JPH03505815A - 高純度ヘパリナーゼの大規模精製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 高純度ヘバリナーゼの大規模精製法 凡豆２１且 米国政府は０国立衛生研究所の認可番号ＧＭ２５８１０により、この発明の権利 を有する。

この発明は、Ｆ、ヘパリナム（Ｆ、　ｈｅ　ａｒｉｎｕｍ）からヘバリナーゼお よび他のエリミナーゼを精製する方法である。

ヘパリナーゼは、ヘパリンの主要な繰り返し単位：　−＞４）−２−デオキシ− ２−スルフアミノー−Ｄ−グルコビラノース　６−スルフェート−（１−＞４） −α−Ｌ〜イドピラノシルロン酸２−スルフェート−（１−＞　　中のα−グリ コシド結合において、ヘパリンを切断するエリミナーゼである。ヘパリンは、血 液の凝固を阻害するために、インビトロおよびインビボのいずれにおいても、臨 床的に用いられる。２０．０００までの広範囲の分子量を有し、その平均分子量 が１３．５００のムコ多糖類であるヘパリンは、血液中のトロンビンおよび活性 化Ｘ因子と池のセリンエステラーゼとを直接に阻害することにより作用する。

ヘパリンの抗凝血効果は、プロタミンで沈澱させるか、あるいは、　Ｈｏｖａｒ ｄ　Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎらによる「固定化種を含む体外リアクター」と題する米 国特許出願第０４４．２４５号（１９８７年５月２２日付で出願）、および、　 　Ｌｉ５ａ　Ｅ、　Ｆｒｅｅｄらによる「懸濁した固定化種を含むバイオリアク ター」と題する米国特許出願第０４４、３４０号　（１９８７年６月６日付で出 願）に記載されているように、固定化されたヘパリナーゼを含むリアクターによ り、臨床的に中和される。ヘパリナーゼを固定化することにより。

リアクター内を通過する血液によってヘパリナーゼが体内に浸入することを防止 している。

スルフェ−トを含まないヘパリナーゼ（触媒グレードのヘパリナーゼとも呼ばれ る）は、酵素分解によってヘパリンの抗凝血性を完全に取り除くことが要求され る。Ｌａｎｇｅｒらの米国特許第４，３４１，８６９号に記載されているように 、ヘパリナーゼは、フラボバクテリウムへパリナム　（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒ ｉｕ＋ｎ励月二ｌｕ）のような細菌によって産生される。微生物を増殖させ、細 胞を溶解し、破片を遠心分離によって取り除き、そして、細胞抽出物を、ヒドロ キシルアパタイト、　すなワチ３Ｃａｓ（ＰＯ４）２あるいはＣａ＋１Ｉ（ＰＯ ４）ｓ（ＯＨ）２のカラムに通す。このタンパクを、少しずつ、　高い塩濃度で カラムから溶離させると、ヒドロ牛ジルアパタイトカラムは１０倍から１００倍 に酵素を濃縮することができる。ここで述べるように、　０．ＯＩＭリン酸ナト リウムｐｎａ、　８からＯ，ＩＯＭ　リン酸ナトリウム０．１９Ｍ塩化ナトリウ ムｐＨ６，８までの範囲内で塩化ナトリウム濃度が増加するリン酸塩緩衝液を使 って、ヘパリナーゼを少しずつ溶離させることにより、さらに高い収量の酵素が 得られる。

Ｙａｎｇらによって、「フラボバクテリウムへバリナムからのヘパリナーゼの精 製および特性付けＪ　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２６０（３）。

１８４９−１８５７（１９８５）に述べられているように、ヒドロキシルアパタ イトクロマトグラフィーを、繰り返し行うゲル濾過クロマトグラフィーおよびク ロマトフオーカシングと組み合わせることにより、この精製法は非常に改善され た。

精製されたヘパリナーゼは、タンパクであって、　４２，９００土１０００ダル トンの分子量を有し、ｐＩ値は８．５である。

これらの方法は、実験室レベルの試薬量を調製したり、この酵素の特性付けを行 ったりする際には有用であるが、大規模な臨床上用途に必要とされる量および純 度で、ヘバリナーゼを調製するには、不適当である。さらに、ここで概略を述べ た精製方式を、大規模な酵素回収に適用するのは困難である。

ダラム陰性菌の細胞周辺腔からタンパクを抽出するために使われてきた他の方法 には、最初の工程として浸透圧ショック処理がある。典型的には、これらの手順 は、浸透圧を安定化させた媒体中における最初の破壊と、続いて浸透圧を安定化 させていない媒体中での選択的な放出とを包含する。これら媒体の組成（ｐＨ， 保護剤）および使用される破壊方法（クロロホルム、リゾチーム、ＥＤＴＡ、音 波処理）は、報告されている特定の手順によって変化する。これらのうちのどれ もまだ、触媒グレードのヘパリナーゼを精製することに成功裏に適用されていな い。

したがって０本発明のある目的は、産業上および臨床上の用途に使用するために 多量の高純度ヘパリナーゼを調製する方法を提供することにある。

本発明の他の目的は、Ｆ、ヘパリナムから他のエリミナーゼを単離する方法を提 供することにある。

本発明のさらに他の目的は、多量の酵素的に活性な精製ヘバリナーゼおよび他の エリミナーゼを提供することにある。

λ豆旦！１ 限外濾過によって濃縮されたＦ、ヘパリナムの細胞を、浸透圧ショック法で処理 し、細胞周辺腔から活性ヘパリナーゼを放出させる。この好ましい実施態様にお いては、　ＥＤＴＡを含むがあるいはＥＤＴＡを含まない、浸透圧を安定化させ た媒体＜２０％スクロース）に細胞をさらし１次に、浸透圧を安定化させていな い媒体（１０ｍＭ　’）ン酸塩、　ｐＨ６，０〜８．６）中に細胞周辺物質をま ず放出させ、続いて浸透圧を安定化させていない第２の媒体（１０ｍＭリン酸塩 、　１５０ｍＭ塩化ナトリウム、　ｐＨ６，０〜８．６）中にヘパリナーゼおよ び他のエリミナーゼ活性物質を放出させることにより、細胞外被の破壊を誘発す る。この三段階法により。

