湿分を示す。

第１図は、ＴＮＦ配合物の等電点電気泳動のプロフィールを示す。

第２図は、種々の温度で９力月の間、凍結乾燥された後のＳ／Ｍ／Ｃ配合物にお けるＴＮＦの生物活性を示す。

第３図は、ＴＮＦ配合物Ｓ／Ｍ／Ｃ及び対照Ｍ／Ｐの光散乱性質を示す。

第４図は、水により再構成し、そして種々の温度で種々の時間、振盪しながら貯 蔵した後のＴＮＦ配合物Ｓ／Ｍ／Ｃの生物活性を示す。対照配合物Ｍ／Ｐのため のデーターも示される。

２１！礼呪 本明細書に言及される場合、腫瘍壊死因子又はＴＮＦは、科学文献においてこの 分子に通常関連する生物学的及び物理的性質を有するタンパク質を言及する。さ らに、用語“組換え”ＴＮＦとは、組換えＤＮＡ技法により生成された腫瘍壊死 因子を言及する。一般的に、これは、ＴＮＦをコードする遺伝子を、確立した組 換えＤＮＡ技法によりクローニングすることから成る。たとえば、ヒトＴＮＦは 、まず遺伝子のｃＤＮＡを得、そしてそのｃＤＮＡを適切なベクター中に挿入す ることによってクローンされ得る。多くのそのようなベクターが存在し、そして しばしば使用されるこれらは、細菌性プラスミド、特にＥ、コリの複製機能に適 合できるものである。

ＴＮＦのｃＤＮＡの挿入により生成されるプラスミドは、適切な宿主細胞を形質 転換するために使用され得る組換えプラスミドである。そのクローンされたＴＮ Ｆ遺伝子は、宿主細胞に発現され、それによって組換えＴＮＦタンパク質を生成 する。

形質転換された宿主細胞は、真核又は原核起源のいづれかの細胞であり得る。

天然に存在する又は組換え的に生成された分子のいづれかのＴＮＦの定義は、そ の分子の医薬的に許容できる形を包含することを意味する。たとえば、ＴＮＦは 、医薬的に許容できる塩と混合され得、又は中性形で存在することもできる。

もちろん、タンパク質の遊離アミノ基は、無機酸、たとえば塩酸、リン酸又は硫 酸中において；又は有機酸、たとえば酢酸、グリコール酸、琥珀酸又はマンデル 酸と共に酸付加塩を形成することができる。分子上の遊離カルボキシル基はまた 、塩基、たとえば無機塩基、たとえば水酸化ナトリウム、カリウム又はカルシウ ム及び有機塩基、たとえばピペリジン、グリコシアミン、トリメチルアミン、コ リン及びカフェインと共に塩を形成することができる。さらに、ＴＮＦの他の医 薬的に許容できる形が、分子を化学的に変性することによって実現化され得る。

そのような変性は、脂質及びサツカリドとＴＮＦとを組合することによって、又 は側鎖変性、たとえばアミノ基のアセチル化、ヒドロキシル側鎖のリン酸化又は スルフヒドリル基の酸化により生ぜしめ得る。ＴＮＦのこれらの種々の医薬的に 許容できる形は、分子の定義の範囲内にあることは当業者により明らかであろう 。

本明細書に言及される場合、用語“ＴＮＦムティン”とは、分子のＮ−末端配列 から１〜１０個のアミノ酸を欠＜ＴＮＦを包含することを意味する。さらに、そ の用語は、システィンを欠く又は減じられたシスティン含有率を有するＴＮＦを 包含することを意味する。ＴＮＦムティンの例は、アメリカ特許第４，６７７． ０６３号及びアメリカ特許第４，６７７．０６４号に言及されている。これらの 特許の開示は、引用により本明細書に組込まれる。

用語“医薬的に許容できる”とは、配合されたＴＮＦの生物学的活性を無効にせ ず又は減ぜず、そして配合されたＴＮＦが患者に投与される場合、いづれの逆の 生物学的効果を有さないキャリヤー媒体を言及する。

本明細書に記載される場合、“結晶化溶質”とは、０°Ｃ以下での凍結に基づい て結晶マトリックスを形成し、そして凍結乾燥及び続く室温への上昇に基づいて 変えられた形態を示さない物質を包含することを意味する。

