JPS6157596A - 酵素標識化されたポリヌクレオチドおよびその製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明はリン酸結合の少なくとも１個以上が式ＣＩ） ｏ−ｐ−０−ＣＩ） −Ｘ （式中、Ｂは炭素数１ないし２００分枝鎖を有すること
もある脂肪族炭化水素または芳香族炭化水素を、Ｘは保
護基を有するとともある官能基を示す。） で表わされる官能基を有するホスホン酸結合であるポリ
デオキシリぜヌクレオチドまたはポリリゼヌクレオチド
（以下、ポリヌクレオチドと総称する）のホスホン酸結
合の官能基に共有結合性酵素標識化合物を反応させるこ
とからなるポリヌクレオチドの酵素標識化方法に関する
ものであり、本発明により得られる酵素標識化された特
定の塩基配列を有するポリヌクレオチドは標的遺伝子の
同定および抽出に使用され、遺伝子工学、臨床診断およ
び食品等の分野で幅広く利用され得るものである。

（発明の背景） 近年遺伝子工学の研究が盛んになるに伴い、有用物質の
生産に必要な遺伝子の検出に、特定の塩基配列を有する
ポリヌクレオチドが用いられるようになってきている。

例えば臨床診断の分野においては現在免疫学的方法およ
び生物学的方法が用いられているが、前者は検査時間が
一般に数分と短いものの交差反応や干渉作用のためにし
ばしば不明瞭な結果を与え、また後者は培養に長時間ｔ
−要するなどの欠点を有する。

これに対して、遺伝子を検出することで疾患の診断を行
なうポリヌクレオチド法は、検査時間は一般に数時間を
要するが、検出感度ばかりでなく特異性も非常に高く、
また誤差がきわめて小さいといり利点を有し、感染症の
みならず免疫学的方法では検出できない潜在性ウィルス
も検出可能であるため、これに適したポリヌクレオチド
の開発が要望されている。

（従来の技術） ポリヌクレオチドを用い、交雑法によって標的遺伝子を
検出さる際は、ポリヌクレオチドを標識化する必要が心
る。漂識化は放射性同位元素を用いる方法と光標識法ζ
こ大別される。現在放射性同位元素ｓｉｐを用いる方法
が最も利用てれており、特開昭５８−１７０４９６号公
報にはＡＴＰ（γ−５ｔｐ　）とキナーゼでポリヌクレ
オチドの５′−末端基にｓｘｐで標識したリン酸基を導
入し、ｌａｐから放射されるβ線でフィルムを感光させ
、その黒斑点によって標的遺伝子の存在を検出する方法
が開示されている。放射性同位元素による標識化は感度
の点で優れている反面、使用に際して（１）取り扱い上
熟練が必要である、０１）法規上の規制が厳しく、特別
の施設および測定機器が必要であす、またその限定逼れ
た場所でしか取り扱えない、（ｆｉｌ）健康上の問題が
ある、（ｉｖ）使用後の廃棄に問題がある、（Ｖ）半減
期に合わせて予約購入するので実験の期日がそれにより
制約される、などの難点がある。これに対して放射性同
位元素を用いないｇ識化法として光標識化法が提案され
、特開昭５８−２３７９５号公報および特開昭５８−４
００９９号公報には化学発光、生体発光、螢光を利用す
る方法が開示されている。しかし光標識法としては、チ
ミジンるるいはウリジンアナローブとしてそのＣ−５位
にアミド結合を介してビオチ／を付したダー０−トリホ
スフェートを酵素的ニックトランスレーションの手法で
ポリヌクレオチドに組み込んで標識化し、標的遺伝子を
検出する方法〔Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏ（Ｎａｔｉ
ｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ８ｃｌｅｎｃｅｏｆ　
ｔｈｅ　Ｕｎｌｔｅｄ　８ｔａｔｅ　ｏｆ　Ａｍｅｒｌ
ｃａ　、第８０巻。