７５％活性までの収量で、５倍から１０倍の初期精製が可能となる。

特に、従来から報告されている方法では、取り除くことが最も困難なことがわか っている不純物が、この浸透圧ショック処理の初めの二段階で取り除かれる。

透析濾過によってナトリウムイオンを取り除いてから、この濃縮物を、陽イオン 交換クロマトグラフィーによって、好ましくは、ＦＰＬＣＭｏｎｏ　Ｓカラムを 使って１分画する。ヘパリナーゼ活性は、２つのタンパクすなわち、約４２．０ ００〜４３．　Ｏｏｏダルトンのタンパクおよびａｓ、　ｏｏｏ〜７５，０００ ダルトンのタンパク中に存在する。全収量は、典型的には２５％であり、純度は ２００〜３００倍に増加する。

浸透圧ショック処理の効果は、２つの放出媒体のｐＨおよびイオン強度を変化さ せることにより、向上させることができる。

さらに、マスフローイオン交換装置を使用することにより、この方法をスケール アップすることができる。

遺伝子ライブラリーの構築方法、およびヘパリナーゼを産生ずる微生物のスクリ ーニング方法についても、述べる。

区画臣ｉ星星五里 第１図は、三段階の浸透圧ショック法によって放出させ。

ＦＰＬＣＭｏｎｏ　Ｓカラムを使った陽イオン交換クロマトグラフィーによって 分画し、０〜０．３Ｍ　ＮａＣ１の勾配で溶離させた物質の活性クロマトグラム である（　１　ｍｌの画分を溶離勾配中から採集し、アズール（Ａｚｕｒｅ）　 Ａ染料を使って、ヘパリナーゼ活性について分析した）。

（以下余白） Ｒμ目と１却透」Ｌ吸 本発明による。バクテリアからの大規模なヘパリナーゼ精製の好ましい方法は、 フラボバクテリウムへパリナムのような微生物あるいは遺伝子操作されるかまた は変異してヘパリナーゼを生産する他のダラム陰性の微生物を含む発酵反応器に おいてヘバリナーゼを生産し、培養培地を除去して、限外濾過または遠心分離の ような方法によって細胞を濃縮し、この濃縮された細胞を三段階の浸透圧シマツ ク法にかけ、細胞と非特異的な細胞周辺物質とを分離し２分子量が１０，０００ のカットオフを有するメンブレンを使用して透析濾過することによって残りの細 胞周辺物質を濃縮して、水および塩類を除去し、１０ｍＭのＮａＣ１溶液を含む 濃縮溶液（好ましくは、陽イオン交換材料を用いた。タンパク分離用の高速液体 クロマトグラフィーカラム上で）のイオン交換クロマトグラフィーによってヘバ リナーゼを分離し、そしてヘパリナーゼ活性を有するカラムから溶離させた物質 をゲル電気泳動またはゲル濾過によって更に精製することである。

選択的な細胞周辺タンパクの放出。

Ａｌｆｒｅｄ　Ｌｉｎｋｅｒ、　Ｖｅｔｅｒａｎｓ　Ａｄ＋ｍ１ｎｉｓｔｒａｔ ｉｏｎ　Ｈｏ５ｐｉｔａｌ、　５ａｌｔ　Ｌａｋｅ　Ｃ１ｔｙ、　Ｕｔａｈから 得たＦ、ヘパリナム細胞を、５００１の特定媒体（３ｇ　）Ｆ２ＨＰＯＪ／Ｌ、 　　１．５ｇ　ＫＨ２ＰＯ４−Ｈ２０／Ｌ、　　０．５ｇ　ＮａＣ１／Ｌ。

１．０ｇ　ＮａＣ１／Ｌ、　　２＋１Ｍ　Ｍｇ５Ｏａ−ＩＨ２０，０，２ｇ　Ｌ −ヒスチジン／Ｌ、０．２ｇＬ−メチオニン／Ｌ、　　８ｇグルコース／Ｌ、　 　Ｉｇヘパリン／Ｌ、　　および各１０−’ｍＭのＮａＭｏ０ａ−２Ｈ２０，Ｃ ＯＣｌ２−６Ｈ２０，Ｍｎ５Ｏｎ−Ｈ２Ｏ，ＣｕＳＯ４−５Ｈ２０、　　ＦｅＳ Ｏ４−７Ｔ１２０およびＣａＣｌ２）を含む、２．８Ｌの攪拌フラスコにおいて ３０°Ｃで増殖させた。微生物は、単一炭素源として４ｇヘパリン／Ｌを含む特 定媒体中に１％のディフコ（Ｄｉｒｃｏ）　寒天を含む寒天プレート上では２週 間まで保存され、　　−８００Ｃの１０％ＤＭＳＯ中では無期限に保存され得る 。

