JPH0353165A - ペルオキシダーゼを標識酵素とする蛍光検出法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、エンザイムイムノアツセイ法やパイプリダイ
ゼイションアッヒイ法等のようにＭＲを標識物質として
用いる検出方法に利用ざれる標識酵素としてペルＡキシ
ダーピを用いて発蛍光させ、この蛍光を測定することか
らなる蛍光検出法に関する。

［従来の技術］ 医療分野・農業分！多での免疫検査や生物学的な検査の
技法として、■測定対象物質と結合する抗体を放耐性同
位元素で標識し、測定物質と結合した抗体の量を放射性
同位元素から出る放射線を検知することによって測定す
るラジオイムノアッセイ法、■ラジオイムノアツセイ法
の改良法として案出ざれた方法で、測定対象物質と結合
する抗体を酵素で標識し、酵素反応によって発色′＠呈
する塁質を加えて、その発色度から目的とづる物質の有
烈およびその良を測定するエンザイムイムノアッセイ法
、■目的の塩単配列を有する核酸をプロープとしてｔ１
ｉ剣性同位元素、蛍光色素、酵素などで標識し、検索ま
たは判定する核酸とパイプリダイビイションを行い、そ
の異同および相同↑４を１１１定するハイブリダイビイ
ションアツセイ法等ｈ：知られている。

［発明が解決しようとする問題点］ これらの検出法において、ｆｉ識物質として敢躬性同位
元素を用いる方法は、感度の点で優れている反面、放射
線の被曝の危険性を有し、特別の施設および測定機器が
必要であり、また廃棄物処理にも特別の施設を必要とす
るなどの問題がある。

一方、酵素で標識し、検出には吸光光度法あるいは蛍光
法を用いる方法では、放射性同位元素取扱時の配慮を必
要とせず安全に取扱える利点を有する。しかしこのうち
吸光光度法による検出は発色度を測定するものであるが
感度の点で不満足である。また蛍光法はホモバニリン酸
、ｐ−ハイドロキシフェニルプロピＡン酸、チラミン等
による二母体の蛍光を利用するもので、高感度であると
いう利点を右するが、ハイブリダイピイション７ツセイ
法においては発光が短波長側で肉眼で検出し難いという
欠点を０づる。

［問題点を解決するための手段］ 本発明者らはハイブリダイピイションアッセイ法やエン
ザイムイムノアッセイ法による従来の検出法の欠点を解
消すべく検討を重ねた結果、１，２−ジアリールエチレ
ンジアミン（以下、ＤＡＥと称する）とカテコール化合
物がベルオキシダーじおよび過酸化水素の存在下に発蛍
光することを見い出だし、肉眼で観測しうる本蛍光検出
法を完或したものである。

本発明は、ハイブリダイしイションアッセイ法やエンザ
イムイムノアッセイ法の如き検出方法において、ベルオ
キシダービを標識醇索として検体に結合させ、これにＤ
ＡＥ、カテコール化合物および過酸化水素を作用させて
発蛍光させたのら、この蛍光を測定することにより、診
断あるいは検査の用に供するものである。

すなわら、本発明において発蛍光に用いる検体は、ハイ
ブリダイピイションアッセイ法では、目的の塩基配列を
有する核酸をプローブとしてペルオキシダーゼで標識し
、メンブレンフィルターなどに固定した核酸とパイプリ
ダイビイションを行わせる。

また、エンザイムイムノアッセイ法では、検定の１１象
となる抗原とベルオキシダーＬ；標識抗体とを、抗原一
抗休反応を行わせるなど、公知の手法により得ることが
できる。

蛍光の測定方法としては、紫外線ランプ照躬下肉眼で検
出する、薄眉クロマトグラフィー蛍光スキＶナーで検出
する、または蛍光光度訓で検出するなどの方法を用いる
ことができる。

本発明において標識酵素として用いるベルＡキシダービ
は、生物界に広く分拓し、強い活性をもっている酵素で
あり、ペルオキシダーゼのほかミクロペルオキシダーゼ
も使用可能である。

また、発蛍光用の試薬であるＤＡＥは、次の一般式（Ｉ
）および（ｎ） （式中、八『はδ換基を有することもあるアリール基を
表わす〉で示されるｍｅｓｏ一形（Ｉ）、ｄｊ一形（Ｉ
ｆ）のいずれも使用することができる。

