JPH03505209A

JPH03505209A - 標的付与されたオリゴヌクレオチド類の合成に使用できるヌクレオシド誘導体類、これ等誘導体類から得たオリゴヌクレオチド類及びそれ等の合成

Info

Publication number: JPH03505209A
Application number: JP1507487A
Authority: JP
Inventors: ロジェ，アンドレ; テウール，ロベル; バザン，ヘルヴェ
Original assignee: コパニー・オリ・インダストリー・ソシエテ・アノニム
Priority date: 1988-06-20
Filing date: 1989-06-19
Publication date: 1991-11-14
Anticipated expiration: 2013-12-14
Also published as: WO1989012642A1; DE68906890D1; AU3866089A; FR2632955B1; DE68906890T2; FR2632955A1; EP0422090A1; JP2835630B2; EP0422090B1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】標的付与されたオリゴヌクレオチド類の合成に使用できるヌクレオシド誘導体類、これ等誘導体類から得たオリゴヌクレオチド類及びそれ等の合成〔産業上の利用分野〕本発明と標的付与され（ｍａｒｋｅｄ）或いは標識付けされた（ｌａｂｂｅｌｅｄ）オリゴヌクレオチド類の合成に使用するヌクレオシド類の誘導体類並びにこれ等誘導体類から得たオリゴヌクレオチド類及びそれ等の合成に関する。

〔従来の技術〕

標的付与されたオリゴヌクレオチド類例えば核酸消息子（ｐｒ−ｏｂｅ）類は遺伝子の及び感染症の病気、癌及び細胞型の決定のような種々の分野で非常に興味ある診断手段となっている。

これ等の診断手段はハイブリダイゼーション法の利用、すなわち、２本の相補的な核酸鎖（ＤＮＡ或いはＲＮＡ）の水素結合による会合の利用に基づいている。

それ故この反応は２本のＤＮＡ鎖、ＤＮＡ鎖とＲＮＡ鎖或いは２本のＲＮＡ［に間する反応である。該反応を通じて、チミン（或いはＲＮＡの場合にはウラシル）はアデニンと対を形成し、シトシンはグアニンと対を形成する。該二重鎖ら線の形成はｐＨ、ナトリウムイオン濃度、反応温度及び反応時間のような物理化学的要素によって影響をうける０診断法に用いる場合標的すなわち決定さるべき生物学的試料の配列と相補的な配列を持つオリゴヌクレオチド消息子を利用する。

更に消息子を探し当てるために、消息子には適当な標識付与或いは標的付与をする要素を付ける。この要素は放射線的に、免疫酵素的に、発色的に、蛍光的あるいは発光的な方法によって探し当てることができる。

非放射線的標的付与を利用する場合には、消息子を利用する前に化学的或いは生化学的生成法を用いて標的付与したヌクレオチド消息子を直接的に合成することができる。しかしながら、標的付与を放射線的におこなう場合には、消息子に標的付与要素を導入することは即座的におこなわなければならない。

標的付与されたオリゴヌクレオチド類を作るための生化学的生成法にあって、ランガー等は自然科学アカデミ−協会専門誌（米国）生化学部門１９８１．１１月号７８巻第１１号６６３３〜６６３７頁（Ｌ−ａｎｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ：　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ、ＵＳＡ、　ｖｏｌ、　７Ｂ＋　ｎｏ、１１゜ｐｐ６６３３〜６６３７．　Ｎｏｖｅｍｂｅｒ　１９８Ｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　）において、種々のＤＮＡ或いはＲＮＡポリメラーゼ類を用いてポリヌクレオチドにビオチンを用いて標的付与をする作成法とビオチンがウラシル部分にアリルアミン結合を用いて連結されている。ウラシル部分を含んでいるヌクレオシド誘導体を作成する方法とについて記載している。この方法はしかし短かい消息子頻にｔｓ識づけする場合には適しないというのが重大な欠点である。

ムラスギ等は核酸３巻第３号２６９〜２７７頁（１９８４）　　（ＤＮＡ。

ｖｏｌ、３．ｎｏ、３．１９８４．　ｐｐ、２６９〜２７７　）に、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｂｉａｃｏｌｉ）のＤＮＡポリメラーゼＩの存在下にウリジン三燐酸のビオチン化誘導体を含んでいる２つのオリゴヌクレオチドと３つのヌクレオシド誘導体の反応を利用してビオチンで標的付与されたオリゴヌクレオチド消息子類を作成することを記載している。ここで２つのオリゴヌクレオチドを用いて反応する場合に一つを大過剰に用いることには興味がある。更に、標的付与或いは標識付与の収率は、オリゴヌクレオチド消息子の中に一箇ある。

ヨーロンパ特許公開第０６３８７９号公報［ＥＰ−Ａ−０６３８７９）（エール大学）にはプリンの８位或いはピリミジンの５位が、ポリペプチドを用いて検出できる錯体形成能のある基（ｒａｄｉｃａｌ）で置換されているプリン或いはピリミジンを含有しているヌクレオシドの誘導体について記載している。この誘導体は酵素的に重合するオリゴヌクレオチドの合成に使用することができる。

国際特許公開−〇−８８０５９３［ｆｌｏ−Ａ−８８０５９３］　（バストウール研究所（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　Ｐａ５ｔｅｕｒ））にはアデノここの８位にビオチン化した２′−デオキシアデノシン誘導体が記載されている。

この誘導体もまた酵素的オリゴヌクレオチドに組み込むことができる。

先の場合と同様、この誘導体もオリゴヌクレオチドの３′の位置にしか標的付与ができない。更にこの誘導体は自動ヌクレオチド合成機では取扱えない。

ビオチン化ヌクレオチドは酵素学手法６５巻４３〜６２頁（１９８０）（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、　ｖｏｌ、６５．１９８０．　ｐｐ、４３〜６２）にウー（ｗｕ）によって記載されている方法に従ってデオキシヌクレオチジル基転移酵素で移動する末端を用いて組み込むことができる。

この方法は短鎖のオリゴヌクレオチド消息子に（一般に３箇から５箇の）ビオチンを組み込むことができるので興味深い方法である。この標識付与には、オリゴヌクレオチド合成に続いて副次的過程が必要である。種々の大きさの生成物の複雑な混合物が得られるので、明らかに一定の融点を持つ消息子を得るように分離しなければならないので明らかに一定数の標的付与基が組み込まれた消息子を作成するのがむづかしい。二重に標的付与或いは標識付与をおこなうことはずっと困難なことであると思われる。更に標的付与はやはり３′位置にしかできない。

化学的方法にあって、合成が終り、オリゴヌクレオチドの保護基をはづした後に鎖の末端で標的付与をおこなう方法がある。

この方法はオリゴヌクレオチドの酵素側（Ｏｓｉｄｅ）部分に核酸研究誌−１３巻第５号１５２９〜１５４０頁（１９８５）　ｌ：Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａ−ｒｃｈ、　ｖｏｌ、１３．　ｎｏ、５．１９８５．　ｐｐ１５２９　１５４０）にＡ、ＣｈｏｌｌｅＬによって記載されている方法で標的付与基を固定する方法である。

この方法を使用することはオリゴヌクレオチド当り単一の標的付与分子を固定するように導き、オリゴヌクレオチド合成に引続いて、該標的付与基を付ける付加的な化学反応段階が必要であるという主要な欠点を持っている。オリゴヌクレオチドに結合している標的付与基の数を増すために、合成し、その保護基をはずした後オリゴヌクレオチド基に標的付与基を結合するために、ローデュ（Ｒｏｄｕｉｔ）等がヌクレオシド及びヌクレオチド誌６　（１＋２＞巻３４９〜３５２頁（１９８７）　　（Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ　＆　Ｎｕｃｌｅｏｔ−４ｄｅｓ、　　６　（１＋２）、ｐｐ、３４９〜３５２．１９８７　〕に記載している方法に従って工夫がなされて来た。この場合数ケの標的付与基を結合することができるが、オリゴヌクレオチド類の決ったヌクレオチドの上に異った標的付与基を確定的に結合することはできていない、更にその上標的付与の効率は６０％以下に留まっている。

ビオチンを標的付与基にしたオリゴヌクレオチドを作成する今一つの方法がキルチェク（Ｋｉｅｒｚｅｋ）等によってヌクレオシド及びヌクレオチド６　（１＋２）巻４０３〜４ｏ５頁（１９１８７）　［Ｎｕｃｌｅｏｓ−ｊｄｅｓ　＆　Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、　　６　（１＋２）、　Ｉ）Ｉ）４０３−４０５．１９８７　）及び国際特許公開−〇−８６０６７２６　（同−Ａ−８６０６７２６）に記載されている。

この場合には、オリゴヌクレオシド合成はオリゴヌクレオチド合成中に使用した機能性を持つヌクレオシド誘導体並びにシチジンに結合している−（ＣＨり　、 −Ｎｕ−Ｒ結合（Ｒはトルフルオロ酢酸基のような保護基を表わす）を持つヌクレオシド誘導体を利用してオリゴヌクレオチド合成をおこなう。

