JPH04500306A

JPH04500306A - ｔ―ＰＡ類似のポリペプチド、その製造法および使用

Info

Publication number: JPH04500306A
Application number: JP1509191A
Authority: JP
Inventors: バツハ，アルフレート; シユミツト，マルチン; シユトルベ，カール―ヘルマン; バルデインガー，ヴエレナ; シユヴアルツ，マルガレツテ
Original assignee: ビーエーエスエフ　アクチエンゲゼルシヤフト
Priority date: 1988-09-17
Filing date: 1989-09-07
Publication date: 1992-01-23
Also published as: DE3831714A1; WO1990003436A1; EP0403598A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】ｔ−ＰＡ類似のポリペプチド、その製造法および使用本発明は、プラスミノゲン活性化因子を有する新規ｔ−ＦＡ類似のポリペプチド、その製造法および疾病を防除する際の該化合物の使用に関する。

ヒトの発達した組織−ブラスミノゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）は、５２７アミノ酸および約６８ｋＤの分子量からなるポリペプチドである（　ｐＨｎ１ｃａ他、ｊ９８３、Ｎａｔｕｒｅ　３０１．　２１４−２２１およびＮｙ他、１９８４、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ｔｌＳＡ８１　％　５３５５−５３５９）（第１ａ図〜第１ｃ図参照）。分子は、種々の機能に対応する数多くの別個の部位、所謂ドメインを包含する。Ｎ末端は、フィブロネクチンと同族であるフィンガ一部位（Ｆｉｎｇｅｒ−Ｒｅｇｉｏｎ）によって形成されている。引続き、多数の成長ファクターを備えＩ；相同性を有する領域が続く。それに続いて、２つの環ドメインが続く。−重鎖分子を２個の鎖に分解することができる分解個所の後に、プロテアーゼ−ドメインが統さ、これは、活性中心を包含しかつ他のセリン−プロテアーゼに対して相同性を有する。

多数の性質は、組織−グラスミノゲン活性化因子を重要な分子に変え：ｔ−ＰＡは、フィブリンに対して強力な親和性を存し、プラスミノゲン活性化は、フィブリンに依存し；プロテアーゼとしてｔ−ＰＡはプラスミノゲンをプラスミンに分解し、プラスミンは再びフィブリンを分解生成物に分解オる。ｔ−Ｐ、Ａは、プラスミノケ〉・抑制因子によって抑制可能である。更に、ｔＰＡは、相対的に短い半減期を有し；分子は、肝臓中で迅速に分解される。

このファクターは、ｔＰＡが生体内で血液凝固に対して特異的にプラスミノゲンをプラスミンに活性化しかつフィブリンの分解によって血管流れの再生を生ぜしめることを惹起する。従って、ｔＰＡは、フィブリン溶解治療において、例えば心臓硬塞により使用することができる。

ところで、ｔＰＡのアミノ酸配列またはそれから誘導される配列を有するがｌ− ６トリベブチドがトリペプチドＲＧＤによって代替されているｔＰＡ類似のポリペプチドは改善された性質を有することが見い出されｌこ。

ｔＰＡから誘導された配列は、天然に由来する対立遺伝子変態および合成変態であり、これらは、初期構造において９０％を上越る量が天然のｔＰＡと一致しかつグラスミノゲン活性化作用を有する。

新規ポリペプチドは、特に分子の全長が不変の場合にｔＰＡ中でそれぞれ１つのトリペプチドの代わりに１つまたはそれ以上のＲＧＤ　（−Ａ　ｒ　ｇ−Ｇ　ｌ　ｙ−Ａ、　ｓｐ）を含有する。

有利なのは、殊にトリペプチドＲＧＤを位１ｔ１３０〜１３２に有するポリペプチドである。更に、有利なのは、位置１３０〜１３２のＲＧＤ配列に加えて１〜２個の他の付加的なＲＧＤ　トリペプチドを含有するポリペプチドである。

更に、本発明は、変化したポリペプチドに対してコート化されるＤ　Ｎ　Ａ配列、ならびにこのＤＮＡ配列配列台有するベクターに関する。

新規のポリペプチドは、遺伝子技術的に公知方法により製造することができる。

本明細書中に記載されｔ−構造に対する出発点は、ｃ　ＤＮＡクローン（以下、ｐＵＣｔ　ＰＡと呼ぶ）であり、これは、ｔＰＡのフード化配列を有しかつなお５′および３′の翻訳されていない範囲を含有する。゛リーダーパ配列およびプロ配列の後に、５ｅｒ（１）を有する成熟した蛋白質が開始し、かつＰ　ｒ　ｏ　（５２７）の後で終わる。

ｐＵｃ　ｔ　ＰＡは次のようにして単離されるニヒトの子宮組織からｍＲＮＡは単離されかつ二、１！　ｔ１４　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａに書き換えられる。このｃＤＮＡを市場で入手できるクローン化ベクターｐＵＣ９に装入しｊ°後に、１つのｃ　Ｄ　Ｎ　、Ａ−ライブラリーが取り付けられるうこの場合使用される方法は、倒えばＭａｎｉａｔｉｓ他、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１゜ｎｉｎｇ、Ｃ５）！− 社刊に記載されている。放射線標識されたオリゴスクレオチドプローブを有する遺伝子バンクの“スクリーニング″は、その間に屡々使用さＪ１記載された方法である。この方法により、コード化部位および限定される範囲を含有するｃ　Ｄ　Ｎ　Ａクローンは単離することができる。