ヘパリナーゼ活性は、　　Ｇａ１ｌｉｌｈｅｒら、　　Ａ　　１．　Ｅｎｖｉｒ ｏｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　４１．３６０−３６５　（１９８１）の手法に 従って、ヘパリンの存在下でアズールＡが青から赤に異染性変化するのを観察す ることによって分析される。吸光度の変化は１分析の線形中の６２０ｎｍにおい て測定され９分析緩衝液（０，２５Ｍの酢酸ナトリウム。

０．００２５１１１の酢酸カルシウム、　　ｐＨ７，０）中の０から８　ｍｇ／ ｍｌのヘパリンの標準曲線と比較される。この分析による１単位の活性は、１時 間あたり、ＩＢのヘパリンを分解する酵素の量に相当する。　　βガラクトシダ ーゼ活性は、　　Ｍｉｌｌｅｒの方法、　　Ｅｘｐｅｒｔｎ＋ｅｎｔｓ　ｉｎ　 Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂ ｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　Ｎ ｅｗ　Ｙｏｒｋによって測定される。

タンパク濃度は、　　Ｂｉｏ−Ｒａｄタンパク分析法によって測定される。

６００　ｍｎにおける微生物の増殖は、細胞懸濁液の吸光度を測定することによ ってモニターされる。生存能力のある細胞の数は、特定媒体寒天プレート上にお いて適切な希釈液を培養することによって決定される。

浸透圧ショック法は、以下のとおりである。まず、浸透圧を安定化させた媒体１ 例えば２０％のシ：ｉ糖、ｉｏ＋ａＭのリン酸ナトリウムを含む保護媒体（ｐＨ ７，０）に、細胞を懸濁する。この処理に続いて、２つの浸透圧を安定化させて いない（回収）媒体：１）１０ｄのリン酸ナトリウム、ｐ）１７．０（低イオン 強度の緩衝化溶液）および２）ＩＳＯｍＭの塩化ナトリウムを含む１０ｍＭのリ ン酸ナトリウム、ｐＨ７，０（緩衝化塩溶液）に、細胞を連続的に再懸濁する。

まず、これらの細胞を採取した後、　　Ｓ。

ｒｖａｌＲｃ−２Ｂ冷却遠心分離機にて、　　７０００　ｇで１０分間、遠心分 離することによって、各溶液から細胞を取り出す。特に、明記しなければ、すべ ての手法は、　　ｐｕｔ、ｏおよび４０Ｃで、５ｘｌＯ’θ細胞／ｍｌの細胞濃 度において実施される。浸透圧ショ・ツク法にかけない細胞部分を、　　Ｂｒａ ｎｓｏｎ　Ｗ−３５０音波処理機（ｓｏｎ　ｉ　ｆ　１ｅｒ）を使用して、１５ 分間、５０％のパルスを印加、＃６）で音波処理し、それを標準（１００％）と して使用する。浸透圧放出溶液の上澄み液および音波処理を行った細胞は、酵素 活性およびタンパク含有量を測定する前に、ｌｏｍＭのリン酸塩、１５０ｍＭの ＮａＣ１中で透析される。

表１に示されるように、全細胞（音波処理の標準）の比活性と比較して、放出酵 素の比活性が高いことは、浸透圧を安定化させていない媒体中にヘパリナーゼが 優先的に放出されることを示す。破壊された細胞を、まず低塩濃度の溶液で洗浄 し９次いで高塩濃度の溶液で洗浄すると、へ／４リナーゼが最もよく放出される 。更に、放出上澄み液中には、少量のβガラクトシダーゼ活性しか検出されない 。このことは、細胞質物質がこの手法によってほとんど放出されないことを示す 。

浸透圧を安定化させていない媒体に、　　ＥＤＴＡ、　　ＳＤＳ、　　リゾチー ム。

トルエンまたはクロロホルムを添加して、細胞の破壊および細胞周辺腔からの酵 素放出を促進するか、または細胞を冷凍および解凍することができる。音波処理 はまた。細胞周辺タンパクを選択的に放出させるが、その制御が容易ではない。

しかし、後者の添加物も音波処理も、シＭ糖を単独で使用する場合はど有効では ない。

表１．　　　三段階の浸透圧ショック処理によるＦ、ヘパリナムからのヘバリナ ーゼの特異的な放出 へへ°リナー七゛　　　　　　β方゛ラクトシタ゛−セ゛　　　　　　　　　タ ン八°り号ンブル１　活性　％　　比活性　活性　％　　　合計　％（Ｕ／ｍｌ ）　　　　　　　　（Ｕ／ｍｌ）　　　　（ｍｇ／ｍｌ）音波処理２９．２２　 １００．０　２９．２　１．５０　１００．０　１．００　１００．０シヨ糖　 　０．ＱＯＯ，００，００，０２１，３０，０２２，０低塩濃度　１．３１　　 ４．５　２６．２　０．０１　０．７　　０．０５　　５．０高塩濃度１１．６ ３　３９．８　８３．２　０．０１　０．７　　０．１４　２４．Ｏａ−すべて のサンプルは、５ｘｌＯ１ｉＩ細胞／＋ｎｌを含む。

表２は１回収溶液のイオン強度に対する酵素放出の依存性を示す。浸透圧を安定 させた細胞を、２つの等量なバ・ソチに分割し、低塩濃度および高塩濃度の溶液 中にそれぞれ再懸濁した。最初の処理を行った後、これらの細胞を、再度２つの バッチに分割し、２つの浸透圧を安定化させていない溶液中にそれぞれ再懸濁し た。上澄み液をすべて回収し、そのヘバリナーゼ活性およびタンパク含有量を分 析した。結果は、３つのすべての溶液（すなわち、２０％のシヨ糖溶液、低塩濃 度の溶液、高塩濃度の溶液）を、この順番で使用することの重要性を示している 。

