JPH03505253A - 検定装置および免疫検定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の名称 検定装置および免疫検定 技術分野 この発明は、膜ベースの検定装置および免疫検定に関し、さらには複数の膜をベ ースとする装置および選択的に透過し得る膜を含む免疫検定に関する。

背景技術 今日、いくつかの検定装置が市販されている。典型的には、これらの装置では、 フィルタまたは膜に直接に、もしくは抗体固定化ラテックス粒子のトラッピング により間接的に固定化された捕獲抗体を用いて、サンドイッチ免疫検定が行なわ れている。検体またはその抽出物は、固定化捕獲抗体を有するフィルタまたは膜 を含む装置に適用される。これらの市販の装置は、毛管作用を利用して、試料お よび試薬をフィルタまたは膜を通してその下に存在する吸収材に流入させる。最 後に、一方の構成要素が適切なシグナル発生置換基、例えば酵素ラベルで標識さ れたサンドイッチを形成する。基質の添加は、酵素と反応して着色反応生成物を 生成することにより酵素標識を検出するであろう。酵素は、その存在が抗原の存 在を必要とするサンドイッチの構成要素に結合するので、着色反応は抗原の存在 をも示す。これらの装置にはいくつかの不利な点があり、その一つに、低い検定 感度がある。例えば、ヒト絨毛性ゴナドトロピンのような主要分析物を測定する ために、これらの検定に、通常１０１１標的分子／−もを含む検体が必要である 。低感度の理由の一つは、検定装置における毛管流動速度の制御が困難なことに ある。反応が終了する前に、試薬が毛管流動によって反応域がら離脱してしまう 。サンドイッチの形成または酵素の検出における抗原−抗体相互作用および他の 段階により多くの時間をかければ、動力学が改良され、より少量の分析物の検出 が可能となる。多層構造を有するいくつかの検定装置には、吸収材に背景色が発 生し、弱い陽性結果と陰性結果との識別を妨げるという別の問題がある。

毛管流動速度の制御の困難さを解消するための一つの試みが、１９８２年１２月 ２８日にＴｏＩＩｌらに発行された米国特許４．３８６，２４１号に記載されて おり、これはサンドイッチ免疫検定を行なうための方法および装置を開示してい る。この装置は、免疫学的な対の一構成要素が吸着する免疫吸着層、液体吸収部 材および吸収性の強い抗液体流動ディスクを含むものとして記述されている。こ の吸収性の強い抗液体流動ディスクは、液体の吸収層への侵入を遅らせ、免疫吸 収部材を通して流動する液体の均一な流動速度を達成する。流動は、免疫吸収部 材の免疫学的な対の一構成要素が固定されている特定の領域に限定されることは ない。

Ｔｏｍらは、さらに、中間層に酵素を添加して検出層からの化合物の移動を妨げ ることにより、多層免疫吸収帯の第１層におけるシグナルの発生を妨げることを 開示している。第１３欄に記載された実施例は、検出用酵素（ｄｅｔｅｃｔｏｒ 　ｅｎｚｙｍｅ　）が第１層および第３層に存在することを記述している。この システムは、検出を第３層で行なうように設計されている。

基質は、第１層には添加されない。その代わり、それは、第３層にその場で生成 する。別の酵素が第１層と第３層との間の層に存在しており、この酵素は、基質 が第３層から第１層に移動するのを妨げ、第３層でのみ検出が行なわれるように する。ここには、酵素に直接作用する酵素阻害剤を用いて吸収材層を処理するこ とにより、吸収剤層における背景色を減少することは教唆されていない。

１９８６年１２月３０日にＶａ　ｌ　ｋ　ｉ　ｒｓらに発行された米国特許４， ５３２．９０１号および１９７８年５月３０日にＲｕｐｅらに発行された米国特 許４，０９２，１１５号の両者は、フィルタまたは膜上に位置する構造を有する 装置に関し、これらのフィルタまたは膜は試薬が結合し得る透過膜上への試料の 流動を可能にするものである。

１９８６年１１月１８日にＨｏ５ｓｕｏ＋らに発行された米国特許４，６２３． ４６１号は、種々の免疫検定に使用しうる横断流動診断装置（ｔｒａｎｓｖｅｒ ｓｅ　ｆｌｏｗ　ｄｌａｇｎｏｓｔｊｃ　ｄｅｖｉｃｅ　）を開示する。この装 置は、全ての流体および反応体が、フィルタ部材を通して、フィルタ最上面の局 在部分上の適用した点からフィルタの周辺部分に外に向けて流動するように組み 立てられている。装置の周辺部分に位置する吸収部材は、横断毛管作用（ｔｒａ ｎｓｖｅｒｓｅ　ｃａｐｉｌｌａｒｙ　ａｃｔｉｏｎ　）を働かせてフィルタ平 面における適用点から液体を外側に吸引する。

１９８３年１０月４日にＣｏ１ｅらに発行された米国特許４，４０７，９４３は 、その表面が免疫化学的に活性化された微孔性膜のゼイン固定内部表面および外 部表面への抗原または抗体の固定化を開示している。膜を通して流動する大量の 流体に露出した、大比率の表面を有する構造は、この表面との反応性の接触の可 能性を増加させ、反応時間を減少させる試みに用いられる。

インキュベーション時間は、流体の流動速度が、ドロップが膜の上部に載ってい るときにそのドロップによって作用する流体静力学的圧力のみによって決定され るように、流体を膜の上面に滴下する技法によって支配される。吸収剤層は、そ れを通して試薬を吸引するための毛管作用を働かせるためには使用されない。

１９８１年１月２０日にＣｏ１ｅらに発行された米国特許４，２３６．９９９号 は、液体試料の予め定められた成分を試験するための多層装置を開示している。

この試験装置は、液体レザバを規定する、伸縮する頂部および基台部材を具備し 、頂部部材は、微孔性膜の周辺に向かって開口している１以上の試験ウェルを有 する。微孔性膜は、その内部表面および外部表面に固定された共反応体（ｃｏ− ｒｅａｃｔａｎｔ　）を有し、この共反応体は分析物と反応することが可能であ る。弾性部材が押し下げられた場合には、膜は、プロッティングまたは毛管作用 によって、試験ウェルを通過する全ての液体を吸収することが可能な吸収材部材 と接触する。吸収材層およびそれを膜の下層と接触させる部材がないと、液体は 膜を通過しない。装置が押し下げられていない場合には、液体は微孔性膜を通過 しないであろう。この吸収材層は、実質的に非湿潤性、すなわち、通常の水溶液 に対してはオシメのインナーライニングと比較し得る表面層と、実質的に湿潤性 の層とを有する。

１９７５年６月ｌＯ日にＢａｇｓｈａｗｅに発行された米国特許３，８８８，６ ２９号は、マトリックスパッドを有する容器と、液体をマトリックスパッドを通 して流動させるマトリックスパッドの支持体とを具備する、ラジオイムノアッセ イへの使用に適した反応セルを開示している。このマトリックスは、分析物と結 合し得る多孔質吸収材料を含んでいる。所望の化学反応は、マトリックス中で起 こり得る。実質的にマトリックスと接触している多孔セル材料を用いることによ り、迅速なろ過が誘導される。