ｐＵＣ９ｔ　ＰＡのＤＮＡ配列の一部は、制限酵素を用いて容易に得る３七ができる。場合によっては、化学的に合成されたオリゴヌクレオチド、アダプターまたは遺伝子断片と関連する前記断片は、新規のポリペプチドに対してつ一ド化するＤＮＡ配列をクローン化ｒるために利用することができる。遺伝子断片もしくは合成りＮＡ配列をクローン化ベクター、例えば市販のブ七・スミドｐＢＲ３２２，ｐＵｃ８もしくは９、ｐＵＣ１８もり、　＜は１９、Ｍ　ｌ　３　ｍ　ｐ　ｌ　８もしくはＭ１３ｍｐｌＱ中に導入することは、公知方法で行なわねる。また、遺伝子または遺伝子断片は、適当に化学合成されｔ−かバクテリア、ファージ、真核生物細胞またはそのビールスから単離された対照部位を備えることができ、この対照部位は、蛋白質の表現を可能にする。こらして得られハイブリッドプラスミドを適当な宿主生物体に形質転換するかまたは移入することは、同様に公知であり、か・）６記されている。また、ハイブリッドプラスミドは、媒体中へのポリペプチドの分泌を許容する相応する信号配列を有す”ることができる。

哺乳動物における表現の場合には、表現すべき遺伝子、この場合には変異されたｔＰ、Ａ−ｃＤＮＡをマウス−メタロチアニン促進因子またはウィルスＳＶ４０促進因子の下４こ置くベクターが使用され得る。メチオニン出発コドンおよびｔＰＡ遺伝子のリーダー−／プロ配列が存在することは、表現にとって必要なことである。更に、エビソームとしてかまたはゲノムｔこ組み込まれたものとして該ベクターのコピーを有するクローンが単離される。特に好ましいのは、牛乳ｌＩ！踵のウィルスを基礎とする異質遺伝子の組換えおよび表現で１＞Ｚ＞。バクテリア細胞の複製および抗生物質抵抗性に対してコード化される原核配列との関連で、所謂“シャトル”ベクターの構成は可能である。プラスミドの構成および増殖は、差当たりバクテリア細胞中で行なわれ；引続き、真核細胞、例えばマウス繊維芽細胞系Ｃ１２７への変換が行なわれる。勿論、別の細胞系、例えば酵素、昆虫細胞および別の哺乳動物細胞、例えばＣＨＯ細胞、Ｌ細胞および２９３細胞も表現に使用することができ乙。

この真核表現系は、生産物を効果的に多くの場合に天然の形で分泌する状態であるという利点を有する。

更に、二の真核表現系は、生産物を翻訳後に修飾する能力を有する。

こうして、組織−プラスミノゲン活性化因子は、表現の際に真核細胞中でなおグリコシド側鎖をアミノ酸１１７．１８４および４４８（Ａｓｎ）に接して得る。

バクテリアは、グリコンド側鎖を合成する状態にはない。多くの場合にバクテリアの際に表現される真核蛋白質、例えばｔＰＡおよびそれから本発明により誘導されるポリペプチドは、細胞内で変性された封入体として生じかつ蛋白質化学的に復元されなければならない。更に、バクテリアは、屡々開始剤アミノ酸メチオニンを完成蛋白質と分離する状態にある。分泌系を使用することによって、この困難は回避することができる。

しかし、遺伝子コードの変性に基づいて、新規のポリペプチドの表現のためｌ；別のＤＮＡ配列、例えば異なるＤＮＡ配列を有する化学合成された遺伝子を利用することは、可能でもある。

新規のポリペプチドの精製は、公知方法によるアフィニティクロマトグラフイーおよびイオン交換クロマトグラフィーにより培地からの分離によって行なわれる。

本発明により得られｔ；ポリペプチドは、次に記載した点で改善された少なくとも１つの性質：凝塊特異性、半減期、抑制因子結合、蛋白質分解活性度を有し、したがって血栓溶解に使用することができる。この場合、このポリペプチドは、ヒトの組織−グラスミノゲン活性化因子に対して改善された性質を示す。

従って、本発明の対象は、新規のポリペプチドの少なくとも１つを、場合によっては製薬学的に認容性の担持剤または結合剤中に含有する医薬品でもある。また、この医薬品は、新規の蛋白質と、別の繊維素溶解薬、例えばプロキナーゼ、ウロキナーズもしくはストレプトキナーゼまたはそれらの誘導体との組合せ物、ならびに別の薬理蛋白質、例えばスーパーオキシドジスムターゼとの組合せ物を含有することができる。本発明の他の特徴は、次の実施例中に詳細に記載されている。

遺伝子技術的には、そのために例えばＨａｎｄｂｕｃｈ　ｖｏｎＭａｎｉａｔｉｓ他、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｏ１ｃｌ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ｌ　９８２が指摘される。

例１ヒト組織−プラスミノゲン活性化因子に対するｃＤＮＡクローンの単離ａ）ＲＮＡの調製ｔＰＡ生産するヒト子宮組織３０９をグアニジニウム６モル、クエン酸ナトリウム５ミリモル（ｐＨ７゜０）、２−メルカプトエタノール０．１モル、サルコシル（Ｓａｒｃｏｓｙｌ）　０　、５％中にウルトラ−ターラックス（［１ｔｒａ −丁ｕｒｒａｘ・）中で溶解した。粗大な細胞の破片を３００Ｏｒｐｍで遠心分離した。ＲＮＡをＣｓＣｌクツシ３ン５．７モルを通して遠心分離することによって１晩中４５００Ｏｒｐｍで沈降させた。引続き、ポリＡ＋含有ＲＮＡフラクシ１ンをオリゴ（ｄＴ）−セルロースでのアブィニティクロマトグラフイーによって分離した。

