JPH04501051A - 組換え型ｄｎａ由来ボルデテラ毒素サブユニット類似体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本明細書は米国特許出願第０９４．４０７号（１９７ｇ年９月４日提出）の一部 継続出願である。

本発明は異種蛋白質の一部との融合に依らないＥ、　ｃｏｌｌにおけるボルデテ ラ属菌（Ｂ　ｏｒｄｅｔＺｅｌ　ｌａ）外毒素のＳｌ、Ｓ２゜Ｓ３．Ｓ４及びＳ ５のサブユニット類似体（アナログ）の高レベル直接組換え発現を提供する。さ らに特に、該サブユニットの遺伝子工学的改変により、毒素中和レベルの抗体を 引き出し、且つ実質的に反応原性成分を生じない能力を有するＢ　ｏｒｄｅｔｅ ｌ　Ｉａ類の毒素類似体が提供される。遺伝子工学的サブユニットを用いて、免 疫原性効能を有し且つ実質的に反応原性成分がないサブユニットワクチンを生産 し得る。

Ｂ　０ｒｄｌｎｔｅｌ　Ｉａ外毒素という語は、Ｂ　、　ｐｅｒｔｕｓｓｉｇ　 。

Ｂ、　ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｌｓ及びＢ、　ｂｒｏｎｃｈｌｓｅｐｔｉｃａと いった種々のＢ　ｏｒｄａｔｅｌ　１１種のゲノムによりコード化される毒素群 を表わしている。Ｂ　０ｒｄｅｔｅｌ　Ｉａ外毒素を指示するために一般に用い る他の語としては、ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ毒素（ｒＰＴＸＪ　）　、リンパ球増加 症促進因子（ｒＬＰＦＪ　）　、及び高活性化蛋白質（ｒＪＡＰＪ　）がある。

百日咳は依然として全世界の多くの地域において乳児罹患率及び死亡率の主要原 因である。全細胞Ｂ　ｏｒｄｅｔｅｌ　Ｉａ　ｐｅｒｔｕｓｓｉｓワクチンはこ の疾病を制御する有効な手段を提供してきた。しかしながら、このようなワクチ ンの使用は軽症副作用と直接相関しており、且つ一時的にはさらに重症副作用と も、さらに時として胎児神経学的事象に関連していた。一般に用いられているワ クチンに関連があることが公知の存寄な副作用を排除するために、努めて広範な 努力が払われてきた。これらの努力により無細胞ワクチンの生産及び試験が行わ れ、さらに安全な組換え物質を開発せんとする基礎研究が行われてきた。組換え ＤＮＡ由来ワクチンのクローニング及び開発に対する決定的第一段階は、　ｐｅ ｒｔｕｓｓ１ｓ毒素オペロンの配列することと、その後の個々のサブユニットの アミノ酸配列を演鐸することであった（Ｌｏｃｈｔ、　Ｃ，及びＫｅｌｔｈ、　 Ｊ、　Ｍ、、　１９８６．　５ｃｉｅｎｃｅ　２３２　：１２５ｇ−１２６４； 　Ｌｏｃｈｔ等、　１９１１６．　Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１４：３ ２５１−３２６１　、並びにＮＩｅＯ８ｉａ等、　１９８Ｇ、Ｐ　ｒｏｃ、Ｎａ ｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃ１．　Ｕ　Ｓ　ＡＨ：　４Ｂ８１−４［１８５）。

Ｎ１ｃｏｓｉａ等（１９８７，Ｉｎｆｅｃｔ、ｌ５ｓｕｎ、、５５：　９６３− ９８７）は、Ｂ　ｏｒｄｅｔｅ＋　ｌａ　ｐｅｒｔｕｓｓｉｓの各サブユニット Ｓｌ、Ｓ２．Ｓ３゜Ｓ４及びＳ５をコード化するｍＲＮＡがＥ、　ｃｏｌｌのク ローン化遺伝子から効率よく転写され得ることを立証した。彼等は本来のｐｅｒ ｔｕｓｓｉｓ毒素ポリシストロンメツセージの高水準転写を示そうとしたけれど も、直接発現により産生された蛋白質量は非常に低いかあるいは検出不可能であ った。さらに、その後合成された融合蛋白質は、中和反応又は保護免疫反応のい かなるものも引き出すことかでかなかった。

Ｂ　ａｒｂｉｅｒｉ　等　（１９８７，Ｉｎｆｅｃｔ、　ｌｍ５ｕｎ、、　５５ ：１３２１〜１３２３）は、Ｅ、　ｃｏｌｔにおける融合蛋白質としてのＳｌサ ブユニットの発現を立証した。この融合蛋白質はベーターガラクトシダーゼの最 初の６個のアミノ酸、ｐＵｃ１ｇポリリンカーにより、その後Ｓ１サブユニツト の２〜２３５のアミノ酸によりコード化される５個のアミノ酸を含有する。少量 産生されるＳｌ融合蛋白質は真正の又は本来のｐ６ｒｔｕｓｓｊｓ毒素のＡＤＰ −リボシルトランスフエラーゼ活性の約２５％を有するのにすぎなかった。

Ｌｏｃｈｔ等（Ａｂｓｔｒａｃｔ、Ｍｏｄｅｒｎ　Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ　ｔｏ 　ＮｅｗＶａｃｃｉｎｅｓ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏ ｒａｔｏｒｙ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、１９ ８６年９月　９−１４日）は、Ｓ１サブユニツトの２〜１８７アミノ酸を含有す る融合蛋白質を発現することができた。その酵素活性が毒素の反応原性に関与す ると確信されているＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼに関連したＮＡＤ結合 部位をそれは欠いていると確信したので、その構成物は毒素活性を有していない であろうと彼等は予測した。この分子を用いたその後の実験から、この切断種は 本質的に低下しない酵素活性を有することが示された。公知の従来の技術のサブ ユニット又はサブユニット類似体で毒素中和水準の抗体を引き出す能力を有する ものはなく、また反応原性に関連した酵素活性を実質的に有していないものもな かった。

発明の要約 本発明は、少なくともＢ　ｏｒｄｅｔｃｌ　ｌａ外毒素のサブユニットＳｌをコ ード化する部分、あるいは上記部分の断片又は誘導体より成る組換えＤＮＡ分子 を提供するが、ここで上記部分あるいは断片又は誘導体は、（ａ）毒素中和水準 の抗体を引き出す（誘発する）ことができ、（ｂ）実質的に反応原性成分を含ま ない生物学的活性を有するポリペプチドをコード化する。ポリペプチドＳｌサブ ユニット又はそのサブユニット類似体はりｅｒｔｕｓｓｉｓ毒性に対して免疫防 御を提供する際に重要であることが公知の主要エピトープより成る。毒素中和水 準の抗体はｐｅｒｔｕｓｓｌｓ毒性に対する免疫防御を示す。部位特異性変異誘 発により実質的には酵素的に不活性であるサブユニットＳｔの類似体が生じる。

遺伝子的処理を施したＢ　ｏｒｄｅｔｅｌ　ｌａ外毒素の５１サブユニツト及び このサブユニットの類似体は、ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ性疾患防止に使用するための 組換えＤＮＡ由来サブユニットワクチン物質を提供する。Ｓｌサブユニット及び その類似体は、単独又はサブユニットＳ２．ＳＳ、Ｓ４及びＳＳ、並びにその混 合物と併用して、ワクチン産物を提供し得る。サブユニットＳ２゜Ｓｔ、Ｓ４及 びＳＳはＢ、　ｐｅｒｔｕｓｓｉｓから精製可能であるか、もしくは融合又は非 融合産物として組換えにより得られる。

Ｂ　ｏｒｄｅｔｅｌ　ｌａ外毒素のサブユニットＳ２．ＳＳ、Ｓ４及びｓ５の高 レベル組換え発現はまた、直接非融合法によりＥ、ｃｏｌｌで達成されている。

酵母菌、例えばＳ　、　ｃｅｒｖｊｓｉａｅ及び細菌類、例えばＳ　ａｌｍｏｎ ｅｌ　ｌａ　ｔｙｐｈｉｍｕｒｌｕｍ又はＳ　、ｔｙｐｈｉ、　Ｂａｃｉｌｌｕ ｓ。

れに代わる組換え宿主をこれらのサブユニット類似体の発現用に用いてもよい。

詳細な説明 本発明は、ワクチン生産に必要なすべてのＰＴＸサブユニットの高レベル、直接 組換え発現を提供する。さらに、Ｓ１サブユニット類似体は高度に免疫原性を示 し且つ実質的に反応原性成分を示さない生物学的活性を提供するが、このような 成分は、その毒性及び反応原性に関連した毒素分子の酵素活性であり、Ｂ、　ｐ ｅｒｔｕｓｓｌｓ細胞から抽出されるワクチン物質とともに見出されると考えら れ且つ反応原性を示すことが公知のＢ　、　ｐｅｒｔｕｓｓｉｓの外来成分（例 えば内毒素）である。単独で、又はＰＴＸの他のサブユニットと組合わせて用い るＳｌ類似体は、非変更性原性サブユニット又はａ換え由来サブユニット中に存 在する反応原性成分により発症する恐れのある副作用に有効で且つ大いにそれを 低減するワクチン産物を提供する。

Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ　ｐｅｒｔｕｓｓｌｓ　１１素の個々のサブユニットＳｌ 。

Ｓ２．ＳＳ、Ｓ４及びＳＳは、各々サブクローン化され、Ｅ、ｃｏｌｌにおいて 独自に直接発現された。組換えＳｌ　（ｒｓｌ）の発現に際してはシグナル配列 が重要な役割りを演じるものと思われる。シグナルペプチド不在下では、無意量 のｒｓｌがＥ、ｃｏｌｌ中に発現された。Ｓｌサブユニットの原リーダーか又は 合成リーダーがプレ蛋白質上に存在する場合、総細胞蛋白質の１０〜３０％の範 囲の高レベルの発現が得られる。供給バッチ１０リットル発酵器中（８■ＳＬ　 １０Ｄ−Ｌの非最適発現レベルで）での生産Ｍ、横でのｒ８１発現体細胞の醗酵 により、図に示されているように、その成熟種へのｒｓＩのほぼ完全な蛋白質分 解処理が行われた。実験室規模での発現体細胞の発酵からは、不完全処理Ｓ１が 生じた。プレ蛋白質と成熟蛋白質はともに対数的細胞成長後に見出された。合成 Ｅ、ｃｏｌｌ開裂可能リーダー配列がシグナル処理を増強できなかったことは、 不完全分割がＢ、　ｐｅｒｔｕｓｓｌｓ蛋白質分解的分割部位に関するＥ、ｃｏ ｌｉリーダーペプチダーゼの矛盾する認識の結果ではないことを示唆した。

高レベルでＥ、ｃｏ目リーダーペプチダーゼを発現するプラスミドにより共転換 される細胞を用いてシグナルペプチダーゼ合成を増大するか、又は低複写数ベク ターを用いて５１発現レベルを低下させることにより処理ブロックを克服できな かったことは、問題が開裂経路の飽和にあるのではないことを示していた。

これらの結果から、Ｅ、ｃｏｌｌにおける外来蛋白質の翻訳処理が成長中の細胞 の生理学的状慧に関連したほとんど不明の機序により制御される可能性があるこ とが立証される。

ＰＴＸサブユニットＳ２．Ｓ３．Ｓ４及びＳ５は、図２に示されている通り、Ｅ 、　ｃｏｌｌにおいて同様に発現された。組換えＳｌと同様に、ｒｓｌ、ｒＳ２ ．ｒｓ３及びｒＳ５サブユニットは実験室規模発酵では不完全処理を示すと考え られた。