１９７３年３月２７日にＬｉｏｔｔａに発行された米国特許３，７２３，０６４ 号は、物質の濃度を定量的に決定する積層試験装置を開示している。この装置は 、はぼ４層からなる。第１多孔層は試薬系を含浸し、この第１層に隣接して被検 流体に対して異なる透過性を有する複数の領域を含む膜があり、第２層に隣接し て多孔質透過層があり、表示ストリップが続く。ここでは、選択的透過性は、分 析物との化学反応、または膜層の細孔サイズによるサイズ選択で起こる。

ミリボア・イムノザイム・トキソプラズマ抗体試験（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ　Ｉｍ ｍｕｎｏｚｙｍｅ　Ｔｏｘｏｐｌａｓ［ｌｌａ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｔｅ５ｔ　 ）を記述する文献、Ｎｏ、ＰＢ　８４７　　（１９７９）は、微孔性免疫吸収材 、多孔質疎水性層および吸収材プロッタ（ａｂｓｏｒｂｅｎｔ　ｂｌｏｔｔｅｒ 　）を有するカセットを開示している。カセット頂部が押し下げられたときに、 その内部に存在する液体は免疫吸収材を通過してプロッタに流れ込む。このよう にして、この装置は、吸収材層に形成されることがある背景色が上層における結 果の検出を妨げることを防止する。

発明の要約 この発明は、ある物質を含有することが推定され、もしくは知られている試料に おいて、その物質の有無を検出もしくは定量するための改良された検定装置に関 する。この装置は、（ａ）捕獲試薬が結合した透過膜、（ｂ）中間層、および（ ｅ）吸収材層を含む多層を有し、（ｂ）層は（ａ）および（Ｃ）層と直接の伝達 がある。前記改良は、（ｂ）層が選択的透過性層であってそれを貫通する少なく とも１つの孔を有していることにあり、この孔は捕獲試薬の直下にあり、この孔 の領域もしくは複数の孔が合体した領域は捕獲試薬によって変換された領域より も小さい。

この発明の検定装置は、結合対の一要素によって捕獲し得る物質の検出または測 定するための免疫検定に用いることができる。

この発明はまた、酵素検出システムが用いられた場合に背景色を減少させるため の検定装置の吸収材層の酵素阻害剤による処理に関する。

図面 第１図は、この発明による、孔を有する（ｂ）層の平面図、第２図は、装置の外 形を示す断面の正面図である。

発明の詳細な説明 この出願において、「選択的透過性」という用語は、もし存在していたとして、 有機溶媒のような他の液体を通過させるかどうかにかかわらず、水溶液を実質的 に通過させない材料を指す。

この発明に従って、種々のタイプの受容体分子、例えば、以下で議論されるよう に特定の免疫もしくは非免疫結合対の一要素を捕獲試薬として使用することがで きる。適切な捕獲試薬の選択は、関心のある分析物、関心のある分析物を検出す るために必要な検定感度等の種々の基準に依存する。この発明の好ましい態様は 、捕獲試薬としてモノクローナル抗体または免疫反応性モノクローナル抗体断片 を使用する。しかしながら、適当な親和性を有するモノクローナル抗体が得られ ない場合には、所望の感度を達成するために、必要な親和性を有するポリクロー ナル抗体が好ましい。

捕獲試薬に加えて、陽性および陰性標準試薬を透過性層表面に結合させて検定お よび検出システムが適性に機能しているかどうかを決定することもできる。

試料が検出用抗体（ｄｅｔｅｃｔｏｒ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　）と前インキュベー トすることなく装置に添加された場合には、適切な陽性標準は精製抗原であり得 る。分析物を含有する試料との前インキュベーションが行なわれる場合には、そ れは検出用抗体に結合した抗原であり得る。これは、抗原と検出用抗体との捕獲 された複合体をこの検定で検出することが可能であることを示すが、そのような 複合体を形成または捕獲可能であることは示していない。検出用抗体上のビオチ ンが試験された、鍵となる基（ｋｅｙ　ｇｒｏｕｐ　ｔｅｓｔｅｄ）である場合 には、結合したビオチンを有するいかなる物質でも前記複合体と置き換えること ができ、かつ陽性標準としても役立つ。そのような物質には、ビオチニル化（ｂ ｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ）ウシ血清アルブミンまたは他のビオチニル化タンパク 質が含まれる。他の可能な陽性標準物質は、抗−酵素のような検出系の成分に対 する抗体である。これは、検出系における酵素が膜上に捕獲される場合に陽性の 結果が得られることを示している。他のタイプの陽性標準も可能である。このよ うに、適切な陽性標準の選択は、一定の条件を満たした場合（抗原が存在した場 合、またはビオチンが存在した場合、あるいは酵素が捕獲された場合等）の陽性 反応を試験するために企図される。

良好な陰性標準物質は、捕獲抗体と同じ種およびサブクラスのモノクローナル抗 体であって、捕獲試薬と等しい濃度（単位面積当たりのｊｉ）で適用されたもの である。この陰性標準抗体は、被検抗原、または検出系の成分に対する（この検 定において）論証可能な親和性は持たない。このように、適切に使用された場合 には、陰性標準は非特異的反応に対する試験を提供する。

捕獲試薬がスポットされる透過性層に使用し得る材料には、種々の天然または合 成材料が含まれ、これらは個別の材料であっても材料の組み合わせであってもよ く、有機、無機またはそれらの組み合わせであってもよい。透過性層は吸収性が 強く、すなわち検定において使用される溶質の移動を実質的に妨げることなくそ れを通しての水溶液の流動を可能にしなければならない。選択された材料はまた 、下に記述されるように、装置の局所領域に、捕獲試薬が共有結合的もしくは非 共有結合的に、直接もしくは間接的に結合し得るものでなければならない。用途 を見出し得る典型的な材料は、多糖体、例えば、紙、酢酸セルロース、ニトロセ ルロースおよび焼成ニトロセルロース等のセルロース材；シリカ、不活性化アル ミナ、硅藻土、ＭｇＳＯ４または塩化ビニル、塩化ビニル−プロピレン共重合体 、および塩化ビニル−酢酸ビニル共重合体のようなポリマーを有する、多孔質ポ リマーマトリックスに実質的に均一に分散された無機細分材料等の無機材料；天 然に産生ずる、例えば木綿と、合成された、例えばナイロン布との両者を含む布 ；多孔質ゲル、例えば、シリカゲル、アガロース、デキストリン、およびゼラチ ン；ポリマーフィルム、例えばポリアクリルアミド等である。

特に、タンパク質が共有結合的に結合し得る膜についても言及することができる 。そのリストには、市場から購入し得る下記のものが含まれる。約０．５ないし 約５−のポアサイズを有する微孔性親和性膜、接触した際にタンパク質を固定す る高密度の共有結合サイトを提供する化学的に予め活性化された表面を有する膜 、および基本膜（ｂａｓｅ　ｍｅｍｂｒａｎｅ　）が、７ないし９のｐＨ範囲に おいてリジンまたはアルギニンのε−アミノ基によってタンパク質の固定を可能 にするよう化学的に誘導された親木性フッ化ポリビニリデンである、化学的に活 性化された親水性微孔性膜。高感度検定については、膜の選択は、膜のブロッキ ングによる非特異的な結合を妨げる能力に主に依存する。これは、選択された試 薬、ブツロク剤、および膜それ自体に順に依存する。この発明の実施において好 ましい膜は、化学的に活性化された親水性微孔性膜である。