合成の終点で、保護基はづしをおこなった後にビオチンをレチジン結合のところ組み込む方法であるから参照した公知文献にあるように違って標的付与基を使用することはできない、同じように、オリゴヌクレオチド合成を終了して保護基をはづしてから種々の化学反応をおこなう必要がある。この化学反応はオリゴヌクレオチド合成装置にかけて自動で反応をおこなうことはできない。

国際特許公開−〇−８４０３２８５号四〇−Ａ−８４０３２８５］に標識付与したオリゴヌクレオシドの製造法が記載されている。この場合ヌクレオシドの誘導体から出発している。このヌクレオシドの塩基には標的付与基と反応することができる置換基があり、標的付与はオリゴヌクレオチド合成の次におこなわれる。

加えるにタック等の文献核酸研究１６巻第９号４０７７〜４０９５号（１９８８）　　［Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　ｖｏｌ、　１６＋　ｎｏ、９＋　１９８８゜ｐｐ、４０７７−４０９５）に示されるように、オリゴヌクレオチド合成の前或いは後どちらでもビオチンを導入する２捧の方法があるけれども、ビオチンと、オリゴヌクレオチド合成に使用する反応薬との間に不都合な反応が起り昌いので合成の後でおこなうことを推せんする。

従って標的付与或いは標識付与したオリゴヌクレオチドの合成として現実によく知られている製造法ではよい条件の下でもオリゴヌクレオド鎖の完全に決まっている位置に、特に５′の位置に、１つ或いはそれ以上の標的付与基分子を導入すること及び異った標的付与基によって鎖の標的付与をおこなうことはできない。

更に、多くの場合現実に、オリゴヌクレオチド合成をおこなった後で補助的に反応する必要があるという不利益な要求が起り、そのため標的付与するオリゴヌクレオチドの直接合成が自動的にはおこなえなくなる。

〔発明が解決しようとする課題〕

本発明は上記した合成法の欠点を回避し得る、標的付与されたオリゴヌクレオチド類の合成に有用なヌクレオド類の誘導体に関するものである。

それ故事発明は特に下記の式に合致する特徴を有する標的付与されたオリゴヌクレオチドの合成に有用なヌクレオシド誘導体に関する。

〔課題を解決するだめの手段〕

図においてＲ１は水素原子或いはヌクレオチド合成に適する酸性媒体中で不安定な基を表わし、Ｒ２は水素原子、保護基、オリゴヌクレオチド合成に適する機能性基、或いは酸素原子をはさんで結合しているオリゴヌクレオチド合成に有用な支持体（ｓｕｐｐｏｒｔ）を表わし、Ｒ３は水素原子、水酸基或いは保護された水酸基を表わし、Ｂは次の式で表わされるプリン或いはピリミジン塩基から誘導される基を表わす。

図においてＲ５はＨ，ＣＨｓ、或いはＲ’Ｚを表わし、Ｒｈは水素原子或いはＲ’Ｚ群を表わし、弐Ｂで表わされる基は弐■の基の位置し或いは弐■、及びＶの基の９位置でＮによって酸素側部分に向って結合しているＲ４は一重結合或いは次の式で表わされる各基から選ばれた炭化水素基を表わす。

Ｎ）Ｉ　（ＣＲｔ）、１−Ｘ−（ＣＬ）　、−ＮＨ（Ｃ）Ｉｚ）−−Ｘ−（Ｃ）Ｉｚ）ｐ−ＮＨ−０−（ＣＨｚ）−−Ｘ−（ＣＨｔ）　ｐ−−０−（ＣＨ，）、 −Ｘ−（ＣＨｌ）、−Ｎｌ（−５−（ＣＨｔ）　、１−Ｘ−（ＣＨり　ｐ−５− （ＣＨｔ）　−−Ｘ−（Ｃ）Ｉｔ）　ｐ−Ｎｏ−−ＮＨＣＯ−（Ｃ）１２）、− Ｘ−（Ｃ）１ｇ）ｐ−−ＮＨＣＯ−（Ｃ）ｌりｊ−Ｘ−（ＣＨり、−ＮＨ−ＮＨ３Ｏｔ−（ＣＨｚ）　、１−Ｘ−（ＣＨｚ）　ｐ−−Ｎ）ＩｓＯ□−（Ｃｕｔ）　、−Ｘ−（ＣＨｚ）−ＮＨ−＝（ＣＨＩ）　、Ｘ−（ＣＨｚ）　ｐ−−（ＣＨ２）、−Ｘ−（ＣＨ２）ｐ−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨｚ）Ｒ−Ｘ−（ＣＨｚ）ｐ−ＣＤ−（Ｃ）Ｉ２）−−Ｘ−（ＣＨｔ）　ｐ−ＮＨ−ここでｎは１から６の間の整数、ｐは０か或いは１から６の整数、ｐはＯから或いは１から６の整数、ＸはＣＨｚ　、Ｏ５Ｓ、ＮＨｌＣＯｌＨＣ＝　Ｃ）Ｉ−１（ＣＩ（ｔ）−Ｚ　、　（ＣＨｚ）ｒＮＨｚ　、　：；Ｃ＝Ｃｔｌ（ＣＬ）ｒＺ　。

；Ｃ＝ＣＨ（ＣＨり、ＮＨ２、／Ｎ（ＣＭ、）、Ｚ　、ンＮ（ＣＨｚ）−ＮＨｚ、；ＣＨ−０（ＣＨ２）、Ｚ　、　ンＣ１ｌ−０−（Ｃ１ｈ）、Ｎｏ２　、　；ＨＣ５（Ｃ）１ｍ）、Ｚ　。

Ｉｃ５（ＣＨｚ）、ＮｏＺ　、ここでｒは１から６の整数である。

Ｚはペブチッド合成に有用な保護基、或いは標的付与基として有用な分子群から選ばれた標的付与をする分子、及び該分子の先駆体から誘導される基、ＺはＲ２が結合長さを伸ばす腕部分を持つ結合を有する支持体である時は保護基を表わすと定められている。

それ放光に参照したヌクレオシド誘導体は、種々の形式の標的付与分子を付加できる。直接検知し得る標的付与分子を使用することも可能で、例えばそれは蛍光或いは燐光を発する標的付与基であり、他の分子に強い親和性を持つ抗原分子或いはその誘導体を用いることが可能である。

例えば直接的に検知し得る標的付与分子にはアビジン或いはストレフタビディン（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）と結合し得る分子、抗原−抗体型の反応を誘起し得る分子或いは蛍光発光或いは紫外可視光を発する性質を持つ分子などがあり得る。

又、使用する時にその場で放射性元素を付加できる標的付与分子の使用することもできる。この場合、放射性原子を使用するに当って放射性原子の半減期からの理由及び原子が誘起する放射線分解反応のために使用に当って上手くこれらの標的付与分子を導入することは困難である。加えて、本発明の方法によれば、かかる場合標的付与される分子として、放射性元素、例えば放射性ヨウ素を用いて、後工程として標的付与し得る分子、そのような標的付与分子を使用する。

本発明の方法によるヌクレオシド誘導体では、他の標的付与分子を使用し得る。

特に便利なのは免疫学的分野の抗原、抗体一般的な合成法でオリゴヌクレオチドを合成する場合に同調性基質（ｓｙｎｔｈｏｎｓ）としてこの種のヌクレオシド誘導体を利用することが多くの利点をもっている。

ヌクレオシドのこの種の誘導体（同調性基質）は安定で自動オリゴヌクレオチド合成の場合にしばしば利用されている誘導体に比べ得る程の安定性を持ち、すべての自動合成の操作を受けても変質することはなく市販されているヌクレオシド誘導体を使用した場合に比べ同等遜色のない反応性を持っている。

ただ、従来技術の場合と異って本発明の誘導体は、すでに標的付与元素を付加されているヌクレオシド誘導体を使用するために、通常のオリゴヌクレオチド合成の場合のように、副次的な工程を必要とせず直接的に速やかに標識消息子を作成することができる。このため合成操作は簡単で、最終収率がよい。

僅か６分間で標的付与分子を付加することができしかも自動反応機でおこなえる。これに対して従来の技術では標的付与分子を付加するのに１日或いは２日が必要である。

標的付与分子を持つ誘導体を付加する工程の収率はどの工程も１００％に近い、これに対して、従来の他の方法は収率がもっと低い、このような場合化学反応でオリゴヌクレチドを合成した後で精製をする必要がある。

多くのオリゴヌクレオチド合成の場合と同じように、標識消息子を作成する場合自動化することができる。

オリゴヌクレオチド鎖に何ヶの目標づけ分子をどの位置につけるかに関して、完全に明確に決まった位置に１ヶ或いはそれ以上の標的付与分子を導入することができる。

更には、同じオリゴヌクレオド鎖の複数の異った標的付与分子を夫々の導入位置に付加して、しかも高純度のオリゴヌクレオチドを得ることができる。

本発明の方法によるヌクレオシドの誘導体は、放射性原子を使用することに対してもよく適合する、なぜならばヌクレオチドの合成中に放射線元素で容易に標的付与される分子をヌクレオシド誘導体に付けて、それをヌクレオチドに組み込んだ後、ヌクレオチドを使用する直前に放射線元素を導入し得るからである。