表２＝回収溶液のイオン強度に対する酵素放出の依存性ヘバリナーゼ　　　　　 タンパク サンプル　　活性　％　　比活性　　　合計　　　％（Ｕ／ｍ　１）　　　　　 　　　　　（ｍｇ／＋　１）音波処理　５０．７４　１００．（１２６，０１， ９５１（１０，０■：低塩　　６．４７　１２．８　３８．１　　　　０．１７ 　　　８．７１■：低塩　　４．５８　　９．０　６５．４　　　　０．０？　 　　　３．６高塩　　２１．６６　４２．７　２１６．６　　　　０．１０　　 　５．１１＝高塩　　０．７２　　１．４　２４．０　　　　０．０３　　　１ ．５■Ｉ：低塩　　！、５２　　３．０　７６．０　　　　０．０２　　　１． ０高塩　　２．３３　　４．６　２３３．Ｑ　　　　　Ｏ，０１０，５表３は、 三段階の浸透圧ショック法を使用して、Ｆ、ヘパリナムからのヘパリナーゼの放 出に及ぼす、　　ＥＤＴＡおよびｐＨの影響を示す。ＥＤＴＡの存在または量に よって、ヘバリナーゼの放出は変化しないようである。しかし、低塩濃度の溶液 に放出されるヘパリナーゼの量は、ｐＨを６．０から８．７へ上昇させるに従っ て増加する。低塩濃度または高塩濃度の両分を最大限に全回収し得るのは、　　 ｐＨ７，５の場合である。

表３：三段階の浸透圧ショック法による。Ｆ、ヘパリナムからのヘバリナーゼの 放出に及ぼすＥＤＴＡおよびｐＨの影響サンプル　　ＥＤＴＡ” （ｍＭ）　　　　　ｐＨｂ　　　　　　　活性　　　％ＥＤＴＡの影響： 音波処理　　　　　　　　　７．０　　　　　　２２．６　　１００．０低塩濃 度　　　０．０　　　　７．０　　　　　　４．０３　　１７．８高塩濃度　　 　　　　　　　　　　　　　　　１０．２５　　４５．２低塩濃度　　　１．０ 　　　　７．０　　　　　　３．５９　　１５．８高塩濃度　　　　　　　　　 　　　　　　　１０．８７　　４８．０低塩濃度　　　２．０　　　　　？、０ 　　　　　　２．２６　　１０．０高塩濃度　　　　　　　　　　　　　　　　 １０．５０　　４６．３低塩濃度　　　５．０　　　　　？、０　　　　　　２ ．５７　　１１．３高塩濃度　　　　　　　　　　　　　　　　１１．８０　　 ５２．１低塩濃度　　１０．０　　　　７．０　　　　　　３．５１　　１５． ５高塩濃度　　　　　　　　　　　　　　　　１０．８０　　４７．７低塩濃度 　　２０．０　　　　７．０　　　　　　５．６１　　２４．８高塩濃度　　　 　　　　　　　　　　　　　　１１．０？　　　４８．９ｐＨの影響： 音波処理　　　　　　　　　？、０　　　　　　２４．４４　１００．０低塩濃 度　　　０，０　　　　６．０　　　　　　１．２９　　５．３高塩濃度　　　 　　　　　　　　　　　　　　５．０７　　２０．７低塩濃度　　　０．０　　 　　６．７　　　　　　３．３５　　１３．７高塩濃度　　　　　　　　　　　 　　　　　１０．９５　　４４；　８低塩濃度　　　０．０　　　　　？、５　 　　　　　４．２９　　１７．６高塩濃度　　　　　　　　　　　　　　　　１ ９．７５　　８０．８低塩濃度　　　０．０　　　　８．６　　　　　　６．１ ８　　２５．３高塩濃度　　　　　　　　　　　　　　　　１６．７６　　６８ ．６ａ−第１段階において加えられたＥＤＴＡの量す一回収溶液のｐＨ 細胞の増殖段階は２回収の程度に影響を及ぼす。最大の回収は、中期から後期に おける対数増殖期に採取されたサンプルから得られる。Ｆ、ヘパリナムの最大増 殖率は、　　０．２１−’である。放出されたヘパリナーゼの比活性は、対数増 殖期を通じて増加するのに対して、放出されたタンパクの全量は、比較的一定で ある。定常増殖期におけるヘパリナーゼの回収の減少は、比活性の減少というよ りはむしろ、放出されたタンパクの量の減少に関連するようである。

一般に、各回収溶液中に放出されたタンパクの量は、はぼ等しく、全細胞タンパ クの５％から８％である。ｐＨ７，０において、ヘパリナーゼは、全放出活性の ６５％から８０％を含む高塩濃度の溶液中に、優先的に放出される。

これらの方法を使用すれば、三段階の浸透圧ショック処理を使用したヘパリナー ゼの最適回収の条件が決定され得る。

表１，２および３のデータに基づいて、放出媒体の塩濃度を変化させることによ って、ヘパリナーゼがＦ、ヘバリナーゼから選択的に放出され、同時に他の細胞 周辺成分から分離されるような、改善された初期精製工程を計画した。

各回収溶液中のタンパク含有量が、はぼ等しく、全細胞タンパクの５％から８％ であるのに対して、放出されたヘバリナーゼ活性のほぼ７５％は、比活性が典型 的に１０倍に増加した高塩濃度の回収画分中に見い出される。浸透圧を安定させ た細胞を直ちに高塩濃度溶液にさらすと、良好なタンパクの放出が得られない。

