JPH0352476B2 - - Google Patents
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- JPH0352476B2 JPH0352476B2 JP6511382A JP6511382A JPH0352476B2 JP H0352476 B2 JPH0352476 B2 JP H0352476B2 JP 6511382 A JP6511382 A JP 6511382A JP 6511382 A JP6511382 A JP 6511382A JP H0352476 B2 JPH0352476 B2 JP H0352476B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- nadp
- reaction
- polyethylene glycol
- present
- aminated
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired
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- Saccharide Compounds (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
本発明は補酵素、特にニコチンアミドアデニン
ジヌクレオチドリン酸（NADP+）の高分子化に
関するものである。 近年の省資源，省エネルギーまたは新エネルギ
ー源の開拓の要請並びに環境汚染防止の要請等か
ら、生体系におけると同様な酵素反応が注目され
てきている。酵素反応は酵素が基質特異性を有す
ること、温和な反応条件等の利点を有することか
ら工業的にも広く利用されてきている。中でも、
一般にバイオリアクターと呼ばれる生産システム
は生体内で行われている生合成を生体外で実施し
ようとするものであるが、生合成と同様な反応を
生体外で行うためには種々の問題を解決しなけれ
ばらない。解決すべき問題の１つとしては安定化
され、回収した後再利用できるような酵素およ
び／または補酵素の開発がある。 このような問題を解決する目的で、本出願人は
既にATPの可溶性高分子化の技術を開発し特許
出願している（特開昭56−154497号）。 更に、前記目的を達成するために今回は脱水素
酵素の補酵素として有用なNADP+の高分子化を
行い、高分子化後も補酵素活性を維持し得ること
を確認して本発明を完成した。 従来も、NADP+を高分子化（固定化）しよう
との試みがなされている。例えば、担体としてセ
ルロース、セフアロースもしくは多孔性ガラスの
アミノシラン誘導体を使用して固定化された
NADP+が知られている（千畑一郎編「固定化酵
素」p80〜昭和50年３月20日講談社刊）。 しかしながら、このような従来の固定化
NADP+は酵素の濃縮、精製に使用されるアフイ
ニテイークロマト用担体として意図されたもので
あり、また巨大な支持体上に隣接して多数の
NADP+分子を固定したものであることに基く、
例えば高濃度で使用した場合に粘度が大きすぎて
取扱いが困難である等の欠点を有し、バイオリア
クターにおいて使用するのに適しているとはいえ
ない。 このような状況の下で、本発明者は従来の固定
化補酵素の有する前記の如き欠点を改善し、バイ
オリアクターにおいて使用するのに適したものと
するために種々検討を行つた結果本発明を完成す
るに至つた。 そこで、本発明の主たる目的は高分子化
NADP+の製造方法を提供することである。 本発明の製造方法で製造される高分子化
NADP+は一般式： N6−NADP+−Ｒ−Ａ−Ｂ ただし、N6は置換基がNADP+のアデニン環の
６−位におけるアミノ基に結合していることを示
し、Ａは−CONH−を表し、Ｒは−（CH2）o−
（ｎ＝２〜８）を表し、Ｂは末端がアミノ化され
たもしくはアミノ化されていないポリエチレング
リコール残基を表す、 で示される。 ポリエチレングリコール残基（以下PEGとい
う）の大きさ、即ち分子量は、得られる高分子化
NADP+をバイオリアクターに組込んだ際に充填
塔から漏洩する可能性と、反応の能率とを考慮し
て決定され、3000〜20000である。分子量を必要
以上に高くした場合には漏洩の危険性が減少し、
ひいては回収操作が容易となる一方、本発明の高
分子化NADP+がNADP+とPEGとの１対１結合
により得られたものであることから、反応の効率
は減少する（NADP+の密度が小さい）。他方、
PEGの分子量を必要以上に小さくした場合には、
高分子化NADP+を閉じ込めておくために必要な
フイルター等支持体の孔径を著しく小さいものと
しなければならず、漏洩の可能性も高くなり、漏
洩がなくなつたとしてもフイルター孔径が小さい