第４０４５頁（１９８３年）〕が実用化されているのみ
である。

（発明が解決しようとする問題点） 核酸は核酸塩基、糖、リン酸の３つの構成要素から構成
され、それぞれの構成要素を光標識化することが可能で
あるが、その際ポリヌクレオチドが標的遺伝子とハイブ
リットする性質を損うことのよいよう標識化合物を導入
する必要かめる。しかし、核酸塩基部を光標識化する場
合、ぜリミジン系塩基ではＣ−５位に標識化合物を導入
することが可能であるが、プリン系塩基については立体
化学的に標識化合物を導入可能なのはＣ−ａ位とＮ−７
位のみであり、Ｃ−８位に導入すると塩基と糖が８ｙｎ
型配座をとるために一般的には二重ら線が右巻きである
場合はハイツリフト能を失い、またＮ−７位に導入する
場合は窒素が四級となり糖と塩基部のグリコシド結合が
切れる、いわゆる脱プリン反応が生起しやすくなるため
プリン系塩基全党標識化することはきわめて困難である
。従って核酸塩基部の光標識化はぎリミジン系塩基の場
合のみ有効であり、−リヌクレオチドの塩基配列がプリ
ン系塩基のみの場合は光標識化ができ難いという不都合
を生じる。次に、糖部を光標識化する場合、ポリデオキ
シリ−ヌクレオチドでは両末端の水酸基しか利用できず
、ポリリゼヌクレオチドでは理論的には２′−位水酸基
も利用可能であるが、この位置に光標識化合物の如き大
きさの分子を導入するとハイブリット形成に影響を及ば
ずため、４リデオキシリゼヌクレオチドと同様に両末端
の水酸基しか利用できず検出感度が低下する。

（問題点を解決するための手段） 本発明者らは光標識法により標識化したポリヌクレオチ
ドの検出感度を向上させるため種々検討を加えた結果、
核酸構成要素のリン酸部に光標識化合物を導入すること
により、ポリヌクレオチドの任意の位置に任意の数の光
標識化合物の導入が可能になることを見い出すと共に、
リン酸結合の代わりに官能基を有するホスホン酸結合を
選択し、このホスホン酸結合の官能基と光標識化合物を
反応させてホスホン酸結合を光標識化することにより、
リン酸結合を光標識化するときに生ずる（イ）合成法に
よるポリヌクレオチド合成後の脱保護工程での標識化合
物の脱離あるいはインターヌクレオチド結合の切断、（
ロ）リン原子がキラリティーを有することによる得られ
た光標識ポリヌクレオチドのリン原子の立体化学の不統
一、という問題も解決し、また光標識化合物として官能
基と特異的に反応する共有結合性酵素標識化合物を用い
ること番こより所期の目的を達成することを見い出し本
発明を完成したものである。

（ポリヌクレオチドの酵素標識化） 本発明のポリヌクレオチドの酵素標識化は、ポリヌクレ
オチドのリン酸結合に代えて官能基を有するホスホ／酸
結合とし、この官能基と共有結合性酵素標識化合物を反
応嘔せることにより酵素標識化するものである。

ホスホン酸と酵素標識化合物との反応は、酵素標識化合
物と特異的に反応する官能基を、分枝鎖を有することも
ある脂肪族炭化水素または芳香族炭化水素を間に挾んで
リン原子と結合させたのち、この官能基に酵素標識化合
物を反応させる。この除用いる官能基としてはチオール
基やアミノ基が通常は用いられるが、酵素標識化合物と
特異的に反応する官能基であればこれに限定されるもの
ではない。これらの官能基はタリヌクレオチド合成の際
副反応をおこすことが考えられるので、保護基により保
護することが望ましく、保護基としては最終脱保護工程
でヌクレオチドの塩基部や水酸基の保護基と同時に除去
式れるものであればよい。

本発明で用いられる酵素標識化合物とは、一端がホスホ
ン酸結合の官能基と特異的な共有結合性をもつ官能基、
すなわちマレイミド基やジチオ基であり、もう一端が酵
素中のアミノ基、メルカプト基と反応する官能基をもつ
架橋剤と、アミン基、メルカプト基を有する酵素、例え
ばガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコ
ースオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、ルシフエラーゼ
、カタラーゼなどよりなるものなどが例示されるが、酵
素と架橋剤の組み合せはこれらに限定されるものではな
い。

