JPH0354559B2 - - Google Patents
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- JPH0354559B2 JPH0354559B2 JP62209780A JP20978087A JPH0354559B2 JP H0354559 B2 JPH0354559 B2 JP H0354559B2 JP 62209780 A JP62209780 A JP 62209780A JP 20978087 A JP20978087 A JP 20978087A JP H0354559 B2 JPH0354559 B2 JP H0354559B2
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Landscapes
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Description
産業上の利用分野
本発明は、β−ガラクトシダーゼを利用するガ
ラクトオリゴ糖の製造方法に関する。 従来技術とその問題点 β−ガラクトシダーゼ（β−Ｄ−ガラクトシド
ガラクトヒドロラーゼ、EC3.2.1.23）は、β−Ｄ
−ガラクトシド結合を分解する酵素であり、哺乳
動物の小腸、組織等に広く分布し、ラクトースの
消化、複合糖質の代謝等に関与することが知られ
ている。またβ−ガラクトシダーゼは、上記哺乳
動物に限らず、各種植物や微生物にも存在してお
り、近年これら各種起源のもの、特に例えばエシ
エリヒア コリ（Escherichia coli）、クリベロ
ミセス ラクテイス（Kluyveromyces lactis）、
アスペルギルス オリゼー（Aspergillus
oryzae）、アスペルギルス ニガー（A.niger）
等の微生物起源のものが、そのガラクトース転移
作用を利用して、乳糖からのガラクトオリゴ糖の
製造に有用であることが示され、ヒトの腸内有用
細菌であるいわゆるビフイズス菌の増殖促進物質
としてのガラクトオリゴ糖の製造へのそれらの利
用が注目されつつある。 しかしながら、これら微生物起源のβ−ガラク
トシダーゼに限らず、一般にβ−ガラクトシダー
ゼの糖転移反応は、乳糖の加水分解反応と競合す
るものであり、上記糖転移反応を優先させて所望
のガラクトオリゴ糖を収率よく製造することは、
一般に非常に困難である。即ち、上記反応におい
ては、所望のオリゴ糖と共に、競合する加水分解
反応によつてグルコース、ガラクトースが生産さ
れ、しかも一旦生成したオリゴ糖も加水分解を受
けて単糖に変換され、オリゴ糖生成量はかなり低
くなる。事実、微生物起源の各種β−ガラクトシ
ダーゼのガラクトオリゴ糖生産量は、酵素の種類
や基質とする乳糖の濃度、酵素濃度（活性）、反
応条件等にかかわらず、最大でも約25％程度に過
ぎないことが報告されている〔雪印乳業技術研究
所報告、78、p19〜26（1982）；J.Dairy Sci.、61
−１、p33−38（1978）；Biochem、15−９、
p1994−2001（1976）；J.Dairy Sci.、68−３、
p581−588（1985）〕。 他方、本出願人も従来より上記β−ガラクトシ
ダーゼ、殊にバチルス サーキユランス
（Bacillus circulans）由来のそれにつき、鋭意研
究を重ねてきたが、その過程でバチルス サーキ
ユランス起源のβ−ガラクトシダーゼが、ハイド
ロキシアパタイトゲルを用いたクロマトグラフイ
ーにより、オリゴ糖生成能等の異なるβ−ガラク
トシダーゼ及び（「酵素」及び「酵素」
と云う）に分離されることを見出した（特開昭62
−118886号）。また上記各酵素を利用したオリゴ
糖生成収率は、ミルク中の濃度に相当する濃度
4.56％の乳糖を基質として、酵素では約６％に
過ぎないのに対し、酵素では約40％であり、該
酵素の利用がガラクトオリゴ糖の製造に有用で