更に、第３段階の工程を、低塩濃度の溶液による洗浄に代えると、高塩濃度の溶 液中に放出されたヘパリナーゼ活性に匹敵するような活性が得られない。

イオン交換クロマトグラフィーおよび電気泳動。

浸透圧放出によって、Ｆ、ヘパリナムから単離されたヘパリナーゼは、陽イオン 交換クロマトグラフィーによって、好ましくはタンパク分離用の高速液体クロマ トグラフィー（ＦＰＬＣ）装置（Ｍｏｎｏ　Ｓ、　Ｐｈａｒｍａｃｆａ　Ｆｉｎ ｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、　Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、　ＮＪ）を使用して、更に 精製され得る。サンプルを透析し。

１０　ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）中に入れ、　　１　＋＊ｌ／ｗｉｎの 流量で。

塩濃度の直線勾配がＯ，ＯＭから０．３Ｍの範囲内のＮａＣ１で溶離させる。

カラムにかけられる全タンパクの７０％より多くが、カラムに吸収されない。第 １図に示されるように、全タンパクの１％未満を含む２つの画分において、活性 が回収される。１５０　ｍＭのＮａＣ１で溶離するタンパクは、　　４２．９０ ０ダルトンの分子量を有する。この画分の比活性は、　　２０００　Ｕ／＋ｇが ら３０００　Ｕ／ｍｇタンパクの範囲内である。第２の酵素は７５　ｍＭのＮａ Ｃ１で溶離する。７５　ｎ＋ＭのＮａＣｌで溶離する物質のヘパリナーゼ活性は 、冷凍に敏感なようだが、　　９０％より多くの活性は、　　　１０ｍＭのリン 酸塩。

０．１ＭのＮａＣ１，ｐＨ７，０，±２０％のグリセロール中テ、　　−２０’ Ｃにて７日間程度保持される。

酵素の調製は、　　Ｌａｅ＋ｏｍｌｉ、　Ｎａｔｕｒｅ　２２７．６８０−６８ ５　（１９７０）（１２，５％のアクリルアミド分離ゲル）の手法を使用して、 　　５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ１００または５ＤＳ−ＰＡＧＥのような分子ふるい上 でゲル濾過することによって、更に精製および分析され得る。４２．９００ダル トンのタンパクは３つの他の主要な夾雑物を含むが、これらの夾雑物は電気泳動 によって除去される。７５ｍＭのＮａＣ１で溶離する物質は、ゲル濾過マトリッ クス（例えば、　　５ｕｐｅｒｏｓｅ　１２゜Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　 Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、　Ｐｉｓｃａｔａｖａｙ、　ＮＪ）を備えたＦＰＬＣ装置 を使用するクロマトグラフィーによって更に精製され得る。サンプルを陽イオン 交換クロマトグラフィーから直接充填し、ｌｏｍＭ（７）リン酸ナトリウム、０ ．１ＭのＮａＣ１，ｐＨ７，０を用いて、　　０．１　ｍｌ／ｒＡｉｎの流速で 溶離させる。ヘバリナーゼ活性は。

６５．０００ダルトンから７５，０００ダルトンの範囲内の分子量を有する画分 中に検出される。５ＤＳ−ＰＡＧＥによって分析する際には。

最大活性を有する物質は、還元条件下でも、　　７０，０００の分子量を有する 。

発酵による大規模な生産 ２つの主要な精製工程（すなわち、浸透圧による放出およびＦＰＬＣ）に次いで 、２つの濃縮工程（すなわち、限外濾過および透析濾過）を使用して、大量の物 質の取扱いを容易にする。　　２　ｇ／Ｌ　ＤＣＷまで増殖させ、０．１μのＲ ｏｔａｉｃｏｎ中空繊維メンブレン装置を使用したマイクロ濾過によって１リツ トルに濃縮されたＦ、ヘパリナムの１０リットル発酵についての結果を表４に示 す。１０．０００ダルトンのカットオフ限外濾過膜を使用して透析濾過すること によって、高塩濃度溶液中に放出された物質を濃縮し、　　ＦＰＬＣ陽イオン交 換クロマトグラフィーによって分画した。通常、２０％から２５％のヘバリナー ゼ活性が回収されるが、比活性は２００倍から３００倍に上昇する。

表４；Ｆ、ヘパリナムの１０リツトルの発酵物からのヘパリナーゼの回収 発酵物　　　　　１３３５０　　　　１００　　４．６　　　２９３０限外濾過 　　　　１２７００　　　　９５　　　　ＮＤ　　　　　ＮＤ浸浸透圧ココツク ７０００　　　　５２　　２７．４　　　　２５５透析濾過６７５０　　　　５ １　　　　ＮＤ　　　　　ＮＤ゛ＦＰＬＣ３２００２４２１００１，５ 抗体の生産およびクローニングのためのハイブリダイゼーシヨンプローブ ゲル電気泳動またはゲル濾過によって得られる精製されたヘパリナーゼタンパク は、当業者に公知の方法を用いて抗体を生産するために使用されることができる 。例えば、抗体はフロイントの不完全アジュバントのような適当なアジュバント 中のタンパクをウサギまたはヤギなどの動物に投与することによって生成し得る 。あるいは、モノクロナール抗体は。