ポリヌクレオチドの酵素標識化は、ポリヌクレオチドの
両末端を酵素標識化するだけでなく、インターヌクレオ
チド結合部を酵素標識化することにより一層の検出感度
の向上を達成できる。

酵素標識化の方法としては、任意の位置にホスホン酸結
合を有するポリヌクレオチドを合成し、これに酵素標識
化合物を反応嘔せて酵素標識化する方法、およびホスホ
ン酸と酵素標識化合物を反応させて得られる酵素標識化
されたホスホン酸基を、通常のリン酸基を用いるポリヌ
クレオチドの合成手段と同様の方法で導入し酵素標識化
する方法、のいずれを用いてもよいが、得られる酵素標
識化てれたポリヌクレオチドが、立体化学的に標的遺伝
子とハイブリット可能であることが必要である。

本発明において用いられるホスホン酸の合成はＨｏｕｂ
ｅｎ　Ｗｅｇｌｓ　Ｍｅｔｈｏｄｅｎ　ｄｅｒ　Ｏｒｇ
ａｎｉｓｃｈｅｎＣｈｅｍｉｅ　、　　Ｅ、Ｍｕｌｌｅ
ｒ　、　Ｅｄｉｔｏｒ　、　Ｍｏｌ、　ＸＬ／　１　。

２　、　Ｇｅｏｒｇ　Ｔｈｉｅｍｅ　Ｖｅｒｌｏｇ　、
　８ｔｕｔｔｇａｒｔ　。

（１９６３〜６４年）に記載されているが、亜リン酸シ
リルエステルと臭化アルキルのアープシフ（Ａｒｂｕｚ
ｏｖ　）反応を利用する合成法〔有機合成化学部会誌、
第３９巻、第９１８頁（１９８１年）〕は副反応も少な
く収率も良好である。

本発明におけるポリヌクレオチドは、ヌクレオシド（反
応式〔ｌ〕の化合物■）と官能基を有するホスホン酸（
反応式〔Ｉ〕の化合物■）を、縮合剤例えばジシクロへ
キシルカルゼジイミト、アルキルベンゼンスルホニルク
ロリド、アルキルベンゼンスルホニルアゾール、アルキ
ルベンゼンスルホニルニトロアゾールナトの存在下に反
応させることによりホスホン酸化された単量体（反応式
〔Ｉ〕の化合物■）が得られる。化合物■で示される単
量体は５′−水酸基が保護されていないヌクレオシド（
反応式ＣＩ）の化合物■）と縮合剤の存在下モこ縮合嘔
せて二量体（反応式〔Ｉ〕の化合物■）とする。化合物
■において几３はＸ、Ｒ１，Ｒ”の保護基とは別異であ
り選択的に除去できる保護基であることが望ましいが、
部の保護基と同一の条件で除去できる保護基でもよく、
また場合によっては保護基を有するリン酸基でもよい。

化合物■で示される二量体のホスホン酸リン原子は結合
している基が全て異なるためキラリティーを有するよう
になり、絶対表示法でＲ体と８体の２個のジアステレオ
マーの混合物となるが、この２個のジアステレオマーは
シリカゲルクロマトグラフィーで分離し、立体化学的に
単一の二量体とすることができる。化合物■で示される
二量体のＲ１が保護基を有するリン酸基である場合は、
キラリティーを有するリン原子が２個となり、４個のジ
アステレオマーが生成して立体異性体の分離が困難とな
るので、几３は３′−末端水酸基が遊離の二量体（反応
式〔Ｉ〕の化合物■）に誘導できる保護基、すなわちＸ
、Ｒ１，Ｒ＋”の保護基とは別異であり選択的に除去が
可能であるか、またはＲ１の保護基と同一の条件で除去
できる保護基であることが望ましい。後者の場合は３′
、ダー両末端水酸基を遊離の形にしたのち、ダー末端水
酸基のみを再保護することにより化合物■で示される二
量体とする。化合物■は３′−末端水酸基をリン酸化す
ることにより二量体（反応式（Ｉ）の化合物■）とする
。化合物■はＲ８が保護基を有するリン酸基である化合
物■からも誘導でき、この際化合物■の３′−末端リン
酸基のキラリティーが消失してジアステレオマーが２個
となるので、シリカゲルあるいは逆相シリカゲルクロマ
トグラフィーにより８体と８体に分離できる。