この多層装置の選択的透過性層は、検定条件下において、水溶液の流動を妨げる 。この流動に対する抵抗は、検定の全体の感度の他に、捕獲試薬が検定に使用さ れる他の試薬に接触する時間を増加させ、それによりサンドイッチの形成および 酵素の検定における、後に続く工程を改善するので、重要である。選択的透過性 層には流動特性が公知である多種の組成物を使用することができ、これには、ポ リエチレン、ポリエチレン裏打ポリテトラフルオロエチレンおよび繊維状多孔質 ポリテトラフルオロエチレンが含まれる。この発明の実施においては、繊維状多 孔質ポリテトラフルオロエチレンが選択的透過性膜の好ましい材料である。膜の 繊維状多孔性は、表面に沿った放射状の流動を助長し、それにより液体を選択的 透過性層の孔が位置する中心へ流動させるように見える。

検定の間、水性試薬は、水性検定試薬に対して選択的透過性である繊維状多孔質 ポリテトラフルオロエチレン膜を通過しない。

繊維状多孔質ポリテトラフルオロエチレン膜は、約１ないし約６０−の範囲をと る種々のポアサイズおよび約０．０６３ｍｍないし約０．０［ｉ５ｍ＋ｘの範囲 をとる種々の厚さのものが利用可能である。製造方法により、これらの膜は、本 来の繊維の寸法および配置まで標準ろ紙の構造を再現する。

この発明に実施において、繊維状多孔質ポリテトラフルオロエチレンまたは他の 選択的透過性膜は約０．１ないし約０．１５−の範囲の厚さ、および約５μｍな いし約６ｎのポアサイズを有ｌ−でいることが好ましい。約０．１５ｍｍをこえ る厚さを有する膜は、孔を通過する液体の滑らかな流動を妨げることがあるので 、避けることが好ましい。一方、選択的透過性膜が薄すぎる場合には、装置が組 み立てられたときに破損する可能性がある。また、より薄い膜はより透明になる 傾向にあり、このため、選択的透過性層の下に位置する吸収材層に発生した色を 中間膜を通して見ることを可能にする。中間層を通しての色の透過は、弱い陽性 結果と陰性結果との識別の困難さを増加させる。

吸収材層は、過剰の試薬溶液の貯蔵部として役立つ。したがって、色の生成に必 要な全ての反応体は吸収材層に存在する。吸収材層中における着色の発生は望ま しいものではないので、吸収材層に種々の試薬を添加して吸収材層における背景 色の生成を減少させることができる。驚くべきことに、また思いがけないことに 、この発明によって、酵素ベースの検出システムを用いた場合に、検出のために 選択された酵素に特異的な酵素阻害剤で飽和させることにより吸収材層における 着色の発生を最小に止めることが可能であることが見出された。

アルカリホスファターゼは、多くの異なるリン酸エステルを加水分解し、比較的 広い特異性を有する酵素である。この特異性は、構造上関連のある、異なる多数 の基質に対して作用することが可能であるというものであるが、割合が非常に異 なる。これは、多種の検定様式において検出システムの一部として非常に頻繁に 使用される。アルカリホスファターゼに対する多数の阻害剤が知られている。Ｂ ｅ”およびＺｎ”は、アルカリホスファターゼを阻害する。アルカリホスファタ ーゼによって触媒された反応の生成物である無機リン酸塩もまた、反応の重要な 阻害剤である。システィン、ヒスチジンおよびフェニルアラニンを含む多くのア ミノ、酸は、アルカリホスファターゼの弱い阻害剤である。ＥＤＴＡ　（エチレ ンジアミン四酢酸）のようなキレート剤は阻害剤である。これは、おそらく、キ レート剤が必須のＺｎ”＋イオンを酵素の構造から除去してしまうためである（ アルカリホスファターゼは亜鉛金属結合タンパクであって、その活性には構成上 の亜鉛を必要とするが、過剰の亜鉛イオンは上述のように酵素を阻害する）。

インドソベンゾエート、インドアセタミド、および１，３．４．５−テトラクロ ロ−３α−６α−ジフェニルグリコウリルもまたアルカリホスファターゼを阻害 する。

西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）およびβ−ガラクトシダーゼは、種々の 検定様式において検出に通常使用される別の酵素である。ＨＲＰは、アジド、フ ッ化物、ヒドロキシルアミン、過酸化ヒドロメチル水素（ｈｙｄｒｏｍｅｔｈｙ ｌｈｙｄｒｏｇｅｎｐｅｒｏｘ　１ｄｅ）および還元剤によって阻害される。β −ガラクトシダーゼは、重金属、有機水銀化合物、金属キレート剤、アルコール およびナトリウムイオンを含む高濃度アルカリイオンによって阻害される。

酵素の阻害について記述された複数の刊行物が存在するにもかかわらず、酵素検 出システムを用いる検定装置の吸収材層における背景色発生の減少への酵素阻害 剤の使用を述べたものはない。下に記述するように、酵素検出は検出の好ましい 方法であり、背景色生成の減少は弱い陽性結果と陰性結果との識別を容易にする ので、驚くべきことに、また思いがけないことに、酵素の阻害は、吸収材におけ る背景色生成を正常化するための最高の道具であった。

使用される検定装置、選択された検定用酵素、選択された酵素に対して特異的な 選ばれた阻害剤、および阻害剤の溶解度特性等の因子に依存して、下に記述され る実施例の多くの変形が可能であることは明らかにされなければならない。これ らの変形は、発明の範囲にある。

以下では、背景色生成を最小にするために、この発明の装置の吸収材層をどのよ うに処理したかを説明する。

吸収材層を２００ｍＭ塩化亜鉛および０．３％のアルキルアリールポリエーテル アルコールのような界面活性剤を含有するイソプロパツール溶液で飽和させた。

例えば、トリトンＸ−１００（Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００）がアルキルアリール ポリエーテルアルコールである。表面活性剤は層を親水性にし、過剰の亜鉛イオ ンは、この場合アルカリホスファターゼである検出用酵素を阻害することにより 吸収層における色の発生を妨げる。吸収層を親水性にするために、当業者に公知 のいかなる界面活性剤をも使用することができる。アルキルアリールポリエーテ ルアルコールは、単に、適切であろうと思われる多くの界面活性剤の１つである 。

同様に、阻害剤を溶解する溶媒の選択は重大なものではない。以下の２つの考察 が適切な溶媒の選択に考慮される。

（１）その溶媒における阻害剤の溶解度限界の値、および（２）この溶媒で飽和 された後吸収材層がいかに素早く乾燥するか、である。

吸収材層の表面上に亜鉛イオンを固定化する必要はなかった。これは、吸収材の 過剰の吸収能力が、吸収材層から他の層へ亜鉛イオンまたは試薬が移動するのを 妨げたためである。

これにより、亜鉛イオンは吸収材層中に留まってアルカリホスファターゼを阻害 し、透過性層の表面上の色発生を妨げなかった。検定装置の構造、選択された阻 害剤および吸収材層の能力により、吸収材層に阻害剤を固定化することが好まし い。

