JPH035495A - 修飾された核酸を製造するための修飾されたホスホルアミダイト法 - Google Patents
修飾された核酸を製造するための修飾されたホスホルアミダイト法Info
- Publication number
- JPH035495A JPH035495A JP2132429A JP13242990A JPH035495A JP H035495 A JPH035495 A JP H035495A JP 2132429 A JP2132429 A JP 2132429A JP 13242990 A JP13242990 A JP 13242990A JP H035495 A JPH035495 A JP H035495A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- group
- atom
- formula
- nucleotide sequence
- nucleotide
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
- C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
- C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
- C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
- C07H19/06—Pyrimidine radicals
- C07H19/10—Pyrimidine radicals with the saccharide radical esterified by phosphoric or polyphosphoric acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
- C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
- C07F9/02—Phosphorus compounds
- C07F9/06—Phosphorus compounds without P—C bonds
- C07F9/22—Amides of acids of phosphorus
- C07F9/24—Esteramides
- C07F9/2454—Esteramides the amide moiety containing a substituent or a structure which is considered as characteristic
- C07F9/2458—Esteramides the amide moiety containing a substituent or a structure which is considered as characteristic of aliphatic amines
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
- C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
- C07F9/02—Phosphorus compounds
- C07F9/06—Phosphorus compounds without P—C bonds
- C07F9/22—Amides of acids of phosphorus
- C07F9/26—Amides of acids of phosphorus containing P-halide groups
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
- C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
- C07F9/02—Phosphorus compounds
- C07F9/547—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom
- C07F9/6558—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom containing at least two different or differently substituted hetero rings neither condensed among themselves nor condensed with a common carbocyclic ring or ring system
- C07F9/65586—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom containing at least two different or differently substituted hetero rings neither condensed among themselves nor condensed with a common carbocyclic ring or ring system at least one of the hetero rings does not contain nitrogen as ring hetero atom
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
- C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
- C07F9/02—Phosphorus compounds
- C07F9/547—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom
- C07F9/6561—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom containing systems of two or more relevant hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring or ring system, with or without other non-condensed hetero rings
- C07F9/65616—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom containing systems of two or more relevant hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring or ring system, with or without other non-condensed hetero rings containing the ring system having three or more than three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members, e.g. purine or analogs
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Luminescent Compositions (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分１！’Ｆ）
本発明は、修飾された核酸を製造するための修飾された
ホスホルアミダイト法およびこの方法に用いる新規な化
合物に関するものである。
ホスホルアミダイト法およびこの方法に用いる新規な化
合物に関するものである。
（従来の技術）
核酸は、世界中の生命にとって基本的に重要であり、し
たがって、全ての生物中に存在している化合物である。
たがって、全ての生物中に存在している化合物である。
遺伝情報は、その核酸中に蓄積される。核酸配列が個々
の生物について特徴的であるので、該核酸は、異なる種
の生物の区別および同定に関する規準でもある。したが
って、核酸の合成および検出が多く試みられてきた。
の生物について特徴的であるので、該核酸は、異なる種
の生物の区別および同定に関する規準でもある。したが
って、核酸の合成および検出が多く試みられてきた。
核酸は、化学的または酵素的に合成することができる。
自然に生じるβ配置の核酸の化学合成によると、定義さ
れたヌクレオチド配列を有する、該核酸を大量に製造す
ることができるので、近年、該化学合成は一層多く増加
してきている。該化学合成は、特に、β配置のオリゴヌ
クレオチドの合成について、行うことができる。別の方
法は、使用するヌクレオチドビルディングブロックのタ
イプおよび配列中の隣接するヌクレオチドに結合させる
反応工程によって区別することができる。
れたヌクレオチド配列を有する、該核酸を大量に製造す
ることができるので、近年、該化学合成は一層多く増加
してきている。該化学合成は、特に、β配置のオリゴヌ
クレオチドの合成について、行うことができる。別の方
法は、使用するヌクレオチドビルディングブロックのタ
イプおよび配列中の隣接するヌクレオチドに結合させる
反応工程によって区別することができる。
ホスホジエステル法では、カップリング試薬、例えばト
リアルキルアリルスルホン酸塩化物と共に、リン酸エス
テル残基以外の全ての反応性基が保護されているヌクレ
オシド−リン酸を、反応を起こすべきヒドロキシル基以
外の全ての反応性基が保護されている別のヌクレオシド
と反応させる。
リアルキルアリルスルホン酸塩化物と共に、リン酸エス
テル残基以外の全ての反応性基が保護されているヌクレ
オシド−リン酸を、反応を起こすべきヒドロキシル基以
外の全ての反応性基が保護されている別のヌクレオシド
と反応させる。
主として、オリゴヌクレオチド鎖を構築する縮合工程中
に、内部ヌクレオチド（リン酸エステル）結合の非エス
テル化ＯＨ基において望ましくない副反応が生じ、複雑
な反応混合物となるために、この方法における収率は低
い。さらに、形成されたリン酸ジエステルは、いくつか
のプロトン性溶媒にだけしか溶解することができず、該
溶媒中でエステル化を行わなければならないという大き
い欠点を有している。ピリジン、ジメチルホルムアミド
またはジメチルスルホキシドのような溶媒は、例えば、
沸点が高いというような周知の欠点を有しているニホス
ホジエステル誘導体の極性特性の結果として、単離およ
び精製は、イオン交換体によって行われるべきであり、
簡単な方法で、例えば低沸点を有する溶媒（例えば、ジ
クロロメタン）を用いてシリカゲルによって行うことは
できない。
に、内部ヌクレオチド（リン酸エステル）結合の非エス
テル化ＯＨ基において望ましくない副反応が生じ、複雑
な反応混合物となるために、この方法における収率は低
い。さらに、形成されたリン酸ジエステルは、いくつか
のプロトン性溶媒にだけしか溶解することができず、該
溶媒中でエステル化を行わなければならないという大き
い欠点を有している。ピリジン、ジメチルホルムアミド
またはジメチルスルホキシドのような溶媒は、例えば、
沸点が高いというような周知の欠点を有しているニホス
ホジエステル誘導体の極性特性の結果として、単離およ
び精製は、イオン交換体によって行われるべきであり、
簡単な方法で、例えば低沸点を有する溶媒（例えば、ジ
クロロメタン）を用いてシリカゲルによって行うことは
できない。
生成物が多くの有機溶媒に不溶であるという欠点は、ホ
スホトリエステル法によって回避される。
スホトリエステル法によって回避される。
ホスホトリエステル法では、反応性基を１つだけ有し、
リン原子の隣りの２つのヒドロキシル基が異なる保護基
で保護されているリン酸誘導体が用いられる。第１のヌ
クレオシドとの反応の１麦、保護基のうちの１つを開裂
し、次いで、形成されたヒドロキシル基を、第２のヌク
レオシドとの反応のために活性化することができる。こ
の方法の結果、活性化されたヌクレオシドホスフェート
の収■を減少させる２つの追加の反応工程を、ヌクレオ
シドホスフェートにおいて行うことが必要である。
リン原子の隣りの２つのヒドロキシル基が異なる保護基
で保護されているリン酸誘導体が用いられる。第１のヌ
クレオシドとの反応の１麦、保護基のうちの１つを開裂
し、次いで、形成されたヒドロキシル基を、第２のヌク
レオシドとの反応のために活性化することができる。こ
の方法の結果、活性化されたヌクレオシドホスフェート
の収■を減少させる２つの追加の反応工程を、ヌクレオ
シドホスフェートにおいて行うことが必要である。
比較的高価な合成ビルディングブロックにおいて、より
少ない反応工程で操作される特に優れている方法は、ホ
スホルアミダイト法として知られている［ゲイト、エム
・ジェイ（Ｇａｉｔ、 Ｍ、 Ｊ、 ）等、オリゴヌク
レオチド・シンセシス：ア・プラクティカル・アプロー
チ（ＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏＬｉｄｅ ５ｙｎｔｈｅｓ
ｉｓ ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ）
、ｒＲＬ プレス（Ｐ ｒｅｓｓ）オックスフォード（
Ｏｘｆｏｒｄ）］。この方法では、リン酸誘導体ではな
くむしろ亜リン酸の誘導体、いわゆるホスホルアミダイ
ト（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｌｌｉｄｉｔｅ）が用いられる
。以下の基 一層１のヌクレオシドと結合することができる反応性基
、例えばハロゲン原子、 一活性化の後に第２のヌクレオシドとの結合を行うこと
ができる第２アミン基、 一保護基によって遮蔽されたヒドロキシル基を３価のリ
ン原子に結合させる。
少ない反応工程で操作される特に優れている方法は、ホ
スホルアミダイト法として知られている［ゲイト、エム
・ジェイ（Ｇａｉｔ、 Ｍ、 Ｊ、 ）等、オリゴヌク
レオチド・シンセシス：ア・プラクティカル・アプロー
チ（ＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏＬｉｄｅ ５ｙｎｔｈｅｓ
ｉｓ ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ）
、ｒＲＬ プレス（Ｐ ｒｅｓｓ）オックスフォード（
Ｏｘｆｏｒｄ）］。この方法では、リン酸誘導体ではな
くむしろ亜リン酸の誘導体、いわゆるホスホルアミダイ
ト（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｌｌｉｄｉｔｅ）が用いられる
。以下の基 一層１のヌクレオシドと結合することができる反応性基
、例えばハロゲン原子、 一活性化の後に第２のヌクレオシドとの結合を行うこと
ができる第２アミン基、 一保護基によって遮蔽されたヒドロキシル基を３価のリ
ン原子に結合させる。
ホスホルアミダイト法の第１工程において、亜ノン酸誘
導体と、第１のヌクレオシドとを反応させる；この工程
において、該ヌクレオシドは、反応性基を置換する。第
２工程において、第２アミ７基を第２のヌクレオシドに
よって選択的に置き換える。該第２工程では、活性化試
薬として、通常、テトラゾールが用いられる。次の工程
において、このヌクレオチド配列を、例えばヨウ素を用
いて酸化し、保護基を開裂除去する。１つの変法として
は、ホスホルアミダイト法が固相法として開示されてい
る。この変法では、成長するヌクレオチド配列を固相に
結合させる。過剰の合成試薬およびビルディングブロッ
クの分離ならびにオリゴヌクレオチド配列の精製は、こ
の方法によって非常に簡素化される。市販の入手可能な
自動核酸合成器は、この方法に従って作動する。これら
の構造は、例えば、ホスホルアミダイト法の特定の工程
に適合している。
導体と、第１のヌクレオシドとを反応させる；この工程
において、該ヌクレオシドは、反応性基を置換する。第
２工程において、第２アミ７基を第２のヌクレオシドに
よって選択的に置き換える。該第２工程では、活性化試