ｂ）ｃＤＮＡバンクの製造酵素の逆転写酵素（ＡＭＶ）およびオリゴ（ｄＴ）１２〜１８をプライマーとして用いて、ポリ八〇−ＲＮＡを一重鎖ｃ　ＤＮＡに書き換えた。第２の鎖の合成は、エシェリキアコリーＤＡＮポリメラーゼｌを用いて行なわれた。二重５７４　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａについては酵素Ｔ　４−ＤＮＡリガーゼを用いて５ａｌＩリンカ−が取り付けられる。市場で入手できるプラスミドｐＵＣ９を制限酵素と一緒に線状化する。２つのＤＮＡを互いに結合させ、こうして得られたハイブリッドＣａＣｌ２処理された、エシェリキアコリ菌株ＨＢＩＯＩの適格な細胞を形質転換した。

この細胞にＬＢ板上でアンピシリン１００μｇ／ｍ（１を塗布し、かつ１晩中３７℃で恒温保持した。

ｃ）ｃＤＮＡバンクのスクリーニング約ｓ　ｏ　ｏ　ｏ　００（［のコロニーをニトロセルロースフィルター上に塗布し、レプリカ平板法を実施し、０゜５ＮのＮａＯＨ／ＮａＣｌ　Ｏ，５モルで溶解し、変性されたＤＮＡを２時間の焼付けによって８０℃で堅固にフィルターに結合させた。

このフィルターを５ｘＳＥＴ緩衝液（ＩＸＳＥＴ〜ＮａＣ１０，１５モル、トリス１５ミリモル／ＨＣＩ　ｐＨ７，４、ＥＤＴＡ　ｌミリモル）、５ＤＳＯ。

１％および５×デンハルト（Ｄｅｎｈａｒｄｔ）溶液（５０ｍ１２当りｌ　００　ｘ　Ｄｅｎｈａｒｄｔｗ−フィコールｌｉｔ、ポリビニルピロリドン１ｇ、ＢＳＡｌｔ）中で６８℃で４時間前ハイブリッド形成させｔ：（核酸に対して非特異的結合位置での飽和）。

ＤＮＡ合成装置を用いて、ｔＰＡ−ＤＮＡに対してそれぞれ１７個の塩基を有する３個のオリゴヌクレオチドプローブを製造しｊ；。このオリゴヌクレオチドプローブは、次の配列からなる：５’ＴＧＣＡＧＡＴＣＡＣＴＴＧＧＴＡＡ３’５’ＣＣＡＧＧＣＣＣＡＧＴＧＣＣＴＧＧ３’５’ＴＣＣＡＧＴＣＣＧＧＣＡＧＣＴＧＣ３’このプローブを５′ 末端につきγ−３２Ｐ　−Ａ　Ｔ　Ｐで標識化した。次に、このプローブを前ハイブリッド形成したフィルターを用いて、６ＸＳＥＴ％　５ＤＳ０．１％、５　Ｘ　Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液およびデキストランスルフェート１０％を含有する溶液中で１晩中４２℃で弱く振盪させながら恒温保持しｔ；。その後に、このフィルターを数回６ＸＳＥＴ／５ＤＳＯ，１％中で４２°Ｃで洗浄し、乾燥させ、かつＸ線フィルムに露出しｔ；。スクリーニングの際に放射化アンサ−（ｒａｄｉｏａｋＬｉｖｅ　Ａｎｔｗｏｒｔ）を与えるクローンを単離し、かつさらに培養した。

１つのクローン（以下、ｐＵＣｔ　ＰＡと呼ぶ）は、約２゜ｌｋｂの大きさの挿入断片を含有し、この挿入断片は、コード化部位、ならびに５′および３′の非フード化範囲を含有する（第２図）。ｐＵＣｔ　ＰＡのプラスミドＤＮＡをリゾチーム溶解およびバクテリア培地のＳＤＳアルカリ金属地理ならびに引続＜ＣｓＣ１勾配遠心分離によって調製した。

例２一重鎖ｔＰＡフード化ＤＮＡの製造出発点は例１に記載のプラスミドｐｕｃ　ｔ　ＰＡであった。これを調製的に制限酵素５ａｌｌを用いて切断した。得られた断片をゲル電気泳動法により分離した。ｔＰＡコード化ＤＮＡ配列を含有する５ａｌＮを電気泳動法によりゲルから溶離しｔ；。この断片３０ｎｇを４℃で５ａｌＩ切断した、商業的に得られるクローン化ベクターｍｐ１９　１１００ｎと結合した。結合配合物の容量は１０μ Ｑであった。結合を８０℃に５分間加熱することによって終結させた。

この結合配合物の１／ｌＯの容量を適格なＪＭＩＯ１細胞の形質転換にために使用した。形質転換の終結後、形質転換配合物に０．２モルのＩ　ＰＴＧ溶液６０ｆｉＱおよびＸＧａ　Ｉ　ｌ　２０μＱ（２０ｍｇ／ｍＱ）を添加しｔ；。この配合物をＮＺＹＤＴ寒天上のＮＺＹＤＴトップアガル（Ｔｏｐａｇａｒ）中に塗布した。媒体ＮＺＹＤＴは商業的に得ることができる。ｔＰＡ−ｃＤＮＡを含有するクローンは、斑の不足した青変のために確認することができた。ＤＮＡ配列分析（Ｓａｎｇｅｒ他、１９７７、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、ｓｃｉ、ＵｓＡ７４．５４６３〜５４６７）により、ｔＰＡ−ｃＤＮＡの配向をプラスミド中で確認した。