固体塩化亜鉛は、０．３％の界面活性剤アルキルアリールポリエーテルアルコー ルを含有するイソプロパツール、メタノール、クロロホルム、また°は上述の基 準を満たす他の溶媒に直接溶解し得るｏ　Ｍｉｎｅｒａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｅｈ、 Ｉｎｃ、（Ｈａｒｒｉｓｂｕｒｇ、ＮＣ）から購入することが可能な５０％塩化 亜鉛水溶液を、吸収剤層を飽和させるための溶液の調製に使用することも可能で ある。

５０％塩化亜鉛水溶液を使用した場合には、０．３％のアルキルアリールポリエ ーテルアルコールを含有するイソプロパツールのガロン当り前記溶液的２０６ｇ を溶解してイソプロパツール溶液中に塩化亜鉛の最終濃度２００ｏ＋Ｍを達成す るように計量した。別の試みは、洗剤を含有するイソプロパツールで吸収剤層を 飽和し、この層を乾燥させ、その後吸収剤層を塩化亜鉛溶液で飽和させることで ある。

吸収剤層（複数）に適切な材料の選択は重大なものではない。これらの材料には 、セルロース、酢酸セルロース、ポリエステル、多孔質ポリエチレンおよびポリ エチレンテレフタレートのような他のポリオレフィンが含まれる。重要なことは 、事実上選択的透過性層を移動する色がないように、吸収剤層を、背景色の発生 を最小にする適切な阻害剤溶液で飽和させることである。

選択的透過性層の必要不可欠な特徴は、透過性膜上にスポットされた捕獲試薬の 直下に、選択的透過性層を通して伸びるユないし約７個の孔を有しており、孔（ 複数）のサイズは捕獲試薬によって覆われる領域よりも小さい領域を覆う。この 発明の好ましい態様は、選択的透過性層に５個の孔を有している。第１図に示す ように、１つの孔は中心にあり、残りの孔は中心孔の周りに対称的に配置されて いる。検定の終りに陽性結果を定義する円形捕獲試薬スポットの明確な輪郭を得 ることが可能である限りにおいて、別のタイプの配置も可能である。

孔の形状が重要でないのに対して、孔のサイズは重要である。孔は、円形、楕円 系、矩形等であり得るが、孔が大きすぎる場合には流れの制御は失われる。捕獲 抗体スポットの直径をこえる単独の孔が使用される場合には、感度が失われる。

また、より大きな孔は、ドツトの代わりに、最上層を通してより暗い円を見せる 傾向にあり、これは弱い陽性結果との混同を招く可能性がある。これらの孔は、 約２５−×約１０００゜（ａｂｏｕｔ　２５　ｍｉｃｒｏｍｅｔｅｒｓ　ｂｙ　 ａｂｏｕｔ　１０００　ｍ１ｃｒｏａ＋ｅｔｅｒｓ）のサイズであり得る。この 発明の好ましい態様は、上述したように配置された５個の孔を有する選択的透過 性層を使用する。

好ましい孔のサイズは、約１００ｘＸ約３００．である。このサイズの孔は、３ ０ゲージ針を用いることにより得られる。これらの寸法を有する５個の孔は、捕 獲試薬スポットの下の約０．４ないし１０％の領域を占め、透過性層上面の領域 と比較した場合、これは透過性層の上面全域の約０，０４％ないし１％を構成す るものと見積もられている。

前述の層を有する装置を第２図に示す。これは、キャップ１１透過性層２、叶リ ング３、上述の孔９を有する選択的透過性層４、タブ８を有するベース７に順に 置かれている本体６内に収納された吸収剤プラグ５を存している。装置が組み立 てられたときには、０−リング３がキャップ内に押し込まれているので、透過性 層２、選択的透過性層４、および吸収剤プラグ５は互いの直接下にある。タブ８ を引き下げると、低真空が発生する。これは、試薬が装置を通して適切に流動す ることを保証する。続く流動は、毛管作用によって容易に起こる。

遠心、ろ過またはそれらの組み合わせのような、通常用いられている実験室技法 は、検定の前に、検体から特定の物質を除去することが可能である。透過性膜の ポアサイズよりも大きな寸法を有する特定の物質を含有する検体に対しては、い くつかの試料処理工程が必要である。そのようなサイズの特定の物質は透過性層 の表面に捕獲される。そこでは、背景汚染が起こる可能性があり、それにより検 定の実施を妨げる。

この発明を用いて検出および／または定量することができる物質は、以下に説明 される。ポリペプチドおよびタンパク質、多糖類、核酸、およびそれらの組み合 わせ、細菌、ウィルス、染色体、遺伝子、ミトコンドリア、核、細胞膜等。典型 的なタンパク質は、核タンパク質、糖タンパク質、硬タンパク質、プロテオグリ カン、ムコタンパク質、ヒストン、アルブミン、インシュリン、ペプシン等であ る。さらに、グルカゴン、卵胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン等のペプチドお よびタンパクホルモンの他に、フィブリノーゲン、トロンビン等の血液凝固因子 に言及することもできる。ウィルスに関しては、以下に言及することができる。

アデノウィルス；単純ヘルペス、帯状水痘、ヘルペスウィルスＢ、サイトメガロ ウィルス、エプスタイン−バーウィルス、ヒトヘルペスウィルス６型のようなヘ ルペスウィルス；ポックスウィルス；ピコルナウィルス；オルソミクソウィルス ；バラミクソウィルス；コロナウィルス；ラブドウィルス；トガウィルス；ブン ヤウイルス；アレナウイルス；風疹ウィルス；アルボウィルス；レオウィルス； 肝炎；レトロウィルス；腫瘍ウィルス等。

前に、捕獲試薬にポリクローナル抗体を使用することができると述べたが、この 発明の好ましい態様は、上述のように、捕獲試薬にモノクローナル抗体を用いる 。モノクローナル抗体はまた、検出用抗体に好ましく使用される。この発明のモ ノクローナル抗体を調製する方法は公知であり、多種の刊行物に引用されている 。それらのうち以下のものは参考として組み込まれている。Ｋｏｈ　Ｉ　ｅｒお よびＭｉｌｓｔｅｉｎ　５Ｎａｔｕｒｅ、　２５６　　：４９５−４９７　　（ １９７５）　、Ｐｅｒｅｉｒａ　ら、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎ ｉｔｙ。

２９巻、ＮＯ１２，７２４−７３２頁（１９８０年８月）　、Ｂ、Ｍｉｓｈｅｌ ｌおよびＳ、Ｓｃｈｉｉｇｉ編、５ｅｌｅｃｔｅｄ　ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　ｃ ｅｌｌｕｌａｒ　ｉｆｆｌｌｕｎｏｌｏｇ）’　。

Ｗ、Ｈ，Ｐｒｅｅｍａｎ　Ｃｏ、　、Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ　　（１９８ ０）における０１ら、Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ　ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ　ｈ ｙｂｒｉｄ　ｃｅｌｌ　１ｉｎｅｓ、　３５１−３７１頁、およびＧａ　Ｉ　ｆ 　ｒｅら、Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂ ｏｄｉｅｓ　：Ｓｔ　ｒａｔｅｇｉｅｓおよびＰｒｏｃｅｄｕｒｅｓ　、　Ｍｅ ｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ７３．１−４６頁（１９８１）。ここ でこれらの技術をさらに説明することはしない。検定において使用する特定の試 薬の感度により、最良の捕獲抗体はポリクローナルまたはモノクローナルのいず れかである。