薬として、通常、テトラゾールが用いられる。次の工程
において、このヌクレオチド配列を、例えばヨウ素を用
いて酸化し、保護基を開裂除去する。１つの変法として
は、ホスホルアミダイト法が固相法として開示されてい
る。この変法では、成長するヌクレオチド配列を固相に
結合させる。過剰の合成試薬およびビルディングブロッ
クの分離ならびにオリゴヌクレオチド配列の精製は、こ
の方法によって非常に簡素化される。市販の入手可能な
自動核酸合成器は、この方法に従って作動する。これら
の構造は、例えば、ホスホルアミダイト法の特定の工程
に適合している。
特に、生物学的試料中のＤＮＡの特異的な検出に、既知
のヌクレオチド配列を有する核酸を適用している。
のヌクレオチド配列を有する核酸を適用している。
このような検出法では、ある核酸と別の核酸の一重鎖が
互いに相補的であるヌクレオチド配列を有しており、両
者がリボースのＣ−１で同一の配置（αまたはβ）を有
している場合には、ある核酸の一重鎖が別の一重鎖核酸
と反応して、二重鎖を形成することができるという性質
を利用している。
互いに相補的であるヌクレオチド配列を有しており、両
者がリボースのＣ−１で同一の配置（αまたはβ）を有
している場合には、ある核酸の一重鎖が別の一重鎖核酸
と反応して、二重鎖を形成することができるという性質
を利用している。
自然に生じる核酸は塩基類および糖類の結合に関してβ
配置を有しているので、特に、β核酸は、相補的核酸と
して考慮され得る。この二重鎖形成方法は、ハイブリダ
イゼーションと称されている。
配置を有しているので、特に、β核酸は、相補的核酸と
して考慮され得る。この二重鎖形成方法は、ハイブリダ
イゼーションと称されている。
修飾された一重鎖の相補的核酸を、−重鎖核酸とのハイ
ブリダイゼーションに用いると、二重鎖の形成を検出す
ることができる。その後、例えば放射性標識であっても
よい修飾によって、ハイブリダイズされた核酸のｍを測
定する。
ブリダイゼーションに用いると、二重鎖の形成を検出す
ることができる。その後、例えば放射性標識であっても
よい修飾によって、ハイブリダイズされた核酸のｍを測
定する。
修飾された核酸の合成に関して、既に入手可能である天
然の核酸を化学的もしくは酵素的に修飾することができ
るか、または既に修飾されたヌクレオチドビルディング
ブロックの助けによってヌクレオチド配列を合成するこ
とができる。
然の核酸を化学的もしくは酵素的に修飾することができ
るか、または既に修飾されたヌクレオチドビルディング
ブロックの助けによってヌクレオチド配列を合成するこ
とができる。
シカシ、例えば、ＷＯ３６１０７３６３において５゛−
末端について示唆されているように、既に完全に合成さ
れた核酸の末端を修飾することによって、−重鎖あたり
修飾されたヌクレオチドを１つだけ含む核酸を製造する
ことができる。したがって、プローブとしてこのタイプ
の修飾された核酸を用いて核酸の量を測定する方法は、
あまり感受性が強（ない。
末端について示唆されているように、既に完全に合成さ
れた核酸の末端を修飾することによって、−重鎖あたり
修飾されたヌクレオチドを１つだけ含む核酸を製造する
ことができる。したがって、プローブとしてこのタイプ
の修飾された核酸を用いて核酸の量を測定する方法は、
あまり感受性が強（ない。
したがって、ＥＰ−Ａ ０１７３２５１において、完全
な核酸の塩基が化学反応によってｔｍｌｌｉＴｉされる
ことが示唆されていた。しかし、このために、い（つか
の核酸の反応工程が必要であり、修飾の割合は、核酸が
遊離アミ７基を含む塩基を含有しているか否かに依存し
ており、この修飾は、相補的核酸とハイブリダイズする
能力を損なわない。
な核酸の塩基が化学反応によってｔｍｌｌｉＴｉされる
ことが示唆されていた。しかし、このために、い（つか
の核酸の反応工程が必要であり、修飾の割合は、核酸が
遊離アミ７基を含む塩基を含有しているか否かに依存し
ており、この修飾は、相補的核酸とハイブリダイズする
能力を損なわない。
ジェゲル（ＪＭｇｅｒ）等［バイオケミストリー（Ｂｉ
ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第２７巻、第７２３７頁、１
９８８年コには、リン原子に修飾を有するジヌクレオチ
ドの製造が記載されている。該修飾は、リンカ−を介し
て結合している第１アミノ基からなっており、通常のホ
スホルアミダイト法と類似の方法に導入される。
ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第２７巻、第７２３７頁、１
９８８年コには、リン原子に修飾を有するジヌクレオチ
ドの製造が記載されている。該修飾は、リンカ−を介し
て結合している第１アミノ基からなっており、通常のホ
スホルアミダイト法と類似の方法に導入される。
しかし、この方法は、ホスホルアミダイトを使用する通
常の自動合成器では行うことができない。
常の自動合成器では行うことができない。
他の欠点は、遊離アミ７基が、これに使用する求電子試
薬と反応するので、もはや追加のヌクレオチドと結合し
得ないということである。
薬と反応するので、もはや追加のヌクレオチドと結合し
得ないということである。
したがって、入手可能な従来技術の方法は、それぞれ、
かなりの欠点を有している。
かなりの欠点を有している。
（発明が解決しようとする課題）
本発明は、既知の方法の欠点を回避すること、さらに詳
細には、高い収率を有し、いくつかの反応工程において
簡単な出発物質で行うことができるリン酸エステル残基
の位置で修飾されたβ配置の核酸の固相上における合成
方法を利用可能にすることを目的とするものである。
細には、高い収率を有し、いくつかの反応工程において
簡単な出発物質で行うことができるリン酸エステル残基
の位置で修飾されたβ配置の核酸の固相上における合成
方法を利用可能にすることを目的とするものである。
（課題を解決するための手段）
本発明は、ヌクレオシドホスホルアミダイトを、遊離ヒ
ドロキシル基を有する別のヌクレオチドと反応させ、つ
いでリン酸エステルに形成されるヌクレオチド配列を酸
化することを特徴としており、該ヌクレオシドホスホル
アミダイトとして式（１）％式％） ［式中、 Ａは、酸素原子保護基、ヌクレオチドまたはオリゴヌク
レオチドであり、 Ｂは、天然のまたは修飾された核塩基であり、Ｘは、酸
素原子または硫黄原子であり、Ｌは、（ｎ＋１）価の架
橋結合基であり、Ｔは、水素原子、低級アルキル基、Ｎ
３、低級アルコキシ、または所望により保護されたヒド
ロキシル基であり、 Ｕは、酸素原子、硫黄原子、窒素原子またはＮ−Ｈであ
り、 ■は、開裂し得る保護基であり、 ｎは、１〜２００の自然数であり、 Ｄは、第２アミン残基である］ で示される化合物を使用する、式（ＩＸ）：［式中、 Ｋは、水素原子、または別のヌクレオチドもしくはヌク
レオチド配列のリン酸エステル残基のリン原子であり、 Ｊは、ヒドロキシル基、または別のヌクレオチドもしく
はヌクレオチド配列の５゛位の酸素原子であり、 Ｂは、天然のまたは修飾された核塩基であり、Ｔは、水
素原子、低級アルキル基、アジド基、低級アルキルオキ
シ基またはヒドロキシル基であり、 Ｘは、酸素原子または硫黄原子であり、Ｌは、（ｎ＋１
）価の架橋結合基であり、Ｕは、酸素原子、硫黄原子、
窒素原子またはＮ−Ｈであり、 ｎは、１〜２００の自然数である］ で示されるヌクレオチド配列の製造方法を提供するもの
である。
ドロキシル基を有する別のヌクレオチドと反応させ、つ
いでリン酸エステルに形成されるヌクレオチド配列を酸
化することを特徴としており、該ヌクレオシドホスホル
アミダイトとして式（１）％式％） ［式中、 Ａは、酸素原子保護基、ヌクレオチドまたはオリゴヌク
レオチドであり、 Ｂは、天然のまたは修飾された核塩基であり、Ｘは、酸
素原子または硫黄原子であり、Ｌは、（ｎ＋１）価の架
橋結合基であり、Ｔは、水素原子、低級アルキル基、Ｎ
３、低級アルコキシ、または所望により保護されたヒド
ロキシル基であり、 Ｕは、酸素原子、硫黄原子、窒素原子またはＮ−Ｈであ
り、 ■は、開裂し得る保護基であり、 ｎは、１〜２００の自然数であり、 Ｄは、第２アミン残基である］ で示される化合物を使用する、式（ＩＸ）：［式中、 Ｋは、水素原子、または別のヌクレオチドもしくはヌク
レオチド配列のリン酸エステル残基のリン原子であり、 Ｊは、ヒドロキシル基、または別のヌクレオチドもしく
はヌクレオチド配列の５゛位の酸素原子であり、 Ｂは、天然のまたは修飾された核塩基であり、Ｔは、水
素原子、低級アルキル基、アジド基、低級アルキルオキ
シ基またはヒドロキシル基であり、 Ｘは、酸素原子または硫黄原子であり、Ｌは、（ｎ＋１
）価の架橋結合基であり、Ｕは、酸素原子、硫黄原子、
窒素原子またはＮ−Ｈであり、 ｎは、１〜２００の自然数である］ で示されるヌクレオチド配列の製造方法を提供するもの
である。
低級アルキル基および低級アルコキシ基は、炭素原子を
１〜６個、好ましくは１〜４個有する。
１〜６個、好ましくは１〜４個有する。
いわゆるホスホルアミダイト法による核酸の製造方法は
、例えば、ビオシミイ（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ） １９８
５、第６７巻、第６７３頁〜第６８４頁によって、本質
的には知られている。本発明の方法は、特に、式（１）
で示される別のヌクレオシドホスホルアミダイトを出発
物質として用いる従来技術の方法とは異なる。
、例えば、ビオシミイ（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ） １９８
５、第６７巻、第６７３頁〜第６８４頁によって、本質
的には知られている。本発明の方法は、特に、式（１）
で示される別のヌクレオシドホスホルアミダイトを出発
物質として用いる従来技術の方法とは異なる。
式（］）における残基Ａは、好ましくは、酸素原子保護
基である。ヌクレオチド合成において５−ヒドロキシル
基の保護に適している保護基は、公知である。酸性条件
下で開裂することができるトリフェニルメチル基または
ジメトキシトリフェニルメチル基のような保護基が非常
によく用いられる。
基である。ヌクレオチド合成において５−ヒドロキシル
基の保護に適している保護基は、公知である。酸性条件
下で開裂することができるトリフェニルメチル基または
ジメトキシトリフェニルメチル基のような保護基が非常
によく用いられる。
残基Ａがヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドである
場合、それは天然のまたは修飾されたヌクレオチドまた
はオリゴヌクレオチドのいずれであってもよい。オリゴ
ヌクレオチドを用いる合成はより困難であるので、オリ
ゴヌクレオチドよりもヌクレオチドのほうが好ましい。
場合、それは天然のまたは修飾されたヌクレオチドまた
はオリゴヌクレオチドのいずれであってもよい。オリゴ
ヌクレオチドを用いる合成はより困難であるので、オリ
ゴヌクレオチドよりもヌクレオチドのほうが好ましい。
残基Ａのヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、本
発明によって製造される残基であってもよい。残基Ａの
ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの反応性基を適
当な保護基によって保護するのが好ましい。
発明によって製造される残基であってもよい。残基Ａの
ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの反応性基を適
当な保護基によって保護するのが好ましい。
特に、残基Δのヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド
の末端の５゛−ヒドロキシル基を酸素原子保護基によっ
て保護する。この酸素原子保護基は、特に、残基Ａにつ
いて上述した定義を有する。
の末端の５゛−ヒドロキシル基を酸素原子保護基によっ
て保護する。この酸素原子保護基は、特に、残基Ａにつ
いて上述した定義を有する。
残基Ｂの天然の核塩基は、好ましくは、アデニン、チミ
ン、シトシン、ウラシルまたはグアニンである。修飾さ
れた塩基は、例えば、それらの構造を環または置換基に
おいて変化させた塩基であってもよい。例えば、７−ジ
アザグアニンまたは５−アミノアルキルウラシルまたは
８−アミノヘキシル−アミノ−アデニンが挙げられる。
ン、シトシン、ウラシルまたはグアニンである。修飾さ
れた塩基は、例えば、それらの構造を環または置換基に
おいて変化させた塩基であってもよい。例えば、７−ジ
アザグアニンまたは５−アミノアルキルウラシルまたは
８−アミノヘキシル−アミノ−アデニンが挙げられる。
これらの塩基は好ましく、該塩基において相補的核酸の
とワトソンークリック塩基対に全（影響を与えないか、
または極僅かだけに影響を与えるだけである。
とワトソンークリック塩基対に全（影響を与えないか、
または極僅かだけに影響を与えるだけである。
残基Ｔは、リボまたはアラビノ配置を有し得る。
好ましくは、リポ配置である。塩基性、酸性または求核
条件下で開裂することができる基、好ましくは、し−ブ
チルジメチルシリル基またはトリイソブロビルシリル基
は、ヒドロキシル基に関スル保護基として使用すること
ができる。
条件下で開裂することができる基、好ましくは、し−ブ
チルジメチルシリル基またはトリイソブロビルシリル基
は、ヒドロキシル基に関スル保護基として使用すること
ができる。
保護基■は、選択的に開裂し得る保護基であるのが好ま
しい。完全なヌクレオチド配列を固形担体から開裂する
条件下で同時に開裂し得る保護基が好ましい。したがっ
て、例えば残基Ａにおいて記載したような酸性条件下で
開裂し得る保護基は、好ましくない。故に、アルカリま
たはアンモニア条件下で開裂し得る保護基が特に好まし
く、フルオレニルメトキシカルボニル基またはトリフル
オロアセチル基が特に好都合であることが確認された。
しい。完全なヌクレオチド配列を固形担体から開裂する
条件下で同時に開裂し得る保護基が好ましい。したがっ
て、例えば残基Ａにおいて記載したような酸性条件下で
開裂し得る保護基は、好ましくない。故に、アルカリま
たはアンモニア条件下で開裂し得る保護基が特に好まし
く、フルオレニルメトキシカルボニル基またはトリフル
オロアセチル基が特に好都合であることが確認された。
式（１）で示される化合物は、式（■）：［式中、
Ａは、酸素原子保護基、ヌクレオチドまたはオリゴヌク
レオチドであり、 Ｂは、天然のまたは修飾された核塩基であり、Ｔは、水
素原子、（所望により保護された）ヒドロキシル基、低
級アルキル基、Ｎ３または低級アルキルオキシ基である
］ で示される化合物を、式（ＩＩＩ） ［式中、 ２は、良好な離脱基であり、 Ｘは、酸素原子または硫黄原子であり、Ｌは、少なくと
も２価の架橋結合基であり、Ｕは、酸素原子、硫黄原子
、窒素原子またはＮ−Ｈであり、 ■は、開裂し得る保護基であり、 ｎは、１〜２００の自然数であり、 Ｄは、第２アミン残基である］ で示されるホスファンと反応させることによって製造す
ることができる。
レオチドであり、 Ｂは、天然のまたは修飾された核塩基であり、Ｔは、水
素原子、（所望により保護された）ヒドロキシル基、低
級アルキル基、Ｎ３または低級アルキルオキシ基である
］ で示される化合物を、式（ＩＩＩ） ［式中、 ２は、良好な離脱基であり、 Ｘは、酸素原子または硫黄原子であり、Ｌは、少なくと
も２価の架橋結合基であり、Ｕは、酸素原子、硫黄原子
、窒素原子またはＮ−Ｈであり、 ■は、開裂し得る保護基であり、 ｎは、１〜２００の自然数であり、 Ｄは、第２アミン残基である］ で示されるホスファンと反応させることによって製造す
ることができる。
該反応条件としては、従来技術のヌクレオシドホスホル
アミダイトについて既述した条件に類似の条件が当業者
によって選択され得る。しかし、この方法において、試
薬を用いる場合は、保護基Ｖを開裂し得る試薬を用いな
いように注意しなければならない。個々の保護基に関す
るこれらの反応条件は、当業者に知られている。
アミダイトについて既述した条件に類似の条件が当業者