ｒｓｌは生産規模で完全に処理され得たので、同様の発酵条件を用いて他のサブ ユニットを完全処理形態で産出し得る。

ｒｓｌと対比して、ｒＳ４サブユニットは成熟メチオニルポリペプチドとして高 レベルで発現可能であるが、しかしその自然リーダーペプチド配列により発現さ れる場合は検出可能でなかった。サブユニットＳ２．Ｓ３．Ｓ４及びＳ５は、目 下、メチオニル成熟ポリペプチドとして全て発現されている。これらの分子のア ミノ酸分析により、異種性（非原性）メチオニル残渣を細胞メチオニンアミノペ プチダーゼにより各種（Ｓ４以外）から除去して完全成熟蛋白質の原配列を提供 することが立証される。細胞性酵素に関するアミノ末端認識配列の不適合性ゆえ に、メチオニル残渣は実質的には組換えＳ４から除去されない。

組換え蛋白質はすべて、分解細胞からの封入体として回収された。サブユニット は真正源サブユニットと本質的に等しい５ＤＳ−ＰＡＧＥの移動様式に有するか 、あるいはＷｅｓｔｅｒｎプロットにおいてモノクローン性及びポリクローン性 抗毒素血清と反応することが判明した。図２に示されているように旦。

ｃｏｌｌにおけるサブユニー）トＳ１．Ｓ２．Ｓ３．Ｓ４及びＳ５の高レベル組 換え発現は、直接、非融合手段により達成される。

本発明の実施に際しては代替的方法及び物質を用いることができるけれども、好 ましい方法及び物質を以下に記載する。以下に引用の全参考文献は参考文献とし て本明細書に組み込まれている。

サブユニットＳｔ、Ｓ２．Ｓ３．Ｓ４及びＳ５の組み換え発現に関する材料と方 法 ベセスダ・リサーチ・ラボラトリ（Ｇａｌｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）、ベーリ ンガマンハイム・バイオケミカルス（Ｉ　ｎｄｌａｎａｐｏｌｌｓ。

ＩＮ）及びインターナショナル−バイオテクノロジー、１ｎｃ。

（Ｎｅｗ　Ｈａｖｅｎ、　ＣＴ）の各社からＤＮＡ修正酵素を購入し、メーカー の勧告に従って酵素を使用した。化学薬品及び生化学薬品はすべて分析用試薬品 等であった。精製ｐｅＭｕｓｓｉｓ毒素ＰＴＸはリスト・バイオケミカル・ラボ ラド１ハ　ｔｎｃ。

（Ｃａａｐｂｅｌｌ、ＣＡ）から購入した。　Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ　（１９８２ ，Ｈ。

Ｇ、　Ｇｕｓｓｅｎ及びＡ、ＬａｎｇＷ集。「遺伝子断片の化学的及び酵素的合 成Ｊ　Ｖｅｒｌａｇ　Ｃｈｅｓｆｅ、Ｗｅｉｎｈｅｉｍ、西独、　７１−７９頁 ）に従って合成オリゴヌクレオチドを合成した。全Ｐ　Ｔ　Ｘ　ｌ：ｌ：対する ウサギ抗血清は、アンチボディーズ、Ｉｎｃ、（ＤａｖｉｓＣＡ）　及びＮＩＡ ＩＤロッキーマウンテンラボラトリで生産され、原ＰＴＸからのサブユニットに 対するモノクローン性抗体は標準的方法により産生された（ＫｏｈｌｅｒとＭｌ ｌｓｔｅｌｎ、１９７５゜１ｇＧは二ニー・イングランド・ニューフレア（Ｗ目 ■ｉｎｇｔｏｎ。

ＤＥＬ）から購入した。抗Ｓｌモノクローン抗体ＩＢ７（ＳＢｔ。

等の記載の通り。１９８７．　Ｉｎｆｅｃｔ、ｌ−５ｕｎ、　５５：　９０９− ９１５）は日本のＨ，５ａｔｏ氏（Ｎ　Ｉ　Ｈ，ｔｏ　Ｋｅｙｏ）から寄贈され たちのスミドｐＰＴＸ４２が報告されている（　Ｌ　ｏｃｈｔとＫ　ｅｉ　ｔｈ 、上記；Ｌ　ｏｃｈｔ等、上記を参照）。発現プラスミドｐ　ＣＦ　Ｍ２Ｏ２Ｓ 。

ｐ　ＣＦ　Ｍ１１４Ｂ、ｐ　ＣＦ　Ｍ１１５２及びｐ　ＣＦ　Ｍ１１５ＢはＡ　 Ｉｇｅｎで得られた。Ａ　ｍｇｅｎの発現ベクター系の詳細な説明は発行済みの 欧州特許第１３６．４９０号明細書に報告されており、本明細書でも参考文献に 入れられている。このようなプラスミドは誘導可能プロモータ、合成リポソーム 結合部位、クローニング群、プラスミド起源の複製、転写ターミネータ、プラス ミド複写数調節遺伝子、及びカナマイシン耐性遺伝子を含有してもよい。得られ たプラスミドは、多くの点で互いに異なる。プラスミドｐＣＦＭ１０３６は、以 下のオリゴヌクレオチドにより合成Ｐｔ、プロモータを含有する独自ＡａｔＩＩ 及びＥｃｏＲＩ制限部位間のＤＮＡ配列を置換することによりｐｃＦＭ８３Ｂ　 （欧州特許第１３６．４９０号）により得られる： ３’　ＴＧＣＡＧＴＡＧＣＴＡＡＧＡＴＣＴＴＡＡ該プラスミドは、制御群に先 行する誘導可能プロモータを含有しない。プラスミドｐ　ＣＦ　Ｍ１１４Ｂは独 自Ｃｊ）ａｌ及びＸｂａｌ制御部位間の小ＤＮＡ配列を以下のオリゴヌクレオチ で置換することにより： Ｂ’　Ｔ　Ａ　Ａ　Ａ　ＣＴ　Ａ　Ａ　Ｇ　Ａ　Ｔ　Ｃ５’またＴ４ポリメラー ゼ酵素で終末充填し、その後ゆるく終末結紮して２つの内生Ｎｄｅｌ制限部位を 破壊することにより、ｐ　ＣＦ　Ｍ１３８から得られる。該プラスミドは制限群 直前に合成リポソーム結合部位を含有しない。プラスミドｐ　ＣＦ　Ｍ１１５Ｂ は独臼のＸｂａｌ及びＫｐｎｌ制限部制限部小間ＮＡ配列を以下のオリゴヌクレ オチドで置換することによりｐ　ＣＦＭｌ１４６から得られる： Ｘｂａｌ　ＫｐｎＩ ５’　ＣＴＡＧＡＡＧＧＡＡＧＧＡＡＴＡＡＣＡＴＡＴＧＧＴＴＡＡＣＧＣＧＴ ＴＧＧＡＡＴＴＣＧＧＴＡＣ３’３’　ＴＴＣＣＴＴＣＣＴＴＡＴＴＧＴＡＴＡ ＣＣＡＡＴＴＧＣＧＣＡＡＣＣＴＴＡＡＧＣ５’プラスミドｐ　ＣＦ　Ｍ１１５ ２は、ｃｏｐＢプロモータを含有し、ｃｏｐ　Ｂ遺伝子の一部をコード化するＢ ｇｊ！　ＩＩ　〜ＢｇＮ　ＩＩ（２４８塩基対）ＤＮＡをプラスミドｐｃＦＭ５ １２　（欧州特許第１３８．４９０号）からのそれに対応するＤＮＡで置換する ことによりｐｃＦＭｌ１５Ｂから得られる。このプラスミドは、ｐ　ＣＦ　Ｍ１ １５Ｂより少する複写数を有する。

プラスミドｐＢＲ３３２、ｐＵｃｌｇ、ｐＵｃ１９並びにファージＭ１３謂ｐ１ ８及びＭ１３ｍｐ１９Ｄ　Ｎ　Ａは、ベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズから 購入した。Ｅ、　ｃｏｌｔリーダーペプチダーゼに関する遺伝子を含有するプラ スミドｐＴＤ１２５　（Ｄａｌｅ、Ｔ、　１９８ＬＪ　、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ 、　１４３　：　７Ｇ−８３）はＷ、　Ｗｉｃｋｎｃｒ　（Ｕ　ＣＬ　Ａ）から 寄贈された。Ｅ、　ｃｏｌＩＦＭ５細胞は、Ａｌｇｅｎ　Ｉ　ｎＣ。

（Ｔｈｏｕｓａｎｄ　０ａｋｓ、ＣＡ）で、Ｃ，Ｆ、　Ｍｏｒｒｌｓからの且ｌ Ｃａ１ｌＫ　−１２株（Ｂ　ａｃｈｍａｎｎ等、１９７６、　Ｂａｃｔｅｒｌｏ ｌ、　Ｒｅｖ、赳：１１６−１８７）から得られたもので、完全ラムダファージ レプレッサ遺伝子、ＣＩ　８５７　（Ｓ　ｕｓｓ＋ｓａｎ等、　１９６２．　Ｃ ，Ｒ，Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、２４５　：　１５１７〜１５７９）を含有する。個々のサブユニット発 現プラスミドの構造は本明細書に記されている。標準的方法により（Ｍａｎｉａ ｔｉｓ等、　ｆ９１！２．　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｆｎｇ：　実験室マ ニュアル。Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇｓ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、 ＮＹ）、ベクター産生、細胞形質転換及びコロニー選択を実施した。

分析方法ニプライマー伸長、鎖終止法によりＤＮＡ配列を行なりた（　Ｓ　ａｎ ｇｅｒ等、　１９７７、　Ｐｒｏｃ、Ａｃａｄ、Ｓｃ１．　ＵＳＡ７４　：　５ ４Ｅｉ３−５４６７　；　Ｈｅ１ｄｅｃｋｅｒ等、１９８０．　Ｇｅｎｅ　１０ ：　８９−７３）。

ＡＢＩ４７０Ａガス相微小配列器中で自動Ｅ　ｄｓａｎ分解により蛋白質配列分 析を実施した（　Ｒｅｖｉｃｋ等、　１９８１．　Ｊ　、　Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ 。

−８８５）の通りに５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧ Ｅ）を実施し、ポリアクリルアミドゲルからのポリペプチド溶出はＨｕｒｉｋａ ｐｌ　ｌ　ｌｅｒ等の方法により実施しく１９８３．　Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚｙｓｏ ｌ、　９１：　２２７−２３６）、Ｂ　ｕｒｎｅｔｔｅ（１９８１゜Ａｎａｌｙ ｔ、ＢＩｏｃｈｅｍ、　＋１２　：　１９５−２０３）による報告の通りにＷｅ ｓｔｅｒｎプロッティングを実施した。組換え蛋白質対総細胞蛋白質又は総封入 体蛋白質の比を、全細胞分解産物又は封入体標本の５ＤＳ−ＰＡＧＥを施し、そ の後Ｃｏｏｓａｓｓｊｅ　Ｂ　ｒｊｌｌｌａｎｔＢＩｕｅＲ２５０で染色し、次 いで集成的密度測定によりゲルスキャニングによって査定した。過去の報告と同 様に（Ｋ　ａｔａｄａ等。