透過性膜への結合は、直接であろうと間接であろうと、共有結合であろうと非共 有結合であろうと、公知の技術を使用して達成することができる。好ましい態様 において、捕獲試薬は共有結合的に透過性膜に結合し、洗浄により、または次の 試薬を添加した際に試薬が失われるのを避ける。

この発明によると、検出に使用されるモノクローナル抗体は、通常の技術を用い て標識される。受容体システムまたは特異的結合対の一要素を標識として使用す ることができる。

特異的結合対は、免疫タイプのものでも非免疫タイプのものでもよい。免疫特異 的結合対の例には、抗原−抗体システムまたはハブテン／抗−ハブテンシステム である。フルオレセイン／抗−フルオレセイン、ジニトロフェニル／抗−ジニト ロフェニル、ビオチン／抗−ビオチン、ペプチド／抗−ベプチド等に言及するこ とができる。特異的結合対の抗体要素は、当業者には普通の慣例法によって調製 することができる。

そのような方法には、特異的結合対の抗原要素、または合成ペプチドのような合 成もしくは遺伝的に処理し得る抗原の一部で動物を免疫することが含まれる。特 異的結合対の抗原要素に免疫原性でない、すなわちハプテンである場合には、そ れを担体タンパク質に共有結合させて免疫原性にすることができる。

非免疫結合対には、２つの成分が互いに自然親和性を共有し、かつ抗体ではない 系が含まれる。典型的な非免疫対は、ビオチン−ストレプトアビジン、内因性因 子−ビタミンＢ１２、葉酸−葉酸塩結合タンパク質等である。

標識モノクローナル抗体と特異的結合対の一要素とを共有結合させるために種々 の方法が利用される。方法は、特異的結合対の要素の性質、所望の結合の型、お よび抗体の様々な結合化学に対する耐性を基にして選択される。例えば、ビオチ ンは、市販の活性誘導体を利用することによりモノクローナル抗体に共有結合さ せることができる。これらのいくつかは、タンパク質のアミノ基に結合するビオ チン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド：カルボジイミドによって含水炭素部分、 アルデヒドおよびカルボキシル基に結合するビオチンヒドラジド；およびスルフ ヒドリル基に結合するビオチンマレイミドおよびヨードアセチルビオチンである 。

フルオロセインが使用される場合には、フルオレセインイソチオシアネートを用 いてタンパク質アミン基に結合させることができる。ジニトロフェニル基が使用 される場合には、２．４−ジニトロベンゼンスルホネートまたは２，４−ジニト ロフルオロベンゼンを用いてタンパク質アミン基に結合させることができる。モ ノクローナル抗体と特異的結合対とを結合させるために利用し得る他の標準的な 結合方法には、カルボジイミド結合・ホモ三官能性架橋（ｈｏａ＋ｏｂｉｆｕｎ ｃｔｉｏｎａｌ　ｃｒｏｓｓ−１ｉｎｋｉｎｇ　）　、およびヘテロ三官能性架 橋（ｈｅｔｅｒｏｂｉ−ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｃｒｏｓｓｌｌｎｋｉｎｇ　） が含まれる。カルボジイミド結合は、ある物質のカルボキシル基を他の物質のア ミン基に結合させる効果的な方法である。カルボジイミド結合は、市販の試薬、 １−エチル−３−（３−ジメチル−アミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＤＡ Ｃ）を使用することにより容易になる。

二官能価のイミドエステルを含むホモ三官能性架橋剤は、市販品を利用すること ができ、ある物質のアミン基と他の物質のアミン基との結合に使用される。ヘテ ロ三官能性架橋剤は、２つの異なる官能基を有する試薬である。最もありふれた 市販のへテロ三官能性架橋剤は、１つの官能基としてアミン反応性Ｎ−ヒドロキ シ−スクシンイミドエステルを、第２の官能基としてスルフヒドリル反応基を有 している。最もありふれたスルフヒドリル反応基は、マレイミド、ピリジルジス ルフィドおよび反応性ハロゲンである。官能基の１つは、照射により種々の基と 反応する光活性アリールニトレンであってもよい。この発明による好ましい方式 は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルによってモノクローナル抗体をビオ チンと結合させることである。

シグナル検出を容易にするために、モノクローナル抗体または特異的結合対の要 素のいずれかをレボーティングシステムの成分で標識する。レボ−ティングシス テムという用語は、選択されたレポーターおよびこのレポーターをモノクローナ ル抗体もしくは特異的結合対の成分と架橋させる手段を指す。

したがって、レポーターはモノクローナル抗体もしくは特異的結合対の要素と、 直接もしくは間接的に、共有結合的もしくは非共有結合的に結合することができ る。レポーターは、放射性同位体、酵素、蛍光体、磁性体、化学発光物質または 電気化学物質であり得る。通常使用されている２つの放射性同位体は、１２５Ｉ および３Ｈである。標準的な放射性同位体標識手順には、クロルアミンＴ１ラク トペルオキシダーゼおよび１２５Ｉに対するＢｏｌｔｏｎ−）Ｉｕｎｔｅｒ法な らびに３Ｈに対する還元メチル化が含まれる。

酵素もまた、免疫検定のレポーターとして使用される。これらには、西洋ワザビ ベルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコー スオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、β−ラクタマーゼ、ウレアーゼおよびリゾチ ームが含まれる。酵素を用いた標識は、前に特異的結合対でのモノクローナル抗 体の標識のために述べたように、ジアルデヒド、カルボジイミド結合、ホモ三官 能性結合剤を用いることにより容易になる。選択された標工方法は、酵素に有効 な官能基および標識される物質、ならびに結合条件に対する両者の耐性に依存す る。この発明において用いられる標識方法は、Ｅｎｇｖａｌ　］およびＰｅａｒ １ｍａｎｎｓ　ＩｍｍｕｎｏｃｈｅＩＩｌｉｓｔｒｙ　８．８７１　　（１９７ １）　、ＡｖｒａｍｅａｓおよびＴｅｒｎｙｎｃｋ　、　ｌａ＋＋ｎｕｎｏｃｈ ｅｍｉｓｔｒｙ　８．１１７５　（１９７１）　、Ｉｓｈｉｋａｗａら、Ｊ、Ｉ ｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　４（３）　：２０９−３２７　　（１９８３）およびＪ ａｂｌｏｎｓｋｉ、Ａｎａ！、Ｂｉｏｃｈｅａ＋、　１４８：１９９　　（１９ ８５）によって記述されたものを含む、現在用いられている通常の方法の１つで あり得る。標識は、スペーサーまたは特異的結合対の別の要素を用いるような間 接法によってなされてもよい。この例は、非標識ストレプトアビジンおよびビオ チニル化酵素、非標識ストレプトアビジンおよび連続的もしくは同時に添加され たビオチニル化酵素を用いたビオチニル化抗体の検出である。酵素活性の検出は 、普通に知られた方法によって、色素産生の、蛍光発生の、磁性の、化学発光の または電気化学的な変化を測定することにより、容易にすることができる。