あると考えた。しかし該酵素を分離して利用す
ることは、その調製自体繁雑であり、決して工業
的実施に有効であるとはいえなかつた。 本出願人らは、上記現状に鑑み、乳糖のβ−ガ
ラクトシダーゼ処理における競合反応の内、糖転
移反応を優先させることができ、所望のガラクト
オリゴ糖をより短時間に多量に高収率で収得でき
る方法を開発することを目的として、さらに鋭意
研究を重ねた結果、上記酵素及び酵素を分離
することなく、バチルス サーキユランス由来の
粗酵素のままで、基質濃度の高い所で、乳糖に作
用させる時には、実に驚くべきことに、より短時
間で多量のガラクトオリゴ糖が生産され、上記目
的に合致する方法が提供されることを見出した。 即ち、上記粗酵素を基質濃度の高い所で乳糖に
作用させる時には、基質濃度が高いことに基づい
て、該基質による保護作用により、用いられる各
酵素の熱安定性が増加し、両酵素とも優れた酵素
活性を発現し、この両者の酵素活性発現によつ
て、反応速度の上昇、反応時間の短縮、使用酵素
量の低減等が計り得ると共に、製品濃縮の度合が
少なくて済み、コストの低減が計り得ることを見
出した。しかるに、従来の酵素は、本来ガラクト
オリゴ糖生成収率自体の低いものであり、基質濃
度を高くしても本発明の上記酵素に見られる如き
酵素活性は発現されない。本発明は、上記新しい
知見に基づいて完成されたものである。 問題点を解決するための手段 本発明によれば、バチルス サーキユランスに
由来しβ−ガラクトシダーゼ及びβ−ガラクト
シダーゼを含むβ−ガラクトシダーゼ粗酵素
を、基質濃度30重量％以上の高基質濃度下に乳糖
に作用させ糖転移反応を優先させてガラクトオリ
ゴ糖を得ることを特徴とするガラクトオリゴ糖の
製造法が提供される。 本発明方法によれば、非常に簡単な操作で収率
よくガラクオリゴ糖を生産できる。また本発明方
法によれば、基質濃度の高い所で、より少量の酵
素の使用（低活性）で、より短時間に所望のガラ
クトオリゴ糖を多量に生産できる。 本発明方法において使用するβ−ガラクトシダ
ーゼとしては、バチルス サーキユランスに属す
る公知の該酵素生産菌、例えばバチルス サーキ
ユランスATCC No.31382の培養により得ること
ができる。その培養方法及び得られる酵素の酵素
化学的性質等は、例えば米国特許第4237230号明
細書に記載されている。上記酵素は培養除菌液で
あつてもよく、またこれを常法に従い硫安塩析、
遠心分離、透析等により精製した精製品であつて
もよい。 本発明方法は、上記バチルス サーキユランス
由来のβ−ガラクトシダーゼを、基質濃度30重量
％以上で乳糖に作用されることにより実施され
る。ここで基質として用いられる乳糖は、その濃
度を30重量％以上、好ましくは約40〜80重量％に
調製される限り、特に限定はない。また、上記酵
素の作用条件としては、一般に該酵素の作用至適
PH及び温度条件が採用される。そのPHは通常約６
〜７の範囲であるのが好ましく、また温度は通常
約40〜70℃の範囲であるのが好ましい。酵素の基
質に対する使用量も、特に限定されるものではな
いが、通常約2.5〜25LU／ｇ基質程度の範囲から
選択されるのがよい。尚、上記酵素単位は実施例
において詳述される。 かくして、本発明によれば所望のガラクトオリ
ゴ糖を、非常に簡単な操作で、収率よく製造する
ことができる。 実施例 以下、本発明を更に詳しく説明するため、実施
例を挙げる。 尚、各例におけるβ−ガラクトシダーゼ活性
は、以下の方法により測定したものであり、ガラ
クトオリゴ糖の定量は、以下の方法により行なつ
た。 ＜β−ガラクトシダーゼ活性の測定＞ ５％乳糖を含有する0.1M酢酸緩衝液（PH6.0）
４mlに本酵素１mlを加え、40℃で15分間反応させ
た後、反応液１mlを10％炭酸ナトリウム１mlに注
入して反応を停止させ、生成したグルコース量を
測定して乳糖の分解量を求める。１分間に1μM
の乳糖を加水分解する酵素量を1LU単位とする。 ＜ガラクトオリゴ糖の定量法＞ ウオーターズ社製高速液体クロマトグラフイー