ことに基き反応効率も低下する可能性がある。 このような本発明の高分子化NADP+即ちPEG
−NADP+は種々の脱水素酵素に対して補酵素活
性を有し、バイオリアクターに組込んで場合に長
期に亘り連続反応に供することができる。 本発明の高分子化NADP+の製造方法は以下の
通りである まず、NADP+をアルキル化剤でアルキル化
し、必要により転移反応させて、式： N6−NADP+−R′ ただしN6は前記定義通りであり、R′はＲ−
COO−またはＲ−COOH（Ｒは前記と同じ）を表
す。 で示される中間体を形成し、次いで分子量3000〜
20000のポリエチレングリコールまたはアミノ化
ポリエチレングリコールとペプチド結合させるこ
とにより製造することができる。 アルキル化剤としてはハロカルボン酸またはラ
クトン、例えばハロ酢酸、β−ハロプロピオン
酸、γ−ハロ酪酸、４−ハロ吉草酸、５−ハロカ
プロン酸、８−ハロペラルゴン酸、γ−，δ−ま
たはε−ラクトン等を使用することができる。 アルキル化反応においては、初めにアルキル化
剤はNADP+のN1−位に結合するが、デイムロス
転移反応に付すことにより容易にN6−誘導体を
得ることができる。 以下、本発明を実施例に従つて更に具体的に説
明する。 実施例 (a) NADP+の高分子化 NADP+（オリエンタル酵母製）１ｇを水６ml
に溶解し、PHを6.0に調節しつゝ４時間毎に0.2ml
のβ−プロピオラクトンを５回添加した。室温
（20℃）で20時間反応させた。反応液を6N HCl
でPH3.0に調節して、０℃に冷却後、20倍容量の
冷アセトン：エタノール混液（１：１）を滴下
し、生成した白色沈澱N1−（２−カルボキシエチ
ル）−NADP+を遠心分離し乾燥した。0.54ｇを得
た。 N1−（２−カルボキシエチル）−NADP+1ｇを
1.3％NaHCO3溶液50mlに溶し窒素気流下で
Na2S2O4500mgを添加し（室温）反応完了後空気
を15分間流した後、LiOHにてPHを11.0に調節し、
65℃に10分間保つてDimroth転移反応を行つた。
冷却後PHを7.5に調節し、酢酸アンモニウム500
mg、α−ケトグルタール酸300mg、EDTA3mgと
馬肝臓グルタメートデヒドロゲナーゼ164単位を
加えて30℃で一晩反応させた。生成したN6−（２
−カルボキシエチル）−NADP+は20倍量のアセ
トン−エタノール混液を加えて沈澱させた。粗
N6−（２−カルボキシエチル）−NADP+を１の
水に溶し、DEAE−Sephadex Ａ−25（Cl-）のカ
ラムに吸着させ、LiClの濃度勾配にて溶出させ
た。N6−（２−カルボキシエチル）−NADP+を含
む区分から前述のアセトン−エタノールを加えて
沈澱させた。収率0.25ｇ。 ジアミノポリエチレングリコール８ｇを20mlの
水に溶しHClにてPHを4.5にした。N6−（２−カル
ボキシエチル）−NADP+400mgと、１−エチル−
３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイ
ミド−HCl2.4ｇを室温下で分割添加した。20時
間室温でPHを4.5に保ちながら反応させた。反応
生成物をカツトオフ分子量1000のセルローズ透析
膜を用いて一夜透析した後SP−SephadexC−25
（H+）のカラムとDEAE−Sephadex Ａ−25
（Cl-）のカラムを通過する区分をとる。収率
1.065ｇ（NADP+として38％）であつた。 (b) 補酵素活性の測定 反応液3.0ml中に50μMのNADP+残基と50mM
のトリス塩酸（PH8.0）と0.05％馬血清アルブミ
ンを含み、その他に以下のような成分を含む溶液
を30℃にて反応させ、340nmにおける吸収の変化
を測定することにより、補酵素活性の測定を行つ
た。結果を第１表に示す。 (i) グルコース−６−ホスフエートデヒドロゲナ
ーゼの場合には1mMのグルコース−６−ホス
フエート、5mMのMgCl2および0.05単位の酵
母起源、0.1または５単位のB.ステアロサーモ
フイルス起源もしくは0.08単位または0.5単位
のL.メセンテロイデス起源の酵素を含む。 (ii) グルタメートデヒドロゲナーゼの場合は、
0.1ML−グルタメートと0.06単位の酵母起源ま
たは0.6もしくは1.2単位の馬肝臓起源の酵素を
含む。 (iii) ６−ホスホグルコネートデヒドロゲナーゼの
場合には1mMの６−ホスホグルコネート、
10mMのMaCl2および0.1単位の酵母起源の酵
素を含む。 (iv) アルデヒドデヒドロゲナーゼの場合には、
50mMのアセトアルデヒド、0.1MKCl，1mM
のEDTA，5mMの２−メルカプトエタノール
および４単位の酵母起源の酵素を含む。
ジヌクレオチドリン酸（NADP+）の高分子化に
