JPH0355789B2

JPH0355789B2 -

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Publication number: JPH0355789B2
Application number: JP1211230A
Authority: JP
Priority date: 1978-02-27
Filing date: 1989-08-16
Publication date: 1991-08-26
Also published as: JPH02111374A; CA1095477A; GB2014879A; GB2014879B; JPH0225149B2; US4190535A; JPS54126718A

Description

【発明の詳細な説明】

（産業上の利用分野）本発明は抗凝固処理された血液から血小板、リ
ンパ球および単核大白血球を分離する方法に関す
るものである。（従来の技術）人間の血液から白血球、特にリンパ球の分離
は、組織適合性測定、特に器官移植を要する患者
の組織適合性測定にとつて臨床上必要である。免
疫閉止に必要な薬物治療のタイプおよびレベルが
問題となる場合にリンパ球作用の測定が必要とさ
れる。通常の刺絡技術によつて採取された抗凝固処理
された人間の血液からリンパ球および単核大白血
球を分離するのに現在行なわれている方法は、一
般にはフイコールパキユー（Ficoll−Paque、
登録商標）である特殊なニユートン流動体による
血球の遠心分離を利用したものである。このフイ
コールパキユーは1.077ｇ／c.c.の比重を有する
流動体であり、フアルマチアフアインケミカル
社（Pharmacia Fine Chemicals AB、
Uppsala、Sweden）から市販されている。この
方法は下記の４つの基本的な工程からなる。 (1) あらかじめ決められた量のフイコールパキ
ユーを試験管の底に設置する工程、 (2) そのままのあるいは希釈した血液試料を注意
深くフイコールパキユー上にピペツトで移す
工程、 (3) フイコールパキユーの比重（1.077）より
も大きな比重を有する血液成分が、フイコール
パキユー中に進むあるいはフイコールパキ
ユーを通過するように、フイコールパキユー
血液調製物を400乃至500Gで約30乃至40分間遠
心分離する工程、および (4) ピペツトで白血球（主としてリンパ球）をフ
イコールパキユー相から分離し取り出す工
程。上記現在行なわれている方法はいくつかの次点
を有している。まず第１に、最初血液試料をフイ
コールパキユー上にピペツトで移す時、白血球
がもしフイコールパキユー媒体の表面より下に
広がつた場合には、フイコールパキユーの比重
が局部的に減少し、この減少した比重はリンパ球
および単核大白血球を分離するのには不適当であ
る。第２に、遠心分離の間に血液中のより軽い相
がフイコールパキユー媒体中に取り込まれた場
合、400乃至500Gによつて生じる浮力は小さいの
で取り込まれた相はフイコールパキユーを通つ
て上昇することができない。第３に、フイコール
パキユーは水溶性であり、より大きな遠心分離
速度は血液中でフイコールパキユーの溶解度を
増加させ、このためにフイコールパキユーの比
重が変化するので、約400乃至500Gよりも大きな
遠心力を使用することができない。第４に、遠心
分離が終つた後、ピペツトによるフイコールパ
キユー媒体からの白血球の分離は、フイコール
パキユー媒体がニユートン特性を有しているので
非常に注意深く行なわれなければならない。第５
に、この方法を行なうのには１乃至２時間を要
し、従つてより迅速な方法が強く望まれている。人間の血液試料中の血小板の数の測定は、凝血
における欠陥を知るのに臨床上重要である。他の
血液成分、特に赤血球および白血球からの血小板
の分離は、この血小板の数の測定を非常に迅速に
行なうことを可能にする。さらに、あるタイプの
血友病においては、血小板の欠乏は激しい出血の
原因となる。この問題をなくすために考えられて
いる手法の１つは、血小板濃度の高い血漿を出血
個所に与えて凝血を促進させることである。血小板を分離するのに現在行なわれている方法
は、抗凝固処理された採血管中に血液を採取し、
その後遠心分離を行なうことからなる。ほとんど
の赤血球および白血球は管の底に沈澱し、血小板