（カラム：ラジアルパツクマイクロボンダパツク
NH2、溶媒：アセトニトリル／水＝65／35、流
速：２ml／分、検出：示差屈折計による）で測定
した。 本条件では、単糖、２〜５糖類は、いずれもそ
れぞれ単一のピークとして検出される。本発明に
おけるガラクトオリゴ糖とは、上記のうち３糖類
以上のものをいい、各例におけるガラクトオリゴ
糖量はこの３糖類以上の合計量で表わした。 実施例 １ ラクトース0.3ｇ、ポリペプトン３ｇ、肉エ
キス1.5ｇ及びNaCl0.2ｇを水に加えて全量を
100mlとし、PH7.0に調整後、これを坂口フラス
コに入れ、減菌した。これにバチルス サーキ
ユランス（ATCC31382）の１白金耳を接種し、
38℃で１日間振盪培養した。 下記各成分 ラクトース 48ｇ 魚 粉 36ｇ フアーマメデイア（トレーダーズオイルミル社
製） 18ｇ コーンデイステイラーズソリユブル 10ｇ 酵母エキス 1.95ｇ CaCO3 ４ｇ （NH4）2SO4 1.5ｇ MnCl2 0.02ｇ Na2CO3 2.1ｇ 大豆油 ５ml を全容２のジヤーフアーメンターに入れ、水
を加えて１とした後、殺菌した。これに上記
で得た培養液10mlを接種し、38℃で２日間、
通気攪拌培養した。 上記で得られた培養液の一部を遠心分離し
て菌体を除き酵素液を得た。この酵素液を濃
縮、透析処理して、100LU／mlの酵素液を得
た。 上記で得た酵素液（100LU／ml）１mlに、
予め加熱溶解させた乳糖液（乳糖60ｇに0.1M
酢酸緩衝液（PH6.0）55.8mlを加えたもの）を
加え、51.4％（Ｗ／Ｗ％、以下同じ）の反応液
100mlを調製し、これを65℃で３時間放置して、
酵素を乳糖に作用させた。 得られた反応液から0.1mlを取出し、これに
水2.0mlを加えて希釈し、ガラクトオリゴ糖の
定量に供した。 その結果、ガラクトオリゴ糖の収率は40％で
あつた。なお、この収率は、反応開始時の基質
乳糖濃度を100とした時の収率であり、以下の
各実施例においても同様とする。 実施例 ２ 実施例１において、基質濃度を55W／Ｗ％と
し、70℃で３時間反応させる以外は同様にした。 その結果、ガラクトオリゴ糖の収率は38％であ
つた。 実施例 ３ 実施例１ので得た酵素液（100LU／ml）１ml
に、予め加熱溶解させた乳糖液（乳糖20ｇに
0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）29mlを加えたもの）
を加え、40％の反応液50ｇを調製し、これを40℃
で５時間放置して、酵素を乳糖に作用させた。 得られた反応液から0.1ｇを取出し、これに水
２mlを加えて希釈し、ガラクトオリゴ糖の定量に
供した。 得られたガラクトオリゴ糖収率を第１表に示
す。 実施例 ４〜14 下記第１表に示す各種乳糖濃度、反応温度及び
反応時間（PH＝7.0一定）を採用して、実施例３
と同様にして、反応液を得た。 得られた反応液におけるガラクトオリゴ糖収率
を第１表に示す。尚、酵素濃度はLU／ｇ乳糖で
ある。
ラクトオリゴ糖の製造方法に関する。 従来技術とその問題点 β−ガラクトシダーゼ（β−Ｄ−ガラクトシド
ガラクトヒドロラーゼ、EC3.2.1.23）は、β−Ｄ
−ガラクトシド結合を分解する酵素であり、哺乳
動物の小腸、組織等に広く分布し、ラクトースの
消化、複合糖質の代謝等に関与することが知られ
ている。またβ−ガラクトシダーゼは、上記哺乳
動物に限らず、各種植物や微生物にも存在してお
り、近年これら各種起源のもの、特に例えばエシ
エリヒア コリ（Escherichia coli）、クリベロ
ミセス ラクテイス（Kluyveromyces lactis）、
アスペルギルス オリゼー（Aspergillus
oryzae）、アスペルギルス ニガー（A.niger）
等の微生物起源のものが、そのガラクトース転移
作用を利用して、乳糖からのガラクトオリゴ糖の
