JPH0354550B2 - - Google Patents
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- Publication number
- JPH0354550B2 JPH0354550B2 JP18606186A JP18606186A JPH0354550B2 JP H0354550 B2 JPH0354550 B2 JP H0354550B2 JP 18606186 A JP18606186 A JP 18606186A JP 18606186 A JP18606186 A JP 18606186A JP H0354550 B2 JPH0354550 B2 JP H0354550B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- medium
- glutamic acid
- lysozyme
- culture
- biotin
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
本発明はコリネバクテリウム属またはブレビバ
クテリウム属に属し、リゾチームに感受性を有
し、培地中に存在する過剰のビオチンによつてＬ
−グルタミン酸の生産が抑制されないＬ−グルタ
ミン酸生産性新規微生物に関する。 生育にビオチンを要求するＬ−グルタミン酸生
産菌のＬ−グルタミン酸生産性は培地中のビオチ
ン濃度と極めて密接な関係があり、生育に対して
制限量のビオチン濃度のときはじめてＬ−グルタ
ミン酸を生産できる。一方安価な培地の粗原料と
して利用される廃糖蜜、殿粉加水分解物などはビ
チオンを多量に含有している。これら粗原料を含
有する培地にＬ−グルタミン酸生産菌を培養する
方法としては特公昭37−1695号公報、特公昭38−
25288号公報などに記載されている方法が知られ
ているが、工業的にはさらに優れた方法が望まれ
ている。 本発明者らは、安価な粗原料を用い、過剰量の
ビチオンの作用を回避してＬ−グルタミン酸を製
造する方法につき研究した結果、従来のＬ−グル
タミン酸生産菌を親株として変異誘導したリゾチ
ームに感受性を有する変異株を用いれば、過剰の
ビオチン含有培地を用いても、ビオチンによる抑
制を受けることなく高い収率でＬ−グルタミン酸
を生産できることを見出した。 以下本発明をさらに詳細に説明する。 本発明によればコリネバクテリウム属またはブ
レビバクテリウム属に属し、リゾチームに感受性
を有し、培地中に存在する過剰のビオチンによつ
てＬ−グルタミン酸の生産が抑制されない性質を
有する微生物を培地に培養すれば培地中にＬ−グ
ルタミン酸が蓄積するので、これを採取すること
により高収率にＬ−グルタミン酸が得られる。 本発明に用いる微生物はコリネバクテリウム属
またはブレビバクテリウム属に属し、リゾチーム
に感受性を有し、培地中に存在する過剰のビオチ
ンによつてＬ−グルタミン酸の生産が抑制されな
い性質を有する微生物であればいかなる菌株をも
用いることができる。一般にはコリネバクテリウ
ム属またはブレビバクテリウム属に属し、Ｌ−グ
ルタミン酸生産能を有する菌株を親株とし、これ
を変異誘導処理して得られた変異株からリゾチー
ムに感受性を有するものを選択し、これを用い
る。変異誘導の方法としては、紫外線照射、放射
線照射、変異誘起剤処理等の通常の方法が用いら
れる。変異誘導された変異株からリゾチームに感
受性を有する菌株を選択するには、親株が生育可
能な濃度のリゾチームを含有する培地で生育でき
なくて、リゾチーム無添加培地では親株と同様に
生育できるものを選べばよい。従つて、ここでリ
ゾチームに感受性であることは、リゾチームに対
する最小阻止濃度が親株より低いことを意味す
る。また培地中に存在する過剰のビオチンによつ
てＬ−グルタミン酸の生産が抑制されないとは、
培地中に存在する過剰のビオチンによるＬ−グル
タミン酸生産の抑制が実質的に無視できる程度の