が懸濁した血漿が上層中に残留する。その後血小
板を含有する血漿は赤血球と混ざるのを避けるた
めにピペツトによつて注意深く取り出される。上述から明らかなように、現行の方法は血漿成
分を注意深くピペツトで取り出すという非常に退
屈な操作を必要とするが、さらに重要なことは、
この方法はもともと赤血球および白血球から血小
板を完全には分離し得ないものであることであ
る。ある臨床上の測定においては、血小板の存在は
リンパ球あるいは単核大白血球の作用を不明瞭に
するので、リンパ球および単核大白血球から血小
板を分離することが極めて重要になる。米国特許第3852194号には、分離される２つの
相の中間の比重を有する揺変性ゲル状物質を用い
て、血液試料中に存在するより重たい相をより軽
い相から分離する方法が開示されている。ゲル状
物質は血液試料とともに遠心分離される。この遠
心分離操作の間にゲル状物質は流動して分離され
る２つの相の間に障壁を形成する。この障壁はそ
の上に存在する相の容易な、かつほぼ完全な除去
を可能にする。この特許には上記方法に使用される種々のゲル
状物質、すなわちグリースが述べられている。こ
れらの物質に必須の属性として、以下の３つの基
準が述べられている。 (1) 分離される２つの相の中間の比重を有するこ
と。1.035乃至1.06ｇ／c.c.、好ましくは1.04乃至
1.055ｇ／c.c.の比重を有する物質が有効である。 (2) 分離される２つの相と化学反応を起さないこ
と。 (3) 静止状態において非流動性（半剛体）である
こと。この特許には、リンパ球および単核大白血球の
分離に関しては何も開示されておらず、また少な
くとも1200G、好ましくは1400G以上の遠心力を
使用する分離方法に関しても何も開示されていな
い。上記のような大きな遠心力は、リンパ球およ
び単核大白血球をゲル状物質−血漿界面に浮き上
がらせるのに充分な浮力を生ぜしめるのに必要と
される。米国特許第3920549号には、上記米国特許
3852194号の発明の変形および改良が述べられて
いる。上記米国特許第3852194号の発明について
改良がなされた点は、「エナージヤイザー」
（energizer）と称せられる固体成分を採血管に挿
入して使用することである。このエナージヤイザ
ーはゲル状物質よりも大きな比重を有している。
遠心分離操作の間に、エナージヤイザーがゲル状
物質（通常採血管の底に置かれる）に衝撃を与
え、これによつてそゲル状物質が採血管の壁にそ
つて上方に移動するのを容易にする。エナージヤ
イザーを含ませることは、各血液成分の分離を促
進させ、各血液成分のより明確な分離を可能にす
る。この特許には比較的大きな遠心力（1100G）の
使用が述べられているが、他の血液成分からリン
パ球および単核大白血球を分離することについて
は何も述べられていない。ここでもまた使用され
るゲル状物質の比重は1.035乃至1.06ｇ／c.c.、好
ましくは1.04乃至1.055ｇ／c.c.の範囲にあること
が述べられている。米国特許第3963119号には、密閉剤を採血管中
に設置するための装置が述べられている。この特
許で述べられている密閉剤は、上記米国特許第
3852194号および第3920549号で述べられているゲ
ル状物質で同じタイプのものであり、同じ働きを
するものである。この特許には1.026乃至1.092ｇ／c.c.の比重を有
する密閉剤が述べられているが、好ましい範囲は
1.030乃至1.050ｇ／c.c.であることが述べられてい
る。他の血液成分からのリンパ球および単核大白
血球の分離に関しては何も述べられておらず、ま
た大きな遠心力、すなわち少なくとも1200Gの遠
心力が有効であることも指摘されていない。（発明の構成）本発明は抗凝固性血液からリンパ球と単核大白
血球を、さらには付随的に血小板を分離する方法
に関するものであり、本発明の方法によれば上述
のフイコールパキユーを使用する方法よりも著
しく迅速に該分離を行なうことができる。ツツカ
一氏およびカーセン氏はリンパ球は赤血球および
顆粒白血球よりも小さい比重を有していると報告
している（Blood、34：591、1969）。単核大白血
球はリンパ球とほぼ同じ比重を有しており、血液
中にリンパ球の数の約25％以下の量存在してい
る。血小板は約1.025乃至1.03ｇ／c.c.の比重を有
している。