１９８２、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　ＵＳＡ７９：３１２９ −３１３３；Ｌｌｍ等、１９８５．　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｓ、２６０　：２ ５８５−２！Ｊ８）、ＮＡＤ−グリコヒドロラーゼ及びＡＤＰ−リボシルトラン スフェラーゼに関する効力検定を行なった。種々の組換えサブユニット標本に対 する抗血清を用いてのＰＴＸに対するＣＨＯ細胞の形態学的反応の低減（Ｈｅｖ ｌｅｔＬ等、１９８３．　１　ｎｒｅｃｔ、Ｉ　ｗｍｕｎ。

４０　：　１１９１１−１２０３）を、Ｇ　１ｌｌｅｎｉｕｓ等の手法（１９８ ５，Ｊ、　Ｂｉｏｌ。

術の図１に示される制限部位を用いて個々のｐｃｒｔｕｓｓｉｓ毒素サブユニッ ト遺伝子分節を単離した。上流制限部位はサブユニットのシグナルペプチド含有 型の発現に関する開始コドンのすぐ内側か又はサブユニット類似体のメチオニル 成熟形の発現に関するサブユニットの成熟、処理形のアミノ終末残基に関するコ ドンのすぐ内側であった。ある場合には、完全Ｂオリゴマーの共発現はＳ３終末 を通して５２の上流非コード化領域を含有する断片を利用し、またＥ、ｃｏｌ１ 発現ベクターの合成リポソーム結合部位を抜かし、他の場合には、Ｓ２の上流非 コード化領域を欠失し、合成Ｅ、ｃｏｌｉリポソーム結合部位が挿入された。合 成オリゴヌクレオチドを使用して、遺伝子分節を、合成プロモータ及びリポソー ム結合部位の下流の至適距離での発現プラスミドに挿入した。上流リンカ−は、 前サブユニット作製の場合は真正開始コドンの後に、あるいは成熟アミノ終末の 最初のコドン後方に各遺伝子の読み枠を修復した。後者のオリゴヌクレオチドは メチオニル開始コドンを包含した。いくつかの場合には、コドン使用は、その結 果生じるｍＲＮＡの５′末端近くの二次構造に関する力を低減するべく改変され た。例えば、Ｓｌサブユニットのシグナル領域の３位でのシスティンコドン（Ｌ 　ｏｅｈｔとＫｅｌｔｈ、上記）はセリンに関するコドンで置換され、好ましく ないジスルフィド相互作用の可能性を排除した。

種々のプラスミド構成物でＥ、　ｃｏｌｉＦＭ５細胞を形質転換後、カナマイシ ン含有寒天上に置き、適当数のコロニーを選別し、複製平板化し、小液体培養と して育成しく「ミニブレラプスＪ　）　、４２℃で４時間誘導させた。次いでミ ニブレラプスを細菌細胞内の封入体の存在に関して光学顕微鏡でスクリーニング した。明らかな封入体を示す標本を固定して、レプリカ平板からの適合コロニー に誘導温度でフラスコ規模の（１リツトル）実験室発酵を施した。いくつかの標 本は後にｌＯリットルの工業用発酵ロウでの供給バッチ発酵を施された。誘導後 種々の時間に発酵中の標本を抜き取り、５ＤＳ−ＰＡＧＥにより、その後Ｃｏｏ ■ａｓｉｃブリリアントブルー染色とＷｅｓｔｅｒｎプロッティングとによって 適当なＰＴＸサブユニットの出現に関して調べた；プロットは先ず適当なモノク ローン抗体と反応させてオートラジオグラフィで検査し、次いでポリクローン抗 ＰＴＸ血清と反応させた後、さらにオートラジオグラフィで調べた。各発現クロ ーンからのプラスミドの構造は、単離プラスミドの制限マツピングにより確証さ れ、接合領域のＤＮＡ配列により立証された。

中で４２℃で誘導した場合、それらは、５ＤＳ−ＰＡＧＥにおいて高圧ＰＴＸＳ Ｉと共移動する約２８．０００ダルトンの主要細胞内蛋白質（図２Ａ左、レーン ｒｓｌ）を産出した。部分アミノ酸配列分析（５周期）により、このポリペプチ ドが成熟Ｓｌサブユニットを予測させるアミノ終未配列を有することが確実され た（　Ｌ　ｏｃｈｔとＫｅｉｔｈ、上記）。その蛋白質はＷｅｓｔｅｒｎプロッ トにおけるマウス抗Ｓｌモノクローン抗体との反応性により免疫化学的に８１と 同定された（図２Ａ右、レーンｒｓ１）。

１リツトルフラスコ規模でのＳ１発現体細胞の実験室発酵により、ｒｓ１シグナ ルペプチドの不完全分割が生じ、Ｅ、　ｃｏＨにおける他のＰＴＸサブユニット の発現に関する現象も観察された（以下参照）ことに注目すべきである。プレ蛋 白質開裂範囲を増大するために企画された一連の実験によりフラスコ規模で観察 されるシグナルプロセッシングに対する分子ブロックを確認する試みがなされた ：すなわち、低複写数発現ベクターへのＳｌ遺伝子の挿入、真正Ｓ１シグナルペ プチドに代わして（Ｄａｔｅ、上記）この酵素の構成レベルを増大するなどの試 みであった。これらのアプローチでシグナル開裂の何らかの有意の変化を引き起 こしたものはない。しかしながら、供給バッチ処理に対する発酵条件を改良した 結果、実質的に完全な成熟型へのブレＳｌのプロセッシングが生じた。

成熟メチオニルポリペプチドとしてＳ４サブユニット発現が成功したことにより （以下）、ｒｓｌに関しても同様の手法の使用が促進された。しかしながら、Ｅ 、　ｃａｌｌにおけるｒＳ４発現と異なり、成熟メチオニルＳ１の発現量は非常 に低く、それを検出するためにＷｅｓｔｅｒｎプロットを必要とした。これに対 して、その真正シグナル配列を用いたｒｓｌの発現は、総細胞蛋白質の１０〜３ ０％のレベルで完全に処理されたポリペプチドを産生した。後述の通り、組換え によるｒｓｌの成熟アミノ終末の切断により、非常に高いレベルの発現を生じた 。事実、成熟Ｓｌ配列の最初の２個という少量の残基（ＡｓｐＡｓｐ）をＭｅｔ Ｖａ＋で置換した結果、メチオニル成熟型に関連した有意の発現を生じた。

Ｓ２．Ｓ３．Ｓ４及びＳ５の発現：実行可能性の一検査として、ＰＴＸＳ４サブ ユニットがその原リーダーペプチドを伴わない成熟メチオニル蛋白質として先ず 発現され、上記の通りＥ。

ｃａｌｌ中で高レベルで産生された（図２Ｂ左、ｒｌＳ４レーン）。

５ＤＳ−ＰＡＧＥにおけるその移動は全毒素標本からの８４の場合に関してわず かに減速されたけれども、予測されたアミノ酸配列を示した。ＨＰＬＣによりＢ 　、ｐｅｒｔｕｓｓｌｓから精製されるＳ４は、ゲル電気泳動で同様の減速を示 した（　Ｌ　ｏｃｈｔ等、上記）。組換えＳ４は、Ｗｅｓｔｅｒｎプロットにお いてポリクローン抗血清とよく反応するが（図２Ｂ右、レーンＳ４）、しかしＳ 番モノクローン抗体との反応性を減少した。

Ｓｌに関して得られた結果と対比的に、その原リーダーペプチド配列を有するＳ ４の発現（Ｌ　ｏｃｈｔとＫ　ｅｉ　ｔｈ、上記）により検出不可能レベルの蛋 白質が生じた（示されていない）。しかしながら、Ｎ１ｃｏｓｉａ等（上記）が 異なる翻訳開始部位をさらに上流に予測したことに注目すべきである；Ｓ４リー ダーペプチドにこの付加配列を使用するとさらに高レベルの発現が生じる可能性 がある。組換えＳ２．Ｓ３及びＳ５は各々それらの原リーダー配列により発現さ れる（図２Ａ、それぞれレーンｒＳ２゜ｒＳ３及びｒＳ５）；これらのサブユニ ットのうち実験室規模発肝中に完全に処理されたものはないが、しかしながら供 給バッチ処理を用いた予備的工業規模発酵によりＳ２及びＳ５のプロセッシング に顕著な改良が示されている。Ｓ２．５３及びＳ５はまた、メチオニル成熟形態 で、それらの原リーダーペプチドによって得られるものに匹敵するレベルで、各 々Ｅ、　ｃａｌｌ中で発現される（図２Ｂ、それぞれレーンｒｍｓ２．ｒ■Ｓ３ 及びｒ＊ｓ５）。上記の通り、細胞メチオンアミノペプチダーゼによりＳ２．Ｓ ３及びＳ５の異種メチオニン残基を処理して完全成熟ポリペプチドの原配列を産 生ずる。

Ｂオリゴマーサブユニット（Ｓ２−５４−Ｓ５−５３）を表わす完全ポリシスト ロン分節はＰｔプロモータ制御下で発現された。図３はＳ２サブユニツトの産生 に及ぼす上流非コード化領域の作用を説明している。ある場合には、発現プラス ミドはＳｌの終止コドンとＳ２の開始コドンとの間の全シストロン間部分を保持 した（ＬｏｃｈｔとＫｅｌｔｈ、上記）が、しかし他のすべての発現プラスミド において用いた合成リボゾーム結合部位を有していなかった。これにより、抗Ｓ ２モノクローン抗体を用いてＷｅｓｔｅｒｎプロットで検出した場合に完全に処 理されると思われる組換えＳ２の合成が生じた（図３．レーンＤ及びＥ）が、し かし示されていないポリクローン抗体分析からは、他のＢオリゴマーサブユニッ トもまた完全に処理されてその成熟形態となることが示唆された。非コード化シ ストロ２間分節を合成ｓ　ｈｉｎｃ　−Ｄ　Ｑ１ｇａｒｎＯ配列で置換すると、 さらに高レベルのｒＳ２合成が起る（図３．レーンＢ及びＣ）：しかしながら、 この物質は不完全に処理される。各シストロンの合成効率は、そのメツセージの ５′末端との近接度、すなわちＳ２　＞Ｓ４　＞Ｓ５　＞Ｓ３に直接相関してい ると思われる。オペロン保持体が高度発現ＳＬ構成物から下流にある予備的実験 では（上記参照）、Ｓｌを含めた各サブユニットの非常に低レベルの合成と不完 全なプロッシングが起きた。

組換えＰＴＸサブユニットの特性：もし存在するとしても極く少量の処理剤ＰＴ Ｘサブユニットは、Ｅ、ｃｏｌ！細胞から分泌されると考えられるが、しかし完 全処理ｒｓ１がプラスミド周囲間隙に限定されて見出されることがあるという例 もいくつか示されている。大量の各サブユニットは封入体の形で見出され、総細 胞蛋白脂質の１０〜３０％を構成していた。Ｆ　ｒｅｎｃ１１ブレス及び低速遠 心分離による細胞溶解により、個々のサブユニットとしてその蛋白質の６５％ま でを含有するベレット分画を生じた。

ＰＴＸサブユニットはすべて、ポリクローンウサギ抗毒素血清を用いたＷｅｓｔ ｅｒｎプロットにおいて検出可能であった（図２）。上記の通り、サブユニット ｒｓ１及びｒＳ２はＷｅｓｔｅｒｎプロットにおいて特異的モノクローン抗体と よく反応した。メチオニルポリペプチドとして作られた組換えＳ４は抗Ｓ４モノ クローン抗体との反応性を減じた。サブユニットＳ３及びＳ５に対するモノクロ ーン抗体は利用できなかったが、ｒｓ３はＳ２との密接な配列相同性により抗Ｓ ２モノクローン抗体を用いたＷｅｓｔｅｒｎブ０７ト上で検出可能であった（　 Ｌ　ｏｃｈｔとＫｅｉｔｈ。