用語“安定剤”とは、凍結温度で結晶構造を欠く物質を包含することを意味する 。

最後に、“有機親木性ポリマー”とは、ポリマーを親水性にする極性残基を有す る反復モノマ一単位を有する炭素主鎖を有するマクロ分子を包含することを意味 する。

二敗負星脱皿 上記のように、本発明に記載される配合物の主要目的であるＴＮＦは、生物学的 源、たとえば細胞、組織又は生物から得られる天然に存在するＴＮＦ、又は組換 えＴＮＦ、すなわちＤＮＡＩＪＩ換え技法により生成されるＴＮＦであり得る。

天然に存在するＴＮＦは、いづれか適切な種、たとえばマウス、ラット、ウサギ 、ブタ又はヒトからのものであり得る。同様に、組換えＴＮＦは、多くの種、た とえばマウス、ラット、ウサギ、ブタ及びヒトに由来する。好ましくは、ＴＮＦ はヒト超厚のものであり、そしてより好ましくは、それはヒト組換えＴＮＦであ る。典型的には、この分子は、適切に形質転換された微生物、好ましくはＥ、コ リに発現され、そしてそれから精製されるであろう。しかしながら、他の形質転 換性細胞、たとえば酵母及び高等哺乳類細胞もまた使用され得る。

ＴＮＦを形成する初期段階は、それが十分な医薬品質のものであるように分子を 精製することである。現在、ヒト又は非ヒト起原のＴＮＦのための出版された精 製スケムが存在する。たとえば、ウサギＴＮＦの精製は、Ａｂｅｌｅなど、、　 ＦＥＢ、。

１９８５、第１８０（２）巻き、２０３ページに記載されている。天然に存在す るヒトＴＮＦ又は遺伝的に製造されたヒトＴＮＦムティンの精製は、アメリカ特 許第４，６７７．０６３号及び第４．６７７、１９７号に示される。これらの出 版物は、引用により本明細書に組込まれる。

簡単に言えば、組換えヒ）ＴＮＦムティンのための精製スケムは、細菌培養物又 は細菌細胞の抽出物からのＴＮＦの分離から成り、ここでＴＮＦは汚染細菌タン パク質から精製される。その混合物は、一般的に初めに、ＴＮＦを効果的に結合 する（ところが、相当量の汚染物を結合しない）アニオン交換クロマトグラフィ ーにかけられる。次に、ＴＮＦは、適切な塩グラジェントを用いて、アニオン交 換カラムから除去され得る。典型的なアニオン交換クロマトグラフィー材料はＤ ＥＡＥセルロースである。組換えＴＮＦは、それが約４０１１＋ＭのＮａＣ１， にゆだねられる場合、この材料から溶離する。次に、ＤＥＡＥ−セルロースカラ ムから溶離されたＴＮＦは、約１．８Ｍの硫酸アンモニウムに移される。他方、 その溶液のイオン強度は、０．１Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液の存在下で相当す る塩により調整され得る。この溶液は、疎水性クロマトグラフィー、好ましくは フェニルＴＳＫ支持体を用いるクロマトグラフィーにかけられる。組換えＴＮＦ は、疎水性クロマトグラフィー材料に結合し、そして硫酸アンモニウムの濃度及 び最後に、緩衝液中のリン酸塩の濃度を減じることによって連続的に溶離される 。次に、アメリカ特許第４，６７７．０６３号に示される方法によってアッセイ されるように、ＴＮＦ活性を含む疎水性クロマトグラフィ一段階から得られた画 分が固定され、そして濾過にかけられ、それによって組換えＴＮＦが、その疎水 性クロマトグラフィ一段階の後に残る塩から分離される。種々のゲル濾過カラム 、たとえば当業者に良く知られていて、そしてＰｈａｒｍａｃｉａにより製造さ れているＧ−２００及びＧ−２５が、利用できる。

ドデシル硫酸ナトリウムポリ−アクリルアミドゲル電気泳動（ＳＯ５−ｐａｇｅ ）により示されるように、上記精製方法により実現化されたＴＮＦは、本発明の 組成物を用いての配合物のために均質且つ適切である。

本明細書に記載されるＴＮＦ配合物の主要特徴は、それらが、サンプルの凍結乾 燥及び取扱いの結果として生じるＴＮＦオリゴマーの形成を遅らせる又は妨げる ことである。さらに、その配合物は有意な粒状物質を欠き、そしてさらに、材料 の取扱いが粒状物質の形成をもたらさない点で耐撹拌性である。オリゴマーの形 成が、明らかに粒状物質と無関係であり、そしてその形成に関係ないことを注目 することは重要である。いづれの特別な理論に束縛されない場合、オリゴマー形 成はＴＮＦのマルチマーの形成を包含するように思われ、ところが粒状物質は明 らかに、有機及び／又は無機材料の組合せに起因するように思われる。