例えば、標的付与分子がアビジン或いはストレフタビジンと結合し得る分子である時には、基Ｚは次に示す分子式で表わされる。

（■）　　　　　　　　　　　　（■）（■）　　　　　　　　　　　　（■）二二でｓ−４，５，６或いは７、ｔ−３，４，５，６或いは７そしてＲ７はアルキル基である。

これらの基にあって、ｓ−４の分子式（Ｖｌ）の基はビオチンから誘導され、従ってアビジンに強い親和性をもっている。

例えば、目標づけ分子が、抗原−抗体型の反応をおこなう分子であるならば、その時Ｚは次の式で表わされる。

例えば目標づけ分子が蛍光発光性である場合には、Ｚは次のＸＸ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ＸＸＩＸＸｎ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ＸＸＩここでＲＩ５および１７１６は今でも異っていてもよく、水素原子かアルキル基である。

標的付与分子がヨードで標的付与され得る分子であるときは、１ヶ以上のフェノール、或いは第１級、第２級或いは第３級の芳香族アミン機能を持つ分子を用いる。この場合Ｚとして次の式に従うものを使用する。

およびここでｕ＝Ｑ、あるいは１〜６の整数、Ｖ−０，１或いは２、ｗ＝３．２或いは１但しｖ＋ｗ−３である。

Ｒ１は水素原子或いはアシル基ＹはＣＨｚ　、ＮＨ，ＯｌＳ、Ｃ０１ＳＯ，、Ｃ０ＮＨ或いはＳＯ，ＮＨである。

アシル基は例えばアセチル基である。

本発明では、Ｒ２が結合長さを伸ばす腕部分を持つ結合を有する支持基である時には、Ｚは又Ｒ４を保護する基を表わす。この保護基はペプチド合成において使用される保護基の一つ、例えばトルフルオロアセチル基であってよい。Ｆｍｏｃのように保護基として使用できる他の基についてローデュ（Ｒｏｄｕｉｔ）等がヌクレオシド及びヌクレオチド誌６巻１号２号合併号３４９〜３５２頁１９８７年（Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ　＆　Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、　１９８７，６　ｎｏ、１ａｎｄ２＋　ｐｐ。

３４９〜３５２．）に記載している。これらの基もまたＲ４が一本鎖結合である場合に、オリゴヌクレオチド合成に当って使用できる保護基である。

かかる保護基の例としてはベンゾイル、アニソ−イル、イソブチリル基があり、ヨーロンパ特許公開第０２４１３６３号公報（ＢＰ−Ａ−０２４１３６３）に記載されているものと合せて使用できる。

本発明によれば式■及び弐■の基の場合にはベンゾイル基が弐Ｖの基の場合にはイソブチリル基を使用することが好ましい。

本発明のヌクレオシド誘導体においては、プリン塩基或いはピリミジン塩基から誘導される（式１における）Ｂ基は弐■及び弐Ｖの基の場合にはプリン塩基から誘導される基の２．６及び／或いは８の位置にあるいくつかのＲ’Ｚ基を、或いは弐■の基の場合にはピリミジン塩基から誘導される基の４．５或いは６の位置にあるいくつかのＲ’Ｚ基を持つことができる。

本発明のヌクレオシド誘導体は特に標的付与されたヌクレオチドの合成に当って同調的基質の型として使用することが望まれる。この場合Ｒ１基はヌクレオチドの合成に適する酸性媒体中では不安定な基であり、Ｒ２基はヌクレオチド合成に適するｌＩ能性基である。Ｒ３が水素原子であるか、保護されていても、いなくてもよく、どちらの水酸基であるかによってＤＮＡ型か或いはＲＮＡ型のオリゴヌクレオチドが得られる。

Ｒ１の形として使用できる、酸性媒質中で不安定な基の例としては特にフェニル −９−ザンテニル基及び次の式のトリチル基が挙げられる。

ここでＲ９、ＲＩＯおよび）１＋１　は同しでも異っていてもよく、水素原子、アルキル、アルコキシ或いはアミノ基を表わす。

Ｒ１はメトキシ−或いはジメトキシ−トリチル基、或いはＲ９或いはＲ９とＲｌｅがメトキシ基である式ＸＸ■で表わされる基であることが好ましい。

オリゴヌクレオチドの合成の場合にＲｔ基がオリゴヌクレオチド合成に適する機能的基、例えばオリゴヌクレオチドの燐酸トリエステル（ｐｈｏｓｐｈｏｔｒｉｅｓｔｅｒ）、燐酸ジエステル（ｐｈｏｓｐｈｏｄｉ−ｅｓ　ｔｅｒ）、燐酸アミド（ｐｈｏｓｐｈｏｒａ＋ｎ１ｄｉｔｅ）或いはホスホン酸エステル（ｐｈｏｓｐｈｏｎａ　ｔｅ）合成に使用する燐基或いは＋１”Ｃｏ基である。

ここでＲ＋ｚは支持基に結合し易い、選択的にアルキルアミノ鎖を媒介として結合する結合鎖を表わす。

ここで使用する燐基の例は次の式で表わされる基である。

ここでＲ′及びＲ’は、お互に関連なく別々に、炭素数１０までのアルキル基、アラルキル基或いはシクロアルキル基を表わすか、或いはＲ′とＲ′とで炭素数５までのアルキレン鎖を形成するか或いは窒素原子と併せて、共に、ヘテロ環を形成する、ここでヘテロ環にはＮ、０及びＳから選ばれたヘテロ原子の１つ或いはそれ以上を含むことができる。

Ｒ′及びＲ′は関連なく別々の基である時には、それ等の基はイソプロピル、Ｌ −ブチル、イソブチル、２級ブチル、ネオペンチル、３級ペンチル、インペンチル、或いは２級ペンチル基の如き低級アルキル基であることが好ましい。Ｒ′及びＲ′が窒素原子と共にヘテロ環を形成する場合には、ピロリジン、モルホリン或いはピペリジン基であることが好ましい。

例えばＲ２は次の式で表わされる基である。

ＮＣＣＨｚＣ）ｌｔｏ　　Ｐ　　Ｎ　［ＣＨ（ＣＨ３）　ｚ］□オリゴヌクレオチドの合成に際してＲ２は又酸素原子と共に結合長さを伸ばす腕部分となる結合を持っている支持体となっていることもある。

この支持体には種々の型式がある。一般的には無水珪酸で形成されており、５０〜１１００ｕの直径に調整された粒状をしている。

伸びた腕は、支持体にヌクレオシドを固定している。この腕は例えば、コハク酸のような二価の酸から誘導された基でヌクレオシドの酸素原子と、基とを結合する基のようなアルキルアミノ鎖から形成されている。

Ｒ３が保護されている水酸基である時には、リボヌクレオチドの合成に使用して便利な基が該水酸基の保護基となっている。

Ｒ１が保護基で、Ｒ２がヌクレオチドの合成に適した機能性基である、弐（１）の構造をもったヌクレオシドの誘導体類は、これまで説明して来たように、直接検出できる分子或いは通常の方法で、検出できる分子に変換できる分子からなる少くとも一ヶの標的付与分子を有する′ヌクレオチドの直接的な化学的合成をするのに使用できる。

この化学的オリゴヌクレオチドの製造はＲ２が弐（ＸＸ■）の基である時には燐酸トリエステル合成によるか、Ｒ１が式（ＸＸ■）或いは（ＸＸＩＸ）の基である場合には燐酸アミド合成によって、また或いはＲ２が式（ＸＸＸ）の基である場合にはホスホン酸合成によって製造される。この合成は溶液中でおこなう方法か或いは支持体で合成するか何れかの方法でおこなわれるが、支持体上で合成する方法が選択され、現在では最もよい結果を得ている。

本発明のオリゴヌクレオチド合成法は数回の縮合サイクル（くり返し工程）を実施することから成り、各サイクルで、ヌクレオシド誘導体がヌクレオシド誘導体に縮合するか、オリゴヌクレオチドと縮合することから成り、少なくとも使用されたヌクレオシド誘導体のうちの一つは次の式に合致するヌクレオシド誘導体であることに特徴がある。

ここでＲ１は酸性媒体中で不安定な基であり、Ｒ２はヌクレオチド合成に通した機能性基であるか、或いは、長く伸びた腕を持つ結合で酸素原子と結合するヌクレオチド合成に使用される支持体を表わしている。

Ｒ３は水素原子、水酸基或いは保護されて水酸基を表わしＢは以下に示す意味を有する。

本発明に従って、種々のＺを持ったいくつかのヌクレオシド誘導体を、上記した合成工程で用いた場合に、標的付与されたオリゴヌクレオチドが得られ、そこで得られたオリゴヌクレオチドは、従来の合成技術を用いてはできなかった、種々の標的付与基を有するオリゴヌクレオチド鎖を持っている。

加えて、本発明によって種々のヌクレオチドのくり返し単位を持ち、その単位には少なくとも２つのヌクレオチド単位が異った標的付与基を持っているか或いは鎖の５′末端に位置する相隣る２つのヌクレオチドが標的付与分子で標的付与されているか、或いは標的付与分子の前駆体であるような単位が含まれている標的付与されたヌクレオチドが得られる。