ｔＰＡのｃＤＮＡを、−重鎖Ｍ１３ファージの形成の際にｔＰＡの十−鎖がファージゲノムのｃＤＮＡ成分であるように配向して含有するｍ−Ｐ　ｌ　９　？ラスミドは〜ｍｐ　ｔ　Ｐ　Ａと呼ばれた。

ところで、菌株ＪＭＩＯＩのバクテリアまたはそれから誘導される細胞をプラスミドｍｐｔ　ＰＡで形質転換する場合には、この細胞の増殖の際に一重鎖バクチリアファージを、ｔＰＡ−ｃＤＮＡの十−鎖を含有する媒体中に去らせる０次に、−重鎖ＤＮＡは、従来の屡々記載されている方法により単離することができるその他の点では、別記しない場合には、酵素およびプラスミドの製造者には、酵素を分解しかつプラスミ例３ｔＰＡのｃＤＮＡ中への置換基の導入状に、置換されたｃＤＮＡの表現後にアミノ酸モチーフＲＧＤが１回または数回ポリペプチドの異なる位置でｔＰＡを含有している全部のものを生ぜしめる置換基が記載されている。この全部のポリペプチドは、５２７のアミン急の長さを有する。置換基の出発点は、例２に記載のｍｐ　ｔ　Ｐ　Ａであった。

−重鎮ｍｐｔＰＡ　Ｏ，０４ｐｍｏｌを、配列が１〜３回までの塩基交換でｍｐｔＰＡ　ＤＮＡの変化すべき範囲に対して補足するオリゴヌクレオチド０．５μ ｍｏ　ｌ　（２１−２７ｍａ　ｒ）と反応させｔ；。オリゴヌクレオチドを先にＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いてホスホリル化しｔ；。典型的な突然変異誘発配合物は、次のものから認められるニ一重鎖ｍｐｔＰＡ　ＤＮＡ　ｌμ１２（０，０４ｐｍｏｌ）キナーゼ化オリゴヌクレオチド（キナーゼ化反応からのＡＴＰを含む）　１　、ｕｆｆ（０，５ｐｍｏ　１）ｌＯ×リガーゼ緩衝液　５μａ１ミリモルのｄＮＴＰｓ　２．５μ０（最終的濃度５０μＭ）１ミリモルのＡＴＰ　４μｇ（最終的濃度１００μＭ）Ｈ２Ｏ３６，５μ４突然変異誘発配合物を３７℃で１５分間恒温保持し、次いで室温に冷却し、最後に１単位のフレノウ断片（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を添加した。室温で１時間の恒温保持後、２００単位のＴじリガーゼ（Ｂｉｏｌａｂｓ）を添加した。その後に、この配合物を４℃で１６時間恒温保持した。引続き、この配合物５μｇを成分ＪＭＩ０１の形質転換のために使用した。それから生じる７ア一ジ斑をニトロセルロース上に移しＩ；。その後に、フィルターを５分間５ＸＳＳＣ中で洗浄し、空気で乾燥し、かつ８０℃で２時間“焼き付けｊ；。前／＼イブリッド形成およびハイブリッド形成を例１の記載と同様に実施した。フィルターの洗浄は６ＸＳＥＴ／ＳＤＳ　０１１％で５５〜６５℃の温度で、使用したオリゴヌクレオチドーハイブリッド形成試料の塩基ｉ成および長さに依存して行なわれた。それぞれ相応する突然変異誘発配合物中で使用されるオリゴヌクレオチドを用いてハイブリッド形成された。正のクローンはオートラジオグラフィーにより目で見ることができｌこ。

この置換は、ｍｐｌａ中に含有されているｔＰＡ−ｃＤＮＡが今や、１つまたはそれ以上の位置でアミノ酸モチーフＲＧＤならびに３つの他のアミノ酸置換基を含有するポリペプチドに対してコード化することを生ぜしめ、この場合このポリペプチドのアミノ酸の全体数はそれぞれ５２７である。

例２に記載のｍｐｔＰＡ−ＤＮＡをオリゴヌクレオチドＣ，＋５’ＡＧＣＡＧＴＣＡＣＴ　ＧＧＡＴＣＣＣＴＣＡ　ＧＡＧＣ３’ Ｃｘ、：　５’ＡＣＧＴＧＧＣＣＣＧ　ＧＧＴＡＴＣＴＡＴＴ　ＴＣ３’ ＣＡ：５’ＡＡＣＴＴＴＴＧＡＣｃｃｃｃｃｃＴｃＡＧ　ＴＧＧＣＡ　３’ Ｃい：５’ＣＡＧＧＣＣＧＣＡＧ　ＣＴＣＧＡＧＣＡＧＧ　ＡＧＧＧ３’ を用いて、個々の蛋白質領域をコード化するＤＮＡ断片の間で制限酵素に対して付加的に認識位置が発生するように突然変異させた。この認識位置は、個々の蛋白質領域をコード化するＤＮＡ断片の意図的な切取りを可能にする。このように突然変異されたｍｐ　ｔ　ＰＡＤＮＡは、次の例３．１〜３．１３の出発点であった。

例１．３例３の記載と同様に突然変異誘発のために、次の配列を有するオリゴヌクレオチドを使用した：５’ＴＣＴＧＣＧＴＴＴＴＡＴＣＡＣＣＴＣＴＧＣＡＧＡＴ３’ 洗浄温度は、６ＸＳＥＴ／ＳＤＳ　Ｏ，１％中で６０℃であっＩ；。

生じる正のクローンはｍｐｔＰＡ−Ｒ，ＧＤｌと呼ば例３の記載と同様に突然変異誘発のために、次の配列を存するオリゴヌクレオチドを使用した二５’ＣＣＡＣＣＣＧＧＣＴＣＧＣＣＴＣＴＧＡＧＣＡＣＡ３’ 洗浄温度は、５ＸＳＥＴ／ＳＤＳ　Ｏ，１％中で６２℃であった。