本発明のＴＮＦの配合は、精製されたＴＮＦ、すなわち天然に存在するか又は組 換えのＴＮＦのいづれかを用いての分離操作として、又は上記に概略され、そし て従来技術に記載されているようにいづれかのタイプのＴＮＦの精製を伴う操作 で行なわれ得る。しばしば、その配合物は、精製されたＴＮＦと配合試薬との組 合せから成るであろう。本発明の配合物は、固体又は液体形で、ＴＮＦと組合さ れ得る。好ましい固体配合物は特に、凍結乾燥されたＴＮＦと共に使用できる。

凍結乾燥された配合物及び液体配合物の両者は、従来の試薬、たとえば安定剤、 有機親水性ポリマー及び生理学的に許容できる緩衝液を有する。１又は複数の個 々のタイプの試薬が配合物に存在することができる。適切な安定剤の定義は、０ ゛Ｃ以下への凍結に基づいて結晶構造を有さない物質であるので、安定剤の一部 のものは、あるタンパク質、たとえばヒト血清アルブミン及びオリゴ塘、たとえ ばスクロース、トレハロース及びラクトースを包含する。また、約１０，０００ 〜２．０００，０００の範囲の分子量を有するデキストランも適切な安定剤であ る。さらに、あるを機親水性ポリマーもまた、安定剤成分として満足して使用さ れる。有機親水性ポリマーとは、反復上ツマ一単位の炭素主鎖を有し、そして極 性残基の存在により実質的に親水性特徴を有するマクロ分子を意味し、ここで後 者は、主鎖と関係する官能基として又は側鎖として表わされる。有機親水性ポリ マーの代表的な例は、ポリエチレングリコール及びポリビニルピロリドン並びに 当業者に良く知られている他の類似する分子を包含するが、但しこれだけには限 定されない。

上記の他に、凍結乾燥された配合物はまた、結晶化溶質も有するであろう、結晶 化溶質とは、０°Ｃ以下への凍結に基づいて結晶マトリックスを形成し、それに よって、凍結乾燥及び続くサンプルの高温への暴露に基づいてその結合性を維持 する構造体を生成する物質を意味する。結晶化溶質の２つの例は、マンニトール 及びグリシンである。これらの２種の結晶化溶質に実質的に同等である多くの他 のそのような結晶化溶質が存在することは当業者によって明らかであろう。

凍結乾燥された配合物の他の特性は、それらが、長期間、たとえば６力月間まで の間、広範囲の温度、たとえば−２０°Ｃ２４°Ｃ１２５°Ｃ及び３７℃で貯蔵 される場合、低い湿分を有することである。一般的に、その湿分は、高温で約３ ．０％（Ｗ／Ｗ）及び低温で１．５％（Ｗ／Ｗ）又はそれ以下であろう。湿分は 、標準の電量技法を用いて容易に決定される。

液体配合物の一般的な特徴は、それらがＴＮＦ以上の過剰量の安定剤成分を有す ることである。凍結乾燥された配合物はまた、ＴＮＦ以上の過剰量の安定剤を有 するが、しかしさらに、それらはまた結晶化溶質も有し、そしてさらに、その結 晶化溶質は、安定化物質がオリゴ糖である場合、その安定化物質に対して少なく とも２：ｌの重量比で存在するであろう。

凍結乾燥された配合物及び液体配合物の両者は、適切な生理学的に許容できる緩 衝液をそれらに添加しているであろう。

そのような緩衝液はクエン酸又はリン酸緩衝液、又は動物又はヒト投与のための 医薬を配合するために通常使用される他の緩衝液である。しかしながら、リン酸 塩は一般的に、オリゴ糖、たとえばスクロース及びトレハロースに対して好まし くないが、しかしＨ３Ａ又はデキストランに対しては使用され得る。

上記配合物のすべては、そのサンプルが約９カ月間、広範囲の温度で貯蔵された 後、ＴＮＦの生物活性を維持する。その生物活性は約１〜６Ｘ］Ｏ’単位である 。

凍結乾燥された配合物及び液体配合物の組成が何であるかを一般的に説明する場 合、いくつかの例が、ＴＮＦを安定化するために適切な配合物の範囲及びこれら の配合物に帰する特性をさらに例示するために示されるであろう。もちろん、こ れらの例は、本発明をいづれの手段でも限定しないことは当業者により理解され るであろう。