、　本発明によって得たヌクレオチド誘導体はそれ故、例えばビオチン成るいは、その類似体の一つで標的付与された、ダンシル（ｄａｎｓｙｌ）或いはピレンスルフォニルのような蛍光性誘導体或いはジニトロフェニルのような抗原性試薬で標的付与された、冷消息子（ｃｏｌｄ　ｐｒｏｂｅ）を作成するのに使用できる。

これ等のヌクレオシド誘導体はまた、標的付与する分子、或いは出発、ヌクレオシド誘導体に用いられている分子Ｚに放射性ヨードで特に標的付与できる消息子を作成するために使用できる。

本発明のヌクレオシド誘導体はプライヤー（ｐｒｉｍｅｒｓ）、例えばＰＣＲ型増巾法の合成に用いることができる。

本発明は文種々のヌクレオチドのくり返しの中に、次の式の基の中から選ばれた基（車）で標的付与されたヌクレオチドの少くとも一つを含んでいる標的付与されたオリゴヌクレオチドを得ることに関する。

ここで、Ｕ＝Ｏ或いは１から６の整数ｖ＝ｏ、１或いは２ｗ＝３．２或いは１で　ｖ＋ｗ＋３Ｒ８は水素原子か或いはアシル基でＹはＣＴｏ　、Ｎ）］、　ＯＳＳ、　Ｃｏ、　Ｓｏｗ、　Ｃ０ＮＨ，或いは５０，１１１（ここでＲ１は水素原子であり、ｕ、ｖ、ｗ及びＹは上記した値と与えられた意味を持ち、ｙは１．２．３或いは４の値で、Ｉ。

は放射性ヨード原子である。

次の式で表わされる基（ｒａｄｉｃａｌ）ε０− ここでＲＩＳとＲ１６は同じか或いは異なり、水素原子或いはアルキル基を表わす、そして次の式で表わされるピレニル基（ｒａｄｉｃａｌ）　ｍ１ＸＩＸ　　　　　　　Ｘｖ　　　　　　　ＸｖＸＶＩ［ＸＶＩＩＩ　　　　　　　　Ｘ　ＩＸ〔等の基類の中から基（本）が選ばれる〕本発明は又、異ったヌクレオシドのくり返し連結鎖を有し、そのくり返し連結鎖の少なくとも末端のうちの１つに位置する５ケのヌクレオシドが標的付与分子で標的付与されているか、その分子の前駆体であることを特徴とする、標的付与されたオリゴヌクレオチドに関するものである。

このオリゴヌクレオチドを作成する工程は大変興味あるものである、それは連結鎖の一つの末端の少なくとも５ケの標的付与分子が存在することが、感度を高めるからである。

本発明によるヌクレオシド誘導体は核酸の有機化学なる書物、Ｐａｒｔ　Ｂ、（Ｎ、に、Ｋｏｃｈｅｔｋｏｖ　ａｎｄ　Ｅ、１．Ｂｏｄｏｖｓｋｉ＋　１９７２　ｏｒｇａｎｉｃｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｏｆ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ（Ｐｌｅｎｕｍ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　）に記載されている公知の方法で合成できる一般に、出発物質は次の式で表わされるヌクレオシド誘導体である。

ここでＲ１、Ｒｔ及びＲ３は既に上記した意味を有し、Ｂ′は次の式の基を表わす。

（Ｉｌｌ’　）　　　　　　　（■’　）　　　　　　　　　　　（Ｖ’　）ここでＲ５はＨ或いはＣＨｓを表わし、先に述べたと同じ位置に対して公知の方法を用いて１つ或いはそれ以上のＲ’Ｚ基が結合される。

合成されるヌクレオシド誘導体のもつ基Ｂが■式の基である時、保護されている、或いは保護されていない４−チオチミジン或いは４−チオデオキシウリジンを出発物質として、ジアミン、置換ジアミン誘導体或いは、それが−級アミン機能とカップリングし得る場合には、標的分子Ｈ，Ｎ−Ｒ’Ｚと反応させて該誘導体を合成することができる。

後者の反応は次の反応図で表わされる。

ここでＲ１３及び／或いはＲＩ４は同じであっても、異っていてもよく、水素原子或いは保護基を表わし、Ｒは炭化水素基すなわちＲ’Ｚである。

この反応の後ヌクレオシド誘導体をヌクレオチド合成に適するように処理し、若し必要ならば、そして特にＲが）Ｉ’Ｚ　Ｍでない時には１つ或いはそれ以上の標的分子を付加する。

〔実施例〕

他の様式及び本発明の利点は次に示す実施例から明らかになるであろう。本実施例は本発明を実証するものであり制限するものではない。

（実施例−１）次の式で表わされるヌクレオシド誘導体（化合物−１）の合成式（１）のうちこのヌクレオ、シト誘導体において、Ｒ１，１１”及びＲ３は水素原子を表わし、Ｂは式（Ｉ［［）の基を表わし、Ｒ５は水素原子、Ｒ６はＲ’ Ｚを表わす、又Ｒ４は−（ＣＬ）　Ｊ）ｌ−をＺはヒオ−１−７から誘導される基を表わす、ここでｍ＝ｏである。

ａ）　　（化合物−２）の合成４−チオデオキシウリジンの０．２６　ｇ　（１ｍｍｏ］ｅ）を絶対エタノールの５−に溶解し、この溶液に１．６−ジアミツヘキサンの０．５８ｇ（５ミリモル）を加え、６０゛Ｃに１６時間保つ。乾燥するまで蒸発し、つづいて水のｌ０ＫＩｄｌとトリエチルアミンの０．２　ｉｄに溶解し、つづいて蒸発乾個する。

残渣をエチルエーテル９１０ｉを加えて４回すりつぶし操作をおこなう。残渣はＣｅ１ｉｔｅ　５４５の１ｇに吸着させて、これを酢酸エチル−メトキシエタノール−水の４＝１＝２の混合比の混合物の下側の相の溶液と共にＣｅ１ｉｔｅ塔内に納め、この内容物を上記混合液の上側の相の溶液で溶出し、目的製品を酢酸エチル−ｎ−ブタノール−水の１：１：１混合溶液の上側相の溶液で溶出する。

溶出した適当な溜升を蒸発乾個し、凍結乾燥すると（化合物−２）の２２０■（収率６５％）を得る。

ｂ）　　（化合物−１）の合成（化合物−２）の６５３■（２ｍｍｏｌｅ）をジメチルフォルムアミドの１５− に溶解し、エチェチルアミン０．４ｄ　（４＋ａｓ＋ｏｌｅ）及びＮ−ヒドロキシコハク酸イミドの７００■（２ＩＩＩＩＯ１ｅ）を加える。２０”で３時間混合した後、反応混合物を真空乾燥し、蒸溜水の１５１ｄ。

と共に２回蒸発乾個し次に絶対エタノールを加えて蒸発し乾燥する。残渣をメタノールに溶解（抽出）し、これに（０，２から０．５日径の）シリカゲル８ｇを加え、そのまま懸濁物を真空乾燥する。先にシリカ上に吸着していたこの混合物をシリカゲル塔（メルクゲル６０）上に置き、クロロホルムとメタノールの混合物（５から２０％）溶液で濃度を漸時濃くして溶出する。かくして（化合物−１）の７４０■を得る。収率は６５％に相当する。

（実施例−２）（化合物−３）の合成、この合成物は下記の式で表わされるヌクレオシド誘導体である。

（化合物−１）の１．１１　ｇ　（２ｍ＋ａｏｌｅ）を無水ピリジン中に加熱溶解する。この溶液を冷却し、真空乾燥する。残渣は無水のジメチルホルムアミドの５ｄに溶解し、無水ピリジンの２０ｄで稀釈する。混合物を、攪拌しなからＯ ″Ｃに冷却する。次に４，４”−ジメトキシトリチルクロライドの７４４■を加える。混合物を１６６時間混する。この混合物にメタノール２ｍを加え、１５分後反応混合物を飽和の重炭酸ナトリウム水溶液の３５ｄ中に注入する。

混合物からクロロホルム５０ｍで２回抽出をおこない、有機溶媒層（クロロホルム抽出物）を蒸発乾個し、トルエンの２０ｄを加え蒸発乾個することを２回おこなう。

残留物はジクロロメタンで熔解（抽出）し、シリカゲルクロマトグラフ（メルクゲル６０）法により、ジクロロメタンのメタノール濃度勾配のついた溶液で溶出して精製した。（化合物−３）の１．３８ｇを得た、これは８１％の収率に相当する。

（実施例−３）本実施例では、（化合物−３）を次式で表わされる（化合物−４）から合成する。

ａ）　　（化合物−４）の合成ジメトキシトリチル−５′−千オー４−デオキシー２′−ウリジンの３．７ｇ（６，８ｍｍｏｌｅ）を絶対エタノールの４０ｄ中に溶解し、これに１，６ジアミノヘキサンの３．９ｇ　（３４ｍｍｏｌｅ）を加え、６０°Ｃに１６時間放置する。蒸発乾個後クロロホルムと０．ＩＮソーダ液の間に分離熔解し、有機溶媒相を水で洗浄して中和し、つづいて蒸発乾個する。残渣をジクロロメタンに溶解（抽出）し、メルク６シリカゲルクロマトグラフ法を用いクロロホルム中のメタノール濃度を変えて溶出して精製する。（化合物−４）の３．６５ｇを得、これは８５％の収率に相当する。