【表】分布の標
準偏差 0.0031 0.0054 0.0025
一般には本発明の方法は (1) 血液成分に対して化学的に不活性であり、血
小板、リンパ球および単核大白血球よりは大き
いが血液のその他の血球成分よりも小さな比重
を有する不水溶性揺変性ゲル状物質、すなわち
グリースを血液試料中に入れ、 (2) ゲル状物質−血液試料を大きな相対遠心力、
すなわち少なくとも1200G、好ましくは1400G
以上の遠心力で、ゲル状物質が重たい血球と軽
い血球の間に障壁を形成するのに充分な時間の
間遠心分離し、その後 (3) 上記分離工程の間にゲル状物質を通り抜けて
上方に移動した血液の血漿成分、血小板、リン
パ球および単核大白血球を除去することからなる。その後血球の数の測定が行なわれ
る。ゲル状物質、すなわちグリースの組成は、以下
のような基準が満たされる限り重要な要因ではな
い。 (a) ゲル状物質は約1.065乃至1.077ｇ／c.c.の比重
を有していなければならない。 (b) ゲル状物質は血液中に存在する成分に関して
化学的に不活性でなければならない。 (c) 遠心分離の後血小板、リンパ球および単核大
白血球が障壁中に浸透するのを最小にするため
に、ゲル状物質は揺変性でなければならない。
すなわち、ゲル状物質は１より大きく10以下の
揺変指数を有していなければならない。 (d) ゲル状物質は、約1200乃至2500Gの遠心力を
受けた時に流動し、これによつて血小板、リン
パ球および単核大白血球と重たい血球との間に
望みの障壁を形成するのに充分な粘度を示すも
のでなければならない。本発明の方法は従来の開口採血管および閉口採
血管のいずれによつても行なうことができる。開
口採血管が使用される場合には、ゲル状物質は一
般に遠心分離操作の直前に管の中に入れられる。
ゲル状物質はしばしば管の内壁の血液試料の水平
面よりも高い位置に置かれる。閉口採血管が使用
される場合には、ゲル状物質はゴム栓あるいはそ
の他の通常の手段によつて管が閉口される前に、
管内のいかなる場所に置かれてもよい。一般に、
ガラスあるいはプラスチツク製の採血管が使用さ
れる。リンパ球および単核大白血球からの血小板の分
離が望まれる場合に、血小板、リンパ球および単
核大白血球を含む血漿成分が、先に述べた本発明
の方法によつて処理される。しかしながらこの場
合には、1.055ｇ／c.c.以下、一般には1.03乃至
1.055ｇ／c.c.の比重を有する不水溶性揺変性物質
が使用されなければならない。勿論、すべての赤
血球および白血球からの血小板の単一分離が望ま
れる場合には、1.055ｇ／c.c.以下の比重を有する
ゲル状物質が使用されなければならないことは明
白である。（実施例）本発明を以下の実施例に基づいてさらに詳細に
説明する。本発明の方法のこのましい具体例を説明する以
下の実施例において、使用されるゲル状物質、す
なわちグリースはシリコン流動体と非常に細かい
疎水性のシリカ粉末との混合物からなる。用いら
れたシリコン流動体はダウコーニング社
（Dow Corning Corporation、Midland、
Michigan）によつて製造され、ダウコーニン
グ社社報CPO−1072およびCPO−158−１（Dow