上：己）　。

粗製組換えｒｓ１標本をＣＨＯ細胞から単離した膜とともに（３２Ｐ）ＮＡＤの 存在下でインキュベートした場合、約４１．０００ダルトンの蛋白質がＡＤＰ− リボシル化されたが、これは原全ＰＴＸによりリボシル化される量と同等である ；この分子は、アデニレートシクラーゼ複合体のＮｉ膜調節蛋白質であると確信 されている（　Ｂ　ｏｋｏｃｈ等、　１９８３．　Ｊ　、　Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ 。

対する基質としてウシのトランスデユーシンを利用することができる（図４）が 、この分子はＮＡＤからのｐｅｒｔｕｓｓｉｓ毒素触媒ＡＤＰ−リボース運搬体 に対する受容体であることが立証されている（Ｍａｎｎｉｎｇ等、上記；Ｗｅｓ ｔ等、上記）。この結果、該毒素のＡプロモータ（Ｓｌサブユニット）上のＡＤ Ｐ−リボシドランスフェラーゼ活性の位置が確かめられ、組換え且。

ｐｅｒＬｕｓｓｌｓ蛋白質がＥ、　ｃａｌｌにおけるその原二次元構造に近い形 態に折り畳まれることが示唆される。さらに、ＮＡＤ−グリコヒドロラーゼ活性 を示す組換えＳｌもまた、Ａプロモータを用いて鑑定した。ｒｓｌの粗製封入体 標本を用いた。又は精製組換えメチオニルＳ４を用いた腹腔的注射によりマウス を免疫化し、効能促進した。使用したｒｓ１サブユニット材料は完全処理ポリペ プチドと未処理プレ蛋白質を約１：２の割合で含有した；２つのｒｓｌ種の相対 的免疫原性は公知でない。抗毒素抗体の存在に関して固相ＲＩＡで血清標本を試 験した（図５）。

組換えＳｌを投与された動物は、完全Ｆ　ｒｅｕｎｄアジュバントを用いて免疫 化用量を処方したか否かにかかわらず、有意の抗毒素反応を示した。補強形態で のみ生じた組換えＳ４もまた、補強された全毒素及び市販ｐｅｒｔｕｓｓｉｓワ クチンに関して大いに免疫原性を有した。

培養ＣＨＯ細胞を全ｐｅｒｔｕｓｓｌｓ　ＩＢ素で処理した場合、抗毒素血清に より阻害され得る（　Ｇ　ｅｌ　Ｉｅｎｌｕｓ等、上記）「房状」形態を生じた （　Ｅ　ｅｖｌｅｔｔ等、上記）。予備実験では、上記の通り調製され、且つ相 対的に高滴定の抗毒素抗体を処理するｒｓｌ又はｒＳ４に対するマウス血清は、 原毒素に対するＣＨＯ細胞の反応を慣例的に中和することができなかった。

組換えＳｌによるマウスの免疫防御：粗製組換えＳｌ、精製組換えＳ４、及び適 当な対照物質（上記参照）で免疫化したマウスに、Ｂ、ｐｅｒｔｕｓｓｌｓマウ ス有毒株１８３２３による脳内チャレンジ（脳性）を施こし、チャレンジ後４５ 日間の死亡率を採点した（図６）ａ５０μｇの試験物質（市販ｐｅｒｔｕｓｓｔ ｓワクチンの１：３５稀釈液１００μｇ）を腹腔内注射してマウスを免疫化した ；接種後２１日ロー同量を注射して補強し、成育可能Ｂ　、ｐｅｒｔｕＳＳＩＳ 菌株１８３２３の脳内チャレンジにより７日後にチャレンジした（３ｘ１０４細 菌／動物）。組換え標本には活性全毒素が欠如しているため防御は予測されなか ったけれども、意外にも非免疫化対照に対してｒｓ１免疫化動物に関する生存時 間の増大が認められた。さらに、補強化ｒｓｌを投与された多数のマウスはチャ レンジに対して完全に防御された；補強ｒＳ４で免疫化したマウスは、良好な抗 体反応を示した（図５参照）けれども、非免疫化マウスより良好に防御されはし なかった。別の予備実験では、補強ｒｓｌはチャレンジに対する用量−反応防御 を引き出すと思われた。脳内チャレンジ効力検定における不完全防御は、免疫化 物質中に活性全毒素がなかったことによるものと考えられる；にもかかわらず、 この予備試験で達成された防御は、組換えＳｔ蛋白質がサブユニットワクチン材 料としての力を有していることを立証するものである。その後の研究からは、Ｂ 　、ｐｅｒｔｕｓｓｉｓマウス有毒菌株Ｈ１３２３による脳内チャレンジに対す る免疫防御は確証されていない。

図の簡単な説明 図１はＰＴＸオペロンのシストロン順位を模式的に説明したものである（従来の 技術、　ＬＯＣｈｔ及びＫｅｉｔｈ、上記）、Ｓｌ。

Ｓ２．Ｓ４．Ｓ５及びＳ３を示す領域はこれらのＰＴＸサブユニットの各々に関 して提案された開放読み枠を示している。各シストロン直前の充満領域は推定上 のシグナル配列を示す。各シストロン因子のすぐ下流の制限酵素部位は、そのシ ストロンの発現ベクターへのサブクローニングに用いる下流制限部位を示してい る。各シグナル配列領域のすぐ内側に位置する制限酵素部位は、適当なオリゴデ オキシヌクレオチドリンカーと共に発現ベクターへの全長シストロンのサブクロ ーニングに関する上流制限部位として用いられて、そのシグナル配列はそのまま で未熟ＰＴＸサブユニットを産生ずる。各成熟ＰＴＣサブユニット開放開放枠の すぐ内側の制限酵素部位は、適当なオリゴデオキシヌクレオチドリンカーととも に、そのコード化シグナル配列を伴わずに、シストロンのサブクローニングに関 する上流制限部位として用いられ、メチオニル−成熟ＰＴＸサブユニットを産生 ずる。

図２は、組換えＰＴＸサブユニットの５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル及びＷｅ ｓｔｅｒｎプロットである。パネルＡの左は、測定可能量で産生された組換えＰ ＴＸサブユニットのＣｏｏａａｓｓｉｅＢ　ｒｉｌｌｌａｎｔ　Ｂ　１ｕｃ−染 色ゲルを示す；パネル人右は、ウサギのポリクローン性抗ＰＴＸ過免疫血清を用 いた場合の平行ゲルのＷｅｓｔｅｒｎブＯットである。ＰＴＸは市販等級のｐｅ ｒｔｕｓｓｉｓ毒素を含有するレーンを示す。これらの結果は、組換え＜ｒ）Ｓ Ｌ。

５２．５３及びＳ５がすべて有意量で産生されたことを立証している。ＷｅＳｔ ｅｒｎプロットからは、ｒｓｌがそのプレ蛋白質種から完全に処理され、ｒＳ２ 及びｒＳ５は一部処理され、ｒＳ３は発酵条件下では実質的に処理されないこと が示されている。ｒＳ４は視覚化されるほど十分量で処理されなかった。

パネルＢはメチオニル−成熟組換え（ｒｌ）サブユニットとしての発現産物を示 している。これらのサブユニットは、「■Ｓｌ（示されていない）は例外として 、有意量で作製される。

図３は、ｒＳ２の発現に及ぼす上流非コード化配列の作用を立証するｗｅｓｔｅ ｒｎプロットである。図の詳細は本文に記されている。

図４は、組換えＳｌのＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼ活性を立証する５Ｄ Ｓ−ポリアクリルアミドゲルのオートラジオグラムである。組換えＳ　Ｌ（５０ ０ｎｇ）、精製原ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ毒素（１μｇ）、及び反応緩衝液を別々に 、実質的には下記と同様に（３２Ｐ）ＮＡＤ存在下でウシトランスデユーシンと 反応させた：（Ｍａｎｎｌｎｇ等、　１９８４．　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｗ、 ２５９　：　７４９−７５６；Ｗｅｓｔ等、　１９１１５．　Ｊ８５．　Ｊ、　 Ｂｌｏｔ、Ｃｈｅｗ、２８０　：　１４４２８−１４４３０）。その標本を冷却 １０％トリクロロ酢酸で沈降させ、その沈渣を５ＤＳ−ＰＡＧＥとその後のオー トラジオグラフィにかけた。３９Ｋｄでの放射性帯はリボシル化されたトランプ ニーシンサブユニットである。レーンＡ１反応緩衝液対照；レーンＢ。

原ＰＴＸ　、レーンＣ，ｒｓ１゜ 図５は、マウスのｒｓｌ及びｒＳ４サブユニットの免疫原性を示すラジオイムノ アッセイのグラフである。マウスは組換えＳ１１メチオニルｒＳ４ｓ原９ｅｒｔ ｕｓｓｒｓ　＠素（Ｐ　Ｔ　Ｘ）　、市販ｐｃｒｔｕｓｓ１ｓワクチン、又は賦 形剤（ＮＭＳ）で過免疫化された。

いくつかの標本は完全Ｆ　ｒｅｕｎｄアジュバント（ＣＦＡ）を含有した。血清 を収集し、その稀釈液を固相ラジオイムノアッセイにおけるそれらの抗ＰＴＸ滴 定に関して調べた。

図６は、Ｂ　、ｐＯｒｔｕＳＳｉＳによるｉ、　ｃ、チャレンジに対するマウス のｒｓｌ及びｒＳ４の免疫防御力を立証するグラフである。

図の詳細は本文に記されている。

図７は、ｐＰＴＸｓｌ（６＾−５７４−１）の発現から推論されるｒｓｌ　ミュ ータントの演鐸化アミノ酸配列である。

図８Ａ及び８Ｂは、組換え類似体Ｓ１のＡＤＰ−リボシルトランフェラーゼ活性 及びグリコヒドロラーゼ活性のグラフである。

図９は、精製Ｓ１サブユニツト蛋白質の５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルのオー トラジオグラムである。

図１０は、原Ｂオリゴマーと組換えＳ　Ｌ／１又は組換えＳ　１／１−４の組合 わせからの全毒素の原性、非低減、非変性ポリアクリルアミドゲルのオートラジ オグラムである。

図１１は、光学顕微鏡により細胞群の存在に関して調べた細胞単層の写真である 。

ＳＬ類似体 蛋白質工学技術及び部位特異的変異誘発技術を用いて、裁断した類似体を作成し た。バリン７とプロリン１４を境界とする領域がＳ１分子のＡＤＰ−リボース転 位酵素作用に必要な領域であることが分かった。マウスにおいて毒素作用から受 動保護するモノクローン抗体を結合する抗原決定１＆（すなわち保護応答の引出 しに関係する抗原決定基）がバリン７とプロリン１４を境界とする領域の中に少 なくとも部分的に存在する。バリン７とプロリン１４を境界とする領域の８１分 子の変異誘発によって酵素作用を欠＜５ｌｊｆｉ似分子が保護性抗原決定基を保 持したままで生成された。保護性抗原決定基は百日咳毒素に対する免疫保護を与 える上で重要である。ＩＦｉ類またはそれ以上のアミノ酸の置換及び／または削 除も含めたプロリン１４、領域１４を介してのバリン７の修飾により、毒素中和 レベルの抗体を引き出すことができ、実質的に応動性成分を含まないＳｌ類似生 成物が得られる。

