JPH0358280B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、特異的ビリルビン減成活性を有する
酵素製剤の分析組成物、要素及び方法への使用に
関する。この酵素は、キク科（Compositae
family）植物、例えば朝鮮あざみ（artichokes）
から単離される。

〔従来の技術〕

ビリルビンは、ヘモグロビンの減成の結果とし
て血液中で形成される黄色物質であり、肝臓中で
産生される胆汁の主要色素である。約200〜230ミ
リグラムのビリルビン及びその誘導体は健全な成
人においては、肝臓、脾臓及び骨髄内のヘモグロ
ビンの減成によつて毎日形成される。

ビリルビンの診断上の意義は、充分に確立され
ている。例えば、種々の病状、特に肝臓の病気の
証拠として、人体内に過剰量のビリルビンの存在
（黄疸と言われる）が認められる。更に、肝臓が
徐々に正常に機能し始める新生児には、しばしば
黄疸が起こる。従つて、ある症状の早期診断を容
易にするか、又はビリルビン濃度を有効に減少す
るためには、ビリルビン特異性酵素が極めて有用
である。

ビリルビンに対して特異性であることが示され
た酵素は、米国特許第4211844号明細書に記載さ
れているように、菌類から一部分精製され、特性
決定された。しかしながら、このような起源、特
に、この特許に記載されたマツシユルームから得
られた酵素は、ビリルビンに対して比較的穏和な
特異性を有する。粗製の状態で使用する場合、酵
素製剤は比較的に低い特異的活性を有し、従つて
所望の分析結果を生じるのに一層多量の酵素を必
要とする。

〔発明が解決しようとする問題点〕

従つて、ビリルビンの減成に対して特異的で、
改良されたビリルビン分析に適当な高活性酵素製
剤を得、これによつて分析にあたつて過剰量の酵
素の使用を回避することが望まれている。

〔問題を解決するための手段〕

前記の問題点は、キク科植物から単離され、下
記の(a)〜(e)の物理化学的性質、すなわち、 (a) ビリルビン〔複合形又は非複合形
（conjugated or unconjugated form）〕と特異
的に反応し、色の変化を起こす活性、 (b) 1.5×10^-5モルのビリルビンに対するKm、 (c) ７〜10の有用なPH範囲での活性、 (d) 37℃で燐酸塩緩衝液中で測定して7.4の最適
PH、及び (e) 複合及び非複合形について20〜50℃の有用な
温度範囲での活性 を有するビリルビン−特異性酵素を用いて克服さ
れた。

水性液体中のビリルビン以外の被分析物を測定
する分析用組成物は、該被分析物に対する反応性
組成物及び前記のビリルビン−特異性酵素を含
む。

被分析物を測定する分析要素は、前記のビリル
ビン−特異性酵素を含む。

水性液体中のビリルビンの減成方法は、液体を
前記のビリルビン−特異性酵素と接触させること
を含む。

水性液体中のビリルビンの測定方法は、 () ビリルビンを含むと思われる液体を前記の
ビリルビン−特異性酵素と接触させ、ビリルビ
ンを酵素と反応させて検出可能な変化を生じさ
せ、そして () 工程（）で生じた変化を検出する工程を
含む。

妨害物質であるビリルビンを含む水性液体中の
ビリルビン以外の被分析物を測定する方法は、 () ビリルビン以外の被分析物を含むと思われ
る液体を該被分析物に対する反応性組成物と接
触させて検出可能な変化を生じさせ、 () 工程（）の前又はその間に該液体を前記
のビリルビン−特異性酵素と接触させ、これに
よりビリルビンを減成させ、工程（）で生じ
た検出可能な変化を妨害する能力を減少させ、
そして () 工程（）で生じた変化を検出する 工程を含む。

実施態様 本発明に有用なビリルビン−特異性酵素は、キ
ク科植物から抽出することができる。このような
植物は、例えば、朝鮮あざみ（Cynara spp.）、
ひまわり（Helianthus annuus）、カルドン
（Cynaracardunculus）、ちしや（Lactuca
sativa）、きくにがな（Cichorium intybus）及
び西洋たんぽぽ（Taraxacum officinale）であ
る。朝鮮あざみから抽出された酵素が最も好まし
い。文献に明らかなとおり、本発明の酵素製剤は
実質的に純粋な形又は粗製（すなわち、不純な）
形であつてもよい。