Corning Bulletins CPO−1072、March、1972
and CPO−158−１、March、1972）に記載され
ているジメチルポリシロキサン流動体であるダウ
コーニング200流動体（Dow Corning 200
Fluid）である。キヤボツト社（Cabot
Corporation、Boston、Massachusetts）によつ
て製造され、キヤボツト社パンフレツトSGEN−
１に記載されているシラノツクス101（Silanox
101、登録商標）がシリカ粉末として用いられた。
この物質は熱分解法シリカの表面にトリメチル基
を結合させて疎水性を付与したものである。しか
しながら、先に説明したように、ゲル状物質に必
要な特性基準を満たすものであるならば非シリコ
ン揺変性ゲル状物質もまた同様に使用することが
できる。人間の血液を採取し、充分なEDTA抗凝固剤
が入つた７mlガラス採血管中に入れた。約1.5ml
のシリコン流動体−疎水性シリカ粉末ゲル状物質
の塊りを上記血液試料が入つた管の内壁上に置い
た。第１図は血液試料が入つた採血管の説明図であ
る。血液試料３が採取された後、開口採血管１の
内壁の上端（開口端）にゲル状物質の塊り２が置
かれた。血液試料は平衡状態に到達するまで約1800Gで
遠心分離された。一般に平衡状態に到達するのに
約５乃至10分間を要した。第２図は遠心分離操作
における平衡状態に到達する前のゲル状物質−血
液試料混合物を示すものである。ゲル状物質の塊
り２は管１の下方へ移動し、血液試料３の重たい
成分と軽い成分は互いに分離し始めている。第３
図は遠心分離が平衡状態に到達した時の状態を示
す説明図である。第３図から明らかなように、ゲ
ル状物質の塊り２は血液試料の重たい成分および
軽い成分を互いに分離している。血液の血漿成分
４と血小板、リンパ球および単核大白血球５はゲ
ル状物質の障壁２の上に存在し、一方顆粒白血球
６および赤血球７はその他の重たい成分と共に障
壁２の下に保持されている。次に血漿成分４を除去した。この血漿成分４の
除去は血小板、リンパ球および単核大白血球５を
乱さないように注意深く行なわれた。第４図はピ
ペツト８によつて血漿成分４を除去し、障壁２上
に血小板、リンパ球および単核大白血球５を残す
様子を示すものである。その後のCa⁺²、Mg²⁺遊離塩等張緩衝溶液９を
静かに管１のゲル状物質の障壁２上に注いだ（第
５図）。その後管１を静かに揺り動かすかあるいは攪拌
してゲル状物質の障壁２上に静止していた血小
板、リンパ球および単核大白血球５を緩衝溶液９
中に懸濁させ、この懸濁液を管１から除去した。
第６図はデカンテーシヨンによつて懸濁液をゲル
状物質の障壁２から除去する様子を示すものであ
る。なお、ここで、上記緩衝溶液の使用は必須では
なく、上記障壁形成後、障壁をこわさないように
管を攪拌して血漿中に血小板、リンパ球および単
核大白血球を再懸濁させ、この懸濁液をピペツト
でゲル状物質の障壁から除去するようにしてもよ
い。他の血小板、リンパ球および単核白血球分離方
法の場合と同様に、回収された血球は緩衝溶液で
洗浄され、その後数が測定された血球は種々の生
物学的薬効試験に利用された。比重および揺変指数が異なる３種類のシリコン
流動体−SiO₂粉末混合物を用いて得た実験結果
を下表に示す。