ＰＴＸＳＩ遺伝子のｐＵｃｌｇへの二次クローニングＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ　ｐ ｅｒｔｕｓｓｌｓ　ｆｙ素（ＰＴＸ）用のオペロン全体を含むプラスミドｐＰＴ Ｘ４２をＪ　、　Ｋｅｌｔｈ　（Ｎ　Ｉ　Ａ　Ｉ　Ｄ　、　ＲｏｃｋｙＭｏｕｎ ｔａｊｎ　Ｌ　ａｂｏｒａｔｏｒｙ）から形質転換ＪＭ１０９細胞として獲得し た。アンピシリンを含むしブイヨンの中で細菌を成長させて、プラスミドを回収 した後標準的方法で精製した（前出Ｍａｎｌａｔｉｓ　ｅｔ　ａｔ）ｏ制限酵ｇ Ａｖａ！及びＸｂａＩを用いてプラスミドの消化を行なった後、アクリルアミド ゲルの電気泳動とそれにひき続いてのＤＮＡ断片のゲルからの溶離を行なうこと によって、ＰＴＸＳＩ遺伝子（シストロン）の一部を含む７９２ｂｐのＤＮＡ断 片（前出Ｌｏｃｈｔ　ａｎｄ　Ｋｅｌｔｈ）をｐＰＴＸ４２から単離した。この ＤＮＡ断片はプレＳ１蛋白質用の開放読み枠のすぐ内側にあるＡｖａＩ部位に始 まって、Ｓｌ用終止コドンのＸｂａ１部位で終了するものである。標準クローン 化ベクターｐＵＣ１８もＡｖａｌ及びＸｂａｌを用いて消化し、消化物をホスフ ァターゼで処理した。消化したｐＵｃ１８ベクターｐＰＴＸ４２の７９２ｔ）Ｉ ）のＤＮＡ断片（Ａｖａ　Ｉ　−Ｘｂａ　Ｔ　）とＴ４ＤＮＡ合成酵素との連結 反応を標準条件下で行なった。新しい適格ＤＨ５２ａ細胞を連結反応混合物を用 いて形質転換し、形質転換物質をアンピシリンと「ブルーガルＪ　（“Ｂ　Ｉｕ ｅ−ｇｅｌ”、メアリランド州ガイザースバーグ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅ ａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を含むしブイヨンの寒天平板上で選択し た。１２の白色コロニーを選択し、レプリカ平板法で培養し、２ｍｌの液体培養 菌として成長させた。

標準アルカリ溶解法によって細胞を「ミニブレツブ」した後、ＤＮＡをＡｖａｌ とＸｂａｌで消化し、消化物をアクリルアミドゲルの電気泳動にかけた。

ｒＰＴＸｓ１発現プラスミドｐＰＴＸｓｉ／ｌの構成７９２ｂｌ）のＡｖａＩ− Ｘｂａｌ断片を上述のようなプラスミドｐＰＴＸ４２から単離した。Ｅ　５ｃｈ ｅｒｌｅｈｉａ　ｃｏｔ　Ｉ発現プラスミドｐｃＦＭ１１５６．ｐｃＦＭ１０３ Ｇをカルフォルニア州すウザンド・オークスのＡｓｇｅｎ　Ｉｎｃ、、Ｃｈａｒ ｌｃｓ　Ｆ、　Ｍｏｒｒｉｓから入手した。プラスミドｐ　ＣＦ　Ｍ１１５Ｂを 制限酵素５ｓｔＩ及びＮｄｅｌで消化し、ＮＡ４５紙にューハンプシャー州キー ン、　ｓｃｈ＋ｅｉｃｈｅｒ＆　Ｓ　ｃｈｕｃｌ　１）上への電気溶出によりｔ 、ｇｘｂの断片をアガロースゲルから単離した。プラスミドｐ　ＣＦ　Ｍ２Ｏ２ Ｓを５ｓｔｌとＸｂａＩで消化し、２．８ＫｂのＤＮＡ断片を同様の方法で単離 した。

Ｓｌの開放読み枠の削除部分を再構成するオリゴデオキシヌクレオチドリンカー の２つの補完的路をＣａｒｕｔｈｅｒｓ　ｅｔ　ａｌ　（前出）のアミノホスフ ィン化学法で合成した。標準アミノ酸配列を保持しながら、合成断片の配列をコ ドン使用法において変更して、伝令ＲＮＡの潜在的二次構造を低減した。例外と して、プレプロティン信号配列順のアミノ酸位置番号２にあるシスティンコドン をセリンコドンと置換して、成熟蛋白質の４１と１９９の位置にある２つのシス ティン残基とプレプロティン信号との間のジスルフィド相互作用を無くした。こ のようなオリゴデオキシヌクレオチドリンカーはｐ　ＣＦ　Ｍ１１５８の１つに 対して粘着性のＮｄｅ１部位を有し、Ｓ１遺伝子の７９２−ｂｐＤ　Ｎ　Ａ断片 のＡｖａ１部位への結合用のＡｖａＩ付着末端を有していた。このオリゴデオキ シヌクレオチドの配列は、 ５’　ＴＡＴＧＣＧＴＴＣＴＡＣ３’ ３’　ＡＣＧＣＡＡＧＡＴＧＡＧＣＣ５’であった。

ｐ　ＣＦ　Ｍ２Ｏ２Ｓの２．８ＫｂのＤＮＡ断片と、ｐ　ＣＦ　Ｍ１１５Ｂの１ ．８　ＫｂのＤＮＡ断片と、Ｓｌ遺伝子セグメントを含む７９２ｂｐのＤＮＡ断 片し、オリボデオキヌクレオチドリン力−とＴ４ＤＮＡ合成酵素とを用いて連結 反応の準備を行なった。連結後のＦＭ６細胞（カルフォルニア州すウザンド・オ ークス。

Ａｓｇｅｎ　Ｉｎｃ、、Ｃ，Ｆ、　Ｍｏｒｒｌｓから入手）を連結反応混合物を 用いて形質転換し、カナマイシンを用いてＬブイヨン寒天に塗布した。コロニー を選択して、両方ともアルカリ法（前出Ｍａｎ１ａｔｌｓ　ｅｔ　ａｌ）によっ てレプリカ平板法による培養とミニブレツピングを行なった。ミニプレツブした ＤＮＡ試料の制限酵素の記録を行なって、所要のＤＮＡ制限断片を保有している ことが分かった。合成リンカ−の始端部から標準Ｓ１遺伝子の開放読み枠内へと 延びる領域をＤＮＡ配列分析によって評価した。

引続いてこのプラスミドを誘導した結果、組換えＳ１蛋白質が高レベルに発現し た。

ｒＰＴＸ５１発現プラスミドｐＰＴＸｓ１／２の構成Ａｃｃｌ及びＳ　ｐｈ　Ｉ による消化でプラスミドｐｐＴｘｓｔへがら１ｇ１−ｂｐのＤＮＡ断片を単離し た。続いてＤＮＡ断片の精製をポリアクリルアミドゲル上で行なった。このＤＮ Ａ断片はｓ１遺伝子内部の左手部分である。同じ方法を用いて遺伝子の残りの右 手部分を表す５Ｂ４ｂｐのＤＮＡ断片を、ｐＵｃ１８にクローン化したＰＴＸＳ Ｉから単離した。これはｓ　ｐｈ　ｒ及びＢａｍＨＩによるプラスミドの消化に よって行ない、後者の酵素によりｓ１クローン化部位（ＸｂａＩ）の下流側のｐ Ｕｃ１８クローン化集塊内部のＢａｍＨＩ部位において切断した。制限酵素Ｎｄ ｅ１．　５ｓｔＩ、Ｂａ−ＨＩによる消化の後、アガロースゲル電気泳動にょる 単離とＤＮＡ断片の電気溶離を行なって、１．８Ｋｂ及び２．８ＫｂのＤＮＡ断 片を発現ベクターｐｃＦＭ１１５Ｂから単離した。

オリゴデオキシヌクレオチドリンカーを合成した。この二本鎖リンカ−はＮｄｅ ＩとＡｃｃｌの粘着末端を有し、下記の配列を有していた。

５’　ＴＡＴＣＧＡＣＧＡＴＣＣＡＣＣＴＧＣＴＡＣＣＣＴ　３’３’　ＡＣＣ ＴＧＣＴＡＧＧＴＧＧＡＣＧＡＴＧＧＣＡＴＡ　５’ｐＰＴＸｓｌ／１からの１ ｌｌｂｐ（Ａ　ｃｃ　Ｉ　−Ｓ　ｐｈ　Ｉ　）及び５Ｂ４ｂｐ（Ｓｐｈｌ−Ｂａ ｓＨｌ）のＤＮＡ断片、ｐ　ＣＦ　Ｍ１１５［ｉがらの１．８Ｋｂ　（Ｎｄｅｌ −５ｓｔｌ）及び２．８Ｋｂ　（Ｓｓｔｌ−ＢａｍＨＩ）のＤＮＡ断片、オリゴ デオキシヌクレオチドリンカー、及びＴ４ＤＮＡ合成酵素を用いた標準的な方法 （前出Ｍａｎｊａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ）によって連結反応を実施した。連結反応 後、この混合物を用いて新しい適格ＦＭ５細胞に形質転換した。耐カナマイシン 性形質転換細胞を獲得し、プラスミドＤＮＡのミニブレツブに関する酵素分析を 行ない、結合部のＤＮＡ配列の分析によって構造を確認した。

ｐＰＴＸｓ１／２のＢ　ａ１３１消化と裁断Ｓ１遺伝子によるベクターの構成 成熟したＳ１分子のアミノ末端付近にある重要な抗原決定基と酵素的に活性の部 位を評価するために、この蛋白質の裁断異型を作成した。発現プラスミドｐＰＴ Ｘｓ１／２をＮｄｅｌで消化し、標準条件下でエキソヌクレアーゼＢａ１３１　 （Ｔ　Ｂ　Ｉ）で処理した後、１００分までの何回かでアリコートを除去した。

６５℃で１５分間Ｂ　ａ１３１の不活性化を行なった後、アガロースゲル上での 電気泳動により、電気泳動移動度の増大に関して標本の分析を行なった。１００ 分と１１０分のアリコートからの標本をプールしく断片Ａ）、残りの標本はプー ルした後、別のＢａ１３１で消化した。１８０分までの何口かで７リコートを除 去した。反応を停止させた後、再び電気泳動移動度の増大に関してアリコー　ト を検査１７、さらに４つの断片（Ｂ、　Ｃ，Ｄ、　Ｅ）を保存１．た。５つの断 片を個々に５ｓｔｌで消化し、電気溶離によって３〜３．５ＫｂのＤ　Ｎ　Ａ断 片をアガロースゲルから単離した。