によって選択され得る。しかし、この方法において、試
薬を用いる場合は、保護基Ｖを開裂し得る試薬を用いな
いように注意しなければならない。個々の保護基に関す
るこれらの反応条件は、当業者に知られている。
式（ＩＩＩ）で示されるホスファンは、簡単な方法で、
市販の入手可能な出発物質から合成され得る。好ましい
製造方法において、第２アミンがより安価な粗製物質で
あるが故に、第２アミンとの反応が最初に計画される。
市販の入手可能な出発物質から合成され得る。好ましい
製造方法において、第２アミンがより安価な粗製物質で
あるが故に、第２アミンとの反応が最初に計画される。
この反応工程において、必要であれば、非特異的な反応
による収率の減損は容認し得る。式（ＩＩＩ）で示され
るホスファンは、好ましくは、式（■）： Ｐ（−Ｚ）３ （Ｖｒ）［式中、Ｚは良
好な離脱基である］ で示される化合物と、式（■）： Ｈ−Ｄ （■） ［式中、Ｄは第２アミン残基である］ で示される第２アミンとを反応させ、得られた生成物を
、式（■）： Ｈ−Ｘ−Ｌ（−Ｕ−Ｖ）ｎ （■）Ｌ式中、 Ｘは、酸素原子または硫黄原子であり、しは、（ｎ＋１
）価の架橋結合基であり、Ｕは、酸素原子、硫黄原子、
窒素原子またはＮ−Ｈであり、 ■は、開裂し得る保護基であり、 ｎは、１〜２００の自然数である］ で示される化合物と反応させ、形成された生成物を単離
することによって製造される。残基Ｚは、好ましくはハ
ロゲン原子であり、特に好ましくは塩素原子である。
による収率の減損は容認し得る。式（ＩＩＩ）で示され
るホスファンは、好ましくは、式（■）： Ｐ（−Ｚ）３ （Ｖｒ）［式中、Ｚは良
好な離脱基である］ で示される化合物と、式（■）： Ｈ−Ｄ （■） ［式中、Ｄは第２アミン残基である］ で示される第２アミンとを反応させ、得られた生成物を
、式（■）： Ｈ−Ｘ−Ｌ（−Ｕ−Ｖ）ｎ （■）Ｌ式中、 Ｘは、酸素原子または硫黄原子であり、しは、（ｎ＋１
）価の架橋結合基であり、Ｕは、酸素原子、硫黄原子、
窒素原子またはＮ−Ｈであり、 ■は、開裂し得る保護基であり、 ｎは、１〜２００の自然数である］ で示される化合物と反応させ、形成された生成物を単離
することによって製造される。残基Ｚは、好ましくはハ
ロゲン原子であり、特に好ましくは塩素原子である。
式（■）で示される化合物は、特に、式：Ｈ−ＮＲ’Ｒ
’ ［式中 ＲｌおよびＲ２は、同一または異なっており、
１〜ｌＯ個の炭素原子を有する第１１第２または第３ア
ルキル基であるか、または所望により、−緒に、ヘテロ
原子としてｌまたは２つの窒素原子、酸素原子および／
または硫黄原子を含有し得る５〜７個の炭素原子を有す
るアルキル分技鎖状シクロアルキル基を示すか、または
ＮＲ’Ｒ”＋よイミダゾリル基、トリアゾリル基、テト
ラゾリル基、３−ニトロ−１，２４−トリアゾリル基、
チアゾリル基、ピロリル基、ベンゾトリアゾリル基もし
くはベンゾヒドロキシトリアゾリル基である］で示され
る、当業者に知られている第２アミンである。ジイソプ
ロピルアミンおよびモルホリンが特に好ましいアミンで
あることが確認されている。
’ ［式中 ＲｌおよびＲ２は、同一または異なっており、
１〜ｌＯ個の炭素原子を有する第１１第２または第３ア
ルキル基であるか、または所望により、−緒に、ヘテロ
原子としてｌまたは２つの窒素原子、酸素原子および／
または硫黄原子を含有し得る５〜７個の炭素原子を有す
るアルキル分技鎖状シクロアルキル基を示すか、または
ＮＲ’Ｒ”＋よイミダゾリル基、トリアゾリル基、テト
ラゾリル基、３−ニトロ−１，２４−トリアゾリル基、
チアゾリル基、ピロリル基、ベンゾトリアゾリル基もし
くはベンゾヒドロキシトリアゾリル基である］で示され
る、当業者に知られている第２アミンである。ジイソプ
ロピルアミンおよびモルホリンが特に好ましいアミンで
あることが確認されている。
直鎖状または分枝鎖状の、飽和または不飽和の、炭素原
子１〜１０個、好ましくは２〜６個を有する炭化水素は
、架橋結合基として有用である。炭化水素鎖は、ペテロ
原子、例えば酸素原子または硫黄原子によって中断され
ていてもよい。該架橋結合基は、脂肪族環系または芳香
族環系を含んでいてもよい。さらに、該架橋結合基は、
ペテロ原子を含んでいてもよい。しかし、本発明方法に
おいてこの架橋結合基を含有する化合物と行われるべき
反応に関して、これらの架橋結合基としては、置換基と
して遊離非置換アミノ基もしくは第１アミ７基またはヒ
ドロキシル基を有するものを除外巳なければならない。
子１〜１０個、好ましくは２〜６個を有する炭化水素は
、架橋結合基として有用である。炭化水素鎖は、ペテロ
原子、例えば酸素原子または硫黄原子によって中断され
ていてもよい。該架橋結合基は、脂肪族環系または芳香
族環系を含んでいてもよい。さらに、該架橋結合基は、
ペテロ原子を含んでいてもよい。しかし、本発明方法に
おいてこの架橋結合基を含有する化合物と行われるべき
反応に関して、これらの架橋結合基としては、置換基と
して遊離非置換アミノ基もしくは第１アミ７基またはヒ
ドロキシル基を有するものを除外巳なければならない。
該架橋結合基は、ｎ個の共有結合を介して、ｎ個の基Ｕ
と結合する。ｎの数は、１から２００までが好ましい。
と結合する。ｎの数は、１から２００までが好ましい。
式（ＩＩＩ）で示される化合物は、核酸のホスホルアミ
ダイト合成用のヌクレオシドホスホルアミダイトの合成
に用いることができ、かつ保護された形の反応性基を有
する、従来技術のホスファンに比べて優れており：これ
は、検出可能な基に関する結合部位として作用すること
ができる。
ダイト合成用のヌクレオシドホスホルアミダイトの合成
に用いることができ、かつ保護された形の反応性基を有
する、従来技術のホスファンに比べて優れており：これ
は、検出可能な基に関する結合部位として作用すること
ができる。
ヌクレオチド配列の製造に関する本発明の方法は、特に
、下記工程を含む： 式（ｆ）で示されるヌクレオシドホスホルアミゲイトと
、遊離ヒドロキシル基を有するヌクレオチドとのカップ
リング反応。゛遊離ヒドロキシル基を有するヌクレオシ
ドは、固形担体に共有結合されるのが好ましい。アミノ
基、カルボニル基または別のヒドロキシル基のようなヌ
クレオシドの別の反応性基は、カップリング反応の条件
下で安定である保１ｔＨｉによって保護されているのが
好ましい。糖残基に存在し得る２゛−ヒドロキシル基は
、Ｌ−ブチルジメチルシリル基によって保護されている
のが好ましい。遊離ヒドロキシル基は、糖残基の５′−
ヒドロキシル基であるのが好ましい。
、下記工程を含む： 式（ｆ）で示されるヌクレオシドホスホルアミゲイトと
、遊離ヒドロキシル基を有するヌクレオチドとのカップ
リング反応。゛遊離ヒドロキシル基を有するヌクレオシ
ドは、固形担体に共有結合されるのが好ましい。アミノ
基、カルボニル基または別のヒドロキシル基のようなヌ
クレオシドの別の反応性基は、カップリング反応の条件
下で安定である保１ｔＨｉによって保護されているのが
好ましい。糖残基に存在し得る２゛−ヒドロキシル基は
、Ｌ−ブチルジメチルシリル基によって保護されている
のが好ましい。遊離ヒドロキシル基は、糖残基の５′−
ヒドロキシル基であるのが好ましい。
ヌクレオシドは、モノヌクレオシド、オリゴヌクレオチ
ドまたはポリヌクレオチドであってよい。しかし、２〜
２００、好ましくは２０〜６０のヌクレオチドビルディ
ングブロックを有するモノヌクレオシド、オリゴヌクレ
オチドまたはポリヌクレオチドが好ましい。
ドまたはポリヌクレオチドであってよい。しかし、２〜
２００、好ましくは２０〜６０のヌクレオチドビルディ
ングブロックを有するモノヌクレオシド、オリゴヌクレ
オチドまたはポリヌクレオチドが好ましい。
ヌクレオチドビルディングブロックは天然のまたは修飾
されたヌクレオチドであってよい。
されたヌクレオチドであってよい。
該ヌクレオシドは、本発明の方法で修飾されたヌクレオ
シドであってもよい。
シドであってもよい。
その後、固相に結合したヌクレオチド配列を酸化する。
ヨウ素が好ましい酸化剤であることが確認されている。
次に、キャッピング工程（ｃａｐｐｉｎｇ ５ｔｅｐ）
を行うのが好ましい。これは公知の方法に従って行われ
る。
を行うのが好ましい。これは公知の方法に従って行われ
る。
保護基Ａまたは残基Ａのヌクレオチドまたはオリゴヌク
レオチドの末端５′−ヒドロキシル基の酸素原子保護基
の選択的開裂。好ましい場合において、残基Ａの酸素原
子保護基が酸性条件下で開裂し得るジメトキシトリフエ
ニノ１メチル基のような保護基である場合、それは、例
えば、ジクロロ酢酸によって開裂され得る。
レオチドの末端５′−ヒドロキシル基の酸素原子保護基
の選択的開裂。好ましい場合において、残基Ａの酸素原
子保護基が酸性条件下で開裂し得るジメトキシトリフエ
ニノ１メチル基のような保護基である場合、それは、例
えば、ジクロロ酢酸によって開裂され得る。
ここで、所望により、これら第１の工程を繰り返すこと
ができる。これに関して、モノヌクレオシドホスホルア
ミダイトとして、慣用のモノヌクレオシドホスホルアミ
ダイトまたは式（ｔ）で示されるモノヌクレオシドホス
ホルアミダイトを用いることができる。
ができる。これに関して、モノヌクレオシドホスホルア
ミダイトとして、慣用のモノヌクレオシドホスホルアミ
ダイトまたは式（ｔ）で示されるモノヌクレオシドホス
ホルアミダイトを用いることができる。
ヌクレオチド配列が所望の長さに達するとすぐに、保護
基■を開裂する。アミノ保護基の場合、トリフルオロア
セチルまたはフルオレニルメトキシカルボニル基（Ｆｍ
ｏｃ）が特に優れていることが確認されている。
基■を開裂する。アミノ保護基の場合、トリフルオロア
セチルまたはフルオレニルメトキシカルボニル基（Ｆｍ
ｏｃ）が特に優れていることが確認されている。
その後、既知の方法で固形担体からヌクレオチド配列を
開裂する。この条件は、共有結合のタイプに応じて選択
され、本発明の修飾によっては影響されない。
開裂する。この条件は、共有結合のタイプに応じて選択
され、本発明の修飾によっては影響されない。
しかし、これらの条件としては、保護基■の開裂および
担体からのヌクレオチド配列の開裂が同時に行われる条
件が特に好ましい。
担体からのヌクレオチド配列の開裂が同時に行われる条
件が特に好ましい。
これは、例えば、３′−〇−スクシニルを介してＣＰＧ
［制御されたボアガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｐｏ
ｒｅ ｇｌａｓｓ）］に結合した担体および残基Ｖとし
てのＦ ｍｏｃ保護基の利用によって行うことができ、
これには、開裂試薬として、アルカリ、好ましくは濃ア
ンモニア水溶液またはアミン溶液が用いられる。
［制御されたボアガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｐｏ
ｒｅ ｇｌａｓｓ）］に結合した担体および残基Ｖとし
てのＦ ｍｏｃ保護基の利用によって行うことができ、
これには、開裂試薬として、アルカリ、好ましくは濃ア
ンモニア水溶液またはアミン溶液が用いられる。
通常、次に、精製工程、例えばＨＰＬＣクロマトグラフ
ィーまたは／および透析による精製が行われる。一般的
にオリゴヌクレオチド合成に用いられるのと同一の条件
が適用される。
ィーまたは／および透析による精製が行われる。一般的
にオリゴヌクレオチド合成に用いられるのと同一の条件
が適用される。
これら全ての工程は、別のヌクレオシドホスホルアミダ
イトが用いられ、リン酸エステル残基の酸素原子保護基
を開裂するための試薬の代わりに保護基■の開裂用の既
存の試薬が用いられるという事は別にして、この方法の
慣用の反応経路の変化を必要としないという共通点を有
する。特に、工程の数は、慣用のホスホルアミダイト法
と同じであるかまたはそれよりも少ない。すなわち、本
発明の方法は、装置を変えずに、ホスホルアミダイト合
成用の人手可能な核酸合成器で行うことができる。
イトが用いられ、リン酸エステル残基の酸素原子保護基
を開裂するための試薬の代わりに保護基■の開裂用の既
存の試薬が用いられるという事は別にして、この方法の
慣用の反応経路の変化を必要としないという共通点を有
する。特に、工程の数は、慣用のホスホルアミダイト法
と同じであるかまたはそれよりも少ない。すなわち、本
発明の方法は、装置を変えずに、ホスホルアミダイト合
成用の人手可能な核酸合成器で行うことができる。
この方法で製造される式（ＩＸ）で示されるヌクレオチ
ド配列は、好ましくは２〜２００．特に好ましくは２０
〜６０のヌクレオチドビルディングブロックを有する。
ド配列は、好ましくは２〜２００．特に好ましくは２０
〜６０のヌクレオチドビルディングブロックを有する。
ヌクレオチドビルディングプロ。
りの１０〜８０％、特に好ましくは２０〜５０％は、リ
ン原子の位置で修飾された式（］）で示されるヌクレオ
シド−リン酸から形成されたヌクレオチドビルディング
ブロックである。これらの修飾されたヌクレオチドビル
ディングブロックは、配列中で互いに２〜５ヌクレオチ
ド間隔であるのが好ましい。式（ＩＸ）で示される化合
物は多くの用途を有する。
ン原子の位置で修飾された式（］）で示されるヌクレオ
シド−リン酸から形成されたヌクレオチドビルディング
ブロックである。これらの修飾されたヌクレオチドビル
ディングブロックは、配列中で互いに２〜５ヌクレオチ
ド間隔であるのが好ましい。式（ＩＸ）で示される化合
物は多くの用途を有する。
例えば、ヌクレオチド配列は、簡単な方法で、検出可能
な基または検出可能な基に変化し得る基を有する、本発
明方法で製造した式（ＩＸ）で示されるヌクレオチド配
列から製造することができる。
な基または検出可能な基に変化し得る基を有する、本発
明方法で製造した式（ＩＸ）で示されるヌクレオチド配
列から製造することができる。
ヌクレオチド配列がいくつかの修飾されたヌクレオチド
ビルディングブロックを有する場合、このような基をい
くつか含有するヌクレオチド配列を装造することができ
る。結果として、核酸の測定がより高感度になることが
確認されており、このために、この方法は好ましい。
ビルディングブロックを有する場合、このような基をい
くつか含有するヌクレオチド配列を装造することができ
る。結果として、核酸の測定がより高感度になることが
確認されており、このために、この方法は好ましい。
さらに、本発明は、上記工程の後に、形成された式（Ｉ
Ｘ）で示されるヌクレオチド配列と式（■）：Ｙ −Ｗ
（Ｉ’／） ［式中、 Ｙは、反応性基であり、 Ｗは、検出可能な基または検出可能な基に変化し得る基
であるコ で示される化合物とを反応させることからなる、式（Ｖ
）： ［式中、 Ｋは、水素原子、または別のヌクレオチドもしくはヌク
レオチド配列のリン酸エステル残基のリン原子であり、 Ｊは、ヒドロキシル基、または別のヌクレオチドらしく
はヌクレオチド配列の５′位の酸素原子であり、 Ｂは、天然のまたは修飾された核塩基であり、Ｔは、水
素原子、低級アルキル基、アジド基、低級アルキルオキ
シ基またはヒドロキシル基であり、 Ｗは、検出可能な基または検出可能な甚に変化し得る基
であり、 ＸＳＬ、Ｕおよびｎは前記定義と同じである］で示され
るヌクレオチド配列の製造方法を堤供するものである。
Ｘ）で示されるヌクレオチド配列と式（■）：Ｙ −Ｗ
（Ｉ’／） ［式中、 Ｙは、反応性基であり、 Ｗは、検出可能な基または検出可能な基に変化し得る基
であるコ で示される化合物とを反応させることからなる、式（Ｖ
）： ［式中、 Ｋは、水素原子、または別のヌクレオチドもしくはヌク
レオチド配列のリン酸エステル残基のリン原子であり、 Ｊは、ヒドロキシル基、または別のヌクレオチドらしく
はヌクレオチド配列の５′位の酸素原子であり、 Ｂは、天然のまたは修飾された核塩基であり、Ｔは、水
素原子、低級アルキル基、アジド基、低級アルキルオキ
シ基またはヒドロキシル基であり、 Ｗは、検出可能な基または検出可能な甚に変化し得る基
であり、 ＸＳＬ、Ｕおよびｎは前記定義と同じである］で示され
るヌクレオチド配列の製造方法を堤供するものである。
容易に置換することができる求核基、または求電子基は
、例えば、反応性基Ｙとして使用することができる。式