ものであることを意味する。具体的には前記のご
とき粗原料を用いた場合でも過剰のビオチンによ
る影響をうけることなくＬ−グルタミン酸の生産
ができることを意味する。 本発明に用いる具体的に好適な菌株の一例とし
ては、コリネバクテリウム・グルタミクム
ATCC13032を親株として得られたコリネバクテ
リウム・グルタミクムKY9703（微工研菌寄第
4412号、NRRL11271）、コリネバクテリウム・
グルタミクムKY9705（微工研菌寄第4413号、
NRRL11272）およびブレビバクテリウム・フラ
ブムATCC14067を親株として得られたブレビバ
クテリウム・フラブムKY9733（微工研菌寄第
4414号、NRRL11273）があげられる。 コリネバクテリウム・グルタミクム
ATCC13032を親株としてリゾチーム感受性変異
株を取得する方法について以下具体的に説明す
る。該親株を粉末ブイヨン（極東製薬社製）20
ｇ／および酵母エキス５ｇ／の組成を有する
培地（殺菌前PH7.2、以下Ｃ培地という）に植菌
し30℃で振盪培養する。中期対数期で培養を中止
し、集菌し、生理食塩水で洗浄後、Ｍ／20トリ
ス・マレート緩衝液（PH6.0）に５×108細胞／ml
になるように懸濁する。この懸濁液に最終濃度
500μｇ／mlになるようにニトロソグアニジンを
加え、25℃で30分間放置し、遠心分離により菌体
を集め、同一緩衝液で菌体を洗浄後、生理食塩水
に懸濁し、適宜生理食塩水で希釈してＣ培地にさ
らに２ｇ／dlの寒天を含む固体培地（以下CA培
地という）に塗りつける。これを30℃で２日間培
養し、生じたコロニー（約6000）を次の３種類の
固体培地にレプリカ法により塗りつける。 CA培地 CLA培地：CA培地を加熱殺菌後、冷却して
培地の温度が45℃まで下がつてから200mg／
になるようにリゾチームを添加した培地。 MA培地：グルコース10ｇ／、NH4Cl4
ｇ／、尿素２ｇ／、KH2PO41ｇ／、
K2HPO4 ３ｇ／、FeSO4・7H2O 10mg／、
MgSO4・7H2O 400mg／、MnCl2・4H2O ２
mg／、ZnSO4・7H2O 0.9mg／、CuSO4・
5H2O 0.4mg／、Na2B4O7・10H2O 0.09mg／
、（NH4）6Mo7O24・4H2O 0.04mg／、ビオ
チン30μｇ／、サイアミン塩酸塩１mg／、
システイン塩酸塩20mg／および寒天20ｇ／
の組成を有する培地（殺菌前PH7.0）。 30℃で２日間培養後、CA培地で生育し、CLA
培地で生育しない菌をリゾチーム感受性変異株と
して得る。MA培地で親株と同様に生育する自己
栄養性でリゾチームに対して感受性の変異株は試
験した6000コロニーの中に110株得られた。この
110株中17株がビオチン過剰培地でも多量のＬ−
グルタミン酸を生育する能力を有していた。コリ
ネバクテリウム・グルタミクムKY9703および
KY9705はかくして得られた変異株の一例であ
る。 ブレビバクテリウム・フラブムATCC14067を
親株とする変異誘導も上記と同様に行つて、ブレ
ビバクテリウム・フラブムKY9733を得た。 上記例示の変異株とMA培地、CA培地、CLA
培地での生育およびリゾチーム感受性度について
親株と比較した結果を第１表に示す。３種類の固
体培地上での生育はレプリカ法で塗りつけ、30℃
で２日間培養後判定した。表中生育欄の＋は菌の
生育が観察されたものを、−は生育が観察されな
かつたものを示す。また表中リゾチーム感受性は
次のように試験した。すなわちＣ培地にて24時間
30℃液体振盪培養した菌を集菌後、生理食塩水に
て適当に希釈して菌体の懸濁液をつくる。この懸
濁液104細胞相当を倍々系列の濃度のリゾチーム
を含有するCA培地に滴下接種し、30℃で２日間
培養する。菌の生育がまつたくみとめめられない
最小のリゾチーム濃度を菌のリゾチーム感受性値
（最小生育阻止濃度）とした。
クテリウム属に属し、リゾチームに感受性を有