本明細書に記載する酵素は、任意の適当な抽出
方法によつて所望の植物から抽出することができ
る。２種のこのような方法が前記の米国特許第
4211844号明細書に詳細に記載されている。有用
な抽出法を下記の例１に記載する。

ビリルビンは、電磁スペクトルの440nｍで特
性吸収ピーク（λmax）を示す。酵素が適当なPH
及び温度条件下に液体中のビリルビンを減成する
と、λmaxでの吸光度（又は吸収濃度）は減少す
る。この濃度の減少は検出可能な変化であり、ビ
リルビンを含まない対照の液体に対して監視する
ことができる。この方法で、液体（例えば水性液
体）をビリルビンに関して分析することができ
る。

酵素の一つの用途は、生物学的液体、例えば全
血中にビリルビンが、例えば過剰量で存在する場
合に、該液体中のビリルビン（複合形又は未複合
形）を減成することである。これは、酵素を含む
フイルタ装置（患者に移植又は生体外）に液体を
通過させることによつて行うことができる。ビリ
ルビン−結合性物質、例えばアルブミン又は媒染
剤、例えば米国特許第4338095号明細書に記載さ
れているものを酵素と組み合わせて使用してビリ
ルビン又はビリルビン減成生成物を除去すること
ができる。

酵素の別の用途は、水性液体、例えば生物学的
液体（例えばヒト又は動物の全血、血漿、血清、
リンパ液、胆汁、尿、脊髄液、痰、汗等並びに糞
便排泄物）中のビリルビンの測定方法にある。

この分析方法は、 () ビリルビンを含むと思われる液体をビリル
ビン−特異性酵素と、その酵素に関して有効な
PH及び温度で接触させて、ビリルビンを減成さ
せ、ビリルビンの存在又は濃度に対応する検出
可能な変化を生じさせ、そして () ビリルビンの存在から生じる検出可能な変
化を検出する 工程を含む。

酵素の更に別の用途は、ビリルビン以外の被分
析物の分析においてビリルビン妨害を減少させる
ことである。このような分析は、通常、被分析仏
と相互作用したときに、ある種の検出可能な変化
（例えば比色計又はポテンシオメトリーの変化）
を生じる相互作用組成物を使用した分析組成物、
要素及び分析方法を用いて達成される。任意の適
当な反応性組成物を本発明の実施に使用すること
ができる。反応性組成物は、例えば、酵素−結合
NAD−NADH検出系、レドツクス反応、加水分
解反応及び他の、臨床化学分野で公知の反応を包
含する。

ビリルビン以外の比分析物の分析に有用な反応
性組成物は、問題の被分析物と物理的、電気的、
化学的又は他の反応により検出可能な変化、例え
ば被分析物の存在又は量に相関させうる吸光度の
移動又は吸収濃度の変化を生じることができる任
意の組成物であつてよい。

本発明のこの実施態様において、被分析物を含
むと思われ、ビリルビンが潜在的妨害物質である
液体を、該液体を反応性組成物と接触させる前又
はそれと同時にビリルビン−特異性酵素と接触さ
せる。ビリルビン−特異性酵素は、被分析物の測
定を妨害するビリルビンの能力を低減させる。本
発明に有用な酵素は、広い有用なPH及び温度範
囲、例えばそれぞれ７〜10及び20〜50℃でビリル
ビン（複合形又は未複合形）と反応性である。し
かし、この酵素は、7.5〜９のPH範囲及び25〜45
℃の温度範囲で特に反応性である。酵素は、37℃
の燐酸塩緩衝液中で測定して7.4の最適PHを有す
る（第２図参照）。

分析組成物中に酵素と共に緩衝剤を使用するこ
とは、必須ではないが、好ましい。緩衝剤は、ビ
リルビン減成に有効な有用PH範囲（すなわち７〜
10）内のPHを維持するために存在させる。燐酸
塩、例えば燐酸ナトリウム及びトリス（ヒドロキ
シメチル）アミノメタンは、特に適当である。し
かし、種々の他の公知緩衝剤が有用である。