置換基を有することもあるアリール塁としてはフェニル
基、メヂルフエニル基やエブルフエニル基などのアルキ
ルフ１ニル基、メトキシフエニル阜やエトキシフエニル
基などのアルコ牛シフエニル塁、３，４−ジアルコキシ
フエニル基、クロロフエニル基やフルオロフエニル塁な
どのハロゲノフェニル基、３，４−ジハロゲノフエニル
基、ナフヂルフェニル基などが例示されるが、これらに
限定されるものではない。これらの中で特にフエニル基
、２−メヂルフエニル基、４−メチルフエニル基、４−
ｘチルフエニル基などの７ルキルノエニル基、４−メト
キシフエニル基、４−エトキシフェニル基などの７ルコ
キシフエニル塁、４−フルオロフエニル基が好ましい結
果を与える。なお、クロロフエニル基、ジクロ口フエニ
ル基、ナフチルフエニル基であるＤＡＥで得られる発光
極大波長はフエニル基のＤＡＥの発光極大波長よりも長
波長域にある。

また、カテコール化合物としてはエピネフリン、３．４
−ジハイド口キシフエニル酢酸、イソプロテレノール、
４−メチル力テコールなどが例示されるが、特にエビネ
フリン、イソプロテレノールが蛍光強度が高く、ざらに
エピネフリンは各種力テコール化合物中最もブランク値
が低く、最−ｂ高い感度が得られる。

すなわち本介明にお【ブる発蛍光の試薬としては、メソ
ー１，２−ジフエニルエチレンジアミンとエピネフリン
の組合せが最適である。

本発明の溶液系での発蛍光反応は、ペルオキシダーゼ、
ＤＡＥ，カテ］一ル化合物および過酸化水素をリン酸塩
緩衝液中で反応させるものである。

反応時間と蛍光強度の関係は、反応時間が長くなるのに
従い蛍光強度Ｃま増加し、約１２０分で最大の蛍光強度
を匂え、以後徐々に減少寸る。従って反応時間は１００
〜１５０分が最適である。このさいの反応温度は３０〜
４５℃が好ましい。

発蛍光反応におｔプるＤ八Ｅの濃度【よＤＡＥのアリー
ル基の種類によっても異るが０．０５〜０．３Ｍが良好
であり、特に０．０８〜０．　１５Ｍが最適である。

カテコール化合物の′ａ度もその種類によって幾分異る
が４〜２０ｍＭが良好であり、特に５〜１５ｍＨ／Ａ最
適である。２０ｍＭ以上の高濃度では蛍光強度が急速に
減少するので好ましくない。

また過酸化水素の濃度は１〜４ｍＨが良好であり、特に
１．５〜３ｍＭが最適である。リンＭ塩緩衝液の９１１
は反応時間１２０分の場合１）１１７．０〜７．５で最
大の蛍光強度が得られる。

ベルオキシダーじを溶解した０．　０５Ｍリン酸塩緩衝
液（ｐＨ７．０）　０．１ｍに０。ＩＭ　　ｌｌｌｅＳ
Ｏ−　１．２　−ジフェニルエチレンジアミン０．２ｒ
Ｉｄｌ，　１０ｍＭエピネフリン１．０　Ｉｄ、２ｍｆ
｛過酸化水！　１．Ｏｒ！ｄｌおよび０．０５Ｍリン酸
塩緩衝液（ｔ）１１７．０）　０．９ｄを加え、この混
液を３７℃で１２０分反応して発蛍光させ、励起側３６
０ｎｍ　，発光側５００ｎｍ　　（いずれも極大波長〉
で蛍光検出を行って作成したペルオキシダーゼの検星線
は、ｌ　ｘ　１０’　〜ｌ　ｘ　１０−３ｕｎｉｔｓ／
　ｍｌ（ｒ）範囲で直線を示した。

さらに本発明はノイロン、イモビロンＰＶＤＦ転写膜な
どのメンプランフィルター上での発蛍光反応を可能とす
るものである。すなわら、ベルオキシダーピを結合した
検体をメンプランフィルター上に保持させ、このメンプ
ランフィルターをＤＡＥ濃度が０．　０５〜０．３Ｍ、
好ましくは０．　０８〜０．　１５Ｍ　，カテコール化
合物濃度が４〜２０１１１８、好ましくは５〜１５ｍ｝
ｌ，過酸化水素が０．０５〜０．２Ｍであるリン酸塩緩
衝液（ｐＨ６．５〜７．０）に浸漬し、３０〜４５℃で
１００〜１５０分間反応させたのら、紫外線ランプ照射
下肉眼で、またはＪｆｆｌクロマトグラフィー蛍光スキ
ｉ？ナーで検出する。