反応式ＣＩ） ■　　　　　　■　　　　　　　　■ ■　　　　　　　　　■ （反応式ＣＩＩにおいて、Ｂは保護基を有することもめ
る塩基残基を、部は水素原子またはトリチル基、モノメ
トキシトリチル基、ジメトキシトリチル基などの保護基
を、凡２は水素原子または保護基を有することもある水
酸基を、ＲｊはＸ％Ｒ１およびＲ２の保護基とは別異で
あり選択的に除去できる保護基、または部の保護基と同
じ条件で除去できる保護基、または保護基を有するリン
、　　酸基を、几４はリン酸保護基を示し、几およびＸ
は前記と同一である。） 次に、化合物■で示される単量体のホスホン酸をリン酸
保護基Ｂｓで保護した単量体（反応式〔■〕の化合物■
）としたのち、酸性条件下で化合物■の部の保護基を除
去し、５′−水酸基が遊離である単量体（反応式〔■〕
の化合物■）こ誘導し、次いで化合物■で示てれる単量
体と化合物■で示される単量体を縮合剤の存在下に反応
させて二量体（反応式［■〕の化合物［相］）とする。

なお、この化合物［相］は化合物■で足場れる二量体の
ホスホン酸化によっても得られる。

反応式ＣＩ［） ■　　　　　　　　　　　　　　■ Ｏ■ （反応式〔■〕において、几ＳはＲ４、！：　Ｍ　−ま
たは異なるリン酸保護基を示し、Ｂ、Ｘ。

ＲｌＷおよびＲ２は前記と同一である。）ＤＮＡおよび
ＲＮＡはそれぞれ４種類のヌクレオシドからなり、化合
物■、化合物■または化合物Ｏで示される１６種類の二
量体を予め調製しておくことにより、いかなる塩基配列
の４リヌクレオチドの合成も可能である。これらの二量
体は固相あるいは液相法（Ｎｕｃｌｅｉｃ　ＡｃＩｄｓ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ　、第１１巻、第５１８９頁および第
６２２５頁（１９８３年）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
　、第２０巻、第１８７４頁（１９８１年）〕で希望す
る塩基配列のポリ４クレオチドの合成に用いられ、また
化合物■は変型ホスファイト法〔Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏ
ｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　、第２４巻、第１０１９頁（１９
８３年〕〕ヲ利用することによって３′−末端水酸基が
遊離のままで４リヌクレオチドの合成に用いることがで
きる。ポリヌクレオチド中に含まれるホスホン酸結合の
個数は、ポリヌクレオチドの鎖長、検出感度、ハイブリ
ッド栄件等に合わせて自由に選択することができる。化
合物■で示される単量体または化合物［相］で示される
二量体を原料として用いた場合は、立体化学の統一をは
かることは困難であるが、全てのリン酸結合をホスホン
酸結合に代えたポリヌクレオチドを得ることができる。

しかし精製の容易さを考慮すると化合物［相］を使うほ
うが好ましい。標的遺伝子とのハイブリッド形成に影響
を及ぼさない限９１ツノ原子のキラリティーは統一され
なくともよいが、立体化学的に統−嘔れた　。

ポリヌクレオチドの合成は８体と８体に分離した化合物
■あるいは化合物■で示される二量体のいずれか一方の
ジアステレオマーを原料として用いることにより達成で
きる。二量体−二量体間のリン酸結合は完全脱保護後ジ
エステルとなり、そのキラリティーが消失するのでこの
問題は解消される。この場合ホスホン酸結合は最大限１
個置きに導入されることになる（　Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ
　Ｂｌｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　、　！
２５５巻、第９６５９頁（１９８０年）、Ｂｉｏｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ　、　第２１巻、第２５０７頁（１９８２
年）〕。