本発明の実施に有用な酵素の量は、分析すべき
液体のビリルビン濃度に左右される。一般に、溶
液分析においては、酵素を0.01〜0.2mg／dlの範
囲、好ましくは0.02〜0.1mg／dlの範囲の量で使
用する。これから、酵素の１mgが、7.3のPH及び
37℃の温度の水性液体中で測定して、毎分当りビ
リルビン少なくとも0.02マイクロモルのビリルビ
ンに対する最低活性レベルを有するものと考えら
れる。それより高い活性の酵素を使用する場合に
は、それに比例して少量の酵素製剤を使用すれば
よい。

分析における妨害物質としてのビリルビンを除
去又は減少するためビリルビン−減成酵素を使用
する場合には、酵素は反応性組成物に関して非妨
害性でなければならない。例えば、過酸化水素検
出組成物を含む反応性組成物を使用して被分析物
を検出すべき場合には、自体が過酸化水素を生成
する酵素を使用することは明らかに適切ではな
い。過酸化水素を生成しないで、ビリルビンを減
成するため酵素製剤を使用することができるの
で、この特別の問題は回避される。

本発明方法によつて生じる検出可能な変化を広
範な種々の手段によつて検出することができる。
例えば、本発明方法は、吸収濃度の変化、螢光若
しくは放射性発光の変化又は特性λmaxの吸光度
の移動を検出しうる適当な検出装置を使用するこ
とができる。

本発明の酵素製剤及び方法は、溶液分析及び乾
式分析の両方に適用することができる。溶液分析
においては、分析を液体媒体中で全部実施し、本
発明の酵素製剤又は分析組成物を液体試薬として
使用する。このような場合には、酵素製剤又は分
析組成物を所望のPH及び温度の分析すべき液体と
混合する。この溶液分析法は下記の例２に更に詳
述する。

また、本発明方法を乾式分析要素を用いて実施
することができる。最も簡単な要素は、本発明の
酵素又は分析組成物を含む吸収性担体物質、すな
わち、自立性吸収性又は吸水性物質の薄いシー
ト、例えばロ紙又はストリツプを含んでいてよ
い。要素を担体物質の個々の帯域に異なる試薬を
混入した２個以上の別々の帯域に分割することが
できる。このような要素は試験ストリツプ、診断
要素、デイツプステイツク又は診断剤として公知
である。

有用な吸収性担体物質は不溶性であり、水又は
生理学的液体、例えば全血又は血清と接触させた
ときに、その構造上の一体性を維持するものであ
る。有用な要素は、紙、多孔性粒状構造体、多孔
性ポリマーフイルム、セルロース、ガラス繊維、
織布及び不織布（合成及び非合成）等から製造す
ることができる。このような要素を作製するため
有用な物質及び操作は、例えば米国特許第
3092465号、同第3802842号、同第3915647号、同
第3917453号、同第3936357号、同第4248829号、
同第4255384号、同第4270920号明細書及び同第
4312834号明細書によつて周知である。

本発明の乾式分析要素の吸収性担体物質は、多
孔性拡散帯域であるのが好ましい。この帯域は自
立性（すなわち、その一体性を維持するのに充分
に固い物質から成る）であつてよいが、別個の支
持体上に担持されているのが好ましい。このよう
な支持体は、任意の適当な寸法安定性で、好まし
くは非多孔性で、200〜900nｍの波長の電磁線を
透過する、透明な（すなわち、輻射線透過性）物
質である。特定の要素のため選択される支持体
は、意図する検出方法（螢光、発光又は反射分光
分析）と認容性であるべきである。有用な支持体
は、紙、金属箔、ポリスチレン、ポリエステル、
ポリカーボネート又はセルロースエステルから製
造することができる。

多孔性拡散帯域は、任意の適当な繊維若しくは
非繊維物質又はその一方若しくは両方の混合物か
ら製造することができる。この帯域の空隙率及び
平均孔径は、意図する用途に応じて変動しうる。
有用な拡散帯域は、米国特許第4292272号、同第
3992158号、同第4258001号及び同第4430436号明
細書及び特開昭57（1982）−101760号公報に記載さ
れているようにして製造することができる。拡散
帯域は等方性に多孔性である、すなわち、孔度が
粒子、繊維、ポリマーストランドの間の連続空間
又は孔によつて生じるように帯域のどの方向でも
同一であるのが望ましい。