蛍光検出はナイロンメンプランフィルターで励起側３６
０ｎｍ　１介光側４６０ｎｍ　１イーＥビロンＰＶＤＦ
メンプランフィルターで励起側３６０ｎｍ　，允光側４
６５ｎｍ　　（いずれも極人波長〉である。なお、メン
プランフィルター上で蛍光検出は溶液系の場合と比較し
て、発光極大波長が短波長側にシフトしているのは、蛍
光物質がメンプランフィルターに吸着され、疎水的な環
境に置かれたためと考えられる。

［発明の効果］ 本発明は標識酵素としてベルＡキシダービを用いた高感
度蛍光検出法に関するものであり、エンザイムイムノア
ッセイ法での蛍光検出のほか、メンプランフィルター上
での蛍光検出を可能とづることにより、パイプリダイピ
イションアッセイ法での利用を従来より容易とするもの
である。すなわち、各種１１・ルモン、薬剤、ウイルス
抗原、腫瘍関連抗原、免疫グロブリン、血清タンパク、
リウマチ囚子などの測定を可能とするもので、生物学的
検査としては植物ウイルスの定量、植物ボルモンの定量
、害虫のウイルス保有率検査などに利用でき得るもので
ある。

［実　施　例］ 以下、実施例により本発明を説明する。

実施例　１ ベルオキシダーピを溶解した０．　０５Ｍリン酸塩緩衝
液（ｐＨ７．０）　０．１ｄに０．ＩＭ　　ＩＩｅＳＯ
−　１．２−ジフェニルエチレンジアミン０．２ｄ，　
１０ｍＨエピネフリン１．Ｏ　ｄ、２１１８過酸化水素
１．０−および０．　０５Ｍリン酸塩緩衝液（ｐｔｌ７
．ｏ）　０．９ｍｉを加え、この混液を３７℃で１２０
分反応して発蛍光させた。同様の充蛍光反応を第１表記
戟のＤ八［を用いたほかはｍｅｓｏ　−１，２　−ジフ
エニルエチレンジアミンと同一の条例で行い、それぞれ
の蛍光強度を測定した。それぞれの蛍光励起おＪ、び梵
光極大波長、ｍｅｓｏ−１．２ジフエニルエブレンジア
ミンの蛍光強度を１００としたときの他のＤ八Ｅの蛍光
強度を第１表に示す第 １ 表 実施例　２ ベルオキシダービを溶解した０．０５Ｍリン酸塩緩山液
＜ＤＨ７．０）　０．１−に０．ＩＭｍｅｓｏＡ，２−
ジフェニルエチレンジアミン０．２ｍ，　１０１１１８
エピネフリン１．０　ｄ，　２ｍＨ’ｐｍ化水素ｉ．ｏ
一および０．０５Ｍリン酸塩緩衝液（ｐｌ１７．０）　
０．９ｍＩｌを加え、この混液を３７℃で１２０分反応
して発蛍光させた。同様の発蛍光反応を第２表記載のカ
テコール化合物を用いたほかはエビネフリンと同一の条
イ１で行い、それぞれの蛍光強度を測定した。それぞれ
の蛍光励起および発光極大波長、エピネフリンの蛍光強
度を１００としたときの他のカテコール化合物の蛍光強
度を第２表に示す。

（以下余白〉 粥 ２ 表 実施例　３ ベルオキシダーぜを溶解した０．０５Ｍリン酸塩緩衝液
（　ｐ１１７．　０）　５μ１を、ナイロンメンブラン
フィルターおよびイモビロンＰ　Ｖ　Ｄ　Ｆメンプラン
フィルター上にそれぞれスポットし、１　０ｎ｝ｌ　Ｉ
ピネフリン、０．ＩＭ　　ｍｅｓｏ−　１．２　−ジフ
エニルエチレンジアミン、０．１Ｍ過酸化水素を０．０
５Ｍリン酸塩緩衝液に溶解した反応液に浸漬する。３７
℃で１２０分反応して発蛍光させたのら、ナイロンメン
ブランフィルターでは励起側３６０ｎｍ　，発光側４６
０ｎｍ（いずれも極大波長）、またイモどロンＰＶＤＦ
メンプランフィルターでは励起側３６０ｎｍ　、発光側
４６５ｎｍ（いずれも極大波長）で蛍光検出を行った。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １、ペルオキシダーゼを標識物質とする検出方法におい
   て、検体に結合させたペルオキシダーゼに過酸化水素の
   存在下１，２−ジアリールエチレンジアミンとカテコー
   ル化合物を作用させて発蛍光させ、該蛍光を測定するこ
   とを特徴とする蛍光検出法。