レポーターは現存する蛍光体、磁性体、または化学発光物質であり得る。加えて 、レポーターは電気化学的手段によって検出することができる。これらのレポー ターを用いた標識の方法のいくつかは上述されている。好ましい態様においては 、レポーターとして酵素、アルカリホスファターゼが使用され、基質に５−ブロ モ−４−クロロインドキシルホスフェイト（以下、ＢＣＩＰ）および２２°−ジ ー（ｐ−ニトロフェニル）−５５′−ジフェニル−３３°−（３３°−ジメトキ シ−４−４゛−ジフェニレン）−ジテトラゾリウムクロリド（以下、ＮＢＴ）が 使用される。

この発明において有用なモノクローナル抗体は、他の免疫グロブリンクラスと同 様にＩｇＧタイプであり得る。

さらに、これらのモノクローナル抗体は、標的に依存する多数の抗原性決定基に 対するものでもよい。説明としては、ヌクレオカプシドタンパク、糖タンパクま たはウィルスエンベロープに関連する抗原性決定基に言及することができる。

ウィルス検出に対する好ましい態様においては、この発明はまた、採取および移 送システム、特に、この発明の免疫検定による試験のための試料を移送するシス テムを用いる。

採取システムにはウィルスを採取する適切な手段が利用され、移送システムには 緩衝界面活性剤溶液を有するチューブが利用される。試料を採取した後、検体は 緩衝界面活性剤に浸漬される。直接浸漬すると試料中のウィルスが溶解し、それ により抗原が試験を受は易くなり、かつ移送の間安定になる。この溶液は、試料 中のタンパク質の互いの、もしくは接触する表面への非免疫性結合を最小にする キャリアタンパクも含む。

以下の界面活性剤は、この発明の範囲内にあるものとして言及することができ、 制限するものとして解釈されるものではない。ポリオキシエチレンエーテルおよ びアルキルフェノキシポリエトキシ化合物のような非イオン性界面活性剤；アル キル／アリールスルホネート／スルフェートのようなイオン性界面活性剤；両性 イオン界面活性剤；オクチルグルコピラノシドおよびドデシルマルトシドのよう な胆汁塩およびその誘導体。

典型的なキャリアタンパクには、血清、アルブミン、ゼラチンおよびカゼインが 含まれる。

検定システムに適合し得るいかなる緩衝剤も発明の実施に使用することができる 。

最も好ましい態様においては、緩衝剤はリン酸緩衝生理食塩水、界面活性剤はＮ ０ＮＩＤＦＴ　Ｐ−４０（ＮＰ４０）およびキャリアタンパクはウシ血清アルブ ミンである。

以下の実施例は発明を説明するためのものであり、これらに制限されるものでは ない。

５５３０７として同定される捕獲モノクローナル抗体および５５３０６として同 定される検出用モノクローナル抗体を、Ｉｎｆ’ｅｅｉｉｏｎ　ａｎｄ　Ｉａｕ ｎｕｎｉｔｙ、　Ｖｏｌ、２９、Ｎ０８２．７２４−７３２頁（１９８０年８月 ）に記載されたり、Ｐｅｒｅｉｒａらの方法、およびＢ、Ｍｉｓｈｅｌｌ　ａｎ ｄ　Ｓ、ＳｅｈＨｇｉ編、５ｅｌｅｃｔｅｄ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｃｅ１ｌ ｕｌａｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ１ν、Ｈ，Ｐｒｅｅｍａｎ　Ｃｏ、、　Ｓａｎ 　Ｐｒａｎｃｉｓｃｏの　Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ　Ｐｒｏｄｕｃ！ｎｇ 　Ｈｉｂｒｉｄ　Ｃｅ１ｌ　Ｌｉｎｅｓ　、　３５１−３７１頁に記載されたＯ ｆらの方法に従って調製した。

５５３０Ｂおよび５５３α７の両者は、）ＩＳＶ−１またはＩＳＶ−２のいずれ かからの糖タンパクｇＤと反応する。エピトープの特異性は、非標識抗体を固相 抗原に対するビオチン標識抗体と競合させることにより決定される。非標識抗体 が標識抗体の結合を阻害しない場合には、これらの抗体は異なるエピトープに対 するものであることが決定される。抗体５５３０Ｂおよび５５３０７は、ＩＳＶ 　ｌおよび２抗原ｇＤの異なるエピトープに対する特異性を有することが見出さ れた。

モノクローナル抗体は、４０％飽和硫酸アンモニウムを用いた塩分面および５ｅ ｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ−３００（Ｐｈａｒａ＋ａｃｉａ、　Ｉｎｃ、、　Ｐｌｓｃ ａｔａνａｙ、　ＮＪ　）でのゲルろ過によって腹水から精製される。

抗体ビオチニル化 抗体５５３０Ｂ溶液をＯ，１Ｍ　ＮａＨＣＯｉ緩衝液、ｐＨ８，４に対して透析 し、ｌ−当り　１ｍｇの濃度に調節した。ジメチルスルホキシドＯ，１ｍＪ７に ５０倍モル過剰のビオチン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（Ｓｉｇｍ ａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、（Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ、　Ｎｏ）およびＣａ１ｂｉ ｏｃｈｅａ＋　（Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、　ＣＡ）を含む様々な源から市販品を購 入）の溶液を添加して室温で２時間反応させ、２Ｍ）リス（ヒドロキシメチル） アミノ−メタン（以下、トリス−ＨＣｌ緩衝液という）　、ｐＨ８，０，０，１ １を添加した。１５分後、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）　、ｐｎｙ、４、中 の１９６ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ）　１−を添加し、この溶液をＰＢＳ に対して透析した。ビオチン化抗体は４℃で保存した。

透過性膜として使用するために、上述の化学的に活性化された膜（Ｃａｔ、Ｎｏ 、　ＩＡＳＤＯＯＯＯ５）をＭｉｌｌｉｐｏｒｅ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｂ ｅｄｆｏｒｄ、　ＨＡ　）から購入した。

第２図に示す外形５を有する、塩化亜鉛処理吸収剤プラグは、Ｐｏｒｅ　Ｔｅｃ ｈｎｏｌｏｇｙ　Ｌｉ１１ｉｔｅｄ　　（Ｓｏｍｃｒｖｉｌｌｅ、　ＨＡ）によ って以下のように製造された。多孔質ポリエチレンプラグを２００［［１Ｍ塩化 亜鉛および０．３％）リドンＸ−１００を含有するイソプロパツールで飽和した 。５０％塩化亜鉛水溶液は、Ｍｉｎｅｒａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｉｎｃ、　　 （Ｈａｒｒｉｓｂｕｒｇ、　ＮＣ）から購入した。この塩化亜鉛水溶液を、０． ３％トリトンＸ−１００を含有するイソプロパツールのガロン当り２０６ｇ溶解 した。プラグを、酵素−阻害剤含有溶液で飽和し、その後除去して使用の前に乾 燥させた。

ｌＯ倍濃縮ＰＢＳ　（Ｃａｔ、Ｎｏ、　３１０−４２００）をＧＩＢＣＯ（Ｇｒ ａｎｄ　Ｉｓ］ａｎｄ、　ＮＹ）から購入し、蒸留水で１／１０に希釈した。

ＨＩＰＵＲＥ液体ゼラチン（４５％ｗ／ｖ）をＮｏｒｌａｎｄ　Ｐｒｏｄｕｃｔ ｓ。

Ｉｎｃ、　（６９５Ｊｏｙｃｅ　Ｋｉｌｍｅｒ　Ａｖｅｎｕｅ、　Ｎｅｗ　Ｂｒ ｕｎｓｗｉｃｋ、　ＮＪ）から得た。以下、これをゼラチンという。

ストレプトアビジンおよびアルカリホスファターゼを５ｃｒｉｐｐｓ　Ｌａｂｏ ｒｔｏｒｉｅｓ　（Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、　ＣＡ　）から購入し、ここに参考と して組み込まれているＥ、Ｅｎｇｖａｌｌ　ａｎｄ　Ｐ、Ｐｅｒｌｎ＋ａｎｎ、 　ＩＩｏｎ＋ｕｎｏｃｈｅＩＩｉｓｔｒｙ　８．８７１　（１９７１）に記述さ れた一工程グルタルアルデヒド法を用いて結合させた。