関するものである。 近年の省資源，省エネルギーまたは新エネルギ
ー源の開拓の要請並びに環境汚染防止の要請等か
ら、生体系におけると同様な酵素反応が注目され
てきている。酵素反応は酵素が基質特異性を有す
ること、温和な反応条件等の利点を有することか
ら工業的にも広く利用されてきている。中でも、
一般にバイオリアクターと呼ばれる生産システム
は生体内で行われている生合成を生体外で実施し
ようとするものであるが、生合成と同様な反応を
生体外で行うためには種々の問題を解決しなけれ
ばらない。解決すべき問題の１つとしては安定化
され、回収した後再利用できるような酵素およ
び／または補酵素の開発がある。 このような問題を解決する目的で、本出願人は
既にATPの可溶性高分子化の技術を開発し特許
出願している（特開昭56−154497号）。 更に、前記目的を達成するために今回は脱水素
酵素の補酵素として有用なNADP+の高分子化を
行い、高分子化後も補酵素活性を維持し得ること
を確認して本発明を完成した。 従来も、NADP+を高分子化（固定化）しよう
との試みがなされている。例えば、担体としてセ
ルロース、セフアロースもしくは多孔性ガラスの
アミノシラン誘導体を使用して固定化された
NADP+が知られている（千畑一郎編「固定化酵
素」p80〜昭和50年３月20日講談社刊）。 しかしながら、このような従来の固定化
NADP+は酵素の濃縮、精製に使用されるアフイ
ニテイークロマト用担体として意図されたもので
あり、また巨大な支持体上に隣接して多数の
NADP+分子を固定したものであることに基く、
例えば高濃度で使用した場合に粘度が大きすぎて
取扱いが困難である等の欠点を有し、バイオリア
クターにおいて使用するのに適しているとはいえ
ない。 このような状況の下で、本発明者は従来の固定
化補酵素の有する前記の如き欠点を改善し、バイ
オリアクターにおいて使用するのに適したものと
するために種々検討を行つた結果本発明を完成す
るに至つた。 そこで、本発明の主たる目的は高分子化
NADP+の製造方法を提供することである。 本発明の製造方法で製造される高分子化
NADP+は一般式： N6−NADP+−Ｒ−Ａ−Ｂ ただし、N6は置換基がNADP+のアデニン環の
６−位におけるアミノ基に結合していることを示
し、Ａは−CONH−を表し、Ｒは−（CH2）o−
（ｎ＝２〜８）を表し、Ｂは末端がアミノ化され
たもしくはアミノ化されていないポリエチレング
リコール残基を表す、 で示される。 ポリエチレングリコール残基（以下PEGとい
う）の大きさ、即ち分子量は、得られる高分子化
NADP+をバイオリアクターに組込んだ際に充填
塔から漏洩する可能性と、反応の能率とを考慮し
て決定され、3000〜20000である。分子量を必要
以上に高くした場合には漏洩の危険性が減少し、
ひいては回収操作が容易となる一方、本発明の高
分子化NADP+がNADP+とPEGとの１対１結合
により得られたものであることから、反応の効率
は減少する（NADP+の密度が小さい）。他方、
PEGの分子量を必要以上に小さくした場合には、
高分子化NADP+を閉じ込めておくために必要な
フイルター等支持体の孔径を著しく小さいものと
しなければならず、漏洩の可能性も高くなり、漏
洩がなくなつたとしてもフイルター孔径が小さい
ことに基き反応効率も低下する可能性がある。 このような本発明の高分子化NADP+即ちPEG
−NADP+は種々の脱水素酵素に対して補酵素活
性を有し、バイオリアクターに組込んで場合に長
期に亘り連続反応に供することができる。 本発明の高分子化NADP+の製造方法は以下の
通りである まず、NADP+をアルキル化剤でアルキル化
し、必要により転移反応させて、式： N6−NADP+−R′ ただしN6は前記定義通りであり、R′はＲ−
COO−またはＲ−COOH（Ｒは前記と同じ）を表
す。 で示される中間体を形成し、次いで分子量3000〜
20000のポリエチレングリコールまたはアミノ化
ポリエチレングリコールとペプチド結合させるこ
とにより製造することができる。 アルキル化剤としてはハロカルボン酸またはラ
クトン、例えばハロ酢酸、β−ハロプロピオン
酸、γ−ハロ酪酸、４−ハロ吉草酸、５−ハロカ
プロン酸、８−ハロペラルゴン酸、γ−，δ−ま
たはε−ラクトン等を使用することができる。 アルキル化反応においては、初めにアルキル化
剤はNADP+のN1−位に結合するが、デイムロス
転移反応に付すことにより容易にN6−誘導体を
得ることができる。 以下、本発明を実施例に従つて更に具体的に説
明する。 実施例 (a) NADP+の高分子化 NADP+（オリエンタル酵母製）１ｇを水６ml
に溶解し、PHを6.0に調節しつゝ４時間毎に0.2ml
のβ−プロピオラクトンを５回添加した。室温