また、反応式ＣＩ）および反応式ＣＩ［］で示された二
社体あるいはポリヌクレオチドは、反応式Ｃｌ　）　−
（１）の如きホスファイト中間体からのアープシフ反応
を経る方法、あるいは反応式ＣＩ　）　−（２）の如き
アルキルジクロロホスホンをホスホン酸化剤としてホス
ファイト法の手法を利用する方法でも合成可能であるが
、前者はアープシフ反応の際分解する可能性があるので
、後者の方が望ましい。

反応式（ｆｆ［） ルーＸ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ル
ーＸ（反応式ＣＩ）において、Ｌは脱離基を、Ｙはハロ
ゲン原子を、ｚはハロゲン原子、二級アミンまたはアゾ
ール類を示し％ＢＩＸ、Ｒ，Ｒ１および几２は前記と同
一でろる。） 上記の方法により得られたホスホン酸結合を含有し特定
の塩基配列を有するポリヌクレオチドの全ての保護基を
通常の脱保護操作により除去し精製したのち、標的遺伝
子とのハイブリッド形成の前あるいは後に、ポリヌクレ
オチド中のホスホン酸結合の官能基と特異的に反応する
共有結合性酵素標識化合物を反応式せて酵素標識化する
。この反応はきわめて容易に進行し、ポリヌクレオチド
と酵素標識化合物を室温または室温以下において温合、
攪拌することにより　　　　′酵素標識化は容易に完了
する。

なお、本発明におけるポリヌクレオチドとは、少なくと
も１個のホスホン酸結合を有する２個以上の単量体より
なり、ぼりヌクレオチドの鎖長やその塩基配列は限定さ
れることなく、目的に応じて自由に選択できる。

実施例１ 〔アルカリホスファターゼ標識化合物の調製〕アルカリ
ホスファターゼ１０ｍｇｔ−０，１ｍｏｌリン酸ナトジ
ナトリウム緩衝液７．ｏ）１ｍに溶解し、これにジオキ
サン０．１　ｍに溶解したＮ−（４−カルゼキシシクロ
ヘキシルメチル）マレイミドのＮ−ヒドロキシサクシン
イミドエステル１．５ｍｇを、５分間隔で５回に分けて
加え、３０℃で反応させる。反応液をセファデックスＧ
−２５カラムを用い、Ｉｍｍｏｌエチレンジアミン四酢
酸を含むＱ、ｌ　ｍｏｌリン酸ナトナトリウム緩衝液ｐ
Ｈ７，０）で溶出したアルカリホスファターゼ活性部分
上冷時濃縮して、アルカリホスファターゼ標識化合物を
得る。

〔１０量体の合成〕 臭化２−Ｎ−ベンゾイルエチルとトリス（トリメチルシ
リル）ホスファイトのアープシフ反応により得られる２
−Ｎ−ベンゾイルエチルホスホン酸２リジン塩４０　ｍ
　ｍｏｆおよびダー〇−ジメトキシトリチルチミジン２
０ｍｍｏｌを、ダウエックスピリジニウムレジ７０．５
　ｇとジシクロへキシルカルゼジイミド２００ｍｍｏｌ
の存在下に、１００ｄのピリジン中で３７℃、３日間反
応させたのち、シアンエタノール１００ｍｌを加え、さ
らに２日間反応する。反応終了後、含水ぜリジン２００
Ｍを加え、ジシクロへキシルウレアを濾別し、濾液を濃
縮する。残渣ｔ−２５０４のクロロホルムに溶解し、シ
リカゲルクロマト（溶出液：メタノール−クロロホルム
）で精製したのち、ベヤサン中に滴下して粉末化する。

次いでアセトニトリル中でトリエチルアミンで処理して
シアノエチル基を除去し、グー０−ジメトキシトリチル
チミジル−３’　−０−（２−Ｎ−ベンゾイルエチル）
ホスホネートトリエチルアンモニウム塩を得る。