し、培地中に存在する過剰のビオチンによつてＬ
−グルタミン酸の生産が抑制されないＬ−グルタ
ミン酸生産性新規微生物に関する。 生育にビオチンを要求するＬ−グルタミン酸生
産菌のＬ−グルタミン酸生産性は培地中のビオチ
ン濃度と極めて密接な関係があり、生育に対して
制限量のビオチン濃度のときはじめてＬ−グルタ
ミン酸を生産できる。一方安価な培地の粗原料と
して利用される廃糖蜜、殿粉加水分解物などはビ
チオンを多量に含有している。これら粗原料を含
有する培地にＬ−グルタミン酸生産菌を培養する
方法としては特公昭37−1695号公報、特公昭38−
25288号公報などに記載されている方法が知られ
ているが、工業的にはさらに優れた方法が望まれ
ている。 本発明者らは、安価な粗原料を用い、過剰量の
ビチオンの作用を回避してＬ−グルタミン酸を製
造する方法につき研究した結果、従来のＬ−グル
タミン酸生産菌を親株として変異誘導したリゾチ
ームに感受性を有する変異株を用いれば、過剰の
ビオチン含有培地を用いても、ビオチンによる抑
制を受けることなく高い収率でＬ−グルタミン酸
を生産できることを見出した。 以下本発明をさらに詳細に説明する。 本発明によればコリネバクテリウム属またはブ
レビバクテリウム属に属し、リゾチームに感受性
を有し、培地中に存在する過剰のビオチンによつ
てＬ−グルタミン酸の生産が抑制されない性質を
有する微生物を培地に培養すれば培地中にＬ−グ
ルタミン酸が蓄積するので、これを採取すること
により高収率にＬ−グルタミン酸が得られる。 本発明に用いる微生物はコリネバクテリウム属
またはブレビバクテリウム属に属し、リゾチーム
に感受性を有し、培地中に存在する過剰のビオチ
ンによつてＬ−グルタミン酸の生産が抑制されな
い性質を有する微生物であればいかなる菌株をも
用いることができる。一般にはコリネバクテリウ
ム属またはブレビバクテリウム属に属し、Ｌ−グ
ルタミン酸生産能を有する菌株を親株とし、これ
を変異誘導処理して得られた変異株からリゾチー
ムに感受性を有するものを選択し、これを用い
る。変異誘導の方法としては、紫外線照射、放射
線照射、変異誘起剤処理等の通常の方法が用いら
れる。変異誘導された変異株からリゾチームに感
受性を有する菌株を選択するには、親株が生育可
能な濃度のリゾチームを含有する培地で生育でき
なくて、リゾチーム無添加培地では親株と同様に
生育できるものを選べばよい。従つて、ここでリ
ゾチームに感受性であることは、リゾチームに対
する最小阻止濃度が親株より低いことを意味す
る。また培地中に存在する過剰のビオチンによつ
てＬ−グルタミン酸の生産が抑制されないとは、
培地中に存在する過剰のビオチンによるＬ−グル
タミン酸生産の抑制が実質的に無視できる程度の
ものであることを意味する。具体的には前記のご
とき粗原料を用いた場合でも過剰のビオチンによ
る影響をうけることなくＬ−グルタミン酸の生産
ができることを意味する。 本発明に用いる具体的に好適な菌株の一例とし
ては、コリネバクテリウム・グルタミクム
ATCC13032を親株として得られたコリネバクテ
リウム・グルタミクムKY9703（微工研菌寄第
4412号、NRRL11271）、コリネバクテリウム・
グルタミクムKY9705（微工研菌寄第4413号、
NRRL11272）およびブレビバクテリウム・フラ
ブムATCC14067を親株として得られたブレビバ
クテリウム・フラブムKY9733（微工研菌寄第
4414号、NRRL11273）があげられる。 コリネバクテリウム・グルタミクム
ATCC13032を親株としてリゾチーム感受性変異
株を取得する方法について以下具体的に説明す
る。該親株を粉末ブイヨン（極東製薬社製）20
ｇ／および酵母エキス５ｇ／の組成を有する
培地（殺菌前PH7.2、以下Ｃ培地という）に植菌
し30℃で振盪培養する。中期対数期で培養を中止
し、集菌し、生理食塩水で洗浄後、Ｍ／20トリ
ス・マレート緩衝液（PH6.0）に５×108細胞／ml