上記配合物が、適切な過度の実験的な操作及び試験によりＴＮＦの配合物に関し て例示される場合、これらの配合物はまた、他の化学的に類憶するシトキンを配 合するために使用され得ることは、当業者により特に明らかであろう。その例は 、コロニー刺激因子−１である。

１：゛　　　　れた配Ａ 上記のように、凍結乾燥形でＴＮＦを維持するために適切な配合物は、適切な安 定剤、たとえばタンパク質、多糖、有機親水性ポリマー又はオリゴ糟及び生理学 的に許容される緩衝液並びに結晶化溶質から成るであろう。後者の例は、マンニ トール及びグリシンを包含する。第１表は、特に効能がある５種の配合物の説明 を表わす。配合物のための略語は、それぞれの説明の最後にカッコで示されてい る。第１の配合物、Ｄ／Ｍ／Ｐは、安定剤デキストラン（Ｄ）、結晶化溶質マン ニトール（Ｍ）及びリン酸ナトリウム緩衝液（Ｐ）を有する。

デキストランは約２％濃度で存在し、そしてマンニトールは約１％濃度で存在し 、そしてリン酸ナトリウム緩衝液は約２０１の濃度である。その緩衝液のｐＨは 約７．４である。また、０．２５■７．１のＴＮＦが存在する。

第２配合物、Ｄ／Ｍ／ＣはＤ／Ｍ／Ｐと同一であるが、但し緩衝液はクエン酸ナ トリウム（Ｃ）であり、そしてそれは約１０ｍＭの濃度及びｐＨ６，５で存在す る。

第３配合物、Ｄ／Ｍ／Ｃ十Ｆは、第２配合物と同一であるが、但しそれはリン酸 ナトリウム（Ｐ）及びクエン酸ナトリウム緩衝液を含む。リン酸ナトリウムは約 ２＋＋＋Ｍの濃度で存在する。さらに、その溶液は約７．０のｐＨを有し、そし て０．２５■／ｉのＴＮＦを有する。

第４配合物、Ｓ／Ｍ／Ｃは、０．５％スクロース（Ｓ）及び１．５％マンニトー ル（Ｍ）から成る。それはまた、０．２５■／−のＴＮＦ及び１０ｏ＋Ｍのクエ ン酸ナトリウム（ＣＸｐＨ＝約６．５）も有する。

第５配合物は、第３配合物に同一であるが、但し安定剤は０．５％ヒト血清アル ブミン（Ｈ）であり、そしてその溶液は６．５のｐＨを有する。この配合物はＨ ／Ｍ／Ｃである。

また、第１表は、マンニトール及びリン酸塩（Ｍ／Ｐ）から成る対照の配合物に ついてのデータも示す。

貫主工辰生ｙ金惣 上記と同じ５種の配合物はまた、ＴＨＦを液体形で維持するためにも適切である 。しかしながら、結晶化溶質は、配合物の性質に影響を及ぼさないので、排除さ れ得る。

３：゛　　　　された　八　の 本発明の凍結乾燥された配合物は、下記に別々に記載されるであろういくつかの 特定の性質を有する。しかしながら、これらが、配合物の長期の保存又は撹拌か ら生じる粒状物質を減じ、そしてＴＮＦのオリゴマーへの凝集を減じることを包 含することは注目されるであろう。さらに、それらの配合物は、長期間、ＴＮＦ の生物活性を安定化し、そして低い湿分及び低いタンパク質不均−性を有する。

これらのすべての性質は、有意な温度範囲にわたって維持される。

゛　　　　された記入　の　　２ 第■表は、すべての５種の凍結乾燥された配合物が約９カ月間、−２０°Ｃ，４ °Ｃ２２５°Ｃ１３７°Ｃでの貯蔵の後、ＴＮＦの生物活性を維持することを示 す。さらに、４７℃で１４日間の貯蔵の後でさえ、それらの配合物はＴＮＦ活性 においてほとんど又はまったくの変化を示さない。生物活性は、凍結乾燥された サンプルを１．２ｄの無菌蒸留水により再構成し、続いてアメリカ特許第４，６ ７７．０６３号又は第６．６７７．０６４号に記載されるようにしてＴＮＦ活性 についてアッセイすることによって決定された。