抗体を銹導した後、マウスを免疫化して肺臓細胞をハイブリドーマ細胞に融合さ せることによって調製されることも可能である。

５ＤＳ−ＰＡＧＥから溶離された材料は充分な純度であるので、当業者が利用可 能な方法および装置を用いて配列決定することができる。い（っかの不一致が見 られ、最も顕著なものはグルタミン／グルタミン酸、リジン及びメチオニンであ るが９表５の結果はどちらのタンパクに対しても類似した組成プロフィールを示 している。４２．０００ダルトンのタンパクの配列は、ニドマント（Ｅｄｍａｎ ｄ）分解法の阻害によって決定されるように、Ｎ末端において修飾される。ヌク レオチドおよびアミノ酸配列は、ヘパリナーゼの生産を増大させることまたは外 部制御による生産で遺伝子操作する微生物において。

次いで使用するために、ハイブリダイゼーシヨンプローブの調製およびヘバリナ ーゼをフードする核酸配列を得る他の手段において使用されることができる。

表５．　　　ヘパリナーゼ活性を示すＦ、ヘバリナムからのタンパクのアミノ酸 組成 り゛ルタミン／り゛ルタミン酸　　　　　　　１４．６　　　　　　５８　　　 　　　　　１０．３　　　　　　７７アス八゛う４”　７／７２八’　ラ今゛ン 酸　　１７．３　　　　　６２　　　　　　　１４．６　　　　１０６セリン　 　　　　　　７．６　　３０　　　５．３　　３８グリシン　　　　　　　６． ９　　２８　　　　７．１　　５１ヒスチジン　　　　　　１．６　　　６　　 　　２．２　　１６アルギニン　　　　　　３．０　　１２　　　　３．７　　 ２７トレオニン　　　　　　６．４　　２６　　　　５．８　　４２アラニン　 　　　　　１１．９　　４８　　　１０．１　　７３プロリン　　　　　　　３ ．０　　１２　　　　４．８　　３５チロシン　　　　　　　３．４　　１４　 　　　３．６　　２５バリン　　　　　　　５Ｊ　　　２１　　　５．２　　３ ８メチオニン　　　　　　１．０　　　４　　　　２．１　　１５イソロイシン 　　　　　３．５　　１４　　　　３．６　　９９０イシン　　　　　　　４． ４　　１８　　　　６．５　　４７フエニルアラニン　　　２．９　　１２　　 　　２．９　　２１リジン　　　　　　　　？、４　　３０　　　１２．１　　 ８８ヘパリナーゼ遺伝子についての発現ライブラリーのスクリーニング方法 遺伝子操作された大量の微生物を、ヘバリナーゼ生産についてスクリーニングす るための分析法が開発されている。ヘパリナーゼに対する抗体を使用して、以前 にスクリーニングを試みたが、いくつかのその他のＦ、ヘバリナムタンパクとの 広範囲な交差反応により成功しなかった。該分析法およびスクリーニング方法は 、　　４２，０００ダルトンのヘバリナーゼまたはヘパリナーゼ活性を有する６ ５，０００−７５，０００ダルトンのタンパクの遺伝子を単離し、そして特性決 定するのに使用され得る。

寒天プレート分析を、硫酸プロタミンとの静電気結合による。ヒト血液からのヘ パリンの沈澱に基づいて行った。０．２５Ｍの酢酸ナトリウム、０．００２５　 ＭのＣａＣｌ２．　１リットル当り１．０ｇのブタ腸内粘膜由来のヘパリン（Ｅ ｌｅｐａｒ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、　Ｆｒａｎｋｔｉｎ、　ＯＨ）　、　　お よび１．５％のアガロース（ＢＲＬ）、　　ｐ）１７．０からなるヘパリン分析 プレートを準備する。ヘパリナーゼの生産について、スクリーニングされるべき 細胞を、このプレートに接種する。上記の方法を使用して、標準としてヘバリナ ーゼを単離し、この単離したものを、１０＋ｌ１Ｍリン酸ナトリウム、１５０ｍ Ｍ　ＮａＣ１，ｐＨ７，０，１０μｌ中に、　　０．０．　０．０１．　０．１ ０および１．００Ｕの様々な量を添加し、これをプレートに加え２次いでこのプ レートを３７０Ｃで１時間インキニベートする。このプレートの表面に、２％の 硫酸プロタミン（ｓａｌｍｏｎ、　Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ。

Ｓｔ、　Ｌｏｕｔｓ、　ＭＯ）溶液を注ぐ。１時間から２時間の間に、白い沈澱 物が形成される。だだし、ヘパリナーゼの増大量が加えられるか、あるいはバク テリアのコロニーがヘパリナーゼを生産しつつある領域においては９強度が増大 するクリアゾーンが残存する。例えば、クリアゾーンは、１リットル当り１、Ｏ ｇのヘパリンを含むＬＢ寒天プレート上に増殖したＦ、ヘパリナムの周囲に形成 されたが、同一のプレート上に増殖したＥ、’ｃｏｌｉ　ＪＭ８３の周囲には形 成されなかった。

Ｆ、ヘバリナムの構成的生産菌株の検出には、ヘパリンを含まない培地において 微生物を増殖させる必要がある。１　ｍＭのＭｇＳＯ４を含む最小培地（抑制条 件）において、Ｆ、ヘバリナムを増殖させ、これを、２つの最小培地寒天プレー ト（その一方には１．０　ｇ／ｌのヘパリン（誘発条件）が補給されている）上 にプレートするという分析法が開発された。このプレートを３０°Ｃで３６時間 インキュベートし、コロニーをニトロセルローフ、（ＮＣ）紙に移す。Ｆ、ヘバ リナムコロニーは、　　ＮＣ紙１ｍ付着し、クロロホルムの蒸気に２０分間さら すことによって溶菌する。次いで、　　ＮＣ紙をヘパリナーゼ分析プレート（上 述）上に重ね、　　３７０Ｃで１時間インキニベートする。ＮＣ紙を捨て、２％ の硫酸プロタミンでプレートを発色させる。クリアゾーンが。