生じる正のクローンはｍｐ　ｔ　ＰＡ−ＲＧＤ２＋！：呼ｌｆ例３の記載と同様に突然変異誘発のために、次の配列を有するオリゴヌクレオチドを使用した：５ ’ＡＣＣＡＧＣＡＡＴＡＡＴＣＣＣＣＣＣＧＧＴＴＧＣＴ３’ 洗浄温度は、５ＸＳＥＴ／ＳＤＳ　Ｏ，１％中で６０℃であっｊ；。

生じる正のクローンはｍｐ　ｔ　ＰＡ−ＲＧＤ３と呼１ｆれｊこ。

例３４例３の記載と同様に突然変異誘発のために、次の配列を有するオリゴヌクレオチドを使用した：５’ＣＴＧＴＧＣＴＣＣＡＡＴＣＧＣＣＣＣＴＧＴＡＧＣ３’ 洗浄温度は、６ｘｓＥＴ１５Ｄ５　０．１％中で６０°Ｃであっに。

生じる正のクローンはｍｐ　ｔ　ＰＡ−ＲＧＤ４と呼ば例３の記載と同様に突然変異誘発のために、次の配列を宵するオリゴヌクレオチドを使用した：５’ＧＧＴＧＣＡＣＴＣＧＴＣＧＣＣＴＣＴＣＴＣＣＧＣＴＧ３’ 洗浄温度は、６ｘＳＥＴ／ＳＤＳ　Ｏ，ｔ％中で６４℃であった。

生じる正のクローンはｍｐ　ｔ　ＰＡ−ＲＧＤ５と呼ばれＩこ。

例３．６例３の記載と同様に突然変異誘発のために、次の配列を有するオリゴヌクレオチドを使用した：５’ＧＡＴＧＣＣＧＴＣＴＣＣＣＣＴＣＣＧＣＣＣＧＣ３’ 洗浄温度は、５ｘＳＥＴ／ＳＤＳ　Ｏ，１％中で６０℃であった。

生じる正のクローンはｍｐ　ｔ　ＰＡ−ＲＧＤ６と呼ｌｆ例３の記載と同様に突然変異誘発のＩ；めに、次の配列を有するオリゴヌクレオチドを使用しｔ；：５ ’ＣＡＧＧＡＡＣＣＧＡＴＣＴＣＣＧＣＧＣＧＡＣＣＴＣＣ３’ 洗浄温度は、６ＸＳＥＴ／ＳＤＳ　Ｏ，１％中で６５℃であった。

生じる正のクローンはｍｐｔＰＡ−ＲＧＤ７と呼ばれＩ；。

例３．８例３の記載と同様に突然変異誘発のために、次の配列を有するオリゴヌクレオチドを使用した：５’ＧＣＴＣＴＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＣＧＧＧＡＣＧＡＡ　３　’ 洗浄温度は、６ＸＳＥＴ／ＳＤＳ　Ｏ，１％中で６１℃であった。

生じる正のクローンはｍｐｔＰＡ−ＲＧＤ　１０と呼ばれた。

例３．９例３の記載と同様に突然変異誘発のために、次の配列を有するオリゴヌクレオチドを使用した：５’ＧＣＴＧＣＡＧＧＴＣＣＣＣＣＣＧＧＧＧＡ、ＡＧＧＣＡ　３’ 洗浄温度は、５ＸＳＥＴ／ＳＤＳ　Ｏ，１％中で６５℃であった。

生じる正のクローンはｍｐｔＰＡ−ＲＧＤ　１１と呼ばれた。

例３，１０例３の記載と同様に突然変異誘発のために、次の配列を有するオリゴヌクレオチドを使用しｔ：：５’ＡＧＴＧＴＣＴＣＣＡＴＴＡＣＡＣＡＧＣＡＴＧ３′ 洗浄温度は、６ＸＳＥＴ／ＳＤＳ　Ｏ，１％中で５５℃であった。

生じる正のクローンはｍｐｔＰＡ−ＲＧＤ　１２と呼ばれた。

例３．１１例３の記載と同様に突然変異誘発のために、次の配列を有するオリゴヌクレオチドを使用した：５’ＴＧＧＧＧＣＣＣＧＴＣＧＣＣＣＣＧＡＧＴＧＴＣ３’ 洗浄温度は、６ｘＳＥＴ／ＳＤＳ　Ｏ，１％中で６０℃であった。

生じる正のクローンはｍｐＬＰＡ−ＲＧＤ　１３と呼ばれた。

例３．１２例３の記載と同様に突然変異誘発のために、次の配列を有するオリゴヌクレオチドを使用した：５’ＣＧＡＡＴＣＧＣＣＣＣＧＧＣＡＧＧＣＧＴＣ３’洗浄温度は、５ＸＳＥＴ／ＳＤＳ　Ｏ，１％中で５５℃であった。

生じる正のクローンはｍｐｔＰＡ−ＲＧＤ　１４と呼ばれた。

例３，１３何３の記載と同様に突然変異誘発のために、次の配列を有するオリゴヌクレオチドを使用した：５’ＧＧＴＣＧＣＡＴＧＴＣＧＣＣＡＣＧＡＡＴＣＣ洗浄温度は、６ｘＳＥＴ／ＳＤＳ　ｏ、ｉ％中で５８℃であった。