ｎ」Ｊ１！ ａ）カルターカウンターアッセイ ｄ当たりの粒子の数を、上記５種の配合物のそれぞれに測定した。測定は、凍結 乾燥された配合物を１．２　ｄの無菌蒸留水により再構成し、続いて試薬を分散 するために溶液を軽く撹拌することから成った。カルターカウンター機械を用い て、前もって定義された大きさの粒子の数を決定し、そして少量で非経口投与さ れる薬物についてのＵｎｉｔｅｄ　５ｔａｔｅｓ　Ｐｈａｒｍａ−ｃｏｐｅｉａ 　（ＵＳＰ）による医薬製剤についての粒子の代表的な数と比較した。上記配合 物３に存在する粒子をアッセイした。第■表は、６．８４１１ｍ以上の粒子がす べての５種の配合物に存在し、そしてそれよりも少ない粒子が配合物Ｈ／Ｍ／Ｃ に存在することを示す。９．８７−よりも大きな粒子がまた、すべての配合物に 存在した。配合物Ｄ／Ｍ／Ｃ＋Ｐ及びＨ／Ｍ／Ｃは、この大々さ以上の最少粒子 を有した。最後に、２４．８６μ以上の粒子をまた決定しく但し、ひじょうに少 ないそのような粒子を有したＤ／Ｍ／Ｃ及びＳ／Ｍ／Ｃ配合物を除＜）、そして 残る配合物は、この大きさ以上の粒子を示さなかった。種々の配合物に存在する 粒子の大きさにかかわらず、許容できる粒子の数は、ｔＪｓＰにより推薦される 数よりもひじょうに低いことを注目することは重要であり、そしてこれらの限界 値は第■表のいちばん下に示されている。

ｂ）光散乱アッセイ 種々の配合物の光散乱性質をまた決定した。その方法は、上記方法に類似してお り、ここで個々のサンプルは、６力月間、−７０，４，２５及び３７°Ｃでイン キュベートされ、そして１、２　ｍの無菌蒸留水により再構成された。測定は、 再構成に続いてすぐに（０時）、又は４，７又は２４時間後に行なわれた。２４ 時間のサンプルの光散乱の程度の測定の前、それは、１０秒間、手により激しく 振盪された。

第■表は、９０″Ｃでの散乱の量を標準の螢光定量器により決定する場合に得ら れる光散乱データを示す。サンプルは、振盪の後でさえ、５００又はそれ以上の 散乱数を示さなかった。

比較目的のためには、５００の散乱数を有する溶液は一般的に透明であることを 注目することは重要である。

主ユユヱニ 上記５種の典型的な配合物のうち４種を、凍結乾燥された配合物が種々の温度で 種々の時間、貯蔵され、そして１．２ｄの無菌蒸留水により再構成された後、オ リゴマーの存在について試験した。配合物中の％オリゴマーを、ドデシル硫酸ナ トリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いて配合物を電気泳動し、そして デンシトメーターによりゲルを走査することによって決定した。％オリゴマーを 、オリゴマーに帰する領域を測定し、そして非凝集及び凝集ＴＮＦに起因する合 計領域により割り算し、そしてｌＯＯを乗じることによって計算した。配合物（ Ｓ／Ｍ／Ｃを除く）が−２０℃で９力月間貯蔵される場合、オリゴマーはいづれ の配合物にも検出不可能であることが第７表から明らかである。

２〜８°Ｃでの３力月間の貯蔵の後、配合物Ｄ／Ｍ／Ｐ、Ｄ／Ｍ／Ｃ＋Ｐ及びＳ ／Ｍ／Ｃはオリゴマーを示すが、しかしＤ／Ｍ／Ｃは示さない。奇妙には、配合 物が６又は９力月間貯蔵される場合、どの配合物もオリゴマーを示さなかった。

２５℃で約３．６又は６力月間貯蔵された配合物は、はとんど又はまったくオリ ゴマーを示さない。類似する結果が、配合物が３７℃又は４７℃で貯蔵される場 合に観察された。２〜８°Ｃで貯蔵された配合物に存在する％オリゴマーに明ら かな矛盾した結果が存在することは注目されるであろう。たとえば、Ｄ／Ｍ／Ｐ 　、Ｄ／Ｍ／Ｃ十Ｐ及びＳ／Ｍ／Ｃは、３力月間（但し、６又は９力月間ではな い）貯蔵される場合にオリゴマーを表わす。多くの場合、これは少量のオリゴマ ーを測定することにおける技術的な困難さによるものである。