（20℃）で20時間反応させた。反応液を6N HCl
でPH3.0に調節して、０℃に冷却後、20倍容量の
冷アセトン：エタノール混液（１：１）を滴下
し、生成した白色沈澱N1−（２−カルボキシエチ
ル）−NADP+を遠心分離し乾燥した。0.54ｇを得
た。 N1−（２−カルボキシエチル）−NADP+1ｇを
1.3％NaHCO3溶液50mlに溶し窒素気流下で
Na2S2O4500mgを添加し（室温）反応完了後空気
を15分間流した後、LiOHにてPHを11.0に調節し、
65℃に10分間保つてDimroth転移反応を行つた。
冷却後PHを7.5に調節し、酢酸アンモニウム500
mg、α−ケトグルタール酸300mg、EDTA3mgと
馬肝臓グルタメートデヒドロゲナーゼ164単位を
加えて30℃で一晩反応させた。生成したN6−（２
−カルボキシエチル）−NADP+は20倍量のアセ
トン−エタノール混液を加えて沈澱させた。粗
N6−（２−カルボキシエチル）−NADP+を１の
水に溶し、DEAE−Sephadex Ａ−25（Cl-）のカ
ラムに吸着させ、LiClの濃度勾配にて溶出させ
た。N6−（２−カルボキシエチル）−NADP+を含
む区分から前述のアセトン−エタノールを加えて
沈澱させた。収率0.25ｇ。 ジアミノポリエチレングリコール８ｇを20mlの
水に溶しHClにてPHを4.5にした。N6−（２−カル
ボキシエチル）−NADP+400mgと、１−エチル−
３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイ
ミド−HCl2.4ｇを室温下で分割添加した。20時
間室温でPHを4.5に保ちながら反応させた。反応
生成物をカツトオフ分子量1000のセルローズ透析
膜を用いて一夜透析した後SP−SephadexC−25
（H+）のカラムとDEAE−Sephadex Ａ−25
（Cl-）のカラムを通過する区分をとる。収率
1.065ｇ（NADP+として38％）であつた。 (b) 補酵素活性の測定 反応液3.0ml中に50μMのNADP+残基と50mM
のトリス塩酸（PH8.0）と0.05％馬血清アルブミ
ンを含み、その他に以下のような成分を含む溶液
を30℃にて反応させ、340nmにおける吸収の変化
を測定することにより、補酵素活性の測定を行つ
た。結果を第１表に示す。 (i) グルコース−６−ホスフエートデヒドロゲナ
ーゼの場合には1mMのグルコース−６−ホス
フエート、5mMのMgCl2および0.05単位の酵
母起源、0.1または５単位のB.ステアロサーモ
フイルス起源もしくは0.08単位または0.5単位
のL.メセンテロイデス起源の酵素を含む。 (ii) グルタメートデヒドロゲナーゼの場合は、
0.1ML−グルタメートと0.06単位の酵母起源ま
たは0.6もしくは1.2単位の馬肝臓起源の酵素を
含む。 (iii) ６−ホスホグルコネートデヒドロゲナーゼの
場合には1mMの６−ホスホグルコネート、
10mMのMaCl2および0.1単位の酵母起源の酵
素を含む。 (iv) アルデヒドデヒドロゲナーゼの場合には、
50mMのアセトアルデヒド、0.1MKCl，1mM
のEDTA，5mMの２−メルカプトエタノール
および４単位の酵母起源の酵素を含む。
【表】
ある。
第１表の結果から、NADP+の補酵素活性は高
分子化することによりかなり低下するが、この点
は使用するPEG−NADP+の濃度を高くすること
により解消される。本発明の製造方法で得られる
PEG−NADP+は高濃度においてもそれ程粘度は
増加しないので、このような条件下においても取
扱いが困難になることはない。 (c) バイオリアクターにおける連続反応テスト 前記のようにして得たPEG−NADP+を使用
し、下記のような共役反応系： について連続反応テストを行つた。 まず、アミコン社製限外過器8MCにUM−２
限外過膜を装着する。主室には反応液１mlあた
り3mMのPEG−NADP+，２mgの馬血清アルブ
ミン，50mgのポリエチレングリコール，酵母グル
コース−６−ホスフエートデヒドロゲナーゼ10単
位、酵母グルタメートデヒドロゲナーゼ14単位お
よび基質溶液（50mMのグルコース−６−ホスフ
エート、5mMのMgCl2、10mMのα−ケトグル
タレート、100mMの酢酸アンモニウム、100mM
のEDTA、0.1Mのトリス塩酸PH8.0、0.02％ナト
リウムアジドおよび0.1％ストレプトマイシン）
を含んでいる。全反応器を30℃に保ち、窒素ガス
圧下で1.2ml／時の速度で反応液を限外過膜を
通して採取すると同時に、同じ速度で基質溶液を
添加した。６日間に亘り連続的に操作し反応液中
のグルタミン酸量を測定した結果を添付図に示
す。 ４日目頃まではほぼ一定の活性を維持したが、