発現ベクターｐ　ＣＦＭ１１５Ｂを５ｓｔｌ及びＨｐａｉで消化して、同様に１ ８Ｋｌ）のＤＮＡ断片を単離した。それぞれｐｐ”ｒｘｓ１／２から得た個々の ３〜３．５ＫｂのＤＮＡ断片（平滑Ｂ　ａＨｌ　−３ｓｔｌ）と１．８ＫｂのＤ ＮＡ断片（ＳｓｔＪ−ＨｐａＩ）を標準条件下で７４　ＤＮＡ合成酵素を用いて 結合した。個々の結合混合物を用いて新しい適格ＦＭ５細胞を形質転換して、耐 カナマイシン性形質転換細胞を単離した。それぞれ断片ＡとＢの截断細胞から成 る形質転換細胞を取出して、４２℃でミニブレツブを誘導し、光学顕微鏡により 封入体の有無について標品の検査を行なった。封入体の存在する標品をＸｂａＩ で消化し、アガロースゲル電気泳動によってＤＮＡ挿入断片をその大きさに関し て検査した。大きさ６００〜６５（ｌｂｐの範囲の標本を選択してＤＮＡを配列 し、截断細胞の構造を確認した。発現した組換え蛋白質を分析した結果、Ｓ１分 子のＡＤＰリボシル転移酵素作用及び保護応答を引出すのに必要な抗原決定基（ すなわちマウスにおいて毒素作用から受動的に保護する働きをするモノクローン 抗体を拘束する抗原決定基）に必要な領域は、成熟した分子のバリン７とプロリ ン１４によって包括的に境界決定される領域の中に存在することが分かった（完 全なアミノ酸配列につい′Ｃは、前出Ｌｏｃｈｔ　ａｎｄ　Ｋｅｉｔｈ参照）、 このような８１分子の試断型は、ベクターの構成により全てそのＮ末端が試断配 列で始まる。

Ｓ１変異誘発 バリン７とプロリン１４によって境界決定される領域を微細記録すると共に、そ の領域の保護抗原決定基を保持しながら酵素作用を欠＜ＳＬの類似分子を生成す るために、保護抗原決定基の保持率をモノクローン抗体ＩＢ７との反応性によっ て決定する。これを、バリン７からプロリン１４までの残留物を符号化する標準 領域を合成オリゴデオキシヌクレオチドセグメントと置換することで達成した。

これらのセグメントは、標準アミノ酸配列を変更できるように一重または二重の コドン置換を含んでいた。修飾は削除及び／または置換によって達成することが できる。１つのＰＡＭを修飾して所要の特性の５１類似体を獲得することも本発 明の範囲に含まれる。１つの塩基を修飾して、アミノ酸配列を変更することがで きる。但し、当業者であれば承知されているように、１つの塩基を修飾した場合 は少なくとも２つの塩基を変更した場合に比較して遺伝子型復帰が野性型になる 傾向が統計的に高くなる。従って好適実施態様では、コドンの修飾をする際に各 コドンの少なくとも２つの塩基を置換して復帰効率を低減する。オリゴデオキシ ヌクレオチドリンカーをＡｃｃｌとＢｓｐＭＩＩの粘着末端を用いて合成すると 、表１のリンカ−説明に示したコドン変更を除いて標準Ｓｌ配列を含んでいた。

表　１ 構成：　ｐ　Ｐ　Ｔ　Ｘ　Ｓ　１　（６Ａ−３１５−１）コドン変更：　ｔｙｒ ８→ｐｈｅ オリゴデオキシヌクレオチドリンカー配列：５’　ＡＴＴＣＣＧＣＴＡＴＧＡＣ ＴＣＣＣＧＣＣＣＧ　３’３′＾ＧＧＣＧＡＴＡＣＴＧＡＧＧＧＣＧＧＧＣＧＧ ＣＣ５’構成＋　ｐ　Ｐ　Ｔ　Ｘ　Ｓ　ｌ　（６Ａ−３／４−１）コドン変更： 　ａｒｇ９″ｌｙｓ オリゴデオキシヌクレオチドリンカー配列：５’　ＡＴＡＣＡＡＧＴＡＴＧＡＣ ＴＣＣＣＧＣＣＣＧ　３’３’　ＴＧＴＴＣＡＴＡＣＴＧＡＧＧＧＣＧＧＧＣＧ ＧＣＣ５’構成：　ｐ　Ｐ　Ｔ　Ｘ　Ｓ　１　（６Ａ−３／３−１＞コドン変更 ：　ａｓｐＨ→ｇｌｕ オリゴデオキシヌクレオチドリンカー配列：５’　ＡＴＡＣＩＩＩ：ＧＣＴＡＴ ＧＡＡＴＣＣＣＧＣＣＣＧ　３’３’　ＴＧＧＣＧＡＴＡＣＴＴＡＧＧＧＣＣＧ ＧＣＧＧＣＣ５’構成：　ｐ　Ｐ　Ｔ　Ｘ　Ｓ　Ｉ　（８Ａ−’ｌ／２−２＞コ ドン変更：　５ｅｒ１２″ｇａｙ オリゴデオキシヌクレオチドリンカー配列：５’　ＡＴＡＣＣＧＣＴＡＴＧＡＣ ＧＧＣＣＧＣＣＣＧ　３’３’　ＴＧＧＣＧＡＴＡＣＴＧＣＣＣＧＣＣＣＧＣＣ ＧＣＣ５’構成：　ｐ　Ｐ　Ｔ　Ｘ　Ｓ　１　（６Ａ−３／１．−１）コドン変 更：　ａｒｇ１３　→ｌｙｓ オリゴデオキシヌクレオチドリンカー配列：５′＾ＴＡＣＣＧＣＴＡＴＧＡＣＴ ＣＣＡＡＧＣＣＧ　３’３’　ＴＧＧＣＧＡＴＡＣＴＧＡＧＧＴＴＣＧＧＣＧＧ ＣＣ５’構成：　ｐ　Ｐ　Ｔ　Ｘ　Ｓ　ｌ　（６Ａ−３／８−１）コドン変更二 ｔｒｙ８−１ｅｕ、　ａｒｇ９−＋ｇｌｕオリゴデオキシヌクレオチドリンカー 配列：５’　ＡＴＴＧＧＡＡＴＡＴＧＡＣＴＣＣＣＧＣＣＣＧ　３’３’　ＡＣ ＣＴＴＡＴＡＣＴＧＡＧＧＧＣＧＧＧＣＧＧＣＣ５’構成：　ｐ　Ｐ　Ｔ　Ｘ　 Ｓ　Ｉ　（ＧＡ−３／７−２）コドン変更：　ａｒｇ９−”ａｓｎ、　ｓｃｒ１ ２＝ｇｌｙオリゴデオキシヌクレオチドリンカー配列：５′＾ＴＡＣＡＡＣＴＡ ＴＧＡＣＧＧＣＣＣＣＣＣＧ　３’８’　ＴＧＴＴＧＡＴＡＣＴＧＣＣＧＧＣＧ ＧＣ（’ＣＧＣＣ５’構成：　ｐ　Ｐ　Ｔ　Ｘ　Ｓ　ｌ　（６Ａ−３７６−１） コドン変更：　ａｓｐＨ−ｐｒｏ、　ｐｒｏ１４−”ａｓｐオリゴデオキシヌク レオチドリンカー配列：５’　ＡＴＡＣＣＧＣＴＡＴＣＣＧＴＣＣＣＣＣＣＡＣ ３’３’　ＴＧＧＣＧＡＴＡＧＧＣＡＧＧＧＣＧＣＴＧＧＧＣＣ５’発現プラス ミドの構成については、電気溶離によって下記のＤＮＡ断片をアガロースゲルか ら単離した。

１）　ｐＰＴＸｓｌ　（８Ａ）からの１８２４ｂｐのＤＮＡ断片。上述のように 構成されたプラスミドであり、アスパルタート１とアスパルタート２を削除して メチオニルバニルで置換した組換え５１類似分子を発現した。

２）　ｐＰＴＸｓｌ　（３３Ｂ）からの３．５ｅＫｂのＤＮＡ断片（Ｓｓｔｌか らＢｓｐＭＩＩ）。上述のように構成されたプラスミドであり、最初から１４個 のアミノ酸残留物を削除してメチオニルバニルで置換した組換えＳ１類似分子を 発現した。この特定遺伝子構造では、結果的にこの短縮分子となった平滑断端結 合により新しいＢｓｐＭｎ部位が生まれた。未変性のＳｉシストロン要素には存 在しないこのような制限部位によって、ＡｃｃｌおよびＢ　ｓｐＭ■粘着末端を 有する比較的短かいオリゴヌクレオチドが変異誘発できるようになる。

上記２つのＤＮＡ断片を上述の個々のオリゴデオキシヌクレオチド断片と標準的 な結合条件下で結合した。この結果、Ｓｌ遺伝子が新たに構成された。すなわち 、ｐＰＴＸｓｌ　（６Ａ）の一部がＡｃｃＩ制限部位の地点に上流側コドンを与 え、合成断片がＡｃｃＩ部位とＢｓｐＭ１１部位との間のコドンに各種の変異を 与え、ｐＰＴＸｓｌ　（１３Ｂ）の一部が新規のＢｓｐＭｎ制限部位の下流側の ８１符号化領域の残りとなった。結合後、それぞれの混合物を用いて新しい適格 ＦＭ５細胞の別個の標品の形質転換を行なった。形質転換細胞を取出して、ミニ プレツブとして成育し、誘導して組換え蛋白質を生成した後、光学顕微鏡検査に より封入体を含む標本を同定した。これらの標本を誘導温度でより大規模（１〜 ６リツトル）に発酵させて、各組換え類似蛋白質をより大量に生成した。単離し た細胞ペーストを１１ＢＭのＤＴＴを含む蒸留水に再懸濁した後、フレンチプレ スで溶解させた。

これらの封入体蛋白質標品は少ないものでは３０％、多いものでは８０％の組換 え蛋白質を含んでいた。各標品を分析して、本発明者らの研究では裁断５１類似 体と同一であるとされる優性抗原決定基に向けられたモノクローン抗体８２Ｆ８ にウェスタンプロット法（前出Ｂυｒｎｅｔｔｅ）で結合する能力、および毒性 Ｂ。

ｐｅｒｔｕｓｓｊｓによる脳内攻撃からマウスを受動的に保護することが知られ ている（前出Ｓ　ａｔｏ　ｅｔ　ａｌ）をモノクローン抗体ＩＢ７に結合する能 力を調べた。また、ＡＤＰリボース転移酵素作用についても評価した。その結果 を表２に示す。

表　２ 標本　抗体結合　ＡＤＰリボース転移酵素ＰＴＸ　（市販品）＋＋＋ ｒＰＴＸＳ（ｐＰＴＸｓｌ／ｌ）　＋　＋　十ｐＰＴＸｓ１（８Ａ−３／１−１ ）　十　＋　十ｐＰＴＸｓ１（ＧＡ−３／２−２）　＋　＋　＋ｐＰＴＸｓ１（ ８Ａ−３／３−１）　＋　＋　＋ｐＰＴＸｓ１（８Ａ−３／４−１）　＋　＋　 −ｐＰＴＸＳＩ（８Ａ−１１５−１）　＋　＋　＋１）ＰＴＸＳＩ（８Ａ−３／ ６−１）　−−−ｐＰＴＸＳｌ（８Ａ−３／７−２）　−−−ｐＰＴＸＳｌ（６ ＾−３／ｌ１−１）　−−−Ｓ１類似体４−１　（Ａ　ｒｇ９−　Ｌ　ｙｓ）は 中和ｍＡｂ　ＩＢ７との反応性を保持したままで転移酵素作用はほとんど、ある いは全く示さなかった。定量法において４−１蛋白質の量を増大しても、認めら れる酵素作用の量はごくわずかにすぎなかった（第８Ａ図）、測定を繰返し行な った結果、Ｓｌ類似体の固有ＡＤＰリボース転移酵素作用が少なくとも５．００ ０分の１に低下した。単残基置換変異体に関連するＮＡＤグリコ加水分解酵素作 用の測定を行なった結果（第８Ｂ図）　、ＡＤＰリボース転移酵素作用の評媛か ら獲得されたのと同様のパターンを得た。８１類似体４−１は検出可能なグリコ 加水分解酵素作用をほとんど、あるいは全く示さず、この作用の大きさが少なく とも５０分の１ないし１００分の１に低減していることが分かフた。