比較目的のために、第７表は、安定剤を欠き、そして０．２５■／ｄのＴＮＦ、 １％のマンニトール及び２０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７，５）から成る配合物 中の％オリゴマーを示す。この配合物は、２５℃、３７℃又は４７℃で貯蔵され る場合に有意なオリゴマーを示すことは明らかである。

最後に、Ｈ／Ｍ／Ｃ配合物におけるオリゴマーをウェスターンプロット分析によ り測定し、ここでＴＮＦは、ＴＭＢ及び抗−ＴＮＦモノクローナル抗体を用いて 、続いてホースラディシュペルオキシダーゼヤギ抗−マウスポリクローナル抗体 及び次に基質の添加により可視化される。これらの方法は当業者に良く知られて おり、そしてマウス抗−ＴＮＦモノクローナル抗体は容易に入手できる。この方 法は、正確なデンシトメーター測定を妨げるサンプル中の高濃度のヒト血清のた めに必要であった。いづれにしても、Ｈ／Ｍ／Ｃ配合物は、２５°Ｃ又は３７℃ のいづれかの温度での約９カ月間の貯蔵の後、検出できるオリゴマーを欠くこと が測定された。

摺ユニ辻 凍結乾燥された配合物に存在する湿気は、ＴＮＦの長期安定性に悪影響をもたら すので、本発明の配合物を、種々の温度での長期の貯蔵の後、低い湿分を有する ように改良した。

配合物中の湿分は、Ｋａｒｌ　Ｐｉｓｃｈｅｒ　Ｃｏｕｌｏｍｅｔｒｙを用いて 決定された。第■表は、−２０°Ｃ，４°Ｃ２２５℃及び３７°Ｃで６力月間貯 蔵されたサンプルから得られた結果を示す。これらの配合物についての結果は、 その表に示される。−２０″Ｃ及び４°Ｃでの湿分はひじょうに類似するが、と ころが２５℃及び３７°Ｃで、湿分は低い温度での湿分の約２倍であることは明 らかである。

最低温度で、約１．５％（Ｗ／Ｗ）の湿分が存在し、ところが最高温度で約３％ （Ｗ／Ｗ）の湿分が存在する。

不良二１ 第１図は、再構成及び電気泳動の前、サンプルが９力月間、２〜８　’Ｃ、２５ ℃、又は３７°Ｃで貯蔵された後、いくつかの凍結乾燥された配合物についての 等電点電気泳動プロフィールを示す。一般的に、電気泳動は、約４〜６．５のｐ Ｈ及び１５００の電圧及び５０ｍＡのアンペア数で、当業者に良く知られている 標準条件及び試薬を用いて行なわれた。その電気泳動パターンを、サンプルが３ ７°Ｃで９力月間貯蔵される場合、有意な不均一パターンを示す上記の対照のマ ンニトール、リン酸塩配合物と比べた。対照的に、Ｄ／Ｍ／Ｃ＋Ｐ　、Ｓ／Ｍ／ ＣＤ／Ｍ／Ｐ　。

Ｄ／Ｍ／Ｐ及びＨ／Ｍ／Ｃ配合物は、サンプルが種々の温度で９力月間貯蔵され る場合、等電点プロフィールの変化をほとんど又はまったく示さなかった。

されたｒ′の　　　　び　　の六 研究は、再構成の後、ＴＮＦ配合物の短期間安定性を決定するために行なわれた 。いくつかの実験を、配合物中の粒状物の含有量及び生物活性を決定するために 行なった。サンプルを再構成し、そして次に４°Ｃ又は２５°Ｃで４又は２４時 間維持した。第１表に示されるすべての５種の配合物に関しては、光散乱実験は 、いづれかの温度及びいづれかの期間でも、溶液中に存在する粒状物質の量の変 化を示さなかった。第２図は、Ｓ／Ｍ／Ｃ配合物についての結果を示す。さらに 、サンプルが、配合物とガラス容器の側壁との接触を引き起こす（但し、ストッ パーの上部とは接触しない）ために振盪され、そして次に２５°Ｃで４又は２４ 時間貯蔵される場合、また粒状物質の上昇は見出されなかった。しかしながら、 溶液が振盪され、そして配合物がストッパー（１３ｍのグレーブチルウェスト） との接触を可能にされる場合、ストッパーに関連する小さな粒子の溶解の結果と して生じる粒子配合物の光の散乱の少々の、但し検出できる上昇が見出された（ 第２図）、シかしながら、これらの粒子は光散乱により検出できるけれども、裸 眼では明らかでない。