（Ｉ’／）で示される化合物は、例えば、カルボン酸ハ
ロゲン化物である。
、例えば、反応性基Ｙとして使用することができる。式
（Ｉ’／）で示される化合物は、例えば、カルボン酸ハ
ロゲン化物である。
求電子基は、例えば、活性化エステルまたは無水物中の
基である。これらがカルボキシル基である場合、好まし
いエステルは、例えば、ハブテンのＮ−ヒドロキシスク
シンイミドエステルである。
基である。これらがカルボキシル基である場合、好まし
いエステルは、例えば、ハブテンのＮ−ヒドロキシスク
シンイミドエステルである。
残基ＫまたはＪの定義に含まれる別のヌクレオチドは、
天然のまたは修飾されたヌクレオチドであってよい。残
基ＫまたはＪの定義に含まれるヌクレオチド配列は、天
然のおよび修飾されたヌクレオチドビルディングブロッ
クを含有し得る。式（Ｖ）で示されるヌクレオチド配列
は、好ましくは２〜２００．特に好ましくは２０〜６０
のヌクレオチドビルディングブロックを有する。ヌクレ
オチドビルディングブロックの１０〜８０％、特に好ま
しくは２０〜５０％は、式（１）で示されるヌクレオシ
ド−リン酸から形成されたヌクレオチドビルディングブ
ロックである。
天然のまたは修飾されたヌクレオチドであってよい。残
基ＫまたはＪの定義に含まれるヌクレオチド配列は、天
然のおよび修飾されたヌクレオチドビルディングブロッ
クを含有し得る。式（Ｖ）で示されるヌクレオチド配列
は、好ましくは２〜２００．特に好ましくは２０〜６０
のヌクレオチドビルディングブロックを有する。ヌクレ
オチドビルディングブロックの１０〜８０％、特に好ま
しくは２０〜５０％は、式（１）で示されるヌクレオシ
ド−リン酸から形成されたヌクレオチドビルディングブ
ロックである。
残基Ｗは、低分子構造および高分子構造であってよい。
好ましい低分子のレポーター分子は色素およびハブテン
であり；好ましい高分子群は、例えば、酵素、または抗
原もしくは抗体のような免疫学的に活性な物質である。
であり；好ましい高分子群は、例えば、酵素、または抗
原もしくは抗体のような免疫学的に活性な物質である。
特に好ましくは、ハブテンである。例えば、ジゴキシゲ
ニンのような体液中で通常の条件下では生じないものが
特に好ましい。ハブテンおよび特に好ましいジゴキシゲ
ニンは、これらを有するヌクレオチド配列の分子量が修
飾によってあまり変化せず、例えばゲルクロマトグラフ
ィーにおいて、長さの標準として用いることができるの
で、免疫学的に活性な物質として特に優れていることが
確認されている。
ニンのような体液中で通常の条件下では生じないものが
特に好ましい。ハブテンおよび特に好ましいジゴキシゲ
ニンは、これらを有するヌクレオチド配列の分子量が修
飾によってあまり変化せず、例えばゲルクロマトグラフ
ィーにおいて、長さの標準として用いることができるの
で、免疫学的に活性な物質として特に優れていることが
確認されている。
さらに、ヌクレオチド配列の構築に関°する本発明方法
は、従来技術と比較して以下の優れた点を有しているこ
とがわかった： 修飾がリン原子の位置で生じるので、相補的ヌクレオチ
ド配列と共に形成されたヌクレオチド配列の塩基対は損
なわれない。
は、従来技術と比較して以下の優れた点を有しているこ
とがわかった： 修飾がリン原子の位置で生じるので、相補的ヌクレオチ
ド配列と共に形成されたヌクレオチド配列の塩基対は損
なわれない。
形成されたヌクレオチド配列はポリメラーゼによってプ
ライマーとして受は入れられる。
ライマーとして受は入れられる。
修飾は、例えば糖残基もしくは塩基の別の修飾、または
３′−もしくは５′−末端標識に付加的に生じる。
３′−もしくは５′−末端標識に付加的に生じる。
該方法は、必要なビルディングブロックの集中合成（ｃ
ｏｎｖｅｒｇｅｎＬ ５ｙｎｔｈｅｓｉｓ）を含む。こ
のような方法は、特に高価なヌクレオチドビルディング
ブロックの収率を高く維持することができるので、特に
優れている。
ｏｎｖｅｒｇｅｎＬ ５ｙｎｔｈｅｓｉｓ）を含む。こ
のような方法は、特に高価なヌクレオチドビルディング
ブロックの収率を高く維持することができるので、特に
優れている。
容易に入手でき、自然に生じるβヌクレオシドをヌクレ
オシドホスホルアミダイトの合成に用いることができる
。
オシドホスホルアミダイトの合成に用いることができる
。
リン酸エステル基の位置で修飾されたヌクレオチド配列
を合成するために、同一または減少した反応工程の数と
共に、ヌクレオチド配列の合成のための固相ホスホルア
ミダイト法の周知の長所を利用することができた。
を合成するために、同一または減少した反応工程の数と
共に、ヌクレオチド配列の合成のための固相ホスホルア
ミダイト法の周知の長所を利用することができた。
本発明の方法を用いて、配列における全（特定の部位で
非常に特定数の修飾を導入することができる。
非常に特定数の修飾を導入することができる。
一般に、形成された修飾されたヌクレオチド配列を用い
ることができる。例えば、異なる検出可能な基を選択す
ることができる。
ることができる。例えば、異なる検出可能な基を選択す
ることができる。
検出可能な基がヌクレオシドホスホルアミダイトに最初
から存在しないので、酵素標識または別の感受性レポー
ター基を用いる場合に予想されるヌクレオチドの化学合
成の間の複雑化が回避される。
から存在しないので、酵素標識または別の感受性レポー
ター基を用いる場合に予想されるヌクレオチドの化学合
成の間の複雑化が回避される。
レポーター分子による立体障害は、オリゴヌクレオチド
合成の収率および効率を減少することがある。この欠点
は、本発明の方法で回避される。
合成の収率および効率を減少することがある。この欠点
は、本発明の方法で回避される。
試料中の核酸に本質的に相ｈｎ的である核酸と試料との
接触、他方に相補的である核酸のハイブリダイゼーショ
ンを生起させる条件下での該混合物の処理および検出可
能な基の検出による試料中の核酸の検出方法において、
式（Ｖ）で示されるヌクレオチド配列は、試料ＤＮＡに
相補的なヌクレオチド配列として好都合に用いることが
できる。検出可能な基の検出は、既知の方法によって行
うことができる。検出可能な基が免疫学的に活性な物質
である場合、該基は、標識化された免疫学的ノ（−トナ
ーと反応し得る。その後、標識を測定する。
接触、他方に相補的である核酸のハイブリダイゼーショ
ンを生起させる条件下での該混合物の処理および検出可
能な基の検出による試料中の核酸の検出方法において、
式（Ｖ）で示されるヌクレオチド配列は、試料ＤＮＡに
相補的なヌクレオチド配列として好都合に用いることが
できる。検出可能な基の検出は、既知の方法によって行
うことができる。検出可能な基が免疫学的に活性な物質
である場合、該基は、標識化された免疫学的ノ（−トナ
ーと反応し得る。その後、標識を測定する。
本発明の核酸利用の場合、基Ｗとして、）＼ブテン、特
にジゴキシゲニンが好ましい。
にジゴキシゲニンが好ましい。
これらは、−重鎖核酸から二重鎖核酸への酵素的合成に
おけるプライマーとして同等に好適である。形成された
二重鎖核酸は、２つの鎖のうちいずれか一方にヌクレオ
チド配列を含有している。
おけるプライマーとして同等に好適である。形成された
二重鎖核酸は、２つの鎖のうちいずれか一方にヌクレオ
チド配列を含有している。
（実施例）
以下の実施例によって、本発明を説明する。
実施例１
２−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）アミノエ
タノール 容ｆｆ１Ｎ２の丸底フラスコ中、撹拌しながら、ジオキ
サン３００ｘＱに９−フルオレニルメトキシカルボニル
−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）（Ｆｍｏｃ
−０−３ｕ）８８．０ｇ（約２００ミリモル）を溶解し
た。該透明溶液に、水２００．ｗｃに溶解したＮａ、Ｃ
Ｏ！１４０９およびエタノールアミン１４゜４ｍＮ！（
２３８ミリモル）を連続して添加した。すぐに形成した
パルプ状（ｐｕｌｐｙ）反応混合液を、室）晶で一晩撹
拌し、型口、吸引濾過した。未反応のＦｍｏｃ−０−８
ｕＳＮ−ヒドロキシスクシンイミドおよび目的生成物を
含をする瀘過残渣を酢酸エステルから再結晶した。減圧
乾燥した後、純な生成物４７．４ｇ（理論収量の７６％
）を得た。
タノール 容ｆｆ１Ｎ２の丸底フラスコ中、撹拌しながら、ジオキ
サン３００ｘＱに９−フルオレニルメトキシカルボニル
−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）（Ｆｍｏｃ
−０−３ｕ）８８．０ｇ（約２００ミリモル）を溶解し
た。該透明溶液に、水２００．ｗｃに溶解したＮａ、Ｃ
Ｏ！１４０９およびエタノールアミン１４゜４ｍＮ！（
２３８ミリモル）を連続して添加した。すぐに形成した
パルプ状（ｐｕｌｐｙ）反応混合液を、室）晶で一晩撹
拌し、型口、吸引濾過した。未反応のＦｍｏｃ−０−８
ｕＳＮ−ヒドロキシスクシンイミドおよび目的生成物を
含をする瀘過残渣を酢酸エステルから再結晶した。減圧
乾燥した後、純な生成物４７．４ｇ（理論収量の７６％
）を得た。
’Ｈ−ＮＭＲ（ｐｐｍＸＤＭｓＯ）： ３．４（ｍ、Ｃ
ＩＩｔＯ１２＋１） ；３、６（Ｌ、ＣＩｌ、Ｎ、２＋
１） ； ４．２−４．５（＋ｎ、ＣＩｌ、ＯＣＯ＋
ＩＩ ［Ｃ９］、３１１） ； ５．２（ｓ ［ｂ］、
Ｎｉｌ、 ＩＨ） ； ７．２−７．９（ｍ１芳香族、
８＋１）。
ＩＩｔＯ１２＋１） ；３、６（Ｌ、ＣＩｌ、Ｎ、２＋
１） ； ４．２−４．５（＋ｎ、ＣＩｌ、ＯＣＯ＋
ＩＩ ［Ｃ９］、３１１） ； ５．２（ｓ ［ｂ］、
Ｎｉｌ、 ＩＨ） ； ７．２−７．９（ｍ１芳香族、
８＋１）。
寒梅Ａｌ
ジクロロ−ＮＮ−ジイソプロピルアミノ−ホスファン
容ｆｆ１５００＊（２の滴下漏斗、ＫＰＧスターラー温
度計およびアセトン／ドライアイス浴を装普した容量２
（ｌの３つロ丸底フラスコ中、撹拌しながら、無水エー
テル３００ｚ（！、無水ピリジン８１ｕＣおよびＰＣ（
！３８７．５贋Ｃ（１モル）を−７０°Ｃに予め冷却し
た。それに無水エーテル２５０村中ジイソプロピルアミ
ン１４２＋＋２（１モル）を、２時間以内で滴下し、温
度を約−６０〜−６５℃に維持した。添加終了後、濃い
パルプ状反応混合液を室温にし、無水エーテル約６００
＊Ｑで希釈して、さらに撹拌し易くした。室温でさらに
３時間撹拌した後、形成した沈殿物をガラスフィルター
で吸引濾過し、エーテルで数回洗浄した。常圧でエーテ
ルを排水した後、水流ポンプ（ｗａｔｅｒ−ｊｅｔ ｖ
ａｃｕｕｍ）で未反応ｐｃｔ、、ジイソプロピルアミン
およびピリジンを除去し、次いで、残存した油状物をオ
イル−ポンプバキューム（ｏｉｌ−ｐｃ＋＋＋＋ｐ ｖ
ａｃｕｕｍ）（Ｋ 、、４６℃／ ０ 、３５ Ｔｏｒ
ｒ）で分別蒸留した。理論収量の３６％に相当するホス
ファン７３．４９を得た。
度計およびアセトン／ドライアイス浴を装普した容量２
（ｌの３つロ丸底フラスコ中、撹拌しながら、無水エー
テル３００ｚ（！、無水ピリジン８１ｕＣおよびＰＣ（
！３８７．５贋Ｃ（１モル）を−７０°Ｃに予め冷却し
た。それに無水エーテル２５０村中ジイソプロピルアミ
ン１４２＋＋２（１モル）を、２時間以内で滴下し、温
度を約−６０〜−６５℃に維持した。添加終了後、濃い
パルプ状反応混合液を室温にし、無水エーテル約６００
＊Ｑで希釈して、さらに撹拌し易くした。室温でさらに
３時間撹拌した後、形成した沈殿物をガラスフィルター
で吸引濾過し、エーテルで数回洗浄した。常圧でエーテ
ルを排水した後、水流ポンプ（ｗａｔｅｒ−ｊｅｔ ｖ
ａｃｕｕｍ）で未反応ｐｃｔ、、ジイソプロピルアミン
およびピリジンを除去し、次いで、残存した油状物をオ
イル−ポンプバキューム（ｏｉｌ−ｐｃ＋＋＋＋ｐ ｖ
ａｃｕｕｍ）（Ｋ 、、４６℃／ ０ 、３５ Ｔｏｒ
ｒ）で分別蒸留した。理論収量の３６％に相当するホス
ファン７３．４９を得た。
３１ Ｐ−ＮＭＲ（ｐｐｍ）（ｃＨｃ＋２．）： １６
７．５゜実施例３ を溶解し、これに無水ピリジン０．４ｍＱを添加した。
７．５゜実施例３ を溶解し、これに無水ピリジン０．４ｍＱを添加した。
磁気的に撹拌しながら、この混合液に、無水テトラヒド
ロフラン２０ｉ（に２−（９−フルオレニルメトキシカ
ルボニル）アミンエタノール（５ミリモル）１．４．９
を溶解した溶液を、約５時間、ゆっくりと滴下した。テ
トラヒドロフランを分離およびυト水したピリジン・塩
酸塩を吸引；店過した後、残存した油状物（２，２９＝
理論収量の９８％）を、ヌクレオシドホスホルアミダイ
トの製造に直接用いた（実施例４参照）。
ロフラン２０ｉ（に２−（９−フルオレニルメトキシカ
ルボニル）アミンエタノール（５ミリモル）１．４．９
を溶解した溶液を、約５時間、ゆっくりと滴下した。テ
トラヒドロフランを分離およびυト水したピリジン・塩
酸塩を吸引；店過した後、残存した油状物（２，２９＝
理論収量の９８％）を、ヌクレオシドホスホルアミダイ
トの製造に直接用いた（実施例４参照）。
容ｆｆ１ｌｏｏ１２の丸底フラスコ中、無水テトラヒド
ロフラン３０ｙＱにジクロロ−Ｎ、Ｎ−ジイソプロピル
アミノ−ホスファン０．９ｆｆ１２（５ミリモル）ａ）
容ｆｆ１ｌｏＯＨの丸底フラスコ中、ジクロロメタン（
Ｎ ａ ｔ ＣＯｓで蒸留した）５０ｙ（およびＮ−エ
チル−ＮＮ−ジイソプロピルアミン２．５ｚＣに５°−
０！ジメトキシトリチル−２′−デオキシチミジン２．
５９（４，６ミリモル）を溶解した。使い捨て注射器を
用いて、これに２−（９−フルオレニルメトキシカルボ
ニル）アミノエチル−Ｎ、Ｎ−ジイソブロビルアミノー
ホスホクロリダイト２ｍ（（約５ミリモル）を加えた。
ロフラン３０ｙＱにジクロロ−Ｎ、Ｎ−ジイソプロピル
アミノ−ホスファン０．９ｆｆ１２（５ミリモル）ａ）
容ｆｆ１ｌｏＯＨの丸底フラスコ中、ジクロロメタン（
Ｎ ａ ｔ ＣＯｓで蒸留した）５０ｙ（およびＮ−エ
チル−ＮＮ−ジイソプロピルアミン２．５ｚＣに５°−
０！ジメトキシトリチル−２′−デオキシチミジン２．
５９（４，６ミリモル）を溶解した。使い捨て注射器を
用いて、これに２−（９−フルオレニルメトキシカルボ
ニル）アミノエチル−Ｎ、Ｎ−ジイソブロビルアミノー
ホスホクロリダイト２ｍ（（約５ミリモル）を加えた。
室温で４８時間撹拌し、減圧下で蒸発させ、粘稠性の残
留物を得た。
留物を得た。
粗生成物をシリカゲル６０［カラム３０Ｘ２ｃＩＩ！。
移動溶媒１石油エーテル５０〜７０°Ｃ／酢酸エチル／
ジクロロメタン／ピリジン（４： ８ ： ８ ： ２
）コによるクロマトグラフィーによって精製した。生成
物を含有する画分を集め、溶媒を完全に減圧除去した。
ジクロロメタン／ピリジン（４： ８ ： ８ ： ２
）コによるクロマトグラフィーによって精製した。生成
物を含有する画分を集め、溶媒を完全に減圧除去した。
理論収量の２０％に相当する白色の泡状残留物０．９ｇ
を得た。
を得た。
ｂ）別法として、撹拌しながら、無水ジオキサン１００
杼に５゛−Ｏ−ジメトキシトリチル−２゜−デオキシチ
ミジン５．４５ｇ（ＩＯミリモル）を溶解した。この溶
液に、ハンモト（Ｓ、 ｌｌａｍｍｏｔｏ）、タカク（
Ｉｌ、 Ｔａｋａｋｕ） ［ケミストリー・レターズ（
Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔ、）、１９８６．１４０
１−１４０４］に従って調製したビス−（ジインプロピ
ルアミノ）−クロロホスファン２．７９（１０４リモル
）、およびトリエチルアミン２．１ｙＣ（１５ミリモル
）をジオキサン１００村に溶解した溶液を、３０分以内
で滴下した。反応の後、移動溶媒として塩化メチレン／
酢酸エチル（１： １）を用いる薄層クロマトグラフィ
ーにかけた。２時間後、保護アルゴンガス（ｐｒｏｔｅ
ｃｔｉｖｅ ｇａｓ ａｒｇｏｎ）の１下、塩化トリエ
チルアンモニウムの沈殿物を濾去し、濾液を濃縮した（
無色の泡状物）。さらに単離せずに、形成された５″−
〇−ジメトキシトリチルー２°−デオキシチミンン−３
−０−ビス−（Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルアミ／）ホスフ
ァンを目的生成物に転換した。これについては、無色の