ｂ）　　（化合物−°３）の合成（化合物−４）の３．１５　ｇ　（５ｍｍｏｌｅ）をジメチルホルムアミドの５０ｄに溶解し、この溶液にＮ−ジメチルヒドロキシコハク酸イミドビオチンの１．７ｇ（５，５ｍｍｏｌｅ）とトリエチルアミン７７０μｆ（５，５ｍｍｏｌｅ）とを加える。常温で３時間撹拌後、溶媒を蒸発乾個し、残渣をクロロホルム５００ｍ１：４こ溶解（抽出）する。このクロロホルム溶液を１０％の重炭酸ナトリウム溶液の５００ｄを用いて２回洗浄し、つづいて蒸溜水５００−で洗浄する。有機溶媒相を蒸発乾個する。残渣をジクロロメタンに溶解（抽出）しクロロホルム溶媒中のメタノール勾配を用いた溶出をおこなうメルク６０シリカゲルクロマトグラフをおこなう。目的製品を含む溜升を蒸発しく化合物−３）の３．２ｇを得、これは７５％の収率に相当する。

（実施例−４）下記式の（化合物−５）の合成（化合物−３）の８５４■（ｌｓｍｏｌｅ）を絶対ピリジン中で共蒸発することによって無水化し、続いて無水のジクロロメタンの１０ｄに溶解する。つづいてジイソプロピルアンモニウムテトラゾレートの８５■（０，５ｖ＋ｍｏｌｅ）　、並びにビス−（ジイソプロピルアミノ）−シアノエトキシホスフィンの３４１ μｌを加える。この反応媒体を室温に２時間撹拌し、つづいてジクロロメタン５０ｍを加える。この有機溶媒溶液を重炭酸ナトリウムの飽和水溶液の５０戚で３回洗浄して、つづいて飽和食塩水Ｓｏｄで洗浄する。有機溶媒相を真空乾燥し、残渣をジクロロメタンの５ｍに溶解（抽出）し、−７８℃に冷却したヘキサンの１００Ｉｄ中に注入して沈澱させる。この沈澱物を集め、真空乾燥する。（化合物−５）の８９７■を得、８５％収率に相当する。

（実施例−５）下記式で表わされる（化合物−６）の合成ａ）下記式で表わされる（化合物−７）の合成（実施例−１）のａ）の例と同じ操作工程を４−チオデオキシウリジンの代りに４−チオチミジンを用いて（化合物−７）の合成に対しておこなう。

ｂ）　　（化合物−６）の合成（実施例−１）のｂ）と同じ操作工程を、（化合物−７）の６８１■（２ａ＋ｍｏｌｅ）　　とジメチルホルムアミドの１５−とトリエチルアミン０．４ｍ　（４＋＋＋ｍｏｌｅ）及びＮ−ヒドロキシコハク酸イミドビオチンの７００ｍｇ　（２ａ＋ｍｏｌｅ）を用いて（化合＠！！−７）から（化合物−６）を合成するためにおこなう、（化合物−６）の７１５１ｇを得た。

これは６３％収率に相当する。

（実施例−６）下記式で表わされる（化合物−８）の合成この化合物は（化合物−６）から（実施例−２）と同じ操作工程を用いて、（化合物−６）の１．］、４　ｇ　（２ｍ＋ｍｏｌｅ）及びジメトキシ−４，４’−）リチルクロライドの１．１４　ｇ　（２１℃ｍｏｌｅ）を用いておこなう。

（実施例−７）下記式で表わされる（化合物−９）から（化合物−８）の合ａ）　　（化合物− ９）の合成（実施例−３）のａ）と同じ操作工程を用いて、ジメトキシトリチル−５′−チオ−４−デオキシ−２′−ウリジンの代りに、ジメトキシトリチル−５′−チオ −４−チオチミジンを用いて（化合物−９）の合成をおこなう。

ｂ）　　（化合物−８）の合成（実施例−３）と同じ操作工程を用いて、（化合物−９）の１．２９　ｇ　（２ｍｍｏｌｅ）、ジメチルホルムアミドの２Ｏ−１Ｎ−ヒドロオキシコハク酸イミドビオチンの６８９ｍｇ及びトリエチルアミンの−３００ｐｌ　＜２ｍｍｏｌｅ＞を用いて（化合物−９）から（化合物−８）の合成をおこなった。３時間の反応後（化合物−８）の１．３７ｇを得た。これは７９％の収率に相当する。

（実施例−８）下記式で表わされる（化合物−１０）の合成（実施例−４）と同じ操作工程を用い（化合物−８）の８７０■（１＋ａｍｏｌｅ）、ジイソプロピルアンモニウムテトラゾレート８５ｇ及びビス−（ジイソプロピルアミノ）−シアノエトオキシホスフィンの３４０ｐｉを用いて（化合物−８）から（化合物−１０）を合成する。最終沈澱をおこなった後、（化合物−１０）の９３０■を得た。これは８７％の収率に相当する。

（実施例−９）ビオチンで標的付与されたオリゴヌクレオチドの合成この実施例は下記の配列を持つビオチンで標的付与されたオリゴヌクレオチドを（化合物−５）を用いておこなう実施例を示している。

５’　−ｄ　（ＸＣ；ＴＣＡＴＡＧＣＴＧＴＴＴＣＣＴＧ）−３’この配列において、Ａはアデニンから作られたヌクレオチドを表わし、Ｃはシトシン、Ｇはグアニン、Ｔはチミンから作られたヌクレオチドを夫々表わし、そしてχは（ビオチオアミド−６−へキシル−１）−４−シトシンから作られたヌクレオチドを表わす。

この合成は（ビオチンアミド−６−へキシル−１）−４−シトシンに相当する同調的基質として（化合物−５）と、そしてアデノシン、シトシン、グアニン及びチミンに夫々相当する同調的基ｉｉ類とを用いておこなわれる。

後者の同調的基質類はジメトキシ−４，４’−）リチル基で５′のヒドロキシ基を保護し、３′のヒドロキシ基を下記の式の基で機能性化することにより夫々相当するヌクレオシド類を用いて得られる。

アデニン及びシトシンに相当するヌクレオチドに対して、環状構造から突出しているアミノ基はベンゾイル基で保護する。

グアニンの場合、環状構造から突出しているアミノ基はイソブチリル基で保護する。

合成は、アミノ鎖を延長用の腕とした「孔径を調節された硝子」（”Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　Ｐｏｒｅ　Ｇｌａｓｓ″）なる支持体−とにグラフト（接木結合）された、そしてヌクレオシドとアミンとの間の結合はサクシニル基を用いておこなった、ヌクレオシドの０．２μｍｍｏｌｅを用い、（実施例−４）の合成で得られた、ヌクレオシド誘導体（化合物−５）或いはデオキシ−２′−アデノシン、デオキシ−２′−シチジン、デオキシ−２′−グアノシン及びチミジンの同調的基質類を各縮合周期当り１０＋Ｑｇ、すなわちヌクレオチドを単位として約１０当量を用い、及びテトラゾール基を含んでいる活性化剤を各縮合周期当り７■ 、すなわちヌクレオチドを単位として１０当量を用い、応用ビオシステムス３８１Ａ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅ＋＋ｓ　３８１Ａ　）　と呼称される自動オリゴヌクレオチド合成機を用いておこなわれた。

縮合の周期は、応用ビオシステムス３８１Ａ装置の標準シアノエチルホスホアミダイド０．２μｍｏｌｅの周期である。

縮合周期の終りには、支持体にサクシニル基を含む延長鎖を経て支持体に結合しているビオチンで標的付与された、そして保護されているオリゴヌクレオチドが得られる。

オリゴヌクレオチドは２８％アンモニアで２時間処理して支持体から切り離なす。そこで得たアンモニア溶液を６０°Ｃで５乃至１６時間加熱して保護基をはずす、アンモニアは蒸発させる。残渣は蒸溜水の５００μ！に溶解し、セファデックス２５の塔（直径１１高さ７　ｃｍ　）でろ過する。この２５４Ｄ１１に最初の吸収を持つ分別物を集め凍結乾燥する。

合成したビオチン付加したオリゴヌクレオチドの正しい長さを、ポリヌクレオチドキナーゼを対照物としてこれと比較して燐３２を標識として、又、ポリアクリルアミドの電気泳動とによって確認した。製品は厚いポリアクリルアミドゲル中に電気泳動させて作った。この物質に相当する帯部を（紫外光で確認した後）切り出して製品を得た。

得たオリゴヌクレオチドは溶出後、同じ配列を持つオリゴヌクレオチドと並べて検定した。この場合比較品のビオチン標識は常法に従っておこない、相補的配列を見出す怒度が同じであることを明らかにした。

（実施例−１０）ビオチンによる標的付与オリゴヌクレオチドの合成（実施例−９）の場合と同じ方法で、ビオチン標的付与オリゴヌクレオチドの次のような配列を持ったものを合成した。