第１表に示される５種の再構成された配合物の生物活性は、２５°Ｃで４又は２ ４時間維持される場合、低められない。これは、配合物が振盪され、そしてスト ッパーと接触され又はされない場合にもかかられず真実である。さらに、Ｓ／Ｍ ／Ｃの生物活性は、溶液が２５°Ｃで９６時間までの間貯蔵される場合、維持さ れ、そしてこれは、対照の配合物Ｍ／Ｐについての結果と共に、第３図に示され ている。

もちろん、本発明に使用され得る多くの変性及び置換が存在することは当業者に 明らかであろう。本発明を実施するためのこれらの他の態様は、本発明の範囲内 に存在し、その発明は次の請求の範囲によってのみ限定される。

】−コし一表 八　によ　　　　れる′５ 柁′声で６カ　日の　蔵の′での配Ａ物生坐Ｘ里圀 ■立生　　　　　　−２０℃　　　　土１　　　鼠　　扛ＩＭ／Ｐ　　　　　　 　２．６５　　　　２．９３　　　　２．０９　　　１．４６Ｍ　／　Ｐ　　　 　　　　　　　　　　　　　　　　３．２３　　　２．５４Ｄ　Ｍ　ＣＯ，９９ ２，９７ Ｓ　Ｍ　Ｃ１，３４１，６９３，０３２，７８ＨＭ　ＣＯ，７９３，３３ 螢光定量確 螢光定量値 ユニット／ｍｇ　　　　　　　　　　　ス手続補正書（方式） 平成３年り月楯日 特許庁長官　深　沢　　　亘　殿 １、事件の表示 ＰＣＴ／ＵＳ　８９１０１２２６ 平成１年特許願第５０４７１２号 ２、　発明の名称 腫瘍壊死因子配合物 ３、補正をする者 事件との関係　　　特許出願人 名称　　シタス　コーボレイション ４、代理人 住所　〒１０５東京都港区虎ノ門−丁目８番１０号６、補正の対象 図面の翻訳文 ７、補正の内容 図面の翻訳文の浄書（内容に変更なし）８、添付書類の目録 図面の翻訳文　　　　　　　　　　　１通国際調査報告 国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）治療を提供するために患者への非経口投与のための 医薬的に許容できる水性ピークルヘの再構成のために適切な減じられたオリゴマ ーを有する低湿分凍結乾燥医薬製剤であって、１）治療的に有効な量のＴＮＦ、 ２）ＴＮＦの安定性に悪影響を及ぼさない、タンパク質、多糖、有機親水性ポリ マー又はオリゴ糖から成る群から選択された生理学的に許容できる安定剤（ＴＮ Ｆ以上の過剰量）、３）生理学的に許容できる緩衝液及び４）有効量の生理学的 に許容できる結晶化溶質（安定剤物質がオリゴ糖である場合、前記結晶化溶質： 安定剤の重量比は少なくとも２：１である）の混合物を含んで成る医薬製剤。 ２．前記安定剤物質を、ヒト血清アルブミン、デキストラン、ポリエチレングリ コール、ポリソルベート８０、ポリビニルピロリドン、スクロース、ラクトース 又はトレハロースから成る群から選択し、そして前記緩衝液をクエン酸塩、リン 酸塩又はクエン酸塩−リン酸塩から成る群から選択し、そして前記結晶化溶質が マンニトールであり、そして溶質：安定剤の比が２：１〜３：１である請求の範 囲第１項記載の医薬製剤。 ３．前記緩衝液がリン酸塩であり、そして前記製剤がさらにエチレンジアミン四 酢酸を含んで成る請求の範囲第１項記載の医薬製剤。 ４．前記ＴＮＦがヒトＴＮＦ配列のムテインである請求の範囲第２項記載の医薬 製剤。 ５．前記ムテインが欠失された成熟ＴＮＦ配列のＮ−末端で１又は複数の初めの ８個のアミノ酸残基を有する請求の範囲第４項記載の医薬製剤。 ６．前記安定剤物質がデキストランである請求の範囲第５項記載の医薬製剤。 ７．０．