誘導条件（ヘパリン補給プレート）の下で増殖した細胞に対応するプレート上に 現れるが、硫酸塩抑制条件の下で増殖した細胞に対応するプレート上には、ゾー ンは検出され得ない。

プレート分析は、ヘバリナーゼ活性を検出するのに十分であり、他のヘパリン異 化酵素の存在を必要としない。この特性は、以前に報告された方法に対して改良 されており、従って、クローン化されたヘパリナーゼ遺伝子に対するＥ、　ｃｏ ｌｉの発現遺伝子のバンクをスクリーニングするのに有用であり得る。更に、　 　ＮＣ紙を使用して、抑制および誘導条件の下で増殖させたＦ、ヘパリナムを区 別する能力は、構成的変異体を同定するこの方法の有用性を高める。

ヘパリン存在下における。アズールＡ　（Ａｚｕｒｅ　Ａ）の青カラ赤への異染 性の変化に基づくヘパリナーゼ分析を、マイクロ培養物の分析の開発に使用して 、ヘバリナーゼを生産する細胞、特に、遺伝子操作されたＥ、　ｃｏｌｉのよう な９通常はヘバリナーゼを生産しない細胞を同定した。マイクロ培養物分析に。

アズールＡを使用するという以前行われた試みは、背景の影響、恐らくは、媒体 成分のために、妨害され、検出され得ないヘパリンを有するサンプルと有さない サンプルにおいて。

色の相違を生じた。０．０２　ｇ／ｌヘパリンおよび種々の量のＮａＣ１を含む Ｂブロスを９６穴マイクロ培養プレートに加え９次いで各ウェルに等しい容量で ０．０４ｇのアズールＡ／１を加え、　　７ｉｔｅｒｔｅｋ　Ｍｕｌｔｉｓｃａ ｎプレートリーダーを使用して、６０５ｎｍで吸光度を測定することによって、 背景の影響の原因となる成分として。

塩化ナトリウムを同定した。ＮａＣ１の濃度を１　ｇ７１未満に保つことによっ て、背景の影響が減少する。

分析は以下のとおりである。ｔｏ　ｇ／ｌのバクトドリプトン。

１．０　ｇ／ｌのＮａＣ１，０，０２ｇ／ｌのヘパリンを含み、メチオン、プロ リン、ヒスチジンおよびチアミンを補給した改変Ｂグロスを濾過滅菌し、マイク ロ培養ウェル（ウェル当り１５０μｌ）に加える。ウェルのすべての列は、無接 種状態のままとするか。

Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＪＭ８３を接種するか、またはＦ、ヘパリナムを接種する。１ つの列は、ヘパリンを含有しない改変Ｂグロスを含む。

プレートを、　　３００Ｃで３６時間インキュベートし９次いで冷凍および解凍 する。０．０４　ｍｇのアズールＡを１　ｍｌあたり１５０μＩの割合で各ウェ ルに加え、６０５ｒ＋ｍで吸光度を測定する前に、解凍したプレートを３７０Ｃ で３時間インキュベートする。更に、異なるウェルのセットつまり、無接種状態 のもの、　　Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＪＭ８３培養物およびＦ、ヘバリナム培養物によ って１色が異なることが、単純な肉眼による観察で検出され得る。

ヘバリナーゼ遺伝子についての１発現ライブラリーのスクリーニング プラスミド発現ベクターｐＵｃ１８を使用して、Ｆ、ヘバリナム染色体遺伝子バ ンクを、　　Ｅ、　ｃｏｎ中に構築した。Ｂａｍ１（１リンカ−の添加およびｐ Ｕｃ１８の脱リン酸化されたＢａｍ旧部位へ連結の前に、Ｆ、ヘパリナム染色体 ＤＮＡを、軽く音波処理した。染色体ＤＮＡ挿入物の平均サイズが６　ｋｂｐで ある。　　５０，０００個の独立形質転換体を単離した。この構築において、音 波処理されたＤＮＡを使用することにより、潜在的に構造遺伝子内に位置する特 異的部位を開裂させる制限酵素消化によって得られたものよりも、形成された断 片のランダム性が高くなる。従って、このｐＵｃ１８遺伝子バンクは、検出のた めの活性タンパクの発現に依存するスクリーニング技術と共に、使用されるのに より適切である。上記の分析技術は１両方とも、この遺伝子バンクからの候補を スクリーニングするのに使用されている。

十分に純粋なヘパリナーゼの調製物を得る際につきあたる問題は、　　Ｅ、　ｃ ｏｌｔのような微生物におけるヘパリナーゼ遺伝子の発現によって解決され得た 。Ｅ、　ｃｏｌｔは、Ｆ、ヘパリナム中に存在するサルファターゼ、グリクロニ ダーゼ等のバックグラウンド汚染酵素を含まない、生合成のための環境を提供し 。

血液の脱ヘパリン化に必要な、触媒グレードのヘバリナーゼの精製工程を非常に 容易にする。更に、Ｆ、ヘパリナムの発酵によって示されるものよりも９組換え 系における生成物の力価の増加が期待され得た。生産工程全体における改善は。

工業規模での生産工程の経済的な実現に必要である。基本的な分析によれば、経 済的損益分岐点は１発酵ブロス１リットル当り１　ｘ　１０’Ｕの純粋酵素の生 産レベルであることを示唆している。本発明の方法を使用すると、１リットル当 り１　ｘ　１０’Ｕの純粋酵素がＦ、ヘバリナム発酵物から得られ、これは２０ ％の収率である。