５’　−ｄ　（ＹＧＴＣＡＴＡＧＣＴＧＴＴＴＣＣＴＧ）−３’この配列において、Ｙは（ビオチンアミド−６−アミノへキシル−１）−４−メチル−５−シトシンの構造を持つヌクレオチドを表わし、Ｙとして使用される相当する同調的基質は（化合物−１０）である。（実施例−９）の場合と同様の方法で合成したビオチニレートしたオリゴヌクレオチドの正しい長さを検査し、相補的配列の検査に対する感度についても検査した。

（実施例−１１）ビオチンにより標的付与されたオリゴヌクレオチドの合成（実施例−９）の場合と同じ操作工程を下記式の配列を持つ、ビオチン標的付与したオリゴヌクレオチドを合成するのに使用した。

５’　−ｄ　（ＸＸＸＧＴＣＡＴＡＧＣＴＧＴＴＴＣＣＴＧ）−３’この配列において、Ｘは（実施例−９）の場合と同じ基を表わし、（ビオチンアミド−６− ヘキジルー１）−４−シトシンでヌクレオチドを作った。これは（化合物−５）に相当する同調的基質である。（実施例−９）でおこなったのと同じ方法で合成したビオチニル化オリゴヌクレオチドの正しし）長さを検定した、その安定性と検査した。

このオリゴヌクレオチドは３ケのビオチニル化ヌクレオチドを持ち、その感応性はそのビオチン数に比例してｐｓ４から感度は３倍に近く上る。

同様の方法で同じ同調的基質を用いて次の弐で表わされるビオチン標的付与オリゴヌクレオチドを合成した。

５’　　−ｄ（ＸＸＸＸ　　ＸＸＸ　　ＸＸＸ　　ＴＴＴ　　ＣＣＴ　　ＧＴＴ　　ＧＣＴ　　ＧＴＧ　　ＡＧＣＴＴＧ　　ＣＴＧＡＧＣＴＡＡ　　ＣＴＧ　　ＣＴＣＴＧＣＣＣＴ　　ＧＧＣ）−３’この場合は配列の５′末端に１０ケのビオチニル化ト化したヌクレオチド類を持つオリゴヌクレオチドが得られた。

同じようにして、次の式で表わされるビオチン標的付与オリゴヌクレオチドが得られた。

５’　−ｄ（ＸＸＸＸＸ　ＴＴＴ　ＣＣＴ　ＧＴＴ　ＧＣＴ　ＧＴＧ　ＡＧＣＴＴＧ　ＣＴＧ　ＡＧＣＴＡＡＣＴＧ　ＣＴＣＴＧＣＣＣＴ　ＧＧＣ）　−３’この場合は５′末端に５ケのビオチニレート　ヌクレオチドと共にオリゴヌクレオチドを与える。

（実施例−１２）次の式の（化合物−１１）の合成ここで、ＤＭＴＯはジメトキシトリチル基を表わす。この式（１）のヌクレオシド誘導体の場合Ｂはシトシンから誘導された弐（ＩＩＩ）の基である。この合成は次のａ）からｆ）の段階の反応のくり返しを用いてチオチミジン（化合物−１２）から出発しておこなった。。

ａ）　チオチミジン（化合物−１２）から出発し、チオチミジン（化合物−１３）のモノメトキシトリチレート誘導体の合成次の反応図式に従う反応％式％）ここで？ＩＭＴＣＺはモノメトキシトリチルクロリドを表わし、？ＬＭＴはモノメトキシトリチル基である。

本反応の目的はＲ’Ｚ基の導入中にその基のアセチル化が起きないように５′及び３′末端の酸素側の水酸基の保護のためである。この基は（化合物−１１）の場合チオチミジンの５ｍｍｏ１．ｅをｖａｎｅポンプで乾燥した後、無水ピリジン５０ｄ中に？８解したモノメトオキシトリチルクロライド（ＭＭＴＣＺ）の１５ｍｍｏｌｅと反応させる。この反応を常温で１６時間、つづいて５０°Ｃで５時間続ける。この反応を５ｉのメタノールを加えて停止する、そして反応混合物をクロロホルムの２５０７に溶解（抽出）する、得られた溶液を５％の重炭酸ナトリウム水溶液２５０　ｄで３回つづいて、蒸溜水２５０−で洗浄する。

生成物はシリカの塔に仕込でＣＨｔＣ１ｄヘキサンの９：１比から純ＣＨ２ＣＺＺまでの濃度勾配を持つ液で溶出させ分離する。得た製品はトリタノールを除くためヘキサンで沈殿させる。得た（化合物−１３）の収率は８７％である。

ｂ）次の式を表わされる（化合物−１４）の合成次の式のチラミンと（化合物− １３）との反応によって（化合物−１４）を得る。

（化合物−１３）　５＋ｍｍｏｌｅとチラミン（４当量）の２０Ｉ１ｍｌｏｌｅを６０°Ｃ２４時間、２５Ｍ１フラスト中でエタノールの１０ｉに溶解し、反応する。この混合物は乾燥するまで蒸発させ、次にクロロホルム１００ｄで溶解（抽出）する。続いて１溜水１００ＲＲで３回洗浄する。得た製品は二酸化珪素上において、クロロホルム−（りロワホルム／メタノール）（９３ニア）の勾配で分離する。

ｃ）　　（化合物−１５）次の式（１５）の製造（化合物−１４）を無水酢酸と共に反応して合成する。

（化合物−１４）の３　ｍｍｏｌｅを無水ピリジン中に共蒸溜して乾燥し、無水ピリジンの３０ｄ中で無水酢酸の３ｍ（約１０当量）と４時間反応する。反応を、メタノール３ｄを加えて停止し、蒸発乾個する。クロロホルムと重炭酸ナトリウムの混合物で抽出後有機溶媒層を分け、蒸発乾個する。そして酸化珪素と混合する。この生成物をメチレンジクロライドとメタノール９８：２の混合液で溶出する。収率は８２％である。

ｄ）下記式で表わされる（化合物−１６）の合成（化合物−１５）を酢酸と反応して合成する。

（化合物−１５）の３　＋ｍ５ｏｌｅを８０％酢酸の３０−と３０分間逆流させて反応し、蒸発乾個する。残渣を蒸溜水に溶解し、水を蒸発させ残渣を蒸溜水の５０ｍに溶解する。水相をトルエン５０ｍと共に２回洗浄し、蒸発乾個させて（化合物−１６）を得る。収率は、この化合物は分離精製せずに使用するので、測定していない。

ｅ）下記式で表わされる（化合物−１７）の合成ｆ）　　（化合物−１７）から（化合物−１１）の合成（化合物−１７）を無水アセトニトリルと共に共蒸発して乾燥する。（化合物−１７）をジクロロメタン５４とジイソプロピルアンモニウムテトラゾレートの０．２５ｍｍ＋ｏｌｅとの混合物に溶解し、これにシアノエトキシ−ビス−ジイソプロピルアミノホスフィンの１．１＋ａｍｏｌｅを加える。この反応は２時間続ける、その後ジクロロメタン５０ｊｄを加える。有機性溶液を５％の重炭酸ナトリウム水溶液の５０１＋１ｉ！と共に３回洗浄し、つづいて硫酸ナトリウムを入れて蒸発乾個する。残渣をジクロロメタンの５１に溶− を加えて沈殿させる。この沈澱は少なくとも１日間真空デシケータ−中に入れておく。

（実施例−１３）標的付与されたオリゴヌクレオチドの合成（実施例−９）の場合と同じ操作工程をおこなって、次の配列を持ったヨードで標的付与されたオリゴヌクレオチドを合成した。

５’　−ｄ　　ＣＸＧＴＣＡＴＡＧＣＴＧＴＴＴＣＣＴＧ）−３’上の配列でＡ、Ｃ，Ｇ、Ｔは（実施例−９）で使用したのと同じヌクレオチドを表わしている。

Ｘは（（ヒドロオキシ−４−フェニル）−２−エチル）　−Ｎ、メチル−５−シトシンで形成されたヌクレオチドを表わす。

この合成をおこなうためにＡ、Ｃ，Ｇ及びＴについて（実施例−９）の場合と同じ同調的基質を使用し、ヌクレオチドＸについては（化合物−１１）を同調的基質として使用する。

合成は（実施例−９）の場合と同じ条件で自動の「アブライドビオシステムス３８１ＡＪオリゴヌクレオチド合成機を用いておこなう。

縮合周期の終りに、支持体に結合された、保護されたオリゴヌクレオチドを使用する。このオリゴヌクレオチドは支持体から分離し保護基をはづし、（実施例− ９）の場合と同じ条件で精製する。

このオリゴヌクレオチドは放射性ヨードを使用して標的付与或いは標識付けをおこなう。この目的のため、蒸溜水１０ｐｌ中に置いた２０ｐｍｏｌｅのオリゴヌクレオチドと、クロルアミン（ｃｈｌｏ−ｒａ＋ｎ１ｎｅ）　ｉ液Ｔの１０ｔｔｌ　（０，１ｍｍｏｌｅ）とを燐酸緩衝液（０，０５Ｍ、　ｐＨ−７，５）の９ｔｔｌ中にある＋ｔｓ１のｌ　μ＋ｎｏｌｅに加える。