になるように懸濁する。この懸濁液に最終濃度
500μｇ／mlになるようにニトロソグアニジンを
加え、25℃で30分間放置し、遠心分離により菌体
を集め、同一緩衝液で菌体を洗浄後、生理食塩水
に懸濁し、適宜生理食塩水で希釈してＣ培地にさ
らに２ｇ／dlの寒天を含む固体培地（以下CA培
地という）に塗りつける。これを30℃で２日間培
養し、生じたコロニー（約6000）を次の３種類の
固体培地にレプリカ法により塗りつける。 CA培地 CLA培地：CA培地を加熱殺菌後、冷却して
培地の温度が45℃まで下がつてから200mg／
になるようにリゾチームを添加した培地。 MA培地：グルコース10ｇ／、NH4Cl4
ｇ／、尿素２ｇ／、KH2PO41ｇ／、
K2HPO4 ３ｇ／、FeSO4・7H2O 10mg／、
MgSO4・7H2O 400mg／、MnCl2・4H2O ２
mg／、ZnSO4・7H2O 0.9mg／、CuSO4・
5H2O 0.4mg／、Na2B4O7・10H2O 0.09mg／
、（NH4）6Mo7O24・4H2O 0.04mg／、ビオ
チン30μｇ／、サイアミン塩酸塩１mg／、
システイン塩酸塩20mg／および寒天20ｇ／
の組成を有する培地（殺菌前PH7.0）。 30℃で２日間培養後、CA培地で生育し、CLA
培地で生育しない菌をリゾチーム感受性変異株と
して得る。MA培地で親株と同様に生育する自己
栄養性でリゾチームに対して感受性の変異株は試
験した6000コロニーの中に110株得られた。この
110株中17株がビオチン過剰培地でも多量のＬ−
グルタミン酸を生育する能力を有していた。コリ
ネバクテリウム・グルタミクムKY9703および
KY9705はかくして得られた変異株の一例であ
る。 ブレビバクテリウム・フラブムATCC14067を
親株とする変異誘導も上記と同様に行つて、ブレ
ビバクテリウム・フラブムKY9733を得た。 上記例示の変異株とMA培地、CA培地、CLA
培地での生育およびリゾチーム感受性度について
親株と比較した結果を第１表に示す。３種類の固
体培地上での生育はレプリカ法で塗りつけ、30℃
で２日間培養後判定した。表中生育欄の＋は菌の
生育が観察されたものを、−は生育が観察されな
かつたものを示す。また表中リゾチーム感受性は
次のように試験した。すなわちＣ培地にて24時間
30℃液体振盪培養した菌を集菌後、生理食塩水に
て適当に希釈して菌体の懸濁液をつくる。この懸
濁液104細胞相当を倍々系列の濃度のリゾチーム
を含有するCA培地に滴下接種し、30℃で２日間
培養する。菌の生育がまつたくみとめめられない
最小のリゾチーム濃度を菌のリゾチーム感受性値
（最小生育阻止濃度）とした。
【表】
本発明の微生物を培養するための培地は、炭素
源、窒素源、無機化合物、その他の栄養素を適当
に含む培地ならば、通常Ｌ−グルタミン酸生産に
用いられる天然培地、合成培地のいずれも使用で
きる。たとえば炭素源としては蔗糖、ブドウ糖、
糖蜜などの糖質および殿粉糖化液などが、窒素源
としてはアンモニア、硫酸アンモニウム、塩酸ア
ンモニウム、硫酸アンモニウム、燐酸アンモニウ
ム、炭酸アンモニウム、水酸化アンモニウム、ク
エン酸アンモニウム、酒石酸アンモニウム、酢酸
アンモニウム、尿素などの有機無機窒素化合物、
ペプトン、肉エキス、コーンスチープリカーなど
の天然栄養源などが、無機化合物としては燐酸第
一カリ、燐酸第二カリ、硫酸カリ、硫酸マグネシ
ウム、塩化マグネシウム、硫酸第一鉄、塩化第二
鉄、硫酸マンガン、塩化マンガンなどが、その他
の栄養源としてはビオチン、サイアミンなどが用
いられる。 培養は振盪培養、通気撹拌培養などの好気的条
件で行い、培養温度は24〜37℃とくに28〜33℃が
好適である。培養中は適当な中和剤を用いてPHを
６〜９に調整るのが好ましい。培養は１〜３日間
行えば培養液中に著量のＬ−グルタミン酸が生成
蓄積する。培養液からのＬ−グルタミン酸の採取
は、菌体を除去した上清液から、イオン交換樹脂