本発明は、特定の実施態様を参照して説明されている。これらの方法に対する変 形および改変は９本発明の上記の詳細な説明から当該技術者に自明である。この ような改変および変形は、添付のクレームの範囲内にある。

ＮαＣ１ ｍＭ１ Ｆ／ＧＵＦ？Ｅ　７ 補正書の翻訳文提出書（特許法第１８４条の８）平成２年１２月６日ヅド

Claims (24)

【特許請求の範囲】
1. １．ヘパリナーゼおよびヘパリナーゼ様酵素をグラム陰性細菌から精製する方法 であって， 浸透圧を安定化させた媒体中で，グラム陰性細菌の外被を破壊する工程； 該細菌を低イオン強度の緩衝液にさらすことにより，破壊された細菌の細胞周辺 腔から非ヘパリナーゼ様タンパクを放出させる工程；および 該低イオン強度で洗浄した細菌を緩衝化塩溶液にさらすことによって，ヘパリナ ーゼ様タンパクを放出させる工程；を包含する，方法。
2. ２．前記浸透圧を安定化させた媒体が２０％ショ糖溶液である，請求項１に記載 の方法。
3. ３．前記放出溶液が約６．０および８．６の間のｐＨを有するリン酸塩含有溶液 である，請求項１に記載の方法。
4. ４．前記放出溶液が，約７．０および７．５の間のｐＨに調整された１０ｍＭリ ン酸塩である，請求項３に記載の方法。
5. ５．前記高イオン強度溶液が，ほぼ生理的な濃度の塩化ナトリウムと生理的なｐ Ｈとを有するリン酸緩衝液である，請求項１に記載の方法。
6. ６．前記細菌が，ＥＤＴＡ，リゾチーム，および有機化合物でなる群から選択さ れる化合物の添加により破壊される，請求項１に記載の方法。
7. ７．前記細菌が，該細菌細胞を凍結し，そして解凍することによって破壊される ，請求項１に記載の方法。
8. ８．前記ヘパリナーゼ様タンパクを陽イオン交換クロマトグラフィーにより分画 することをさらに包含する，請求項１に記載の方法。
9. ９．前記ヘパリナーゼ様タンパクをゲル濾過により分画することをさらに包含す る，請求項８に記載の方法。
10. １０．前記ヘパリナーゼ様タンパクをポリアクリルアミドゲル電気泳動により分 画することをさらに包含する，請求項８に記載の方法。
11. １１．下記の工程によりグラム陰性細菌から単離された，精製ヘパリナーゼ様酵 素： 浸透圧を安定化させた媒体中で，グラム陰性細菌の外被を破壊する工程； 該細菌を低イオン強度の緩衝液にさらすことにより，破壊された細菌の細胞周辺 腔から非ヘパリナーゼ様タンパクを放出させる工程；および 該低イオン強度で洗浄した細菌を緩衝化塩溶液にさらすことによってヘパリナー ゼ様酵素を放出させる工程。
12. １２．前記浸透圧を安定化させた媒体が２０％のショ糖を含有する，請求項１１ に記載の精製ヘパリナーゼ様酵素。
13. １３．前記放出溶液が約６．０および８．６の間のｐＨを有するリン酸塩含有溶 液である，請求項１１に記載の精製ヘパリナーゼ様酵素。
14. １４．前記放出溶液が，約７．０および７．５の間のｐＨに調整された１０ｍＭ リン酸塩である，請求項１３に記載の精製ヘパリナーゼ様酵素。
15. １５．前記高イオン強度溶液が，ほぼ生理的な濃度の塩化ナトリウムと生理的な ｐＨとを有するリン酸緩衝液である，請求項１１に記載の精製ヘパリナーゼ様酵 素。
16. １６．前記高イオン強度溶液中に放出される物質が，さらに，陽イオン交換クロ マトグラフィーにより精製される，請求項１１に記載の精製ヘパリナーゼ様酵素 。
17. １７．約４２．０００ダルトンの分子量を有する，請求項１１に記載のヘパリナ ーゼ様酵素。
18. １８．約６５，００から７５，０００ダルトンの分子量を有する，請求項１１に 記載のヘパリナーゼ様酵素。
19. １９．請求項１７に記載の精製ヘパリナーゼに対する抗体。
20. ２０．請求項１８に記載の精製ヘパリナーゼに対する抗体。
21. ２１．請求項１７に記載の精製ヘパリナーゼをコードする，遺伝子操作された核 酸配列。
22. ２２．請求項１８に記載の精製ヘパリナーゼをコードする，遺伝子操作された核 酸配列。
23. ２３．ヘパリナーゼを生産する細菌をスクリーニングするための分析法であって ， ヘパリンを含む寒天プレートに，スクリーニングに供すべき微生物を接種する工 程， 該プレートをインキュベートする工程，該プレートの表面に注がれる硫酸プロタ ミン溶液を注ぐ工程，および 白色の沈澱物が形成されたか否かを決定する工程，を包含する，分析法。
24. ２４．ヘパリナーゼを生産する細菌をスクリーニングするための分析法であって ， スクリーニングに供すべき微生物を培養するのに適した培地を含む微小培養用ウ ェルを提供する工程，該ウェルに，スクリーニングに供すべき微生物を接種する 工程， 該接種したプレートをインキュベートする工程，各ウェルにＡｚｕｒｅＡ染料を 添加する工程，６０５ｎｍにおいて吸光度を測定する工程，および該吸光度を， 既知量のヘパリナーゼを含むウェルの吸光度と比較する工程， を包含する，分析法。