５分間反応して二亜硫酸ナトリウムで反応を停止させる。シトシンから誘導される式（Ｉ［［）の基であり、その合成は（化合物−１７）から出発して、次のａ）からＣ）の各段階を逐次実行しておこなわれる。

ａ）　　（化合物−１７）からサクシニル誘導体（化合物−１９）の合成無水ピリジン中で共沸、蒸発させて乾燥した（化合物−１７）の（０，５＋ｕ＋ｏｌｅ、　３５３ｍｇ　）にジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）の１．５＋＋＋ｍｏ１ｅと無水コハク酸の１．５ｍ＋＋ｍｏｌｅを加える０反応は１６時間で終了する。反応混合物は蒸発乾個し、クロロホルムの１００−で溶解（抽出）する。得られた有機性溶液をクエン酸の１００−で３回洗浄する。有機性相を硫酸ソーダ上で乾燥し、蒸発乾個する。

残渣をクロロホルムの１０ｄに溶解し、ヘキサンの２００ｍに加えて沈澱させる。収率８７％ｂ）　　（化合物−１９）から活性エステル（化合物−２０）の合成同じヨードによる標的付与処理を、上記したと同じ条件であるが、ヌクレオシドＸを含まない、標的づけしていないオリゴヌクレオチドについておこなった。これ等の条件ではオリゴヌクが含まれていることが、ヨードによる標的付与には必須の条件であることが判る。

（実施例−９）の場合のように、標的付与されたオリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーション法による相補的配列のものの検出に使用できることが確定された。

（実施例−１４）下記式で表わされる（化合物−１８）の合成（化合物−１８）この式においてＮ）Ｉへへ小■　は結合鎖を延長しているアミノ基を有する無水珪素から成る支持体を表わしている。式（１）で表わされるこのヌクレオシド誘導体について、置換基Ｂは無水ピリジン中で共沸蒸発して前もって乾燥させて（化合物−１９）の０．２５＋＋ｍｏｌｅ　、ペンタクロロフェノールの０．２８ｍｍｏｌｅ及びジシクロへキシルカーポジイミド（ＤＣＣ）の０．３７＋＋ｍｏｌｅを無水ジメチルホルムアミドの１０Ｉｄｔ中で１６時間反応させる。

反応混合物を濾過し、濾過液を蒸発乾個し、クロロホルムの１００１に溶解する。得た有機性溶液を蒸溜水の１００ｄで３回洗浄し、つづいてクロロホルムの５から１０ｄで溶解しヘキサン２００−中に加えて沈澱させる。収率９３％ｃ）　　（化合物−２０）から（化合物１８）の合成（化合物−２０）のＱ、２ｍｍｏｌｅを無水ＤＭＦ中で、トリエチ／Ｌ／７ミン３０ｕｌと共に、アルキルアミノで作られている結合鎖延長腕を持つ二酸化珪素ＣＰＧの２００■と２日間機械的に混合攪拌する。２日後グラフト化された支持体を回収し、無水のＤＭＦの２０ｄで３回洗浄し、次に２０．ｄのエタノールで３回洗浄する０反応していないアミノ基は、５０Ｊｄのピリジン中で無水酢酸の５ｄを用いて保１（ｂｌｏｃｋ）する、この支持体を回収し、ピリジン２０ｉで３回、エタノール２０Ｉ１１で３回洗浄する。

支持体のグラフト化の量は酸性媒体中に遊離するジメトキシトリチルカチオンの着色の強さで測定する。支持体のクラフト化は２７μｍｏｌｅ／ｇであった。

（化合物−２１）の式は下記の通り（化合物−２１）この（化合物−２１）は上記と同様にして（化合物−８）を出発物として合成される。

（実施例−１５）次の式の（化合物−２２）の合成４−チオデオキシ−２′−ウリジンの４１１ＩＩｌＯ１ｅを無水ピリジンの１０ｄで２回共沸蒸発して乾燥する。残渣をピリジン４０１１！１！に溶解し、溶液を氷の入ったバス中で冷却する。この溶液に次にジメトキントリチル・クロライドの４．４ＩＩＩ＋＋＋ｏｌｅ　（０，９３ｇ）を加え、４°Ｃで一昼夜攪拌して反応をおこなわせる。反応が終了したと思われた時（二酸化珪素上でＴＬＣ法で確認して）メタノールのＩＨｌを加える、３０分後、反応混合物をその容積の１７４にまで濃縮する。残渣に１００ｄのジクロロメタン中に加えて溶解（抽出）し、飽和の重炭酸ナトリウムの１００ｄで３回洗浄し、次に水の１００Ｉｉで洗浄する。有機性相を硫酸ナトリウム上で乾燥し、蒸発乾個し、トルエンを加えて共沸蒸発させる。かくして得た生成物は二酸化珪素ゲル上に吸着させ、ジクロロメタン中に（０から４％）勾配をもって加えたメタノールで溶出して精製する。無定形、黄色の（化合物−２２）が得られ、収率は１．ｓ４ｇ　（８４％）であった。

（実施例−２）の（化合物−３）を合成するためには、（実施例−１）と同じ操作工程を経て４−チオデオキシウリデンの代りに（化合物−２２）を用いて、（化合物−３）を合成できる。

（実施例−１６）次の式で表わされる（化合物−２３）の合成チオ−４−チミジンの０．６４　ｇ　（２，５ｍｍｏｌｅ）から（化合物−２３）を、（実施例−１５）と同じ操作工程によって合成できる。

（化合物−２３）は１．２０　ｇ得られ、収率８６％であった。（化合物−２３）は（実施例−１）の操作工程をおこない、４−チオデオキシウリジンの代りに（化合物−２３）を用いて、（実施例−６）の（化合物−８）の合成に使用される。

発明の効果標的付与されたオリゴヌクレオチド類を合成するために、次の式で表わされる、夫々相当するヌクレオシド誘導体を用いて目的を達成することができる。

Ｒ１は水素原子或いはヌクレオチド合成に適する酸性媒体中で不安定な基を表わす。

Ｒ２は水素原子、保護的基、機能性基或いはヌクレオチド合成に役立つ支持体を表わす。

Ｒ３は水素原子、水酸基或いは保護された水酸基を表わす。

そして −ＢはＲ’Ｚ基が置換している環状アミン基を含むプリン或いはビリジデン塩基から誘導された基でここでＲ４は一本鎖結合或いは炭化水素基を表わし、Ｚは標的付与要素ある。