による吸脱着法、濃縮晶析法、等電点晶析法な
ど、従来のＬ−グルタミン酸の製造において常用
される諸方法を適宜使用して行うことができる。 以下に本発明の実施例を示す。 実施例 １ グルコース40ｇ／、（NH4）2SO4 ２ｇ／、
MgSO4・7H2O 0.5ｇ／、KH2PO4 0.5ｇ／、
K2HPO4 １ｇ／、FeSO4・7H2O ２mg／、
MnSO4・4H2O ２mg／、サイアミン塩酸塩
１mg／、フエノールレツド10mg／およびビオ
チン2μｇ／あるいは100μｇ／の組成を有す
る培地を調製し、PHを7.0に調整した後、30mlず
つ300ml容の枝付フラスコに入れ、115℃で15分間
加熱殺菌した。冷却後、別に加熱殺菌した尿素液
を２ｇ／になるように添加した。この培地に第
２表に示した菌を接種し30℃で振盪培養を行つ
た。培養中培養液をPH6.5〜8.0に保つため12時間
目と20時間目の２回尿素液を４ｇ／になるよう
に添加し、32時間で培養を終了した。かくして培
養液中に蓄積したＬ−グルタミン酸量は、第２表
に示す通りである。培養液１から菌体を除去
し、濃縮し、塩酸でPH3.2に調整し、冷却してＬ
−グルタミン酸の粗結晶を得た。粗結晶の量
（ｇ）を括孤内に示す。
源、窒素源、無機化合物、その他の栄養素を適当
に含む培地ならば、通常Ｌ−グルタミン酸生産に
用いられる天然培地、合成培地のいずれも使用で
きる。たとえば炭素源としては蔗糖、ブドウ糖、
糖蜜などの糖質および殿粉糖化液などが、窒素源
としてはアンモニア、硫酸アンモニウム、塩酸ア
ンモニウム、硫酸アンモニウム、燐酸アンモニウ
ム、炭酸アンモニウム、水酸化アンモニウム、ク
エン酸アンモニウム、酒石酸アンモニウム、酢酸
アンモニウム、尿素などの有機無機窒素化合物、
ペプトン、肉エキス、コーンスチープリカーなど
の天然栄養源などが、無機化合物としては燐酸第
一カリ、燐酸第二カリ、硫酸カリ、硫酸マグネシ
ウム、塩化マグネシウム、硫酸第一鉄、塩化第二
鉄、硫酸マンガン、塩化マンガンなどが、その他
の栄養源としてはビオチン、サイアミンなどが用
いられる。 培養は振盪培養、通気撹拌培養などの好気的条
件で行い、培養温度は24〜37℃とくに28〜33℃が
好適である。培養中は適当な中和剤を用いてPHを
６〜９に調整るのが好ましい。培養は１〜３日間
行えば培養液中に著量のＬ−グルタミン酸が生成
蓄積する。培養液からのＬ−グルタミン酸の採取
は、菌体を除去した上清液から、イオン交換樹脂
による吸脱着法、濃縮晶析法、等電点晶析法な
ど、従来のＬ−グルタミン酸の製造において常用
される諸方法を適宜使用して行うことができる。 以下に本発明の実施例を示す。 実施例 １ グルコース40ｇ／、（NH4）2SO4 ２ｇ／、
MgSO4・7H2O 0.5ｇ／、KH2PO4 0.5ｇ／、
K2HPO4 １ｇ／、FeSO4・7H2O ２mg／、
MnSO4・4H2O ２mg／、サイアミン塩酸塩
１mg／、フエノールレツド10mg／およびビオ
チン2μｇ／あるいは100μｇ／の組成を有す
る培地を調製し、PHを7.0に調整した後、30mlず
つ300ml容の枝付フラスコに入れ、115℃で15分間
加熱殺菌した。冷却後、別に加熱殺菌した尿素液
を２ｇ／になるように添加した。この培地に第
２表に示した菌を接種し30℃で振盪培養を行つ
た。培養中培養液をPH6.5〜8.0に保つため12時間
目と20時間目の２回尿素液を４ｇ／になるよう
に添加し、32時間で培養を終了した。かくして培
養液中に蓄積したＬ−グルタミン酸量は、第２表
に示す通りである。培養液１から菌体を除去
し、濃縮し、塩酸でPH3.2に調整し、冷却してＬ
−グルタミン酸の粗結晶を得た。粗結晶の量
（ｇ）を括孤内に示す。
【表】
実施例 ２
実施例１で用いた培地中グルコースを甘蔗廃糖
蜜（グルコースとして40ｇ／相当量）に換え、
加熱殺菌後の培地をPH7.0に再調整する以外は実
施例１と同様に行つた。培養液中に蓄積したＬ−
グルタミン酸量を第３表に示す。