受動保護性モノクローン抗体に結合する能力（すなわち主な保護性抗原決定基を 保持する）を有し、毒性作用の主要標識（ＡＤＰリボース転移酵素）を欠落する ことができるため、第７図に示すようにクローンｐ　Ｐ　Ｔ　Ｘ　Ｓ　１　（６ Ａ−３／４−１）によって生成された組換え５１類似体分子およびその修飾体は 単独で、あるいは他のＰＴＸサブユニットと組合せて安全で経済的なサブユニッ トワクチンとして応用できる。リジンとアルギニン９を置換したクローンｐ　Ｐ 　Ｔ　Ｘ　Ｓ　１　（６Ａ−３／４−１）によって生成された５１類似体は、安 全なサブユニットワクチンに必要な所望特性を有するｒ３１３１類似実例である 。他のＢＡ　−３／４−１類似体は、例えばｌと２の位置にアスパルチルアスパ ルチル残基を、０、　１．　２の位置にメチオニルアスパルチルアスパルチル残 基を、０．　１．　２の位置にメチオニルバリルアスパルチル残基を含む場合が ある。

現存の無細胞ワクチンはＳｔ、Ｓ２．ＳＳ、Ｓ４．ＳＳの？ブユニットを含有す る。培養した哺乳類細胞においてａ８咳毒素によって生じる形態的な一時変異は 、最近になってＳｌサブユニットの特性であることが証明された（Ｂｕｒｎｓ　 ｅｔ　ａｌ、、１９８７゜Ｉ　ｎｒｅｅｔ、Ｉ　５Ｉｕｎ、　５５　：　２４− ２８）が、この効果はＢオリゴマーの存在時にしか示されていない。ここに記載 する予備研究によって、主要な保護性抗原決定基は保持するが毒性作用を欠（ｒ ｓｌ類似体を用いた単一サブユニットワクチンの可能性が証明されている。Ｓｌ 類似体もサブユニットＳ２．ＳＳ、Ｓ４゜ＳＳと組合せての用途を有する。これ らのサブユニットはＳＬへの免疫応答を増大すると共に、自身で保護性抗原決定 基を有することができる。Ｓ１サブユニット類似体を含むワクチンがさらにＢ　 ｏｒｄｅｔｅｌ　Ｉａ外ａ素の前記サブユニットＳ２．ＳＳ。

Ｓ４．ＳＳおよびそれらの混合物の少なくとも１つを含むことも本発明の範囲に 該当する。サブユニットＳ２．ＳＳ、Ｓ４゜学によるサブユニットおよびそれら の類似体とすることができる。遺伝子工学によるサブユニット生成物は融合蛋白 質と非融合蛋白質を含むことができる。

次項に記載の実験を行なう目的で、本発明者らは発現系統を変更して、リジン− アルギニン９間の置換を有するが、アミノ末端に未変性アスパルチルアスパルテ ート残基も保有するＳ１サブユニット類似体を生成した。

Ｓｌ／Ｉ−４類似体とＳ　Ｉ／ｌの生物学的作用の評価細胞分裂、遠心分離、尿 素可溶化、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーを含む 方法によって、未変性配列の組換えＳ１蛋白質と類似体Ｓｌ／ｌ−４（上述のよ うにＡ　ｒｇ９−　Ｌ　ｙｓ置換と未変性配列のアスパルチルアスパルテートア ミノ末端残基を含む）とをＥ、ｅｏｌｊ生成細胞から個々に単離した。細胞ペー ストを２５ｎＭのトリス緩衝液（ｐ）１８．５）に懸濁し、高圧分裂（フレシチ プレス）によって溶解させた。溶解物を遠心分離にかけ、組換えＳ１蛋白質を含 む不溶性ベレットを８Ｍの尿素、２５１Ｍのトリス（ｐＨ１１，５）にｉＪ溶化 した。濃度５０μＭになるまでＣｕ　Ｓ　Ｏ４を添加した後、混合物を一晩撹拌 して組換えＳ１蛋白質の中にジスルフィド結合を形成させた。混合物を同量の８ Ｍの尿素ｓ　２５ｍＭのクエン酸ナトリウム（ｐＨ３４）で希釈し、８Ｍ尿素に おいてｐＨ３，８に平衡させたＳ−セファロースカラム（「高速流」）にかけた 。８Ｍ尿素、１２．５＋＋Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ３，８）においてＮａＣ （ｌの線形勾配を用いてカラムを溶離した。それぞれのカラムから先端部を幅広 く採集して、ｐＨ７，５に滴定した。これらのクロマトグラフィー断片のプール を２Ｍの尿素、１０１Ｍの燐酸カリウム（ｐＨ７，５）において平衡させたセフ ァクリルＳ−２００カラムに個々にかＩＪ、溶離材料のプールを収集したところ 、各種類（Ｓ　ｌ／１およびＳ　ｌ／１−４）の酸化単量体組換えＳ１蛋白質を 表した。精製したＳ１サブユニツト蛋白質を５ＤＳ−ＰＡＧＥおよびそれに続く ゲル内蛋白質の銀染色法によって分析した（第９図）。ゲル（１２，５％のアク リルアミド）を還元条件に晒した。レーン１、分子量規格（Ｐ　ｈａｒ■ａｃｉ ａ）。

レーン２、２μｇのＢ、　ｐｅｒｔｕｓｓｊｓホロ毒素（Ｌ　１ｓｔＢ　Ｉｏｌ ｏｇｊｃａｌ　Ｌ　ａｂｏｒａｔｏｒｌｅｓ）ｏ　レーン３％　０−２ｕＫのＢ 、　ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ　Ｓｌサブユニット蛋白質（Ｌ　ｔｓｔ　Ｂ　Ｉｏｌｏ ｇｉｃａｌＬ　ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）。レーン４、０．２μｇの組換えＳｌ ／１．　レーン５、０．２μｇの組換えＳ　１／１−４゜レーン６、ブランク。

レーン７．０．４ｕ　ｇのＳｌサブユニット蛋白質（Ｌ　Ｉｓ’）。レーン８、 ０６４μｇの組換えＳｌ／１．レーン９．０．４μｇの組換えＳ　２／１−４゜ この段階で組換え６１種は純度９０％以上であった。

ＳｌのＡ　ｒｇ９−Ｌ　ｙｓ変異の生物学的活性を評価するために、変異体類似 体と未変性配列の組換えＳｌ蛋白質とを関連させて百日咳ホロ毒性種にする必要 があった。高度に精製した百日咳毒素Ｂオリゴマー（毒素サブユニットＳ２．Ｓ ３．Ｓ４．Ｓ５の三元構造）がＣｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｌｏｌｏｇｌｃｓ　Ｅ ｖａｌｕａｔｉｏｎ　ａｎｄＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｆｏｏｄ　ａｎｄ　Ｄｒｕｇ　 Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎのり、　Ｂｕｒｎｓから提供された。２種類のＳ ｌｌサブユニットを下記の方法によりＢオリゴマーと個々に関連させてホロ毒素 分子（Ｓ　ｌ／ｌまたはＳ　ｌ／ｌ−４の何れかを含む）を形成した。等分子量 の組換え５ｌｔｉｉｉとＢオリゴマーを２Ｍの尿素、１０ｍＭの燐酸カリウム溶 液（ｐＨ７，５）において結合して、３７℃で３０分間温装した。未変性アクリ ルアミドゲルにおける電気泳動によってホロ毒素の形成を評価した（第１０図） 。ゲル１、組換えＳ　ｌ／１と未変性オリゴマー。ゲル２、組換えＳ　１／ｌ− ４と未変性Ｂオリゴマー。ゲル３、未変性Ｂオリゴマー。ゲル４、未変性Ｂ、　 ｐｅｒｔｕｓｓｉｓホロ毒素。

ゲル５、組換えＳ１八。これらのゲルが示すように、ホロ毒素種は未変性Ｂオリ ゴマーと組換えＳ　１／ｌまたは組換えＳ　ｌ／１−４の何れかとの組合せから 組立てられたものであった。

次に半組換えホロ毒素（Ｂオリゴマー＋　Ｓ　１／１または類似体Ｓ　１／１− ４）の検査を、試験管内でのチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞の集塊 応答を引出す能力に関して行なった。この応答は百日咳毒素の細胞変性の測定値 であることが証明されている。実験用標本と適当な対照標本をＣＨＯ細胞培養媒 体（１０％のウシ胎児血清を含むダルベツコ改質形イーグル培地）に希釈し、限 外濾過によって滅菌した後、９Ｇ穴のプラスチック培養皿において連続転移する ことによってさらに希釈した。はぼ５〜７Ｘ１０３の新たにトリプシン処理した ＣＨＯ細胞（アメリカ式培養物収集ＣＣＬ８１．ＣＨＯ−ＫＩＩＢ胞）をそれぞ れの穴に加えて、培養皿を５％Ｃ０２の中で３７℃で４８〜７２時間温置し間装 細胞単層をリン酸塩緩衝食塩水で洗浄してクリスタルバイオレットで染色し、光 学顕微鏡検査によって細胞集塊の有無を調べた。

第１１図はこのような分析の結果を示したものであり、特に興味がもたれるのは Ｓ　ｌ７１−４類似体に関連するパネルＧ、　Ｈ，Ｊの結果である。Ｓ　ｌ／１ −４類似体単独とＳ　１／１−４類似体およびＢオリゴマーから形成したホロ毒 素の１６００分の１希釈液が細胞集塊が無いことを示しているのに対し、２００ 分の１希釈液は相当量の集塊を示している。パネルＡは２００分の１緩衝希釈液 のみで処理した細胞である。パネルＢは２００分の１の希釈度のＢオリゴマーの みを用いての処理である。この希釈度ではある程度の集塊が認められるが、これ は精製後に残留する未変性Ｓｌサブユニットの汚染によるものである。パネルＢ は同一の穴（パネルｌ）の別の領域と比較することが可能であり、希釈度２００ 分の１のＢオリゴマー標品に集塊作用があることを明確に示している。パネルＣ は希釈度２００分の１の未変性工業用Ｓｌサブユニット（Ｌ　ｉｓｔ　Ｂ　Ｉｏ ｌｏｇｉｃａｌｓ）で処理した細胞である。

パネルＤは希釈度２０００分の１の未変性工業用百日咳ホロ毒素（Ｌ　１ｓｔ　 Ｂ　１ｏｌｏｇｉｃａｌｓ）であり、百日咳毒素が培地内のＣＨＯ細胞に対して 劇的な細胞変性効果をもつことを示している。パネルＥは希釈度２０００分の１ の未変性配列の組換えＳｌサブユニットである。パネルＦはＢオリゴマーと結合 して２０００分の１に希釈したＳ　Ｌ／ｌを示す。ＣＨＯ細胞集塊効果は未変性 ホロ毒素の場合と同じ程度に劇的であり、Ｂオリゴマーおよび組換えＳｌ蛋白質 とホロ毒素の関連を示す物理的ゲル結果（上記）を証明するものである。パネル ＧはＡｒｇ−Ｌｙｓ変異体Ｓ　ｌ／１−４自身はＣＩ（Ｏ細胞に対して何の効果 もないことを示している。パネルＨはＳ　１／１−４類似体とＢオリゴマーから 形成したホロ毒素の希釈度が１６００分の１の時、ＣＨＯ細胞の集塊が無いこと を示している。希釈度２００分の１　（パネルＪ）でＳ　ｌ／１−４含有ホロ毒 素のある程度の集塊が見られるが、類似体８１種が集塊効果に与える影響は、同 じ希釈度のＢオリゴマーに比較して無視し得るものであると考えられる（パネル り。