この標的付与されたオリゴヌクレオチド類は遺伝子や、怒染症の病気などの診断手段に利用できる。

国際調査報告国際調査報告ＦＲ８９００３１２ＳＡ　　２９Ｂ３７

Claims

【特許請求の範囲】１．標的付与されたオリゴヌクレオチド類の合成に使用できる、下記式（Ｉ）に従うことを特徴とするヌクレオシド誘導体。 ▲数式、化学式、表等があります▼（Ｉ）ここで、 −Ｒ１は水素原子或いはヌクレオチド合成に適する酸性媒体中で不安定な基を表わし、 −Ｒ２は水素原子、保護基、オリゴヌクレオチド合成に適する機能的基、或いは酸素原子を伴った、結合を伸ばす腕を持った結合を持つヌクレオチド合成に使用し得る支持体を表わし、−Ｒ３は水素原子、水酸基或いは保護された水酸基を表わし、−Ｂは下式記で表わすプリン或いはピリミジンから誘導する基を表わし、 ▲数式、化学式、表等があります▼（ＩＩＩ）▲数式、化学式、表等があります ▼（ＩＶ）▲数式、化学式、表等があります▼（Ｖ）ここでＲ５はＨ、ＣＨ３、或いはＲ４Ｚを表わし、Ｒ６は水素原子或いはＲ４Ｚ基を表わし、そして式Ｂの基は式（ＩＩＩ）の基の１位置のＮに、或いは式（ＩＶ）及び（Ｖ）の基の９位置に、酵素側部分に向けて結合しており、−Ｒ４は一重結合か或いは下記式で示す基類の中から選んだ炭化水素を表わし、−ＮＨ（ＣＨ２））ｎ−Ｘ−（ＣＨ２）ｐ−−ＮＨ−（ＣＨ２））ｎ−Ｘ−（ＣＨ２）ｐ−ＮＨ−−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ −Ｘ−（ＣＨ２）ｐ−−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−Ｘ−（ＣＨ２）ｐ−ＮＨ−−Ｓ−（ＣＨ２）ｎ−Ｘ−（ＣＨ２）ｐ−−Ｓ−（ＣＨ２）ｎ−Ｘ−（ＣＨ２）ｐ−ＮＨ −−ＮＨＣＯ−（ＣＨ２）ｎ−Ｘ−（ＣＨ２）ｐ−−ＮＨＣＯ−（ＣＨ２）ｎ− Ｘ−（ＣＨ２）ｐ−ＮＨ−−ＮＨＳＯ２−（ＣＨ２）ｎ−Ｘ−（ＣＨ２）ｐ−− ＮＨＳＯ２−（ＣＨ２）ｎ−Ｘ−（ＣＨ２）ｐ−ＮＨ−−（ＣＨ２）ｎ−Ｘ−（ＣＨ２）ｐ− −（ＣＨ２）ｎ−Ｘ−（ＣＨ２）ｐ−ＮＨ−−ＣＯ−（ＣＨ２）ｎ−Ｘ−（ＣＨ２）ｐ−−ＣＯ−（ＣＨ２）ｎ−Ｘ−（ＣＨ２）ｐ−ＮＨ−ここでｎは１から６の間の整数、ｐは０か或いは１から６の間の整数であり、ＸはＣＨ２、Ｏ、Ｓ、ＮＨ、ＣＯ、ＨＣ＝ＣＨ−、−（ＣＨ２）ｒＺ、（ＣＨ２）ｒＮＨＺ、▲数式、化学式、表等があります▼、▲数式、化学式、表等があります▼、▲数式、化学式、表等があります▼、▲数式、化学式、表等があります▼、▲数式、化学式、表等があります▼、▲数式、化学式、表等があります▼、▲数式、化学式、表等があります▼、▲数式、化学式、表等があります▼を表わし、ｒは１から６の間の整数であり、 −Ｚはペプチッド合成に有用な保護基或いは標的付与物類として使用できる分子類の群から選んだ標的付与分子から誘導した基であり、但しＺは若しＲ２が結合を延長する結合を持つ支持体である場合には保護的基を表わすに過ぎない。２．標的付与分子がアビジン或いはストレプタビジンと結合し得る分子であることを特徴とする、請求項１に記載のヌクレオシド誘導体。３．Ｚが下記の式で表わす基類から選んだ基であることを特徴とする請求項２に記載の誘導体。 ▲数式、化学式、表等があります▼（ＶＩ）▲数式、化学式、表等があります▼ （ＶＩＩ）▲数式、化学式、表等があります▼（ＶＩＩＩ）▲数式、化学式、表等があります▼（ＩＸ）▲数式、化学式、表等があります▼（Ｘ）▲数式、化学式、表等があります▼（ＸＩ）ここでｓ＝４，５，６或いは７、ｔ＝３，４，５，６，或いは７Ｒ７はアルキル基である。４．標的付与分子が抗原−抗体型の反応をおこない得る分子であることを特徴とする請求項１に記載のヌクレオシド誘導体。５．Ｚが下記の式で表わす基類から選んだ基であることを特徴とする請求項４に記載のヌクレオシド誘導体。 ▲数式、化学式、表等があります▼（ＸＩＩ）及び▲数式、化学式、表等があります▼（ＸＩＩＩ）６．標的付与分子が蛍光発光特性を持つ分子であることを特徴とする請求項１に記載のヌクレオシド誘導体。７．Ｚが下記式で表わす基類から選んだ基であることを特徴とする請求項６に記載のヌクレオシド誘導体。 ▲数式、化学式、表等があります▼（ＸＩＸ）▲数式、化学式、表等があります ▼（ＸＶ）▲数式、化学式、表等があります▼（ＸＶＩ）▲数式、化学式、表等があります▼（ＸＶｌＩ）▲数式、化学式、表等があります▼（ＸＶＩＩＩ）▲ 数式、化学式、表等があります▼（ＸＩＸ）▲数式、化学式、表等があります▼ （ＸＸ）▲数式、化学式、表等があります▼（ＸＸＩ）▲数式、化学式、表等があります▼（ＸＸＩＩ）▲数式、化学式、表等があります▼（ＸＸＩＩＩ）ここでＲ１５とＲ１６は、同じであっても異っていてもよく、水素原子或いはアルキル基を表わす。８．標的付与分子がヨードを用いて標的づけされた分子であることを特徴とする請求項１に記載のヌクレオシド誘導体。９．Ｚが下記の式で表わす基類から選んだ基であることを特徴とする請求項８に記載のヌクレオシド誘導体。 ▲数式、化学式、表等があります▼（ＸＸＩＶ）及び ▲数式、化学式、表等があります▼（ＸＸＶ）ここでｕ＝０或いは１から６の整数、ｖ＝０，１或いは２、ｗ＝３，２、１但しｖ＋ｗ＝３Ｒ８は水素原子或いはアシル基を表わし、ＹはＣＨ２、ＨＮ、Ｏ、Ｓ、ＣＯ、ＳＯ２、ＣＯＮＨ、ＳＯ２ＮＨを表わす。１０．Ｂが下記式で表わす基であることを特徴とする請求項１に記載のヌクレオシド誘導体。 ▲数式、化学式、表等があります▼ ここでＲ５はＨ或いはＣＨ３を表わし、Ｒ４及びＺは請求項１で示した意味をもつ。１１．Ｒ４Ｚは式（ＣＨ２）６−ＮＨＺの基を表わし、この式中のＺは下記の式の基であることを特徴とする請求項１０に記載のヌクレオシド誘導体。 ▲数式、化学式、表等があります▼ １２．Ｒ４Ｚが▲数式、化学式、表等があります▼で表わされることを特徴とする請求項１０及び請求項１１のうちの何れかの請求項に記載の誘導体。１３．Ｒ１が水素原子か或いはジメトキシトリル基であることを特徴とする請求項１０から請求項１２のうちの何れか１つの請求項に記載の誘導体。１４．Ｒ２が下記式の燐基であることを特徴とする請求項１０から請求項１３のうちの何れか１つの請求項に記載の誘導体。 ▲数式、化学式、表等があります▼ １５．Ｒ２が式中の▲数式、化学式、表等があります▼が結合を伸ばす腕であるアミノ基を有する酸化珪素支持体を表している▲数式、化学式、表等があります ▼なる式の基であることを特徴とする請求項１０及び請求項１３のうちの何れか１つの請求項に記載の誘導体。１６．数回の縮合過程、該縮合過程の１回の過程の中でヌクレオシド誘導体がヌクレオシド誘導体に、或いはオリゴヌクレオチドに縮合することをくり返す縮合過程からなるオリゴヌクレオチド合成の製造法は、使用されるヌクレオシド誘導体の少なくとも１種が下記式（Ｉ）に従うヌクレオシド誘導体であることを特徴とする。 ▲数式、化学式、表等があります▼（Ｉ）ここで −Ｒ１はヌクレオチド合成に適する酸性媒質中では不安定な基を表わし、 −Ｒ２はヌクレオチド合成に適する機能的基、或いは酸素原子を伴った、結合を伸ばす腕を持った結合を持つ、ヌクレオチド合成に使用し得る支持体を表わし、 −Ｒ３は水素原子、水酸基或いは保護された水酸基を表わし、そして−Ｂは請求項１で与えた意味をもっている。１７．異った種類のヌクレオチドの連結鎖からなるオリゴヌクレオチドはその連結鎖中の少なくとも２種のヌクレオチドが異った標的付与物によって標的化されていることを特徴とする標的付与されたオリゴヌクレオチド。１８．異った種類のヌクレオチドの連結鎖からなる、そのヌクレオチドの少なくとも−種が次の式の基酸。 ▲数式、化学式、表等があります▼ 或いは ▲数式、化学式、表等があります▼ ここで、ｕ＝０或いは１から６の整数ｖ＝０，１或いは２ｗ＝３，２或いは１但しｖ＋ｗ＝３Ｒ８は水素原子、或いはアシル基を表わし、そしてＹはＣＨ２、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＣＯ、ＳＯ２、ＣＯＮＨ、或いはＳＯ２ＮＨ次の式の基類 ▲数式、化学式、表等があります▼ および ▲数式、化学式、表等があります▼ ここでＲ８は水素原子であり、ｕ、ｖ、ｗ及びＹは上記に指定した意味を持ち、ｙ＝１，２，３或いは４のであり、１■は放射性ヨード原子である。次の式の基類 ▲数式、化学式、表等があります▼ Ｒ１５及びＲ１６は同じか異っており、水素原子或いはアルキル基を表わす、そして次の式の基類 ▲数式、化学式、表等があります▼（ＸＩＸ）▲数式、化学式、表等があります ▼（ＸＶ）▲数式、化学式、表等があります▼（ＸＶＩ）▲数式、化学式、表等があります▼（ＸＶＩＩ）▲数式、化学式、表等があります▼（ＸＶＩＩ）▲数式、化学式、表等があります▼（ＸＶＩＩ）▲数式、化学式、表等があります▼ （ＸＸ）▲数式、化学式、表等があります▼（ＸＸＩ）上記基類から選んだ基によって標的付与されることを特徴とする、標的付与したオリゴヌクレオチド。１９．異なったヌクレオチド類からなる連結鎖を有し、その連結鎖の末端の少なくとも−方の末端に位置する少なくとも５ケのヌクレオチド類が標的付与分子或いは該分子の前駆体によって標的付与されていることを特徴とする標的付与されたオリゴヌクレオチド。２０．異なったヌクレオチド類からなる連結鎖を有し、その連結鎖の５′末端に位置する少なくとも２ケの相隣るヌクレオチドが標的付与分子或いは該分子の前駆体によって標的付与されていることを特徴とする標的付与されたオリゴヌクレオチド。