蜜（グルコースとして40ｇ／相当量）に換え、
加熱殺菌後の培地をPH7.0に再調整する以外は実
施例１と同様に行つた。培養液中に蓄積したＬ−
グルタミン酸量を第３表に示す。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ コリネバクテリウム・グリタミクムまたはブ
レビバクテリウム・フラブムに属し、リゾチーム
感受性を有し、培地中に存在する過剰のビオチン
によつてＬ−グルタミン酸の生産が抑制されない
性質を有する微生物。 ２ 該微生物がコリネバクテリウム・グルタミク
ムKY9703（微工研菌寄第4412、NRRL11271）、
コリネバクテリウム・グルタミクムKY9705（微
工研菌寄第4413、NRRL11272）またはブレビバ
クテリウム・フラブムKY9733（微工研菌寄第
4414、NRRL11273）である特許請求の範囲第１
項記載の微生物。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP18606186A JPS6244171A (ja) | 1986-08-07 | 1986-08-07 | Ｌ−グルタミン酸生産性新規微生物 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP18606186A JPS6244171A (ja) | 1986-08-07 | 1986-08-07 | Ｌ−グルタミン酸生産性新規微生物 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2882178A Division JPS54122794A (en) | 1978-03-14 | 1978-03-14 | Preparation of l-glutamic acid |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6244171A JPS6244171A (ja) | 1987-02-26 |
| JPH0354550B2 true JPH0354550B2 (ja) | 1991-08-20 |
Family
ID=16181705
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP18606186A Granted JPS6244171A (ja) | 1986-08-07 | 1986-08-07 | Ｌ−グルタミン酸生産性新規微生物 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6244171A (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ES2191710T3 (es) * | 1994-08-19 | 2003-09-16 | Ajinomoto Kk | Procedimiento para producir l-lisina y acido l-glutamico por fermentacion. |
| JP4184606B2 (ja) * | 1998-09-04 | 2008-11-19 | 協和醗酵工業株式会社 | 新規遺伝子 |
| KR102254635B1 (ko) * | 2021-01-27 | 2021-05-21 | 씨제이제일제당 주식회사 | 신규한 글루코사민-6-포스페이트 디아미나제 변이체 및 이를 이용한 l-글루탐산 생산 방법 |
-
1986
- 1986-08-07 JP JP18606186A patent/JPS6244171A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6244171A (ja) | 1987-02-26 |
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