泡状物を無水アセトニトリル１００ｙＱ中に取り、２−
（９−フルオレニルメトキシカルボニル）アミノエタノ
ール（実施例り３９およびテトラゾール（昇華した）３
５１１９（５ミリモル）を添加した。室温で一晩撹拌し
、酢酸エチル１ｏｏｒ（の添加によって、反応を停止し
た。塩化ナトリウム飽和水溶液で３回抽出した後、合わ
せた有機相を硫酸ナトリウムで乾燥した。硫酸ナトリウ
ムを濾去した後、他液を濃縮した。粗生成物を、シリカ
ゲル６０Ｈ［Ｑ＝２４ｃｉ、ｄ＝４ｃｍ；移動溶媒：塩
化メチレン／酢酸エチル（５：ｌ）］によるクロマトグ
ラフィーによって精製した。溶媒の除去後、無色の泡状
物を再度得た。これを塩化メチレン１０ｙｔ２中に取り
、水冷したｎ−ヘキサン４００ｘＱによって沈殿させた
。理論収量の２０％に相当する無色粉末の目的生成物１
．８ｇを得た。
杼に５゛−Ｏ−ジメトキシトリチル−２゜−デオキシチ
ミジン５．４５ｇ（ＩＯミリモル）を溶解した。この溶
液に、ハンモト（Ｓ、 ｌｌａｍｍｏｔｏ）、タカク（
Ｉｌ、 Ｔａｋａｋｕ） ［ケミストリー・レターズ（
Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔ、）、１９８６．１４０
１−１４０４］に従って調製したビス−（ジインプロピ
ルアミノ）−クロロホスファン２．７９（１０４リモル
）、およびトリエチルアミン２．１ｙＣ（１５ミリモル
）をジオキサン１００村に溶解した溶液を、３０分以内
で滴下した。反応の後、移動溶媒として塩化メチレン／
酢酸エチル（１： １）を用いる薄層クロマトグラフィ
ーにかけた。２時間後、保護アルゴンガス（ｐｒｏｔｅ
ｃｔｉｖｅ ｇａｓ ａｒｇｏｎ）の１下、塩化トリエ
チルアンモニウムの沈殿物を濾去し、濾液を濃縮した（
無色の泡状物）。さらに単離せずに、形成された５″−
〇−ジメトキシトリチルー２°−デオキシチミンン−３
−０−ビス−（Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルアミ／）ホスフ
ァンを目的生成物に転換した。これについては、無色の
泡状物を無水アセトニトリル１００ｙＱ中に取り、２−
（９−フルオレニルメトキシカルボニル）アミノエタノ
ール（実施例り３９およびテトラゾール（昇華した）３
５１１９（５ミリモル）を添加した。室温で一晩撹拌し
、酢酸エチル１ｏｏｒ（の添加によって、反応を停止し
た。塩化ナトリウム飽和水溶液で３回抽出した後、合わ
せた有機相を硫酸ナトリウムで乾燥した。硫酸ナトリウ
ムを濾去した後、他液を濃縮した。粗生成物を、シリカ
ゲル６０Ｈ［Ｑ＝２４ｃｉ、ｄ＝４ｃｍ；移動溶媒：塩
化メチレン／酢酸エチル（５：ｌ）］によるクロマトグ
ラフィーによって精製した。溶媒の除去後、無色の泡状
物を再度得た。これを塩化メチレン１０ｙｔ２中に取り
、水冷したｎ−ヘキサン４００ｘＱによって沈殿させた
。理論収量の２０％に相当する無色粉末の目的生成物１
．８ｇを得た。
２つのジアステレオマーは、ＴＩ、Ｃおよび３１Ｐ−Ｎ
ＭＲによって識別することができる。
ＭＲによって識別することができる。
Ｒ［直（ＣＨＩＣ１２ｔ／ＥＡ ＝ １ ： ｌ
）：Ｑ、Ｑ４、 Ｑ、１５゜３１ Ｐ −ＮＭ Ｒ（
ｐｐｍＸｃＤ３ｃＮ） ： １４６．７．１４５．８゜
実施例５ ｄ （Ｔｐ□ＴｐＴｐＴｐＴｐＴｐＴｐＴｐＡｇＴ）の
合成オリゴヌクレオチ、ドの合成は、バイオサーチ・カ
ンパニー（Ｉ３ｉｏＳｅａｒｃｈ Ｃｏｍｐａｎｙ）か
ら入手した完全自動Ｄ Ｎ Ａシンセサイザー８６００
において標準的なプロトフールに従って１マイクロモル
の大きさで行った。合成装置は、１マイクロモルのチミ
ジン担体で被覆された反応カラムを装着しており、第１
反応工程において、ジクロ０７２７９２％ジクロロ酢酸
溶液で処理して、５’−０ｆ（保護基（ジメトキシトリ
チル−）を開裂させた。該カラムをアセトニトリルで洗
浄した後、本発明に従ってＰ原子の位置で修飾された実
施例４の５′−〇−ジメトキシートリフェニルメチル−
２°−デオキシチミジン−３°−０−［２−（９−フル
オレニルメトキシカルボニル）アミノエチル］−Ｎ、Ｎ
−ジイソプロピルアミノ−ホスファンと、出発ヌクレオ
シドの遊離５’−ＯＨ基とをカップリングし、同時に、
アセトニトリル中でテトラゾールによって活性化した。
）：Ｑ、Ｑ４、 Ｑ、１５゜３１ Ｐ −ＮＭ Ｒ（
ｐｐｍＸｃＤ３ｃＮ） ： １４６．７．１４５．８゜
実施例５ ｄ （Ｔｐ□ＴｐＴｐＴｐＴｐＴｐＴｐＴｐＡｇＴ）の
合成オリゴヌクレオチ、ドの合成は、バイオサーチ・カ
ンパニー（Ｉ３ｉｏＳｅａｒｃｈ Ｃｏｍｐａｎｙ）か
ら入手した完全自動Ｄ Ｎ Ａシンセサイザー８６００
において標準的なプロトフールに従って１マイクロモル
の大きさで行った。合成装置は、１マイクロモルのチミ
ジン担体で被覆された反応カラムを装着しており、第１
反応工程において、ジクロ０７２７９２％ジクロロ酢酸
溶液で処理して、５’−０ｆ（保護基（ジメトキシトリ
チル−）を開裂させた。該カラムをアセトニトリルで洗
浄した後、本発明に従ってＰ原子の位置で修飾された実
施例４の５′−〇−ジメトキシートリフェニルメチル−
２°−デオキシチミジン−３°−０−［２−（９−フル
オレニルメトキシカルボニル）アミノエチル］−Ｎ、Ｎ
−ジイソプロピルアミノ−ホスファンと、出発ヌクレオ
シドの遊離５’−ＯＨ基とをカップリングし、同時に、
アセトニトリル中でテトラゾールによって活性化した。
３価の形で存在したままであるＰ原子を、洗浄を繰り返
した後、ＴＨＦ／ルチジン／Ｈ，Ｏにヨウ素を溶解した
溶液で酸化することによって、天然の５価のリン酸エス
テルに転換した。次の無水酢酸／ジメチルアミノピリジ
ンによるキャッピング工程によって、アセチル化による
非−結合の５’−０Ｈ−ヌクレオシドを保護した。
した後、ＴＨＦ／ルチジン／Ｈ，Ｏにヨウ素を溶解した
溶液で酸化することによって、天然の５価のリン酸エス
テルに転換した。次の無水酢酸／ジメチルアミノピリジ
ンによるキャッピング工程によって、アセチル化による
非−結合の５’−０Ｈ−ヌクレオシドを保護した。
この方法によって、正しくない配列の形成が抑制された
。洗浄後、５′−〇−ジメトキシトリチル保護基を繰り
返し開裂することによって出発から合成サイクルを再開
した。この方法で、最終段階におけるアミノエチル化チ
ミジン−ホスホルアミダイト（ＴｐＡｘ）とさらにカッ
プリングを行う前に、非修飾ホスホルアミダイト分子を
有する６チミジンビルデイングブロノクを反応配列に導
入した。
。洗浄後、５′−〇−ジメトキシトリチル保護基を繰り
返し開裂することによって出発から合成サイクルを再開
した。この方法で、最終段階におけるアミノエチル化チ
ミジン−ホスホルアミダイト（ＴｐＡｘ）とさらにカッ
プリングを行う前に、非修飾ホスホルアミダイト分子を
有する６チミジンビルデイングブロノクを反応配列に導
入した。
合成終了後、担体に結合したオリゴヌクレオチドを、濃
アンモニア水溶液による処理によって解放し、これによ
って、同時にアミノエチル化＋／ン酸エステルのＦ ｍ
ｏｃ保護基が除去された。結果は、８６０ＤＵ／Ａ、、
。であった。この粗製混合物を以下の条件下でＨＰＬＣ
にかけた。
アンモニア水溶液による処理によって解放し、これによ
って、同時にアミノエチル化＋／ン酸エステルのＦ ｍ
ｏｃ保護基が除去された。結果は、８６０ＤＵ／Ａ、、
。であった。この粗製混合物を以下の条件下でＨＰＬＣ
にかけた。
カラム：モノ（Ｍｏｎｏ）Ｑ ＨＲ１０／ １０ ［
ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）］。
ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）］。
溶離液Ａ：水。
溶離液Ｂ ： ０．５Ｎ ＬｉＣ（！。
勾配液：６０分間で八から５０％Ｂまで。
溶出液をＨ，Ｏに対して一晩透析した〔スペクトレーバ
ー（Ｓｐｅｋｔｒａｐｏｒ）、ＭＷＣＯ１０００］。
ー（Ｓｐｅｋｔｒａｐｏｒ）、ＭＷＣＯ１０００］。
収量：５５０ＤＵ。
実施例６
０．１ｍｍホウナナトリウム緩衝液１ｚｃ（ｐ）＋ ８
、５ ）に実施例５からのオリゴマー５５ ０ＤＵ／
八、。
、５ ）に実施例５からのオリゴマー５５ ０ＤＵ／
八、。
を溶解し、ジメチルホルムアミド１ｘＱにジゴキシゲニ
ンー〇−スクシニルーアミドカプロン１−Ｎ−ヒドロキ
シスクシンイミドエステルＬＯｚｇを溶解した溶液と混
合した。この混合液を室渦で１８時間撹拌し、減圧下で
蒸発乾固し、ｌ−１、○に溶解し、生成物を含有する混
合液を以下の１（ＰＬＯで分離した： カラム：シャンドン・ハイパーシル（Ｓｈａｎｄｏｎ
ＩＩｙｐｅｒｓｉｌ） ＯＤＳ、 ２５ＣＪＩＸ０．４
ＣＪｌ。
ンー〇−スクシニルーアミドカプロン１−Ｎ−ヒドロキ
シスクシンイミドエステルＬＯｚｇを溶解した溶液と混
合した。この混合液を室渦で１８時間撹拌し、減圧下で
蒸発乾固し、ｌ−１、○に溶解し、生成物を含有する混
合液を以下の１（ＰＬＯで分離した： カラム：シャンドン・ハイパーシル（Ｓｈａｎｄｏｎ
ＩＩｙｐｅｒｓｉｌ） ＯＤＳ、 ２５ＣＪＩＸ０．４
ＣＪｌ。
溶離液Ａ：０．１ｍ酢酸トリエチルアンモニウム溶液。
溶離液Ｂ：０．１ｍ酢酸トリエチルアンモニウム溶液／
イソプロパツール。
イソプロパツール。
勾配液：３０分間かけて八から５０％Ｂまで。
生成物画分を、減圧下で蒸発によって濃縮し、水中に取
り、蒸留水に対して一晩透析した［スブレクトレーパー
（Ｓｐｒｅｃ ｔ ｒａｐｏｒ）、ＭＷＣＯ１００Ｏコ
。
り、蒸留水に対して一晩透析した［スブレクトレーパー
（Ｓｐｒｅｃ ｔ ｒａｐｏｒ）、ＭＷＣＯ１００Ｏコ
。
収ｆｆｌ： ｌ ｌ ＯＤＵ／Ａ、、０゜実施例７
ＤＮＡ試験における検出限界の比較
ＨＩ Ｖに対して特異的な配列を有する３つの同一のオ
リゴヌクレオチド（３８ｍａｒｓ）のハイブリダイゼー
ション特性を、クローンしたｌ−１１Ｖ−ＤＮＡ７ラグ
メン） （ＨＩ Ｖ−Ｗｒｌ、 １３−−／イソレート
のｇａｇ領域由来の９６４ ｂｐ Ｐｖｕｌｌ／ Ｂｇ
ｌ ＩＩフラグメント）に対して試験した。オリゴヌク
レオチドの下記部位を、ジゴキシゲニンでｖ：′、Ｘｎ
化した：１、それぞれ、５゛−末端ウラシルおよび中央
部に位置するウラシル（すなわち、２つのデイグ標識（
ｄｉｇ １ａｂｅｌｓ）、ウラシルのＣ−５での塩基標
識）、 ２、それぞれ、５°−末端、３゛−末端および中央部に
位置するウラシル（すなわち、３倍のデイグ標識、ウラ
シルのＣ−５での塩基標識）、３、それぞれ、５°−末
端リン酸エステル残基および中央でに位置するリン酸エ
ステル残基（本発明に従って標識する、２つのデイグ標
識／分子）。
リゴヌクレオチド（３８ｍａｒｓ）のハイブリダイゼー
ション特性を、クローンしたｌ−１１Ｖ−ＤＮＡ７ラグ
メン） （ＨＩ Ｖ−Ｗｒｌ、 １３−−／イソレート
のｇａｇ領域由来の９６４ ｂｐ Ｐｖｕｌｌ／ Ｂｇ
ｌ ＩＩフラグメント）に対して試験した。オリゴヌク
レオチドの下記部位を、ジゴキシゲニンでｖ：′、Ｘｎ
化した：１、それぞれ、５゛−末端ウラシルおよび中央
部に位置するウラシル（すなわち、２つのデイグ標識（
ｄｉｇ １ａｂｅｌｓ）、ウラシルのＣ−５での塩基標
識）、 ２、それぞれ、５°−末端、３゛−末端および中央部に
位置するウラシル（すなわち、３倍のデイグ標識、ウラ
シルのＣ−５での塩基標識）、３、それぞれ、５°−末
端リン酸エステル残基および中央でに位置するリン酸エ
ステル残基（本発明に従って標識する、２つのデイグ標
識／分子）。
試料ＤＮＡを１μりの容量ずつ一連の希釈系にフィルタ
ー上で直接スポットするか、または、アガロースゲル中
で分離した後、フィルター上に、２０ｘＳＳＣ緩衝液を
用いるサザーンプロットによって移した。３分間、ＵＶ
照射によって固定化を行った。
ー上で直接スポットするか、または、アガロースゲル中
で分離した後、フィルター上に、２０ｘＳＳＣ緩衝液を
用いるサザーンプロットによって移した。３分間、ＵＶ
照射によって固定化を行った。
フィルターを以下の条件下で予めハイブリダイズした：
５ｘＳＳＣ中、４０℃で１時間゛、０．５％保護試薬。
５ｘＳＳＣ中、４０℃で１時間゛、０．５％保護試薬。
以下の条件下で、デイグ標識化したオリゴヌクレオチド
との次のハイブリダイゼーションを行った： ５ｘＳＳ
Ｃ中、４℃で一晩、０．５％保護試薬、ハイブリダイゼ
ーション溶液１ｙＱあたりオリゴヌクレオチド２００ｎ
ｇ。
との次のハイブリダイゼーションを行った： ５ｘＳＳ
Ｃ中、４℃で一晩、０．５％保護試薬、ハイブリダイゼ
ーション溶液１ｙＱあたりオリゴヌクレオチド２００ｎ
ｇ。
次いで、フィルターを、２ｘＳＳＣ，０，１％ＳＤＳ中
、４０°Ｃで１０分間、４回洗浄した。
、４０°Ｃで１０分間、４回洗浄した。
ジゴキシゲニンに対するＰＯＤ−標識化抗体を用いて、
非放射性標識化および検出装置［ベーリンガー・マンハ
イム・ゲゼルシャフト・ミツト・ベシュレンクテル＋ハ
フツング（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ
ＧｍｂＨ）］に類似の検出を行った。
非放射性標識化および検出装置［ベーリンガー・マンハ
イム・ゲゼルシャフト・ミツト・ベシュレンクテル＋ハ
フツング（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ
ＧｍｂＨ）］に類似の検出を行った。
ｂ）依釆
スポット／プロットされた試料ＤＮＡの検出限界は、
（１）２倍塩基標識化オリゴヌクレオチドで１０ｎ９、
（２）３倍塩基標識化オリゴヌクレオチドで１０ｎｇ、
（３）リン酸エステルによって２倍標識化されたオリゴ
ヌクレオチドで１〜１０ｎｇ であった。
ヌクレオチドで１〜１０ｎｇ であった。
特許出願人 ベーリンガー・マンハイム・ゲゼルシャフ
ト・ミツト・ベンユレンクテル・ハフラング
ト・ミツト・ベンユレンクテル・ハフラング
Claims (12)
- （１）式（IX）： ▲数式、化学式、表等があります▼（IX） ［式中、 Ｋは、水素原子、または別のヌクレオチドもしくはヌク
レオチド配列のリン酸エステル残基のリン原子であり、 Ｊは、ヒドロキシル基、または別のヌクレオチドもしく
はヌクレオチド配列の５′位の酸素原子であり、 Ｂは、天然のまたは修飾された核塩基であり、Ｔは、水
素原子、低級アルキル基、アジド基、低級アルキルオキ
シ基またはヒドロキシル基であり、 Ｘは、酸素原子または硫黄原子であり、 Ｌは、（ｎ＋１）価の架橋結合基であり、 Ｕは、酸素原子、硫黄原子、窒素原子またはＮ−Ｈであ
り、 ｎは、１〜２００の自然数である］ で示されるヌクレオチド配列を、式（IV）：Ｙ−Ｗ（I
V） ［式中、 Ｙは、反応性基であり、 Ｗは、検出可能な基または検出可能な基に変化し得る基
である］ で示される化合物と反応させることを特徴とする、式（
Ｖ）： ▲数式、化学式、表等があります▼（Ｖ） ［式中、 Ｋは、水素原子、または別のヌクレオチドもしくはヌク
レオチド配列のリン酸エステル残基のリン原子であり、 Ｊは、ヒドロキシル基、または別のヌクレオチドもしく
はヌクレオチド配列の５′位の酸素原子であり、 Ｂは、天然のまたは修飾された核塩基であり、Ｔは、水
素原子、低級アルキル基、アジド基、低級アルキルオキ
シ基またはヒドロキシル基であり、 Ｘは、酸素原子または硫黄原子であり、 Ｌは、（ｎ＋１）価の架橋結合基であり、 Ｕは、酸素原子、硫黄原子、窒素原子またはＮ−Ｈであ
り、 Ｗは、検出可能な基または検出可能な基に変化し得る基
であり、 ｎは、１〜２００の自然数である］ で示されるヌクレオチド配列の製造方法。 - （２）式（Ｖ）： ▲数式、化学式、表等があります▼（Ｖ） ［式中、 Ｋは、水素原子、または別のヌクレオチドもしくはヌク
レオチド配列のリン酸エステル残基のリン原子であり、 Ｊは、ヒドロキシル基、または別のヌクレオチドもしく
はヌクレオチド配列の５′位の酸素原子であり、 Ｂは、天然のまたは修飾された核塩基であり、Ｔは、水
素原子、低級アルキル基、アジド基、低級アルキルオキ
シ基またはヒドロキシル基であり、 Ｘは、酸素原子または硫黄原子であり、 Ｌは、（ｎ＋１）価の架橋結合基であり、 Ｕは、酸素原子、硫黄原子、窒素原子またはＮ−Ｈであ
り、 Ｗは、検出可能な基または検出可能な基に変化し得る基