生じる正のクローンはｍｐｔＰＡ−ＲＧＤ　１５と呼ばれた。

例４修飾ｔＰＡ−ＤＮＡの表現のためのベクターの構成サルのウィルスＳＶ４０のＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩおよびＢｃｌＩで切断し、０．２４．ｋｂ断片をゲル電気泳動法により調製した（第５図）。末端を４つのデスオキシヌクレオチドトリホスフェートｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰの存在下でＤＮＡポリメラーゼＩのフレノウ断片で充填した。引続き、Ｘ　ｈ　ｏ　Ｉリンカ−を結合させた同時に、市場で入手できるベクターｐＵｃ１８を酵素Ｓｍａ　Ｉと一緒に線状化した。次いで、同様にｘｈｏＩリンカ−を結合させた。このベクター（ｐＵＣ１８ＸｈｏＮ）のＤＮＡをＸｈｏＩと一緒に線状化し、アルカリ性ホスファターゼで処理し、かつ０，２４ｋｂのＸｈｏｌ−ＳＶ４０断片（上記参照）と結合させ２＝、ｐｓｖｐＡが生成された。

ｐｓＶｐＡ−ＤＮＡを調製的にＸｈｏＩで分解し、かつ上記のようにクレノウーポリメラーゼｔｏ−緒に４つのｄＮＴＰの存在下に恒温保持しｔ；。０．２４ｋｂの断片をゲルにより単離した。

同時に、ＣＬ２８Ｘおよびｐ　Ｂ　２−２　（Ｒｅｄｄｙ他、１９８７、ＤＮＡ　６．４６１〜４７２）の結合によって生成された、真核生物の表現ベクターＣＬ２８ＸｈｏＢＰＶを部分的に制限酵素ＸｂａＩで切断し、すなわち一時的に、２つのＸｂａｌ認識配列の１つでのみ分解限定して恒温保持した（第６図）。次のこの配合物を記載のようにクレノウーボリメラーゼおよびｄＮＴＰと反応させＩ；。引続き、線状分子をゲル電気泳動法により単離した。

次に、線状ｐＣＬ２８ＸｈｏＢＰＶ断片と、ＳＶ４０からの前処理された０、２４ｋｂ断片との結合を行なった。ミニリザート（ＭｉｎｉｌｙｓａＬｅ）の形質転換およびスクリーニングの後、ＳＶ４０断片を約０．１５ｋＢのＸｈｏＩ位置の３′の方向に置かれた先のＸｂａ■位置で有するクローンを単離し一二のＤＮＡ　（“０ＣＬ２８ＸｈｏＢＰＶ−５Ｖｐｏ　ｌ　ｙＡ”　）　は、′早期の“ 遺伝子のＳＶ４０転写停止信号を有しｌ；。

ｐＣＬ２８ＸｈｏＢＰＶ−ＳＶｐｏ　ｌ　ｙＡのブラフ。

ミド−ＤＮＡを制限酵素ＸｈｏＩと一緒に線状化し、かつアルカリ性ホスファターゼで処理した。同時に、ｍｐ　ｔ　ＰＡＧＤ　１１５を制限酵素Ｓ　ａ　１．　ｒで分解し、２．１ｋｂの大きさの断片を単離した。２つの断片をＴ４−リガーゼを用いて相互に結合した。形質転換およびミニリザート（旧Ｈ４１ｙｓａｔｅ）の後、突然変異されたｔＰＡ−ＤＮＡを１個だけ正しい方向で含有するクローンを単離した：　ｐＣＬ２８ＢＰＶ−ｔＰＡ−ＲＧＤｉ−１５゜例５細胞系の移入および設立Ｃ１２７Ｉ細胞（Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、Ｆ！　５　（１９７８）　２９８；　ＡＴＣＣｃａｔａｌｏｇｕｅ　ｏｆ　ｃｅｌｌ　１ｉｎｅｓ　ａｎｄ　ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ第５版、１９８５、第１４２頁）をＢＰＶ表現プラスミドと一緒に、燐酸カルシウム−共沈殿方法（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ５２（１９７２）／４５６、Ｄ　Ｎ　Ａ　ｃｌｏｎｉｎｇ；第■巻；Ｄ、Ｉｊ、Ｇｌｏｖｅｒ　ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ社版、第１４３頁以降および第２１３頁（１９８５））により移入した。

５Ｘ１０５個のＣ１２７Ｉ細胞をＤ　Ｍ　Ｅ　Ｍ　（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅｓ　Ｍｅｄｉｕｍ）＋　ｌ　０％のＦｅ２（Ｆｏｅｔａｌｅｓ　Ｋａｌｂｓａｒｕｍ）中に６０ｒｒ＋ｍのベトリ皿内で播種した。

直ぐ次の日に、この媒体を２５ミリモルのＨｅｐｅｓ＋ｌＯ％のＦｅ２を有するＭ　Ｅ　Ｓ　（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　ＥａｇｌｅｓＭｅｄｉｕｉ＋）に交換したａｌｏμｙのＣｓＣｌで浄化したプラスミドＤＮＡを用いて、Ｃａ燐酸塩共沈澱物を形成させ、この共沈澱物を注意深＜Ｃｌ２７Ｎ細胞上に施こした。この細胞を３７℃；ＣＯ２７％で４時間恒温保持した。引続き、グリセリン衝撃処理によって、移入の効率を著しく上昇させＩ；。このために、沈澱物の施与の４時間後に媒体を細胞から取り出した。この細胞を６０ｍｍのペトリ皿１回につき１５％のグリセリフ　／　ＨＢ　Ｓ　（ＤＮＡ　ｃ１ｏｎｉｎｇ第２巻、第１５２頁）２ｍＱ宛と一緒に室温で３分間恒温保持した。グリセリン／　ＨＢ　Ｓ溶液を取り出し、セルラーゼ（Ｚｅ　ｌ　ｌ　ｒａｓｅ）をＤＭＥＭ３ｍ４十ＦＣ５ｌ　０％で洗浄した。この細胞をＤＭＥＭ十ＦＣ５ｌ　０％と一緒に３７℃；００２７％で恒温保持した。１週間で３回Ｄ　Ｍ　Ｅ　Ｍ　＋　Ｆ　ＣＳ１０％を取り出し、かつ新しいものに取り替えた６２〜３週間後、ＢＰＶゲノムを含有する移入された細胞は、捕集され形質転換された細胞、所謂７オン（Ｆｏｃｉ）として認めることができた。