【表】第３図に示される血球の分布の正当性が上記デ
ータによつて確かめられる。いずれの場合におい
ても、元の血液試料に比較して好中球（主な顆粒
白血球）の比率は著しく減少したがリンパ球の比
率は著しく増加した。単核大白血球の比率もまた
増加したが、増加の程度はリンパ球よりもいくぶ
ん低かつた。トリパン青染料を使用して測定され
た血球生存能力は95％以上であつた。このような
データは本発明の血液試料からリンパ球を分離す
る方法が実用性を有するものであることを明白に
示している。上記実験は開口採血管を用いて行なわれたが、
閉口採血管を用いても同様に行なうことができ
る。閉口採血管が用いられる場合には、血液試料
は揺変性ゲル状物質と充分な量のEDTAのよう
な抗凝固剤が入つた採血管中に採取される。採取
された血液試料はその後遠心分離され、血漿が取
り除かれ、そしてリンパ球と単核大白血球が回収
される。先に述べたように、非シリコン揺変形ゲル状物
質も使用することができる。例えば、アモコケ
ミカル社（Amoco Chemicals Corporation、
Chicago、Illinois）から市販されており、同社の
社報12−Ｈに主成分が高分子量モノオレフイン
（85％−98％であり、残成分がイソパラフインで
あるブチレン重合体であると記載されている炭化
水素ゲル状物質ポリブデンＨ−100に、デグツサ
社（Degussa、Inc.、Pigments Division、New
York、New York）から市販されている熱分解
法シリカ粉末アエロシルOX50（AEROSIL
OX50）を混合してなるゲル状物質を使用した場
合には、上述のシリコン物質の場合と同様の結果
が得られる。炭化水素重合体が用いられる場合に
は、充填物質を疎水性にする必要はない。ポリブデンＨ−100 100ｇとOX50シリカ充填
剤39.42ｇとの混合物は、比重が1.0672ｇ／c.c.で
あり、揺変指数が2.77であつた。有用な炭化水素ゲル状物質の別な例として、ア
ルコケミカル社（ARCO Chemical
Company、New York、New York）から市販
されており、同社の社報1976年４月号に重合度が
約50のヒドロキシル末端基を有するブタジエンの
ホモポリマーとして記載されているポリ bd Ｒ
−45HS（Poly bd Ｒ−45HT、登録商標）が挙げ
られる。この重合体についてもまた非疎水性充填
物質を使用することができる。上記ポリ bd Ｒ−45HT 100ｇとOX50シリカ
充填剤34.33ｇとからなる混合物は、比重が1.065
ｇ／c.c.であり、揺変指数が1.25であつた。これらの炭化水素重合体−シリカ混合物は、本
発明の方法に使用されるゲル状物質に要求される
上述の特性基準を満たすものである。すなわち、
これらの炭化水素重合体−シリカ混合物は、 (a) 約1.065乃至1.077ｇ／c.c.の比重を有し、 (b) 血液成分に対して化学的に不活性であり、 (c) １より大きく10以下の揺変指数を有してお
り、また (d) 2000G以下の遠心力で流動し、血小板、リン
パ球および単核大白血球と重たい血球との間に
望みの障壁を形成するのに充分な粘度を有して
いる。上記米国特許第3852194号には1.055ｇ／c.c.より
小さい比重を有するいくつかのゲル状物質が述べ
られているが、それらのゲル状物質はリンパ球お
よび単核大白血球（ならびに血液中のその他赤血
球および白血球）から血小板を分離するための方
法に有効であろう。上記特許に述べられている物
質はシリコン流動体と疎水性シリカ粉末との混合
物である。勿論、望みの比重を示す炭化水素重合
体−シリカゲル状混合物を配合することも可能
である。血小板を分離する方法の有効性を説明するため
に、人間の血液を採取し、血液の凝固を防止する
のに充分な量のEDTAが入つた７mlガラス採血
管中に入れた。1.040ｇ／c.c.の比重を有するシリ
コン流動体−疎水性シリカ粉末ゲル状物質の塊り
1.5mlを管の内壁の血液試料水平面よりも上方に
置いた。次にこの血液試料を約1200Gで約５分間
遠心分離した。この遠心分離によつてゲル状物質
の塊りは血小板を含有する血漿と赤血球および白
血球とを分離する障壁を形成した。その後血小板
を含む血漿成分をゲル状物質の障壁からピペツト
で除去した。上記処理を行なつていない血液を上記処理によ
つて得た血小板を含む血漿を使用してスライドを
作製した。いずれのスライドも血小板の数は約
200000であり、血漿の顕微鏡試験の結果赤血球お
よび白血球はほとんど混つていなかつた。上記血小板を分離する実施例において、血液の
かわりに、血小板、リンパ球および単核白血球を
含む血液の血漿試料を用いて同様の処理操作を行
なうこともできる。この場合、ゲル状物質は遠心
分離後、血漿および血小板と、リンパ球および単
核大白血球との間に障壁を形成し、よつて血漿お
よび血小板をリンパ球および単核大白血球から分
離することができる。この分離は、障壁形成後、
血小板が血漿中に再懸濁するように管を攪拌し、
その懸濁液をピペツトで吸引するか、または攪拌
せずに血漿をピペツトで障壁上の血小板を乱さな
いように注意深く除去し、緩衝溶液を加えて血小
板をゲル状物質の障壁表面から遊離させ、その血
小板を含んだ緩衝溶液を吸引して除去することに
より行なう。