およそ５日目頃から活性が低下することが観察さ
れたが、本発明の製造方法で得られる高分子化
NADP+はバイオリアクターに組込み、連続反応
に供し得るものであることは明らかである。
第１表の結果から、NADP+の補酵素活性は高
分子化することによりかなり低下するが、この点
は使用するPEG−NADP+の濃度を高くすること
により解消される。本発明の製造方法で得られる
PEG−NADP+は高濃度においてもそれ程粘度は
増加しないので、このような条件下においても取
扱いが困難になることはない。 (c) バイオリアクターにおける連続反応テスト 前記のようにして得たPEG−NADP+を使用
し、下記のような共役反応系： について連続反応テストを行つた。 まず、アミコン社製限外過器8MCにUM−２
限外過膜を装着する。主室には反応液１mlあた
り3mMのPEG−NADP+，２mgの馬血清アルブ
ミン，50mgのポリエチレングリコール，酵母グル
コース−６−ホスフエートデヒドロゲナーゼ10単
位、酵母グルタメートデヒドロゲナーゼ14単位お
よび基質溶液（50mMのグルコース−６−ホスフ
エート、5mMのMgCl2、10mMのα−ケトグル
タレート、100mMの酢酸アンモニウム、100mM
のEDTA、0.1Mのトリス塩酸PH8.0、0.02％ナト
リウムアジドおよび0.1％ストレプトマイシン）
を含んでいる。全反応器を30℃に保ち、窒素ガス
圧下で1.2ml／時の速度で反応液を限外過膜を
通して採取すると同時に、同じ速度で基質溶液を
添加した。６日間に亘り連続的に操作し反応液中
のグルタミン酸量を測定した結果を添付図に示
す。 ４日目頃まではほぼ一定の活性を維持したが、
およそ５日目頃から活性が低下することが観察さ
れたが、本発明の製造方法で得られる高分子化
NADP+はバイオリアクターに組込み、連続反応
に供し得るものであることは明らかである。
添付図は本発明の製造方法で得られる高分子化
NADP+を組込んだ共役連続反応系の反応経過を
示す図である。
NADP+を組込んだ共役連続反応系の反応経過を
示す図である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ NADP+をアルキル化剤でアルキル化し、必
要により転移反応させて、式： N6−NADP+−R′ ただしN6は置換基がNADP+のアデニン環の６
−位のアミノ基に結合していることを示し、
R′は、Ｒ−COO−またはＲ−COOH（Ｒは−
（CH2）o−（ｎ＝２〜８）を表す） を表す、 で示される中間体を形成し、次いで分子量3000〜
20000のポリエチレングリコールまたはアミノ化
ポリエチレングリコールとペプチド結合させるこ
とにより一般式： N6−NADP+−Ｒ−Ａ−Ｂ ただし、N6及びＲは前記と同じであり、Ａは
−CONH−であり、Ｂは末端がアミノ化された
もしくはアミノ化されていないポリエチレングリ
コール残基を表す、 で示される高分子化NADP+を製造する方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6511382A JPS58183699A (ja) | 1982-04-19 | 1982-04-19 | 高分子化ｎａｄｐ↑＋の製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6511382A JPS58183699A (ja) | 1982-04-19 | 1982-04-19 | 高分子化ｎａｄｐ↑＋の製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS58183699A JPS58183699A (ja) | 1983-10-26 |
| JPH0352476B2 true JPH0352476B2 (ja) | 1991-08-12 |
Family
ID=13277509
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6511382A Granted JPS58183699A (ja) | 1982-04-19 | 1982-04-19 | 高分子化ｎａｄｐ↑＋の製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS58183699A (ja) |
-
1982
- 1982-04-19 JP JP6511382A patent/JPS58183699A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS58183699A (ja) | 1983-10-26 |
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