初期の実験は、ＣＨＯ細胞の集塊現象を引出すために必要な各種百日＃＠素種の 有効濃度を定量するために行なわれて来た。

これまでの結果から、工業用百日咳毒素も組換えＳ　１／１を含むホロ毒素も０ ．２５〜０．３０ｎｇ／ｍｌ程度の低濃度で細胞集塊を生じるのに対し、Ｓ　１ ／１−４類似体を含むホロ毒素は、集塊効果を引出すのに少なくとも１０〜２５ ｎｇ／ｍｌの濃度を要することが明らかになっている。

これらの結果は、百日咳毒素の細胞毒性効果がそのＳｌサブユニットの一部分の 中に存在し、その酵素作用と直接関係することを確認するのである。さらに重要 なこととして、これらの実験から、部位指向形変異誘発によって３導された特定 の組換え毒素サブユニットから、比較的毒性の低い百日咳毒素分子を形成するこ とができる。

本発明はこのような変更および改良を全て、請求の範囲１こ：己栽の本発明の範 囲に該当するものとして含むものとする。

ＦＩＧ、２Ａ １４）発見７４’Ｌｒ：　ＰＴＸ　’７７ユ＝シト　−ＦＩＧ、２Ｂ　ノーＰｉ 二＋Ｉｚ　ｐＴｘ　′７７ユニ・ｙＪ−ＢＣＤＥ ンＶヶ ム ＦＩＧ、３ ＡＢＣ 瓜・２両”η　イｄラ　（１Ｆ二　玖　珂１シ　ｉ）ｉ、Ｃ，片発棟ｇ較 ＴＣＡ−；Ｌ　殿Ｉ　ＣＰＭ　（Ｘ１０−３）６　８　８　＄　を 冒 ＝ 〉 １　−　“　ア ρ　壬　、　６ ■　１　琴 ヨ　４′ 〉　ミ　筺　≧ ン 、＼ｔ　？ へ 試 平成元年５月１Ｇ日 特許庁長官　古　１）文　毅　殿 １、事件の表示　ＰＣＴ／ＬＩＳ　８８１０２９８３２、発明の名称　組換え型 ＤＮＡ由来ＢＯｒｄｅｔｅ　Ｉ　ｌ　ａ毒素サブユニット類似体 ３８補正をする者 事件との関係　特許出願人 名　称　アムジエン・インニーボレーテッド４、代　理　人　東京都新宿区新宿 １丁目１番１４号　山田ビル５、補正命令の日付　自　発 ６、補正の対象　明細書の翻訳文及び請求の範囲の翻訳文７、補正の内容 （１）鮮明な明細書の翻訳文を別紙の通り補充する。

（内容に変更なし。） 国際調査報告

Claims (34)

【特許請求の範囲】
1. １．ボルデテラ属菌（Ｂｏｒｄｅｒｅｌｌａ）外毒素のサブユニットＳ１をコー ドする少なくとも１つの部分または該部分のフラグメントもしくは誘導体を含む 塑換えＤＮＡ分子であって、前記部分またはフラグメントもしくは誘導体が、（ ａ）毒素中和レベルの抗体を誘発することが可能で（ｈ）毒素反応原性と関連す る酵素活性を含まない生物学的活性を有するポリペプチドをコードしていること を特徴とする組換えＤＮＡ分子。
2. ２．前記ポリペプチドをコードしている前記部分が更に、百日咳菌毒性に対する 免疫防御を与える既知の重要な主要エピトープを含むことを特徴とする請求項１ に記載の組換えＤＮＡ分子。
3. ３．前記毒素中和レベルの抗体が百日咳菌毒性に対する免疫防御を与えることを 特徴とする請求項１に記載の組換えＤＮＡ分子。
4. ４．前記（ｂ）の生物学的活性が、実質的に酵素不活性のサブユニットＳ１のア ナログを生じる部位特異的突然変異誘発によって得られることを特徴とする請求 項１に記載の組換えＤＡＮ分子。
5. ５．前記Ｓ１サブユニットが、両端のバリン及びプロリンを含むバリン７からプ ロリン１４までの領域のＳ１サブユニットの部位特異的突然変異を含むことを特 徴とする請求項４に記載の組換えＤＮＡ分子。
6. ６．前記部位特異的突然変異がアルギニン９部位で生じることを特徴とする請求 項５に記載の組換えＤＮＡ分子。
7. ７．アルギニン９がリシンで置換されていることを特徴とする請求項６に記載の 組換えＤＮＡ分子。
8. ８．前記ボルデテラ属菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）外毒素が、百日咳菌（Ｂ．ｐ ｅｒｔｕｓｓｉｓ、パラ百日咳菌（Ｂ．ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）及び気管 支敗血症菌（Ｂ．Ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）から成るグループから選択さ れることを特徴とする請求項１に記載の組換えＤＮＡ分子。
9. ９．（ａ）毒素中和レベルの抗体を誘発することが可能で、（ｈ）毒素反応原性 と関連する酵素活性を含まない生物学的活性を有することを特徴とするボルデテ ラ属菌外毒素Ｓ１サブユニットのアナログ。
10. １０．前記アナログが更に、ボルデテラ属菌毒性に対して免疫防御を与える既知 の重要な主要エピトープを少なくとも１つ含むことを特徴とする請求項９に記載 のアナログ。
11. １１．前記毒素中和レベルの抗体がボルデテラ属菌毒性に対する免疫防御を与え ることを特徴とする請求項９に記載のアナログ。
12. １２．前記（ｂ）の生物学的活性が、実質的に酵素不活性のアナログを生じる部 位特異的突然変異誘発によって得られることを特徴とする請求項９に記載のアナ ログ。
13. １３．前記Ｓ１サブユニットが両端のバリン及びプロリンを合むバリン７からプ ロリン１４までの領域のＳ１サブユニットの部位特異的突然変異を含むことを特 徴とする請求項１２に記載のアナログ。
14. １４．前記部位特異的突然変異誘発がアルギニン９部位で生じることを特徴とす る請求項１３に記載のアナログ。
15. １５．アルギニン９がリシンで置換されていることを特徴とする請求項１４に記 載のアナログ。
16. １６．前記ボルデテラ属菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）外毒素が、百日咳菌（Ｂ． ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、パラ百日咳菌（Ｂ．ちｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）及び 気管支敗血症菌（Ｂ．Ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）から成るグループから選 択されることを特徴とする請求項９に記載のアナログ。
17. １７．前記アミノ末端がメチオニルバリル配列を含むことを特徴とする請求項９ に記載のアナログ。
18. １８．第７図に示すアミノ酸配列を含むことを特徴とするボルデテラ属菌外毒素 サブユニットＳ１のアナログ。
19. １９．（ａ）毒素中和レベルの抗体の誘発が可能で、（ｂ）毒素反応原性と関連 する酵素活性を含まない生物学的活性を有するボルデテラ属菌外毒素の遺伝子工 学的に作製されたサブユニットＳ１を含む改良ワクチン。
20. ２０．前記サブユニットＳ１が、ボルデテラ属菌毒性に対する免疫防御を与える 少なくとも１つの主要エビトープを含むことを特徴とする請求項１９に記載の改 良ワクチン。
21. ２１．前記毒素中和レベルの抗ガボルデテラ属菌毒性に対する免疫防御を与える ことを特徴とする請求項２１に記載の改良ワクチン。
22. ２２．前記（ｂ）の生物学的活性が、実質的に酵素不活性のサブユニットＳ１の アナログを生じる部位特異的突然変異誘発によって得られることを特徴とする請 求項１９に記載の改良ワクチン。
23. ２３．前記部位特異的突然変異誘発が、両端のバリン及びプロリンを含むバリン ７からプロリン１４までの領域を指向することを特徴とする請求項２２に記載の 改良ワクチン。
24. ２４．前記部位特異的突然変異誘発がアルギニン９部位を指向することを特徴と する請求項２３に記載の改良ワクチン。
25. ２５．アルギニン９がリシンで置換されていることを特徴とする請求項２４に記 載の改良ワクチン。
26. ２６．前記ボルデテラ属菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌ）外毒素が、百日咳菌（Ｂ．ｐ ｅｒｔｕｓｓｉｓ）、パラ百日咳菌（Ｂ．ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）及び気 管支敗血症菌（Ｂ．Ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）から成るグルーブから選択 されることを特徴とする請求項１９に記載の改良ワクチン。
27. ２７．更に、前記ボルデテラ属菌外毒素の前記サブユニットＳ２、Ｓ３、Ｓ４及 びＳ５並びにその混合物を少なくとも１つ含むことを特徴とする請求項１９に記 載の改良ワクチン。
28. ２８．ボルデテラ属菌外毒素の前記サブユニットＳ２、Ｓ３、Ｓ４及びＳ５並び にその混合物の少なくとも１つが遺伝子工学的に作製されたことを特徴とする請 求項２５に記載の改良ワクチン。
29. ２９．前記遺伝子工学的に作製されたサブユニットＳ２、Ｓ３、Ｓ４及びＳ５が 、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）酵母菌（Ｓ．ｃｅｒｉｖｉｉｓｉａｅ）、ネズミチフ ス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｙｉｍｕｒｉｕｍ）、チフス菌（Ｓａｌｍ ｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉ）、バチルス菌（Ｂａｃｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．）及び ワクチニア（ｖａｃｃｉｎｉａ）から成るグルーブから選択された組換え宿主中 で非融合タンパク質として発現されることを特徴とする請求項１９に記載の改良 ワクチン。
30. ３０．前記遺伝子工学的に作製されたサブユニットＳ２、Ｓ３、Ｓ４及びＳ５が 、毒素中和レベルの抗体を誘発する能力を維持しているサブユニットＳ２、Ｓ３ 、Ｓ４及びＳ５のアナログを含むことを特徴とする請求項９に記載の改良ワクチ ン。
31. ３１．ボルデテラ属菌外毒素のサブユニットＳ２をコードする少なくとも１つの 部分または該部分のフラグメントもしくは誘導体を含み、該フラグメントまたは 誘導体が、サブユニットＳ２のメチオニン成熟アナログであるペプチドをコード していることを特徴とする組換えＤＮＡ分子。
32. ３２．ボルデテラ属菌外毒素のサブユニットＳ３をコードする少なくとも１つの 部分または該部分のフラグメントもしくは誘導体を含み、該フラグメントまたは 誘導体が、サブユニットＳ３のメチオニン成熟アナログであるペプチドをコード していることを特徴とする組換えＤＮＡ分子。
33. ３３．ボルデテラ属菌外毒素のサブユニットＳ４をコードする少なくとも１つの 部分または該部分のフラグメントもしくは誘導体を含み、該フラグメントまたは 誘導体が、サブユニットＳ４のメチオニン成熟アナログであるペプチドをコード していることを特徴とする組換えＤＮＡ分子。
34. ３４．ボルデテラ属菌外毒素のサブユニットＳ５をコードする少なくとも１つの 部分または該部分のフラグメントもしくは誘導体を含み、該フラグメントまたは 誘導体が、サブユニットＳ５のメチオニン成熟アナログであるペプチドをコード していることを特徴とする組換えＤＮＡ分子。