要素は、同一の層又は重ねられた層に２個以上
の別々の帯域を有していてよい。その少なくとも
１個は多孔性拡散帯域であるのが好ましい。他の
帯域は、試薬帯域又は記録帯域（これらの帯域は
文献に公知である）、付加的拡散帯域、輻射線遮
蔽若しくはフイルター帯域、下塗帯域又はバリア
帯域であつてよい。帯域は、一般に、相互に液体
接触〔液体、試薬及び反応生成物（例えば有色色
素）が隣接帯域の重なつた領域の間を通過又は移
動しうることを意味する〕している。各帯域は、
別々に塗布された層であるのが好ましいが、２以
上の帯域が要素の一つの層の別々の領域であつて
よい。

次に、本発明方法は要素を分析すべき液体試料
と接触させることによつて実施される。要素内で
起こる任意の検出可能な変化を適切な装置を用い
て測定する。酵素又は分析組成物はこのような要
素に乾燥残渣（例えば凍結乾燥粉末又は被覆組成
物の乾燥残渣）として存在する。

乾式分析で使用する場合には、ビリルビン−特
異性酵素は一般に40〜400I.U.／m²、好ましくは
50〜200I.U.／m²の量で存在する。

本発明の分析要素は、本発明の酵素又は分析組
成物を含む試薬帯域を少なくとも１個有すること
ができる。これらの帯域は、自立性（すなわち、
その一体性を維持するのに充分に固い物質から成
る）であつてよいが、前記のような支持体上に担
持されているのが好ましい。これらの要素の試薬
帯域のいずれかが、例えば前記のような拡散帯域
として作用することもできる。

本発明の要素の１個以上の帯域が種々の他の所
望であるが、表面活性剤、酵素活性化剤、結合剤
（一般に親水性の天然若しくは合成コロイド又は
ポリマー）、硬化剤、色素又は溶剤を含めて、必
須ではない成分を１種以上含んでいてよい。これ
らの成分は、臨床化学の分野で公知の量で存在す
る。

本発明により、分析方法に応じて異なる種々の
要素を製造することができる。任意の所望の幅の
長いテープ、シート又は一層小さいチツプを含め
て種々の形で要素を形成することができる。

本発明の分析方法は、手操作で又は自動的にす
ることができる。一般に、要素を供給ロール、チ
ツプ包装物又は他の供給源から採取し、液体試料
（例えば１〜200μ）と、試料が要素中の試薬と
混合するように物理的に接触させることによつ
て、液体中のビリルビン又は他の被分析物の量を
測定する。このような接触は、任意の適当な方法
で、例えば要素を試料中に浸漬するか、又は好ま
しくは適当な分配手段を用いて一滴以上の試料を
手又は機械で要素に落とすことによつて達成され
る。

試料を施した後、要素をコンデイシヨニング、
例えばインキユベーシヨン、加熱等、任意の試験
結果を得るのを促進又は容易にするのに望ましい
処理に付す。

被分析物は反応し、適当な装置によつて定量し
うる検出可能な変化を生じる。適当な検出手段
は、反射若しくは透過比色分光分析、螢光測定、
放射能測定、化学発光、酵素標識又はエンタルピ
ー変化の測定を包含する。

〔実施例〕

下記の実施例は、本発明を更に説明するもので
ある。下記の記載は、各実施例に共通である。

280及び260nｍで測定した吸光度の比を用いる
方法によつて蛋白質濃度を測定した。特に断らな
い限り、すべての酵素製剤の抽出工程は０〜４℃
で実施し、すべての化学薬品は試薬品質であつ
た。100mlのフラスコ中で、0.05モル燐酸ナトリ
ウム緩衝液（PH7.45）に秤量した固体物質（0.1N
NaOH約100μで予め湿潤）を溶解することに
よつてビリルビン（非複合形）ストツク溶液
（100mg／ml）を製造した。この溶液を窒素に富む
雰囲気下に０〜４℃に保持した。ビリルビンに関
して440nｍで55×10³／モル／cmのモル吸光係
数を使用した。使用直前に、ビリルビンストツク
溶液を0.05モルの燐酸ナトリウム緩衝液で希釈し
た。