であり、 ｎは、１〜２００の自然数である］ で示されるヌクレオチド配列。 - （３）式（ I ）： ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ） ［式中、 Ａは、酸素原子保護基、ヌクレオチドまたはオリゴヌク
レオチドであり、 Ｂは、天然のまたは修飾された核塩基であり、Ｘは、酸
素原子または硫黄原子であり、 Ｌは、（ｎ＋１）価の架橋結合基であり、 Ｔは、水素原子、低級アルキル基、アジド基、低級アル
キルオキシ基または所望により保護されたヒドロキシル
基であり、 Ｕは、酸素原子、硫黄原子、窒素原子またはＮ−Ｈであ
り、 Ｖは、開裂し得る保護基であり、 ｎは、１〜２００の自然数であり、 Ｄは、第２アミン残基である］ で示される化合物を、遊離５′−ヒドロキシル基を有す
る別のヌクレオシドと反応させ、ついで生成したヌクレ
オチド配列を酸化することを特徴とする式（IX）： ▲数式、化学式、表等があります▼（IX） ［式中、 Ｋは、水素原子、または別のヌクレオチドもしくはヌク
レオチド配列のリン酸エステル残基のリン原子であり、 Ｊは、ヒドロキシル基、または別のヌクレオチドもしく
はヌクレオチド配列の５′位の酸素原子であり、 Ｂは、天然のまたは修飾された核塩基であり、Ｔは、水
素原子、低級アルキル基、アジド基、低級アルキルオキ
シ基またはヒドロキシル基であり、 Ｘは、酸素原子または硫黄原子であり、 Ｌは、（ｎ＋１）価の架橋結合基であり、 Ｕは、酸素原子、硫黄原子、窒素原子またはＮ−Ｈであ
り、 ｎは、１〜２００の自然数である］ で示されるヌクレオチド配列の製造方法。 - （４）式（IX）： ［式中、 Ｋは、水素原子、または別のヌクレオチドもしくはヌク
レオチド配列のリン酸エステル残基のリン原子であり、 Ｊは、ヒドロキシル基、または別のヌクレオチドもしく
はヌクレオチド配列の５′位の酸素原子であり、 Ｂは、天然のまたは修飾された核塩基であり、Ｔは、水
素原子、低級アルキル基、アジド基、低級アルキルオキ
シ基またはヒドロキシル基であり、 Ｘは、酸素原子または硫黄原子であり、 Ｌは、（ｎ＋１）価の架橋結合基であり、 Ｕは、酸素原子、硫黄原子、窒素原子またはＮ−Ｈであ
り、 ｎは、１〜２００の自然数である］ で示されるヌクレオチド配列。 - （５）式（ I ）： ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ） ［式中、 Ａは、酸素原子保護基、ヌクレオチドまたはオリゴヌク
レオチドであり、 Ｂは、天然のまたは修飾された核塩基であり、Ｘは、酸
素原子または硫黄原子であり、 Ｌは、（ｎ＋１）価の架橋結合基であり、 Ｔは、水素原子、低級アルキル基、アジド基、低級アル
キルオキシ基、または所望により保護されたヒドロキシ
ル基であり、 Ｕは、酸素原子、硫黄原子、窒素原子またはＮ−Ｈであ
り、 Ｖは、開裂し得る保護基であり、 ｎは、１〜２００の自然数であり、 Ｄは、第２アミン残基である］ で示されるヌクレオシドホスホルアミダイト。 - （６）請求項２に記載の式（Ｖ）で示される化合物製造
用の請求項５に記載の式（ I ）で示されるヌクレオシ
ドホスホルアミダイト。 - （７）式（II）： ▲数式、化学式、表等があります▼（II） ［式中、 Ａは、酸素原子保護基、ヌクレオチドまたはオリゴヌク
レオチドであり、 Ｂは、天然のまたは修飾された核塩基であり、Ｔは、水
素原子、低級アルキル基、アジド基、低級アルキルオキ
シ基、または所望により保護されたヒドロキシル基であ
る］ で示される化合物を、式（III）： ▲数式、化学式、表等があります▼（III） ［式中、 Ｚは、良好な離脱基であり、 Ｘは、酸素原子または硫黄原子であり、 Ｌは、少なくとも２価の架橋結合基であり、Ｕは、酸素
原子、硫黄原子、窒素原子またはＮ−Ｈであり、 Ｖは、開裂し得る保護基であり、 ｎは、１〜２００の自然数であり、 Ｄは、第２アミン残基である］ で示されるホスファンと反応させることを特徴とする請
求項５に記載の式（ I ）で示されるヌクレオシドホス
ホルアミダイトの製造方法。 - （８）式（III）： ▲数式、化学式、表等があります▼（III） ［式中、 Ｚは、良好な離脱基であり、 Ｘは、酸素原子または硫黄原子であり、 Ｌは、少なくとも２価の架橋結合基であり、Ｕは、酸素
原子、硫黄原子、窒素原子またはＮ−Ｈであり、 Ｖは、開裂し得る保護基であり、 ｎは、１〜２００の自然数であり、 Ｄは、第２アミン残基である］ で示されるホスファン。 - （９）式（VI）： Ｐ（−Ｚ）＿３（VI） ［式中、Ｚは良好な離脱基である］ で示される化合物と、式（VII）： Ｈ−Ｄ（VII） ［式中、Ｄは第２アミン残基である］ で示される第２アミンとを反応させ、得られた生成物を
、式（VIII）： Ｈ−Ｘ−Ｌ（−Ｕ−Ｖ）＿ｎ（VIII） ［式中、 Ｘは、酸素原子または硫黄原子であり、 Ｌは、（ｎ＋１）価の架橋結合基であり、 Ｕは、酸素原子、硫黄原子、窒素原子またはＮ−Ｈであ
り、 Ｖは、開裂し得る保護基であり、 ｎは、１〜２００の自然数である］ で示される化合物と反応させ、得られた生成物を単離す
ることを特徴とする請求項８に記載の式（III）で示さ
れるホスファンの製造方法。 - （１０）式（Ｖ）： ▲数式、化学式、表等があります▼（Ｖ） ［式中、 Ｋは、水素原子、または別のヌクレオチドもしくはヌク
レオチド配列のリン酸エステル残基のリン原子であり、 Ｊは、ヒドロキシル基、または別のヌクレオチドもしく
はヌクレオチド配列の５′位の酸素原子であり、 Ｂは、天然のまたは修飾された核塩基であり、Ｔは、水
素原子、低級アルキル基、アジド基、低級アルキルオキ
シ基またはヒドロキシル基であり、 Ｘ、Ｌ、Ｕ、Ｗおよびｎは、上記定義と同じである］ で示されるヌクレオチド配列に対して本質的に相補的で
あるヌクレオチド配列検出用の該式（Ｖ）で示されるヌ
クレオチド配列。 - （１１）試料ＤＮＡに対して相補的である核酸として、
請求項２に記載の式（Ｖ）で示されるヌクレオチド配列
を含むことを特徴とする試料に対して本質的に相補的で
ある核酸と接触させることによる試料中の核酸の検出試
薬。 - （１２）二重鎖核酸の酵素合成におけるプライマー用の
式（Ｖ）： ▲数式、化学式、表等があります▼（Ｖ） ［式中、 Ｋは、水素原子、または別のヌクレオチドもしくはヌク
レオチド配列のリン酸エステル残基のリン原子であり、 Ｊは、ヒドロキシル基、または別のヌクレオチドもしく
はヌクレオチド配列の５′位の酸素原子であり、 Ｂは、天然のまたは修飾された核塩基であり、Ｔは、水
素原子、低級アルキル基、アジド基、低級アルキルオキ
シ基またはヒドロキシル基であり、 Ｘ、Ｌ、Ｕ、Ｗおよびｎは、上記定義と同じである］ で示されるヌクレオチド配列。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3916871A DE3916871A1 (de) | 1989-05-24 | 1989-05-24 | Modifiziertes phosphoramidit-verfahren zur herstellung von modifizierten nukleinsaeuren |
| DE3916871.9 | 1989-05-24 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6223299A Division JP2710756B2 (ja) | 1989-05-24 | 1994-09-19 | 新規ヌクレオシドホスホルアミダイトおよびその製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH035495A true JPH035495A (ja) | 1991-01-11 |
| JPH0730108B2 JPH0730108B2 (ja) | 1995-04-05 |
Family
ID=6381283
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2132429A Expired - Lifetime JPH0730108B2 (ja) | 1989-05-24 | 1990-05-22 | 修飾された核酸を製造するための修飾されたホスホルアミダイト法 |
| JP6223299A Expired - Lifetime JP2710756B2 (ja) | 1989-05-24 | 1994-09-19 | 新規ヌクレオシドホスホルアミダイトおよびその製造方法 |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6223299A Expired - Lifetime JP2710756B2 (ja) | 1989-05-24 | 1994-09-19 | 新規ヌクレオシドホスホルアミダイトおよびその製造方法 |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US5700919A (ja) |
| EP (1) | EP0399330B1 (ja) |
| JP (2) | JPH0730108B2 (ja) |
| KR (2) | KR920007274B1 (ja) |
| AT (1) | ATE116327T1 (ja) |
| CA (1) | CA2017369C (ja) |
| DE (2) | DE3916871A1 (ja) |
| DK (1) | DK0399330T3 (ja) |
| ES (1) | ES2068279T3 (ja) |
| GR (1) | GR3015223T3 (ja) |
| ZA (1) | ZA903975B (ja) |
Families Citing this family (58)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3916871A1 (de) * | 1989-05-24 | 1990-11-29 | Boehringer Mannheim Gmbh | Modifiziertes phosphoramidit-verfahren zur herstellung von modifizierten nukleinsaeuren |
| US5955589A (en) * | 1991-12-24 | 1999-09-21 | Isis Pharmaceuticals Inc. | Gapped 2' modified oligonucleotides |
| US5872232A (en) * | 1990-01-11 | 1999-02-16 | Isis Pharmaceuticals Inc. | 2'-O-modified oligonucleotides |
| US7101993B1 (en) | 1990-01-11 | 2006-09-05 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Oligonucleotides containing 2′-O-modified purines |
| US5623065A (en) * | 1990-08-13 | 1997-04-22 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Gapped 2' modified oligonucleotides |
| US5670633A (en) * | 1990-01-11 | 1997-09-23 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Sugar modified oligonucleotides that detect and modulate gene expression |
| US6005087A (en) * | 1995-06-06 | 1999-12-21 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | 2'-modified oligonucleotides |
| US6399754B1 (en) | 1991-12-24 | 2002-06-04 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Sugar modified oligonucleotides |
| US5914396A (en) * | 1990-01-11 | 1999-06-22 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | 2'-O-modified nucleosides and phosphoramidites |
| US5859221A (en) * | 1990-01-11 | 1999-01-12 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | 2'-modified oligonucleotides |
| US5391785A (en) * | 1990-01-16 | 1995-02-21 | La Jolla Pharmaceutial Company | Intermediates for providing functional groups on the 5' end of oligonucleotides |
| US7015315B1 (en) | 1991-12-24 | 2006-03-21 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Gapped oligonucleotides |
| US5965722A (en) * | 1991-05-21 | 1999-10-12 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Antisense inhibition of ras gene with chimeric and alternating oligonucleotides |
| JP2899111B2 (ja) * | 1991-07-15 | 1999-06-02 | ラ ホヤ ファーマシューティカル カンパニー | オリゴヌクレオチドの５’末端へ官能基を提供するための修飾された亜リン酸中間体 |
| US6307040B1 (en) | 1992-03-05 | 2001-10-23 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Sugar modified oligonucleotides that detect and modulate gene expression |
| US7119184B2 (en) | 1991-08-12 | 2006-10-10 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Oligonucleotides having A-DNA form and B-DNA form conformational geometry |
| IT1249732B (it) * | 1991-11-26 | 1995-03-09 | Angeletti P Ist Richerche Bio | Oligonucleotidi antisenso. |
| US5700922A (en) * | 1991-12-24 | 1997-12-23 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | PNA-DNA-PNA chimeric macromolecules |
| JP3131222B2 (ja) | 1991-12-24 | 2001-01-31 | アイシス・ファーマシューティカルス・インコーポレーテッド | ギャップを有する２′修飾オリゴヌクレオチド |
| US5856455A (en) * | 1991-12-24 | 1999-01-05 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Gapped 2'-modified oligonucleotides |