次に、コハク酸を介してチミジ／を担持（１００Ａｍｏ
１以下／ｇ・樹脂）したポリスチレン樹脂（１チクロス
リンクド）ｔｏｏｍｇｔ−用い、５’−０−ジメトキシ
トリチルチミジル−３′−０−（２−Ｎ−ベンゾイルエ
チル）ホスホネートトリエチルアンモニウム塩を、Ｎｕ
ｃｌｅｌｃＡｃｉｄｓ　Ｒｅ５ａａｒｃｈ　、第１１巻
、第６２２５頁（１９８３年）に記載された方法に従い
順次に９回縮合させて１０１Ｌ一体を合成した。ポリス
チレンｍ脂ｔ１ｏｒｔｔｔのエチレンジアミン−エタノ
ール（１：１）と１０時間振とり段、濾別し、濾液ｔ−
ａ縮して逆相（Ｃｔａ　）シリカゲルクロマト（水−ア
セトニトリル直線濃度勾配）で精製し、８０％酢酸で処
理して５′−末端の保護基を除去したのち、一部を再び
逆相（Ｃｓａ）シリカゲルクロマトで精製し、アミノエ
チルホスホン酸結合をもつ１０量体１００Ｄ　（２６０
ｎｍ　）を得た。

〔１０を体のアルカリホスファターゼ標識化〕この１０
量体５０Ｄ　ｔ−０，５ｍｏｌホウ酸ナトナトリウム緩
衝液ｐＨｓ、　ｓ　）　３．　ｅ−およびアセトニトリ
／ｌ／　１．　ＯＷＬｔに溶解し、これに前記のアルカ
リホスファターゼ標識化合物を混合して、４℃で５時間
反応させる。反応液をセファローズ６Ｂカ２ムを用い、
Ｑ、１　ｍ　ｍｏ＋塩ｏ≠Ｑ、ｌ　ｍｏ！塩化ナトジナ
トリウム１ｍｏｌリン酸緩衝液（ｐＨ７，Ｏ）で溶出し
て、核酸部分の紫外吸収とアルカリホスファターゼ活性
を有するフラクションを得た。

特許出願人　有機合成薬品工業株式会社手続補正書 昭和５９年１０月３１日 昭和５９年特許願第１７８９１７号 ゛２０発明の名称 ポリデオキシリボヌクレオチドまたは ポリリボヌクレオチドの酵素標識化方法３、補正をする
者 事件との関係　特許出願人 東京都中央区京橋二丁目１７番４号 有機合成薬品工業株式会社 代表者　玉　重　雅　雄 ４、代理人 ５、補正の対象 ６、補正の内容 （１）明細書第１１頁第８行のｒ　Ｖｅｇｌｓ　Ｊを１
ｉ’ｗｅｙｌｓＪｌに訂正する。

（２）同書同頁第１０行のｒＶｅｒｌｏｇＪをＷＶｅｒ
ｌａｇＪｌに訂正する。

（３）同書第２３頁第１３行のｒｌｏ　　ＯＤＪを「１
０　　立且」に訂正する。

（４）同書、同頁第１６行の「５　ｏＤ」をｒ５　立旦
」に訂正する。

以上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、リン酸結合の少なくとも１個以上が式〔 I 〕▲数
   式、化学式、表等があります▼〔 I 〕 （式中、Ｒは炭素数１ないし２０の分枝 鎖を有することもある脂肪族炭化水素ま たは芳香族炭化水素を、Ｘは保護基を有 することもある官能基を示す。） で表わされる官能基を有するホスホン酸結合であるポリ
   デオキシリボヌクレオチドまたはポリリボヌクレオチド
   のホスホン酸結合の官能基に共有結合性酵素標識化合物
   を反応させることを特徴とするポリデオキシリボヌクレ
   オチドまたはポリリボヌクレオチドの酵素標識化方法。 ２、保護基を有することもある官能基Ｘが、チオール基
   またはアミノ基である特許請求の範囲第１項記載の酵素
   標識化方法。