上記のｔＰＡ−突然変異蛋白質を表現する７オシをカゼイン−寒天−オーバーレイ　（５ａｓｅｉｎ−＾ｇａｒ−Ｏｖｅｒ　＋ａｙ）（前記参照）によって確認した。３７°ｃ；ＣＯ２７％で２〜３時間の恒温保持後、混濁したカゼイン−寒天中に分解量を、ｔＰＡ表現する細胞が存在する位置で認めることができた。カゼイン−寒天の除去後、この位！で存在する細胞を“クローン化−シリンダ−（ｃｌｏｎｉｎｇ−ｃｙ　ｌ　１ｎｄｅｒ）”方法により単離した（ＤＮＡ　ｃｌｏｎｉｎｇ第２巻、第２２０頁）。引続き、得られた細胞系を標準方法によりＤＭＥＭ＋ＦＣ５１０％で高度に培養した。

生産のｔ；めに、細胞系を融合性の達成の後に血清不含のＤＭＥＭ中で保持した。こうして得られｌ；血清不含の細胞培地上澄み液からのｔ−ＦＡ突然変異蛋白質は、今や特性決定することができかつ精製することができる。

上述しｊ；寒天オバーレイ試験（Ａｇａｒ　０ｖｓｒｌａｙ　Ｔｅ５ｔ）には、次の溶液が必要とされるニオバーレイ−アガロース１）Ｈ２Ｏ中のマゲルミルク（Ｍａｇｅｒｍｉｌｃｈ）溶液８％を１００℃で３０分間煮沸し、かつ引続き３７℃の水浴中で冷却する。

２）ＰＨ３中の低融点アガロースの２％溶液をオートクレーブ方法により３７° Ｃの水浴中で冷却する。引続き、ｌ：１の比で２倍に濃縮したＤＭＥＭを添加する３）プラスミノゲン０．６４　ｍ９　をＨ２Ｏ１ｍ（２に溶解する。溶液２　１６ｍＱ、溶液１　４ｍＱおよびグラスミノゲンＱ　、４　ｍＱを一緒にビペツートで注ズすることによって、オバーレイ−アガロースを得る。これを混合後に３７℃の水浴中で保持する。

試験の実施のために、細胞を６０ｒｎｍのベトリ皿中で２回血清不含の媒体で洗浄する。引続き、“オバーレイ−アガロース“それぞれ２ｍ（ｌを注意深くペトリ皿中にピペットで注入する。アガロースの冷却および凝固のＩ；めにペトリ皿を室温で放置する。引続き、爵卵器中で３７℃で２〜３時間００２７％の添加下に恒温保持し、分解量の大きさおよび数を測定する。

例６例５により得られた血清不含の細胞培地上澄み液から、ｔ−ＦＡ突然変異蛋白質を、滅菌濾過および・Ｔｗｅｅｎ８０　０．０１％の添加の後にエリトリナートリ、プシンー抑制因千−セファロース（ＥＴＩ−セファロース、１ｃｍＸ３ｃｍ）でのアフィニティークロマトグラフィーによって単離した。親和性マトリックスの製造のために、ＣＮＢ　ｒ活性化セファロース４Ｂ　１ｍＱ当りＥＴｌ　５ｍｇを結合させた。ゲル物質を細胞上澄み液の塗布前にＮａ燐酸塩２０ミリモル、ＮａＣ１Ｏ１１５モル、”Ｔｗａｅｎ８０　０．０１％、ｐＨ７，０で平衡にさせた。塗布後、非特異性に結合した物質を除去するために、ゲル物質を同じ緩衝液で処理した。引続き、特異的に結合しｊ；突然変異蛋白質の脱着をグリセリン０．１モル、アルギニン０．１モル／ＭＣＩ、ΦＴｖｅｅｎ８０　０．０１％、ｐ　Ｈ３，０での溶離ζこよって行なった。溶出液を合わせかつ苛性ソーダ液０．１モルでｐ　Ｈ５，０に調節した。

こうして、第１ａ−ｄｃＩに示したｔＰＡとは次のように異なる以下のポリペプチドが得られた：６．０１　８Ｇ、　９Ｄ１４６Ｇ。

１７７５．２６３３゜６．０２　２８Ｇ、　２９Ｄ、４６Ｇ。

１７７ｓ、２６３５６．０３　３１Ｇ、　３２Ｄ、４６Ｇ。

１７７Ｓ、２６３Ｓ６．０４　１０３Ｄ、４６Ｇ。

１７７５．２６３Ｓ６．０５　１０９Ｒ，ｌｌＩＤ、４６Ｇ。

１７７Ｓ、２６３Ｓ６−０６　１３１Ｇ、　４６Ｇ。

１７７ｓ、２６３Ｓ６．０７　３０１Ｒ１３０３Ｄ、４６Ｇ、１７７ｓ、２６３５６．０８　３８４ｃ、３８５Ｄ、４６ｃ。

１７７ｓ、２６３Ｓ６．０９　３９８Ｒ，３９９Ｇ、　４６Ｇ１１７７３．２６３Ｓ６．１０　４５８Ｒ，４６Ｇ、１７７　Ｓ、　２６３　Ｓ６．１１　４６３Ｇ、４６４Ｄ、４６Ｇ１１７７　Ｓ、　２６３　Ｓ６．１２　４７５Ｒ１４６Ｇ１１７７ｓ、２６３Ｓ６．１３　５２３Ｇ、５２４Ｄ、４６Ｇ、１７７５、　２６３５数字は、ポリペプチドが第１ａ−ｄ図に示したｔＰＡからずれているアミノ酸の位置を表わし、符号は、突然変異蛋白質中で付した数字で表わされた位置に存在するアミノ酸を表わす。