| US6277603B1 (en) | 1991-12-24 | 2001-08-21 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | PNA-DNA-PNA chimeric macromolecules |
| US5652355A (en) * | 1992-07-23 | 1997-07-29 | Worcester Foundation For Experimental Biology | Hybrid oligonucleotide phosphorothioates |
| US6346614B1 (en) | 1992-07-23 | 2002-02-12 | Hybridon, Inc. | Hybrid oligonucleotide phosphorothioates |
| TW244371B (ja) * | 1992-07-23 | 1995-04-01 | Tri Clover Inc | |
| EP0593901B2 (de) * | 1992-09-24 | 2008-04-09 | Sanofi-Aventis Deutschland GmbH | Oligoribonucleotid- und Ribozym-Analoga mit terminalen 3'-3'-bzw.5'-5'-Verknüpfungen |
| DE4239531A1 (de) * | 1992-11-25 | 1994-05-26 | Gabor Dr Igloi | Reagenz zur Kupplung verschiedener Substanzen an Nukleinsäuren sowie Verfahren zu dessen Herstellung |
| KR100361933B1 (ko) | 1993-09-08 | 2003-02-14 | 라 졸라 파마슈티칼 컴파니 | 화학적으로정의된비중합성결합가플랫폼분자및그것의콘주게이트 |
| DE4418691A1 (de) * | 1994-05-28 | 1996-02-22 | Boehringer Mannheim Gmbh | 3'-(4'-) nicht-radioaktiv markierte Nukleoside und Nukleotide mit Aminocarbonsäure-, Peptid- oder Carbonsäure-Spacer |
| SE9500342D0 (sv) | 1995-01-31 | 1995-01-31 | Marek Kwiatkowski | Novel chain terminators, the use thereof for nucleic acid sequencing and synthesis and a method of their preparation |
| US6017700A (en) * | 1995-08-04 | 2000-01-25 | Bayer Corporation | Cationic oligonucleotides, and related methods of synthesis and use |
| US5856099A (en) * | 1996-05-21 | 1999-01-05 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Antisense compositions and methods for modulating type I interleukin-1 receptor expression |
| US9096636B2 (en) | 1996-06-06 | 2015-08-04 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Chimeric oligomeric compounds and their use in gene modulation |
| US7812149B2 (en) | 1996-06-06 | 2010-10-12 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | 2′-Fluoro substituted oligomeric compounds and compositions for use in gene modulations |
| US5898031A (en) | 1996-06-06 | 1999-04-27 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Oligoribonucleotides for cleaving RNA |
| DE19637042A1 (de) | 1996-09-12 | 1998-03-19 | Boehringer Mannheim Gmbh | Heterocyclische Verbindungen und deren Verwendung in der Detektion von Nucleinsäuren |
| US6576752B1 (en) | 1997-02-14 | 2003-06-10 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Aminooxy functionalized oligomers |
| US6172209B1 (en) | 1997-02-14 | 2001-01-09 | Isis Pharmaceuticals Inc. | Aminooxy-modified oligonucleotides and methods for making same |
| US6127533A (en) * | 1997-02-14 | 2000-10-03 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | 2'-O-aminooxy-modified oligonucleotides |
| US6184347B1 (en) | 1998-11-19 | 2001-02-06 | Agilent Technologies Inc. | Minimization of blooming in high-density arrays by using reactive wash reagents |
| CA2370478A1 (en) | 1999-03-24 | 2000-09-28 | Serge L. Beaucage | N-acylphosphoramidites and their use in oligonucleotide synthesis |
| US6306599B1 (en) | 1999-07-16 | 2001-10-23 | Agilent Technologies Inc. | Biopolymer arrays and their fabrication |
| WO2001093914A2 (en) | 2000-06-08 | 2001-12-13 | La Jolla Pharmaceutical Company | Multivalent platform molecules comprising high molecular weight polyethylene oxide |
| US7135565B2 (en) | 2000-07-28 | 2006-11-14 | Agilent Technologies, Inc. | Synthesis of polynucleotides using combined oxidation/deprotection chemistry |
| US6693187B1 (en) * | 2000-10-17 | 2004-02-17 | Lievre Cornu Llc | Phosphinoamidite carboxlates and analogs thereof in the synthesis of oligonucleotides having reduced internucleotide charge |
| US7435390B2 (en) * | 2001-01-26 | 2008-10-14 | Third Wave Technologies, Inc. | Nucleic acid synthesizers |
| US6932943B1 (en) | 2001-01-26 | 2005-08-23 | Third Wave Technologies | Nucleic acid synthesizers |
| DE10133779A1 (de) * | 2001-07-16 | 2003-02-06 | Chemogenix Gmbh | Multimerpolynukleotidsynthese |
| AU2002353001A1 (en) * | 2001-12-03 | 2003-06-17 | The Government Of The United States Of America, Represented By The Secretary Of The Department Of He | Thermolabile hydroxyl protecting groups and methods of use |
| AU2003291755A1 (en) | 2002-11-05 | 2004-06-07 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Oligomers comprising modified bases for binding cytosine and uracil or thymine and their use |
| US8569474B2 (en) | 2004-03-09 | 2013-10-29 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Double stranded constructs comprising one or more short strands hybridized to a longer strand |
| US8394947B2 (en) | 2004-06-03 | 2013-03-12 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Positionally modified siRNA constructs |
| US7884086B2 (en) | 2004-09-08 | 2011-02-08 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Conjugates for use in hepatocyte free uptake assays |
| WO2006065751A2 (en) * | 2004-12-13 | 2006-06-22 | Government Of The United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Cpg oligonucleotide prodrugs, compositions thereof and associated therapeutic methods |
| US8084589B2 (en) * | 2007-08-31 | 2011-12-27 | University Of Massachusetts | Phosphoramidite nucleoside analogs |
| SG10201913554YA (en) | 2011-12-22 | 2020-03-30 | Alios Biopharma Inc | Substituted nucleosides, nucleotides and analogs thereof |
| US9441007B2 (en) | 2012-03-21 | 2016-09-13 | Alios Biopharma, Inc. | Substituted nucleosides, nucleotides and analogs thereof |
| USRE48171E1 (en) | 2012-03-21 | 2020-08-25 | Janssen Biopharma, Inc. | Substituted nucleosides, nucleotides and analogs thereof |
| EP3004131B1 (en) | 2013-06-05 | 2020-07-22 | AM Chemicals Llc | Phosphoramidite building blocks for sugar-conjugated oligonucleotides |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS59141598A (ja) * | 1983-01-27 | 1984-08-14 | サントル・ナシヨナ−ル・ド・ラ・ルシエルシユ・シアンテイ−フイ−ク（セ・エヌ・エル・エス） | 保護剤を結合したオリゴヌクレオチド連鎖を含む新規化合物、及び該新規化合物の製造方法 |
| JPS6157596A (ja) * | 1984-08-28 | 1986-03-24 | Yuki Gosei Yakuhin Kogyo Kk | 酵素標識化されたポリヌクレオチドおよびその製法 |
Family Cites Families (21)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4668777A (en) * | 1981-03-27 | 1987-05-26 | University Patents, Inc. | Phosphoramidite nucleoside compounds |
| US4415732A (en) * | 1981-03-27 | 1983-11-15 | University Patents, Inc. | Phosphoramidite compounds and processes |
| CA1223831A (en) * | 1982-06-23 | 1987-07-07 | Dean Engelhardt | Modified nucleotides, methods of preparing and utilizing and compositions containing the same |
| US4547569A (en) * | 1982-11-24 | 1985-10-15 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Intercalating agents specifying nucleotides |
| EP0135587B2 (en) * | 1983-02-22 | 2002-12-18 | Syngene, Inc. | Defined sequence single strand oligonucleotides incorporating reporter groups, process for the chemical synthesis thereof, and nucleosides useful in such synthesis |
| JPS59165362A (ja) * | 1983-03-10 | 1984-09-18 | Mitsubishi Electric Corp | 高圧放電灯 |
| DE3329892A1 (de) * | 1983-08-18 | 1985-03-07 | Köster, Hubert, Prof. Dr., 2000 Hamburg | Verfahren zur herstellung von oligonucleotiden |