２５ｍｇ／ｍｌのＴＮＦ、１０ｍＭのリン酸緩衝液、１０ｍｇ／ｍｌの マンニトール及び２０ｍｇ／ｍｌのデキストランを適切な量で含んで成る請求の 範囲第１項記載の医薬製剤。 ８．０．２５ｍｇ／ｍｌのＴＮＦ、１０州のクエン酸緩衝液、１０ｍｇ／ｍｌの マンニトール及び２０ｍｇ／ｍｌのデキストランを適切な量で含んで成る請求の 範囲第１項記載の医薬製剤。 ９．０．２５ｍｇ／ｍｌのＴＮＴ、１０ｍＭのクエン酸緩衝液、２ｍＭのリン酸 緩衝液、１５ｍｌ／ｍｌのマンニトール及び２０ｍｇ／ｍｌのデキストランを適 切な量で含んで成る請求の範囲第１項記載の医薬製剤。 １０．前記安定剤物質がスクロース又はヒト血清アルブミンである請求の範囲第 ５項記載の医薬製剤。 １１．０．２５ｍｇ／ｍｌのＴＮＦ、１０ｍＭのクエン酸緩衝液、１５ｍｇ／ｍ ｌのマンニトール及び５ｍｇ／ｍｌのスクロースを適切な量で含んで成る請求の 範囲第１項記載の医薬製剤。 １２．０．２５ｍｇ／ｍｌのＴＮＦ、１０ｍＭのクエン酸緩衝液、１０ｍｇ／ｍ ｌのマンニトール及び２０ｍｇ／ｍｌのヒト血清アルブミンを適切な量で含んで 成る請求の範囲第１項記載の医薬製剤。 １３．０．２５ｍｇ／ｍｌのＴＮＦ、１０ｍＭのクエン酸緩衝液、１．４％のス クロース及び４．２％のマンニトールを適切な量で含んで成る請求の範囲第１項 記載の医薬製剤。 １４．０．５ｍｇ／ｍｌのＴＮＦ、１０ｍＭのクエン酸緩衝液、０．５％のスク ロース及び１．５％のマンニトールを適切な量で含んで成る請求の範囲第１項記 載の医薬製剤。 １５．前記医薬製剤が１ｍｌ当たり約４４９．８７μｍより大きくなく及び２２ ４．８６μｍより大きくない粒子を有する請求の範囲第１１項記載の医薬製剤。 １６．前記医薬製剤が１ｍｌ当たり約１３９．８７μｍより大きくない粒子及び 約２４．８６μｍより大きくない粒子を有する請求の範囲第１２項記載の医薬製 剤。 １７．前記湿分が、前記製剤の約１．５％〜３％（ｗ／ｗ）である請求の範囲第 １項記載の医薬製剤。 １８．ＴＮＦ治療を提供するために患者への非経口投与のための適切な約２％以 下の腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）オリゴマーを有する液体医薬製剤であって、１）治 療的に有効な量のＴＮＦ、２）タンパク質、多糖、有機親水性ポリマー又はオリ ゴ糖から成る群から選択された生理学的に許容できる安定剤物質（ＴＮＦ以上の 過剰量）及び３７理学的に許容できる非結晶性緩衝液を含んで成る医薬製剤。 １９．前記安定剤物質を、ヒト血清アルブミン、デキストラン、ポリビニルピロ リドン、ポリソルベート８０、ラクトース、スクロース、トレハロースから成る 群から選択し、そして前記緩衝液を、クエン酸塩、リン酸塩及びクエン酸塩−リ ン酸塩から成る群から選択する請求の範囲第１８項記載の医薬製剤。 ２０．前記緩衝液がリン酸塩であり、そして前記製剤がさらにエチレンジアミン 四酢酸を含んで成る請求の範囲第１９項記載の医薬製剤。 ２１．前記安定剤物質がデキストランである請求の範囲第１９項記載の医薬製剤 。 ２２．前記安定剤物質がスクロース又はヒト血清アルブミンであり、そして前記 緩衝液がクエン酸塩である請求の範囲第１９項記載の医薬製剤。 ２３．前記ＴＮＦがヒトＴＮＦ配列のムテインである請求の範囲第１８項記載の 医薬製剤。 ２４．前記ムテインが欠失された成熟ＴＮＦ配列のＮ−末端で１又は複数の初め の８個のアミノ酸残基を有する請求の範囲第２３項記載の医薬製剤。