【図面の簡単な説明】

第１図乃至第６図は本発明の方法の好ましい具
体例の概略説明図である。第１図は血液試料とゲ
ル状物質を含む開口採血管を示すものである。第
２図は遠心分離の間のゲル状物質−血液試料混合
物を示すものであり、ゲル状物質が元の位置から
血液試料中に移動しているのを示している。第３
図は遠心分離の間に平衡状態に達したゲル状物質
−血液試料混合物を示すものであり、流動したゲ
ル状物質が血小板、リンパ球、単核大白血球およ
び血漿成分とその他の重たい血液成分との間に障
壁を形成していることを示している。第４図は血
漿成分の除去を示すものである。第５図は緩衝溶
液の添加を示すものである。第６図はリンパ球が
緩衝溶液に懸濁した懸濁液のデカンテーシヨンを
示すものである。１……採血管、２……ゲル状物質、３……血液
試料、４……血漿成分、５……血小板、リンパ球
および単核大白血球。

Claims

【特許請求の範囲】１ (a) 血液成分に対して化学的に不活性であ
り、1.065乃至1.077ｇ／c.c.の比重を有する不水
溶性揺変性ゲル状物質を抗凝固処理された血液
試料中に入れ、 (b) 上記ゲル状物質と上記血液試料とを、少なく
とも1200Gの力で、上記ゲル状物質が血漿、血
小板、リンパ球および単核大白血球とより重た
い血球との間に障壁を形成するのに充分な時間
の間遠心分離し、その後 (c) 上記血漿、上記血小板、上記リンパ球および
上記単核大白血球を上記障壁上から除去するこ
とからなる抗凝固処理された血液から血小板、
リンパ球および単核大白血球を分離する方法。２上記ゲル状物質がシリコン流動体と疎水性シ
リカ粉末との混合物からなることを特徴とする特
許請求の範囲第１項記載の分離方法。３上記ゲル状物質が炭化水素重合体とシリカ粉
末との混合物からなることを特徴とする特許請求
の範囲第１項記載の分離方法。４上記炭化水素重合体が、主成分が高分子量モ
ノオレフインであり、残成分がイソパラフインで
あるブチレン重合体と、重合度が約50のヒドロキ
シル末端基を有するブタジエンのホモポリマーと
からなる群より選ばれることを特徴とする特許請
求の範囲第３項記載の分離方法。５上記ゲル状物質が１より大きく10以下の揺変
指数を有していることを特徴とする特許請求の範
囲第１項記載の分離方法。６上記遠心分離が1200乃至2500Gの力で行なわ
れることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載
の分離方法。７上記遠心分離が約５乃至10分間行なわれるこ
とを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の分離
方法。