酵素検定の基質は、トリス−ＨＣｌ緩衝液中のＢＣＩＰ／ＮＢＴであった。これ らの試薬は、Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ　ａｎｄ　Ｐａｒｒｙ、　Ｇａｉｔｈｅｒｓ ｂｕｒｇ、　ＨＤのような企業から購入した。

捕獲および検出用モノクローナル抗体を上述のように調製して精製し、検出用抗 体を上述のようにビオチニル化した。

標準抗原調製品はＬＩＴ　０３２９８４１　ＨＶＳ−１であった。陰性抗原はＬ ＩＴ　０４１１８５であった。両者はＶｉｒａｌ　Ａｎｔｉｇｅｎｓ、　Ｉｎｃ 、　（Ｈｅｍｐｈｉｓ、　Ｔｅｎｎｅｓｓｅｅ）から購入した０標準抗原調製品 および陰性標準は、下記のように、試料希釈液中に希釈した。

検定溶液 ＰＢＳを１０倍希釈液として購入し、上述のように、蒸留水で１／１０に希釈し た。

標準抗原以外液は、０．０５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０Ｍ％Ｎｏｎ１ ｄｅｔ　Ｐ−４０、および０．１％アジドを含有するＰＢＳ。

ｐＨ７，４であった。この溶液をポアサイズ０，２２−の膜を通してろ過した。

検出用抗体希釈液は、４％加熱正常ウサギ血清（Ｇ　Ｉ　ＢＣＯ）、０８８５％ ＮａＣ１および０．１％アジドを含有する０、２Ｍへペス緩衝液、ｐＨ７，５で あった。この溶液は、使用前に５０℃で一晩加熱し、ポアサイズ０．２２−のフ ィルタを通してろ過した。

結合体希釈液は、１％ＢＳＡ、　０．０５％トウイーン２０、および０．１％ア ジドを含有するＰＢＳ、　ｐＨ７，４であった。この溶液は０．２２μ膜を通し てろ過した。

基質緩衝液は、Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ　ａｎｄ　Ｐｅｒｒｙから購入した。この 溶液は０．２２μ膜を通してろ過した。

洗浄緩衝液は、０．０５％トウイーン２０を添加した基質緩衝液であった。

停止溶液は１．ＯＮ　ＨＣＩであった。

上述の５５３０６として同定されるビオチニル化検出用抗体を、上述の検出用抗 体希釈液中に１／４０に希釈した。標準抗原調製品および陰性抗原調製品を上述 の標準抗原希釈液で希釈した。ストレプトビオチン−アルカリホスファターゼ結 合体を結合体希釈液中に１１５００に希釈し、基質を、基質緩衝液にＢＣＩＰ　 ｌ−およびＮＢＴ　１−を添加することにより、使用直前に調製した。

装置の作成 透過性膜を、上述の５５３０７として同定される捕獲モノクローナル抗体２パで スポットした。この捕獲試薬は、スポツティングの前に、２ｍｇ／−の濃度に希 釈された。

膜を約５ないし３０分間乾燥させた後、加湿チャンバ内において約３７℃で、Ｐ ＢＳ中の５％ゼラチンを用いて一晩ブロックした。ブロッキング溶液は膜を通し て注意深く吸引し、膜は使用前に乾燥させた。

約３−４趣の径を有する捕獲抗体スポットの下の領域における、約ｉｏｏ　ｘ約 ３００−の５個の孔は、繊維状多孔質ポリテトラフルオロエチレン膜に形成され た。最良の結果は、３０ゲージの針を用いて捕獲抗体スポットの下の領域に５個 の孔を形成することにより得られた。４個の孔が、中央の第５の孔の周りに対称 的に配置された対称配置が最適に作用した。

装置は、上述の通りに組み立てられた。

検定手順 ポリエチレンチューブ中で、抗原０．２ｄを、検出用抗体希釈液に希釈した検出 用抗体０．２−と混合し、室温で１−ｉｏ分間インキュベートして抗原をビオチ ニル化検出用抗体と反応させた。標準抗原以外の試料を検定する場合には、上述 のように、次に特定の物質の除去が必要となることもあることに注意しなければ ならない。

インキュベーション後、混合物を検定装置に入れた。タブを押し下げて、孔を通 した良好な試薬の流動が始まることを確実にした。約５分以内に、試料液体は装 置に吸収された。

さらに５分間（試料添加から１０分間）室温でインキュベーションを続け、抗原 −ビオチニル化抗体を捕獲試薬と結合させた。次に、室温で１０分間インキュベ ートした結合体０．２１を添加して、ストレブトアビジンーアルカリポスファタ ーゼ結合体をビオチニル化ビオチニル化検出用抗体と結合させた。

その後、洗浄緩衝液０．４−を添加した。洗浄緩衝液が十分に吸収されたときに 、基質０．２ａｉ＋を装置に添加し、室温でイキュベートして色を発現させた。

１０分後、停止溶液０．２−を添加した。

膜は、結果を記録するために保存する前に、取り外し、水で洗浄し、かつ乾燥さ せることができる。乾燥膜は、光から保護されたならば、数が月間安定である。

国際調査報告 ｌｅＮ＋□−＾１°”１°ｍｗｗｈｎＮ・ｒ／ＩＪＳ８９１０ｉ７８５

Claims (39)