前記のように緩衝したビリルビン含有溶液を既
知量の酵素製剤と共に温置し、ビリルビンを含ま
ない以外は同一の組成物の対照溶液に対して、
λmax（440nｍ）での吸収濃度の減少を監視した。
各反応混合物の最終容量は、1.01mlであつた。す
べての分析は、特に断らない限り、440nｍで常
用の分光光度計で22〜25℃で監視した。

例 １ 朝鮮あざみい（artichokes）からの酵素の抽出 朝鮮あざみを蒸留水ですすぎ、スライスし、３
〜４容量の氷冷0.05モル燐酸ナトリウム緩衝液
（PH7.45）に添加した。次いで、植物組織を１回
の衝撃（burst）が10〜15秒続き、30秒間の氷浴
冷却を間に挟んだ、別々の衝撃を10〜12回行う標
準ブレンダーで均質化した。生じた均質物を３層
のチーズクロスでロ過した。ロ液を標準遠心分離
機で9000×ｇで、４℃で15〜20分遠心分離した。
無視しうるビリルビン−特異性活性を示す生成ペ
レツトを捨て、上澄液を60％飽和するのに充分な
硫酸アンモニウムで処理した。生じる固体沈殿物
を前記と同じであるが、PH7.4の緩衝液中に懸濁
させ、懸濁液５mlを65℃で３分間加熱した。０〜
４℃の水に対して一夜透析することによつて回収
を実施した。これにより、１〜10mg／mlの蛋白質
を含み、本発明の製剤のビリルビン−特異性活性
特性を示す水性酵素製剤を得た。

例 ２ 酵素濃度の関数として溶液分析でのビリルビン
の減成 例１に記載した操作によつて朝鮮あざみから得
た酵素製剤の種々の量（10〜100μ）を、37℃
の0.05モルのトリス（ヒドロキシメチル）アミノ
メタン緩衝液（PH8.0）に溶解してジタウロビリ
ルビン２mg／dlを含む、それぞれ2.5mlの液体試
料に添加した。ビリルビンを含まない以外は同一
の組成物を基準として、標準分光分析器を使用し
て450nｍの吸光度の変化を監視した。酵素製剤
の容量に対して、10分間の吸光度の変化（ΔA）
を第１図にプロツトした。

例 ３ ビリルビン濃度の関数としての溶液分析におけ
るビリルビン減成 例１に記載したようにして得られた朝鮮あざみ
酵素製剤0.09mgを含む量を2.8×10^-6〜２×10^-5モ
ル／の範囲のビリルビン濃度を有するビリルビ
ン−含有液体試料に添加した。試験条件は例２に
記載したのと同じであつた。これらの試験から測
定されたように、朝鮮あざみビリルビン−特異性
酵素製剤の見掛けの、外挿法によるミハエリス
（Michaelis）定数Kmは、約1.5×10^-5モル濃度
（すなわち約0.9mg／dl）である（Lineweaver＆
Burk、J.A.C.S.、56巻、658頁、1934年）。この
Km値は、米国特許第4211844号明細書の菌酵素
（約7.04mg／dl又は1.2×10^-4モルのKm）に比較
して、朝鮮あざみ酵素の方がビリルビンに対して
高い親和性を有することを意味する。

例 ４ 酵素活性のPH依存性 この例は、本明細書に記載したビリルビン減成
酵素の活性に対するPHの作用を示す。

未複合ビリルビン２mg／dlを含む水性試料を
種々のPH値で例１の朝鮮あざみ酵素製剤２mg／ml
と混合し、酵素活性を37℃で測定した。結果を、
450nｍでPH範囲に対して１分当たりの吸光度の
正味の変化（ΔA／分）又は初期速度の変化とし
て第２図にプロツトした。このプロツトから37℃
で燐酸塩緩衝液中で最適PHは約7.4であることは
明らかである。有用なPH範囲は約７〜約10であ
る。最適PH及びこの純度段階（粗製製剤）で、酵
素の特異性活性は約0.024Δμモル／分／mg又は
0.0048ΔA／分／mgであつた。これは、前記の米
国特許第4211844号明細書に記載されている菌酵
素製剤の、同様に条件下における（該特許の第
表、粗製抽出データ、バツチ２参照）特異性活性
の約５倍である。