| DE3332068A1 (de) * | 1983-09-06 | 1985-03-21 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Verfahren zur herstellung von nukleosidalkyl-, aralkyl- und arylphosphoniten und -phosphonaten |
| FR2568254B1 (fr) * | 1984-07-25 | 1988-04-29 | Centre Nat Rech Scient | Application d'oligonucleotides lies a un agent intercalant, notamment a titre de medicament |
| DE3431536A1 (de) * | 1984-08-28 | 1986-03-13 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Derivatisierte nucleinsaeure-sequenz, verfahren zu deren herstellung sowie deren verwendung zum nachweis von nucleinsaeuren |
| JPS61112093A (ja) * | 1984-11-05 | 1986-05-30 | Wakunaga Seiyaku Kk | ヌクレオチド誘導体 |
| US5252760A (en) * | 1985-03-28 | 1993-10-12 | Chiron Corporation | Method of using colored phosphorylating reagents |
| US4762779A (en) * | 1985-06-13 | 1988-08-09 | Amgen Inc. | Compositions and methods for functionalizing nucleic acids |
| EP0216357A3 (en) * | 1985-09-25 | 1988-08-31 | Nippon Zeon Co., Ltd. | Phosphoramidite compounds and process for production thereof |
| DE3642939A1 (de) * | 1986-06-03 | 1987-12-10 | Europ Lab Molekularbiolog | Verfahren zur dna-markierung |
| JPS638396A (ja) * | 1986-06-30 | 1988-01-14 | Wakunaga Pharmaceut Co Ltd | ポリ標識化オリゴヌクレオチド誘導体 |
| EP0290583B1 (fr) * | 1986-12-02 | 1993-04-07 | Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs) | OLIGONUCLEOTIDES $g(a) |
| AU619170B2 (en) * | 1987-01-09 | 1992-01-23 | Abbott Laboratories | Diagnostic assays using nucleic acid probes |
| DD273445A1 (de) * | 1988-06-29 | 1989-11-15 | Akad Wissenschaften Ddr | Verfahren zur herstellung von kovalenten konjugaten aus oligodesoxynukleotiden und polyaminosaeuren oder proteinen |
| SE8802574D0 (sv) * | 1988-07-08 | 1988-07-08 | Wallac Oy | Oligonucleotide hybridization probes and means for the synthesis of the most preferred probes |
| DE3916871A1 (de) * | 1989-05-24 | 1990-11-29 | Boehringer Mannheim Gmbh | Modifiziertes phosphoramidit-verfahren zur herstellung von modifizierten nukleinsaeuren |
-
1989
- 1989-05-24 DE DE3916871A patent/DE3916871A1/de not_active Withdrawn
-
1990
- 1990-05-15 DE DE59008105T patent/DE59008105D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-05-15 DK DK90109092.8T patent/DK0399330T3/da active
- 1990-05-15 EP EP90109092A patent/EP0399330B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-05-15 AT AT90109092T patent/ATE116327T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-05-15 ES ES90109092T patent/ES2068279T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-05-21 KR KR1019900007260A patent/KR920007274B1/ko not_active Expired
- 1990-05-22 JP JP2132429A patent/JPH0730108B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1990-05-23 ZA ZA903975A patent/ZA903975B/xx unknown
- 1990-05-23 CA CA002017369A patent/CA2017369C/en not_active Expired - Lifetime
-
1992
- 1992-07-13 KR KR1019920012473A patent/KR920007558B1/ko not_active Expired
-
1994
- 1994-09-19 JP JP6223299A patent/JP2710756B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1995
- 1995-01-10 US US08/370,836 patent/US5700919A/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-02-28 GR GR950400427T patent/GR3015223T3/el unknown
-
1997
- 1997-09-19 US US08/934,018 patent/US5902878A/en not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS59141598A (ja) * | 1983-01-27 | 1984-08-14 | サントル・ナシヨナ−ル・ド・ラ・ルシエルシユ・シアンテイ−フイ−ク（セ・エヌ・エル・エス） | 保護剤を結合したオリゴヌクレオチド連鎖を含む新規化合物、及び該新規化合物の製造方法 |
| JPS6157596A (ja) * | 1984-08-28 | 1986-03-24 | Yuki Gosei Yakuhin Kogyo Kk | 酵素標識化されたポリヌクレオチドおよびその製法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE3916871A1 (de) | 1990-11-29 |
| JPH0730108B2 (ja) | 1995-04-05 |
| ZA903975B (en) | 1991-03-27 |
| JPH07233188A (ja) | 1995-09-05 |
| GR3015223T3 (en) | 1995-05-31 |
| US5902878A (en) | 1999-05-11 |
| KR920007274B1 (ko) | 1992-08-29 |
| EP0399330B1 (de) | 1994-12-28 |
| EP0399330A1 (de) | 1990-11-28 |
| US5700919A (en) | 1997-12-23 |
| JP2710756B2 (ja) | 1998-02-10 |
| ATE116327T1 (de) | 1995-01-15 |
| KR920007558B1 (ko) | 1992-09-07 |
| KR900018133A (ko) | 1990-12-20 |
| DE59008105D1 (de) | 1995-02-09 |
| CA2017369A1 (en) | 1990-11-24 |
| CA2017369C (en) | 2001-01-23 |
| DK0399330T3 (da) | 1995-05-15 |
| ES2068279T3 (es) | 1995-04-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JPH035495A (ja) | 修飾された核酸を製造するための修飾されたホスホルアミダイト法 | |
| US5258506A (en) | Photolabile reagents for incorporation into oligonucleotide chains | |
| EP0543889B1 (en) | Incorporation of selectably clevable sites into oligonucleotide chains and reagents therefor | |
| EP0543906B1 (en) | Hydroxyl-protecting groups orthogonally removable by reduction and their use in the chemical synthesis of oligonucleotides | |
| KR101032008B1 (ko) | 폴리뉴클레오티드 표지 시약 | |
| US5367066A (en) | Oligonucleotides with selectably cleavable and/or abasic sites | |
| US5594117A (en) | Polynucleotide reagents containing modified deoxyribose moieties and associated methods of synthesis and use | |
| US5252723A (en) | Method and reagent for sulfurization of organophosphorous compounds | |
| EP0101985A1 (en) | Oligonucleotide derivatives and production thereof | |
| US6017700A (en) | Cationic oligonucleotides, and related methods of synthesis and use | |
| US5869696A (en) | Universal solid supports and methods for their use | |
| US5071974A (en) | Compositions and methods for the synthesis of oligonucleotides having 5'-phosphorylated termini | |
| EP0090789A1 (en) | Chemical DNA synthesis | |
| JPH0631305B2 (ja) | ヌクレオシド誘導体 | |
| MXPA96004355A (en) | Oligonucleotides and used modified intermediaries in nucleic acids therapeuti | |
| WO1995026972A1 (en) | Modified oligonucleotides and intermediates useful in nucleic acid therapeutics | |
| WO1990012020A1 (en) | Coumarin derivatives for use as nucleotide crosslinking reagents | |
| CA2089668A1 (en) | Oligo (alpha-arabinofuranosyl nucleotides) and alpha-arabinofuranosyl precursors thereof | |
| JPH0812698A (ja) | インビトロにおけるオリゴヌクレオチド合成法 | |
| JP2835630B2 (ja) | 標的付与されたオリゴヌクレオチド類の合成に使用できるヌクレオシド誘導体類、これ等誘導体類から得たオリゴヌクレオチド類及びそれ等の合成 | |
| NZ225944A (en) | Biotinylated polynucleotides and analogues thereof, processes for their preparation and intermediates therefor | |
| Augustyns et al. | Influence of the Incorporation of 1‐(2, 3‐Dideoxy‐β‐D‐Erythro‐Hexopyranosyl)‐Thymine on the Enzymatic Stability and Base‐Pairing Properties of Oligodeoxynucleotides | |
| JPS59502025A (ja) | オリゴヌクレオシドホスホネ−トの製造法 | |
| US20030129593A1 (en) | Process for producing multiple oligonucleotides on a solid support | |
| US20040039189A1 (en) | Novel amidite derivates for synthesising polymers on surfaces |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20080405 Year of fee payment: 13 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090405 Year of fee payment: 14 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090405 Year of fee payment: 14 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100405 Year of fee payment: 15 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110405 Year of fee payment: 16 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term | ||
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110405 Year of fee payment: 16 |