【特許請求の範囲】
1. １．被検物質の含有が疑われるサンプル中において、前記被検物質の存在もしく は不存在を検出しまたは定量するために、 （ａ）捕獲試薬が付着された透過性膜と、（ｂ）中間層と、 （ｃ）吸着材層 とを具備し、且つ層（ｂ）が層（ａ）および（ｃ）と直接連通した構造を有する 膜ベースの検定装置において、前記層（ｂ）が選択的な透過性膜であり、該膜は これを貫通する少なくとも一つの孔を有することと、該孔は前記捕獲試薬の直下 にあることと、前記孔の全面積は、前記捕獲試薬によってカバーされた面積より も小さいこととを特徴とする改良された検定装置。
2. ２．前記層（ｂ）が約１〜約７の孔を有する請求の範囲第１項に記載の検定装置 。
3. ３．前記捕獲試薬が、共有結合的に付着されている請求の範囲第１項に記載の検 定装置。
4. ４．前記孔が、約２５μｍ×約１０００μｍ（ａｂｏｕｔ　２５　ｍｉｃｒｏｍ ｅｔｅｒｓ　ｂｙ　ａｂｏｕｔ　１０００　ｍｉｃｒｏｍｅｔｅｒｓ）である請 求の範囲第２項に記載の検定装置。
5. ５．前記孔が、前記捕獲試薬下の面積の約０．４％〜約１０％を占める請求の範 囲第２項に記載の検定装置。
6. ６．前記捕獲試薬が、モノクローナル抗体または免疫反応性モノクローナル抗体 フラグメントである請求の範囲第１項に記載の検定装置。
7. ７．前記層（ａ）が微孔質膜、予め化学的に活性化された表面を有する膜、およ び化学的に活性化された親水性微孔質膜からなる群から選択される請求の範囲第 １項に記載の検定装置。
8. ８．前記層（ｂ）が、繊維性−多孔質ポリテトラフルオロエチレン膜である請求 の範囲第１項に記載の検定装置。
9. ９．前記捕獲試薬が、免疫結合対の要素である請求の範囲第１項に記載の検定装 置。
10. １０．バックグラウンド発色を低減するために、前記吸着材層が酵素阻害剤を含 有する溶液で飽和される、請求の範囲第１項に記載の検定装置。
11. １１．前記吸着材層が塩化亜鉛溶液で飽和される、請求の範囲第１０項に記載の 検定装置。
12. １２．前記吸着材層が、セルロース、酢酸セルロース、ポリエステル、多孔質ポ リエチレンおよびポリエチレンテトラフタレートからなる群から選択される請求 の範囲第１項に記載の検定装置。
13. １３．（ａ）捕獲試薬が付着された透過性膜と、（ｂ）中間層と、 （ｃ）吸着材層 とを具備し、且つ層（ｂ）が層（ａ）および（ｃ）と直接連通した構造を有する 膜ベースの検定装置を用い、検定に使用されるサンプル、検出試薬および他の試 薬が前記層（ａ）に添加され、該層（ａ）上の捕獲試薬に結合した物質を検出し て行われる、被検物質の含有が疑われるサンプル中の前記被検物質の存在もしく は不存在を検出しまたは定量するための膜ベースの免疫検定において、 前記層（ｂ）が選択的な透過性膜であり、該膜はこれを貫通する少なくとも一つ の孔を有することと、該孔は前記捕獲試薬の直下にあることと、前記孔の全面積 は、前記捕獲試薬によってカバーされた面積よりも小さいこととを特徴とする免 疫検定。
14. １４．検出または定量されるべき物質がポリペプチド、タンパク、多糖類、核酸 、血液凝固因子、ホルモン、バクテリア及びウイルスからなる群から選択される 請求の範囲第１３項に記載の免疫検定。
15. １５．検出されるべき物質が、アデノウイルス、単純ヘルペス、帯状水痘、ヘル ペスウイルスＢ、サイトメガロウイルス、エプスタイン−バーウイルス、ポック スウイルス、ピコルナウイルス、オルソミクソウイルス、パラミクソウイルス、 コロナウイルス、ラブドウイルス、トガウイルス、ブンヤウイルス、アレナウイ ルス、風疹ウイルス、アルボウイルス、レオウイルス、肝炎、レトロウイルス及 び腫瘍ウイルスからなる群から選択される、請求の範囲第１４項に記載の免疫検 定。
16. １６．サンプルが緩衝液、洗剤およびキャリアタンパクを含有する緩衝洗剤溶液 を収容したチューブ内に直接移される、請求の範囲第１５項に記載の免疫検定。
17. １７．前記捕獲試薬がモノクローナル抗体または免疫反応性モノクローナル抗体 フラグメントである請求の範囲第１３項に記載の方法。
18. １８．前記捕獲試薬が免疫結合対の要素である、請求の範囲第１３項に記載の免 疫検定。
19. １９．前記検出試薬が免疫結合対の要素から選択される請求の範囲第１３項に記 載の免疫検定。
20. ２０．前記検出試薬がモノクローナル抗体または免疫反応性モノクローナル抗体 フラグメントである請求の範囲第１３項に記載の免疫検定。
21. ２１．前記抗体またはフラグメントは、標識されているか又は標識されておらず 、また抗体またはフラグメントが標識されていないときは、標識された抗体と反 応される請求の範囲第２０項に記載の免疫検定。
22. ２２．前記抗体またはフラグメントが、レポータ系の成分で標識されるか、また は特異的免疫対もしくは非免疫対の第一要素で標識される請求の範囲第２０項に 記載の免疫検定。
23. ２３．前記モノクローナル抗体またはフラグメントが、放射性同位体、酵素、蛍 光発生物質、磁性体物質、化学発光物質および電子化学的物質からなる群から選 択されるレポータで標識される請求の範囲第２２項に記載の免疫検定。
24. ２４．前記抗体またはフラグメントは、放射性同位体、酵素、蛍光発生物質、磁 性体物質、化学発光物質および電子化学的物質からなる群から選択されるレポー タが結合された、結合対の第二要素と反応される請求の範囲第２２項に記載の免 疫検定。
25. ２５．前記抗体またはフラグメントが、ビオチンで標識される請求の範囲第２２ 項に記載の免疫検定。
26. ２６．ビオチニル化された抗体またはフラグメントが、ストレプトアビジン−ア ルカリホスファターゼと反応される請求の範囲第２５項に記載の免疫検定。
27. ２７．請求の範囲第２３項の生成物が、酵素基質としてのＢＣＩＰおよびＮＢＴ と反応される請求の範囲第２６項に記載の免疫検定。
28. ２８．酵素検出系を用いて検定装置の吸着材層における発色を低減する方法であ って、前記吸着材層を、前記検出系の酵素に特異的な酵素阻害剤を含有する溶液 で飽和することを具備した方法。
29. ２９．前記酵素阻害剤が塩化亜鉛である請求の範囲第２８項に記載の方法。
30. ３０．前記吸着材層がセルロース、酢酸セルロース、ポリエステル、多孔質ポリ エチレンおよびポリエチレンテトラフタレートからなる群から選択される、請求 の範囲第２８項に記載の方法。
31. ３１．酵素検出系を用いて検定装置の吸着材層における発色を低減する方法であ って、前記吸着材層を、アルカリホスラターゼに特異的な酵素阻害剤を含有する 溶液で飽和することを具備した方法。
32. ３２．前記阻害剤が亜鉛イオン、ベリリウムイオン、システイン、ヒスチジン、 フェニルアラニン、ＥＤＴＡ、ヨードソベンゾエート、ヨードアセトアミド及び １，３，４，６−テトラクロロ−３α−６α−ジフェニルグリコウリルからなる 群から選択される請求の範囲第３１項に記載の方法。
33. ３３．前記阻害剤が塩化亜鉛である請求の範囲第３２項に記載の方法。
34. ３４．請求の範囲第２８項に記載の方法に従って処理された吸着材層。
35. ３５．前記酵素阻害剤が塩化亜鉛である請求の範囲第３４項に記載の吸着材層。
36. ３６．セルロース、酢酸セルロース、ポリエステル、多孔質ポリエチレンおよび ポリエチレンテトラフタレートからなる群から選択される、請求の範囲第３４項 に記載の吸着材層。
37. ３７．請求の範囲第３１項に記載の方法に従って処理された吸着材層。
38. ３８．前記阻害剤が塩化亜鉛である請求の範囲第３７項に記載の吸着材層。
39. ３９．セルロース、酢酸セルロース、ポリエステル、多孔質ポリエチレンおよび ポリエチレンテトラフタレートからなる群から選択される、請求の範囲第３７項 に記載の吸着材層。