製造に有用であることが示され、ヒトの腸内有用
細菌であるいわゆるビフイズス菌の増殖促進物質
としてのガラクトオリゴ糖の製造へのそれらの利
用が注目されつつある。 しかしながら、これら微生物起源のβ−ガラク
トシダーゼに限らず、一般にβ−ガラクトシダー
ゼの糖転移反応は、乳糖の加水分解反応と競合す
るものであり、上記糖転移反応を優先させて所望
のガラクトオリゴ糖を収率よく製造することは、
一般に非常に困難である。即ち、上記反応におい
ては、所望のオリゴ糖と共に、競合する加水分解
反応によつてグルコース、ガラクトースが生産さ
れ、しかも一旦生成したオリゴ糖も加水分解を受
けて単糖に変換され、オリゴ糖生成量はかなり低
くなる。事実、微生物起源の各種β−ガラクトシ
ダーゼのガラクトオリゴ糖生産量は、酵素の種類
や基質とする乳糖の濃度、酵素濃度（活性）、反
応条件等にかかわらず、最大でも約25％程度に過
ぎないことが報告されている〔雪印乳業技術研究
所報告、78、p19〜26（1982）；J.Dairy Sci.、61
−１、p33−38（1978）；Biochem、15−９、
p1994−2001（1976）；J.Dairy Sci.、68−３、
p581−588（1985）〕。 他方、本出願人も従来より上記β−ガラクトシ
ダーゼ、殊にバチルス サーキユランス
（Bacillus circulans）由来のそれにつき、鋭意研
究を重ねてきたが、その過程でバチルス サーキ
ユランス起源のβ−ガラクトシダーゼが、ハイド
ロキシアパタイトゲルを用いたクロマトグラフイ
ーにより、オリゴ糖生成能等の異なるβ−ガラク
トシダーゼ及び（「酵素」及び「酵素」
と云う）に分離されることを見出した（特開昭62
−118886号）。また上記各酵素を利用したオリゴ
糖生成収率は、ミルク中の濃度に相当する濃度
4.56％の乳糖を基質として、酵素では約６％に
過ぎないのに対し、酵素では約40％であり、該
酵素の利用がガラクトオリゴ糖の製造に有用で
あると考えた。しかし該酵素を分離して利用す
ることは、その調製自体繁雑であり、決して工業
的実施に有効であるとはいえなかつた。 本出願人らは、上記現状に鑑み、乳糖のβ−ガ
ラクトシダーゼ処理における競合反応の内、糖転
移反応を優先させることができ、所望のガラクト
オリゴ糖をより短時間に多量に高収率で収得でき
る方法を開発することを目的として、さらに鋭意
研究を重ねた結果、上記酵素及び酵素を分離
することなく、バチルス サーキユランス由来の
粗酵素のままで、基質濃度の高い所で、乳糖に作
用させる時には、実に驚くべきことに、より短時
間で多量のガラクトオリゴ糖が生産され、上記目
的に合致する方法が提供されることを見出した。 即ち、上記粗酵素を基質濃度の高い所で乳糖に
作用させる時には、基質濃度が高いことに基づい
て、該基質による保護作用により、用いられる各
酵素の熱安定性が増加し、両酵素とも優れた酵素
活性を発現し、この両者の酵素活性発現によつ
て、反応速度の上昇、反応時間の短縮、使用酵素
量の低減等が計り得ると共に、製品濃縮の度合が
少なくて済み、コストの低減が計り得ることを見
出した。しかるに、従来の酵素は、本来ガラクト
オリゴ糖生成収率自体の低いものであり、基質濃
度を高くしても本発明の上記酵素に見られる如き
酵素活性は発現されない。本発明は、上記新しい
知見に基づいて完成されたものである。 問題点を解決するための手段 本発明によれば、バチルス サーキユランスに
由来しβ−ガラクトシダーゼ及びβ−ガラクト
シダーゼを含むβ−ガラクトシダーゼ粗酵素
を、基質濃度30重量％以上の高基質濃度下に乳糖
に作用させ糖転移反応を優先させてガラクトオリ
ゴ糖を得ることを特徴とするガラクトオリゴ糖の
製造法が提供される。 本発明方法によれば、非常に簡単な操作で収率
よくガラクオリゴ糖を生産できる。また本発明方
法によれば、基質濃度の高い所で、より少量の酵
素の使用（低活性）で、より短時間に所望のガラ