〔発明の効果〕

本発明の利点は、キク科植物、好ましくは朝鮮
あざみから得られたビリルビン−特異性酵素を使
用することによつて得られる。この酵素は、ビリ
ルビン（複合形及び非複合形）に対して特異的に
作用することができる。ビリルビンに対するこの
酵素の特異性は、前記の米国特許第4211844号明
細書に記載されている公知菌酵素の特異性より大
きいことが判つた。また、酵素製剤は、比較的高
い特異性活性、すなわち、蛋白質１mg当たり毎分
の基質（ビリルビン）のモル数の増加したターン
オーバー数を有する。

【図面の簡単な説明】

第１図は、前記の例２に記載した本発明のビリ
ルビン−特異性朝鮮あざみ酵素製剤の量の変化に
対してビリルビン減成速度の変化をプロツトした
グラフ図であり、第２図は、前記の例４に記載し
た酵素活性に対するPHの作用を示すグラフ図であ
る。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ キク科植物から単離され、下記の(a)〜(e)の物
   理化学的性質、すなわち、 (a) ビリルビン（複合形又は非複合形）と特異的
   に反応し、色の変化を起こす活性、 (b) 1.5×10^-5モルのビリルビンに対するKm、 (c) ７〜10の有用なPH範囲での活性、 (d) 37℃で燐酸塩緩衝液中で測定して7.4の最適
   PH、及び (e) 複合及び非複合形について20〜50℃の有用な
   温度範囲での活性 を有するビリルビン−特異性酵素を含む分析用組
   成物。 ２ 被分析物測定用の分析要素に含まれる特許請
   求の範囲第１項に記載の分析組成物。 ３ ビリルビンを含むと思われる液体をキク科植
   物から単離され、下記の(a)〜(e)の物理化学的性
   質、すなわち、 (a) ビリルビン（複合形又は非複合形）と特異的
   に反応し、色の変化を起こす活性、 (b) 1.5×10^-5モルのビリルビンに対するKm、 (c) ７〜10の有用なPH範囲で活性、 (d) 37℃で燐酸塩緩衝液中で測定して7.4の最適
   PH、及び (e) 複合及び非複合形について20〜50℃の有用な
   温度範囲での活性 を有するビリルビン−特異性酵素と接触させるこ
   とを含む水性液体中のビリルビンの減成方法。 ４ 水性液体中のビリルビンを測定するため、 () ビリルビンを含むと思われる液体をキク科
   植物から単離され、下記の(a)〜(e)の物理化学的
   性質、すなわち、 (a) ビリルビン（複合形又は非複合形）と特異
   的に反応し、色の変化を起こす活性、 (b) 1.5×10^-5モルのビリルビンに対するKm、 (c) ７〜10の有用なPH範囲での活性、 (d) 37℃で燐酸塩緩衝液中で測定して7.4の最
   適PH、及び (e) 複合及び非複合形について20〜50℃の有用
   な温度範囲での活性 を有するビリルビン−特異性酵素と接触させて、
   ビリルビンを酵素と反応させて検出可能な変化を
   生じさせ、そして、 () 工程（）で生じた変化を検出させる工程
   を含むビリルビンの測定方法。 ５ 妨害物質であるビリルビンを含む水性液体中
   のビリルビン以外の被分析物を測定するため、 () ビリルビン以外の被分析物を含むと思われ
   る液体を該被分析物に対する反応性組成物と接
   触させて検出可能な変化を生じさせ、 () 工程（）の前又はその間に液体をキク科
   植物から単離され、下記の(a)〜(e)の物理化学的
   性質、すなわち、 (a) ビリルビン（複合形又は非複合形）と特異
   的に反応し、色の変化を起こす活性、 (b) 1.5×10^-5モルのビリルビンに対するKm、 (c) ７〜10の有用なPH範囲での活性、 (d) 37℃で燐酸塩緩衝液中で測定して7.4の最
   適PH、及び (e) 複合及び非複合形について20〜50℃の有用
   な温度範囲での活性 を有するビリルビン−特異性酵素と接触させ、こ
   れによりビリルビンを減成させ、工程（）で生
   じた検出可能な変化を妨害する能力を減少させ、
   そして、 () 工程（）で生じた変化を検出する工程を
   含む、ビリルビン以外の被分析物の分析方法。