例７オリゴ糖含量の特性決定例６で得られた突然変異蛋白質５〜ｌＯμ９を５ＤＳ−ゲル電気泳動法によって分離し、引続きニトロセルロース上に運搬しｊ：。・Ｔｖｅｅｎ２０　０．１％、ｐＨ７４を含有するＰＢＳ緩衝液（燐酸塩２ミリモル、ＮａＣ１１５０ミリモル、ｐＨ７，４）での飽和後、この膜をグリノフォニア・ンンプリシフォリア（Ｇｒｉｆｆｏｎｉａ　Ｓｉｍｐｌｉｃｉｆｏｌｉａ）のペルオキシダーゼｌこ結合したレクチンと一緒に２時間恒温保持した。結合していない物質をＴＢＳ緩衝液（トリスｌＯミリモル、ＮａＣ１１５０ミリモル、ｐＨ７，４）を用いて途去した後、ニトロセルロースをトリス５０ミリモル、ＮａＣ１１５０ミリモル、Ｈ２Ｏ２０，０２％および４−クロル−１−ナフトール０．５ｍｇ／ｍＱ中で５− １０分間恒温保持した。陽性の反応を蛋白質バンドの青変によって５分間で目で見ることができた。次に、この反応をニトロセルロース膜を水中に移すことによって停止させた。

オリゴ糖は、第８図の記載によりβ−結合したサブ末端ガラクトース基と結合したα−結合したガラクトース基を有する。この場合、α−ガラクトース基は、ガラクトース６　’（ＩＩ基の番号第８図参照）に位置している。別のサブ末端ガラクトース基は、シアリン酸によって置換されているかまたは他のα−結合したガラクトースによって置換されている。

ＦＩＧ、１ａａ：　ＴｈｒＡｌａＧ１ｕＳ＊ｒＧｌｙＡｌａＧ１ｕＣｙｓＴｈｒＡｓｎＴｒｐＡｍＳｅｒＳｅｒＡｌａＬｅｕＡｌａＧｍｙｓＰｒｏ　−ＦＩＧ、１ｂａＨ５ａｒ）−１ｉｓＰｒｏＴｒｐＧｌｎＡＩａＡＩａｌ−ρ−ＡｌａＬｙｓＨｉ込シ四５ｅｒＰｒｏＧ瞭ＧｌｕＡｒｇＰｈｅ　−ＦＩＧ、　１　ｃａ：　ＰｒｏＧｌｎＡｌａＡｓｎＬｅｕ　＋−１ｉｓＡｓｐＡｌａＣｙｓＧｌｎＧｌｙＡｓｐＳａｒＧｌｙＧＩｙＰｒｏＬｅｕＶａｌＣｙｓkｅｕ　− ＦＩＧ、１ｄＢ：＃ｇＰｒｏＩ：ｎｃｉ− ＦＩＣｉ、２／９ＦＩＧ、３／９ＦＩＧ、４／９ＦＩＧ、５／９国際調査報告ｌｌＴｍ１ｌ−Ｉｉ４−ム−ｃａ＊ｓｎＭｅｐにＴ１ＥＰ９９１〕１ＯｉＧ−ｒ　ｌ＋＋ｏｒ１１１６Ｍｌ　ｉｉＷ１ｗｈ＊＋　ｌｔａフＣＴ／Ｅｌ’　８９１０１０４０　−国際調沓報告

Claims

【特許請求の範囲】

１．ｔＰＡ類似のポリペプチドにおいて、該ポリペプチドがｔＰＡのアミノ酸配列またはそれから誘導された配列を有するが、この場合１〜６のトリペプチドはトリペプチドＲＧＤによって代替されていることを特徴とする、ｔＰＡ類似のポリペプチド。
２．請求項１記載のポリペプチドに対してコード化するＤＮＡ配列。
３．請求項１記載のポリペプチドに対してコード化する遺伝子配列を有するベクター。
４．請求項１記載のペプチド配列を製造するための遺伝子技術的方法において、ホスト有機体中に請求項１記載のペプチド配列に対してコード化する１つの遺伝子を表現のために導入することを特徴とする、請求項１記載のペプチド配列を製造するための遺伝子技術的方法。
５．医薬品において、請求項１記載の少なくとも１つのポリペプチドを製薬学的に認容性の担持剤または結合材中に含有することを特徴とする、医薬品。
６．請求項１記載の少なくとも１つのポリペプチドおよび別の繊維素溶解薬からの組合せ物を含有する、請求項５記載の医薬品。
７．ｔＰＡのアミノ酸配列またはそれから誘導された配列を有するが、この場合１〜６のトリペプチドはトリペプチドＲＧＤによって代替されているｔＰＡ類似のポリペプチドを製造する方法において、ホスト有機体中にペプチド配列に対してコード化する１つの遺伝子を表現のために導入することを特徴とする、ｔＰＡ類似のポリペプチドの製造法。