クトオリゴ糖を多量に生産できる。 本発明方法において使用するβ−ガラクトシダ
ーゼとしては、バチルス サーキユランスに属す
る公知の該酵素生産菌、例えばバチルス サーキ
ユランスATCC No.31382の培養により得ること
ができる。その培養方法及び得られる酵素の酵素
化学的性質等は、例えば米国特許第4237230号明
細書に記載されている。上記酵素は培養除菌液で
あつてもよく、またこれを常法に従い硫安塩析、
遠心分離、透析等により精製した精製品であつて
もよい。 本発明方法は、上記バチルス サーキユランス
由来のβ−ガラクトシダーゼを、基質濃度30重量
％以上で乳糖に作用されることにより実施され
る。ここで基質として用いられる乳糖は、その濃
度を30重量％以上、好ましくは約40〜80重量％に
調製される限り、特に限定はない。また、上記酵
素の作用条件としては、一般に該酵素の作用至適
PH及び温度条件が採用される。そのPHは通常約６
〜７の範囲であるのが好ましく、また温度は通常
約40〜70℃の範囲であるのが好ましい。酵素の基
質に対する使用量も、特に限定されるものではな
いが、通常約2.5〜25LU／ｇ基質程度の範囲から
選択されるのがよい。尚、上記酵素単位は実施例
において詳述される。 かくして、本発明によれば所望のガラクトオリ
ゴ糖を、非常に簡単な操作で、収率よく製造する
ことができる。 実施例 以下、本発明を更に詳しく説明するため、実施
例を挙げる。 尚、各例におけるβ−ガラクトシダーゼ活性
は、以下の方法により測定したものであり、ガラ
クトオリゴ糖の定量は、以下の方法により行なつ
た。 ＜β−ガラクトシダーゼ活性の測定＞ ５％乳糖を含有する0.1M酢酸緩衝液（PH6.0）
４mlに本酵素１mlを加え、40℃で15分間反応させ
た後、反応液１mlを10％炭酸ナトリウム１mlに注
入して反応を停止させ、生成したグルコース量を
測定して乳糖の分解量を求める。１分間に1μM
の乳糖を加水分解する酵素量を1LU単位とする。 ＜ガラクトオリゴ糖の定量法＞ ウオーターズ社製高速液体クロマトグラフイー
（カラム：ラジアルパツクマイクロボンダパツク
NH2、溶媒：アセトニトリル／水＝65／35、流
速：２ml／分、検出：示差屈折計による）で測定
した。 本条件では、単糖、２〜５糖類は、いずれもそ
れぞれ単一のピークとして検出される。本発明に
おけるガラクトオリゴ糖とは、上記のうち３糖類
以上のものをいい、各例におけるガラクトオリゴ
糖量はこの３糖類以上の合計量で表わした。 実施例 １ ラクトース0.3ｇ、ポリペプトン３ｇ、肉エ
キス1.5ｇ及びNaCl0.2ｇを水に加えて全量を
100mlとし、PH7.0に調整後、これを坂口フラス
コに入れ、減菌した。これにバチルス サーキ
ユランス（ATCC31382）の１白金耳を接種し、
38℃で１日間振盪培養した。 下記各成分 ラクトース 48ｇ 魚 粉 36ｇ フアーマメデイア（トレーダーズオイルミル社
製） 18ｇ コーンデイステイラーズソリユブル 10ｇ 酵母エキス 1.95ｇ CaCO3 ４ｇ （NH4）2SO4 1.5ｇ MnCl2 0.02ｇ Na2CO3 2.1ｇ 大豆油 ５ml を全容２のジヤーフアーメンターに入れ、水
を加えて１とした後、殺菌した。これに上記
で得た培養液10mlを接種し、38℃で２日間、
通気攪拌培養した。 上記で得られた培養液の一部を遠心分離し
て菌体を除き酵素液を得た。この酵素液を濃
縮、透析処理して、100LU／mlの酵素液を得
た。 上記で得た酵素液（100LU／ml）１mlに、
予め加熱溶解させた乳糖液（乳糖60ｇに0.1M
酢酸緩衝液（PH6.0）55.8mlを加えたもの）を
加え、51.4％（Ｗ／Ｗ％、以下同じ）の反応液
100mlを調製し、これを65℃で３時間放置して、
酵素を乳糖に作用させた。 得られた反応液から0.1mlを取出し、これに
水2.0mlを加えて希釈し、ガラクトオリゴ糖の
定量に供した。 その結果、ガラクトオリゴ糖の収率は40％で
あつた。なお、この収率は、反応開始時の基質
乳糖濃度を100とした時の収率であり、以下の
各実施例においても同様とする。 実施例 ２ 実施例１において、基質濃度を55W／Ｗ％と
し、70℃で３時間反応させる以外は同様にした。 その結果、ガラクトオリゴ糖の収率は38％であ
つた。 実施例 ３ 実施例１ので得た酵素液（100LU／ml）１ml
に、予め加熱溶解させた乳糖液（乳糖20ｇに
0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）29mlを加えたもの）
を加え、40％の反応液50ｇを調製し、これを40℃
で５時間放置して、酵素を乳糖に作用させた。 得られた反応液から0.1ｇを取出し、これに水
２mlを加えて希釈し、ガラクトオリゴ糖の定量に
供した。 得られたガラクトオリゴ糖収率を第１表に示
す。 実施例 ４〜14 下記第１表に示す各種乳糖濃度、反応温度及び
反応時間（PH＝7.0一定）を採用して、実施例３
と同様にして、反応液を得た。 得られた反応液におけるガラクトオリゴ糖収率
を第１表に示す。尚、酵素濃度はLU／ｇ乳糖で
ある。
【表】
【表】
Claims (1)
- １ バチルス サーキユランスに由来しβ−ガラ
クトシダーゼ及びβ−ガラクトシダーゼを含
むβ−ガラクトシダーゼ粗酵素を、基質濃度30重
量％以上の高基質濃度下に乳糖に作用させ糖転移
反応を優先させてガラクトオリゴ糖を得ることを
特徴とするガラクトオリゴ糖の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP20978087A JPS6451094A (en) | 1987-08-24 | 1987-08-24 | Production of galactoligosaccharide |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP20978087A JPS6451094A (en) | 1987-08-24 | 1987-08-24 | Production of galactoligosaccharide |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6451094A JPS6451094A (en) | 1989-02-27 |
| JPH0354559B2 true JPH0354559B2 (ja) | 1991-08-20 |
Family
ID=16578482
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP20978087A Granted JPS6451094A (en) | 1987-08-24 | 1987-08-24 | Production of galactoligosaccharide |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6451094A (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2594699B2 (ja) * | 1990-11-09 | 1997-03-26 | 富士通株式会社 | ５ｂ６ｂ符号則逆変換回路 |
-
1987
- 1987-08-24 JP JP20978087A patent/JPS6451094A/ja active Granted
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| AGRIC.BIOL.CHEM=1984 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6451094A (en) | 1989-02-27 |
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