JPH0358720B2 - - Google Patents
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- JPH0358720B2 JPH0358720B2 JP57173569A JP17356982A JPH0358720B2 JP H0358720 B2 JPH0358720 B2 JP H0358720B2 JP 57173569 A JP57173569 A JP 57173569A JP 17356982 A JP17356982 A JP 17356982A JP H0358720 B2 JPH0358720 B2 JP H0358720B2
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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Description
(1) 被検液中の加水分解酵素活性測定において、
下記一般式〔〕 （ただし式中、R1またはR2のいずれか一方
はR19CO−NH−基、（Ｓ）ｎ−Ｏ−基、R20−
Ｏ−PO（OH）−Ｏ−基またはR21CO−Ｏ−基
で、R19CO−はアミノ酸残基またはペプチド残
基を示し、Ｓは単糖類単位、ｎは１以上の整数
を示し、R20−Ｏ−はHO−基または置換また
は未置換グリセロール残基を示し、R21CO−は
脂肪酸残基を示し、R1またはR2の他方、R3、
R4、R5またはR6は各々水素原子、ハロゲン原
子、低級アルキル基、低級アルコキシル基、ア
ミノ基、置換アミノ基、水酸基、カルボキシル
基またはスルホ基を示し、またはR5およびR6
は一緒になつて六員環を形成してもよい基を示
す）で表される合成基質を用い、下記一般式
〔〕 （ただし式中、R7は水酸基、アミノ基また
は置換アミノ基を示し、R8、R9、R10、R11ま
たはR12は各々水素原子、ハロゲン原子、低級
アルキル基、低級アルコキシル基、アミノ基、
置換アミノ基、水酸基、カルボキシル基または
スルホ基を示し、またはR11およびR12は一緒
になつて六員環を形成してもよい基を示し、但
し、R7、R8、R9、R10、R11、R12の各基におい
て上記一般式〔〕で表される合成基質から加
水分解酵素の作用にて遊離される化合物と同一
化合物である場合を除く）で表されるカプラー
および酸素の共存下、少なくとも上記一般式
〔〕で表される合成基質から加水分解酵素の
作用にて遊離される化合物と一般式〔〕で表
されるカプラーとを酸素を消費して色素を形成
する酸化酵素を作用せしめ、次いで反応系にお
ける検出可能な変化の量を測定することを特徴
とする被検液中の加水分解酵素活性の測定法を
提供するものである。 一般に、酵素を用いて色素を形成させて被検液
中の化合物を測定することは、酵素分析法として
多く行なわれるようになつたが、その大部分は、
過酸化水素やフエノールまたはそれらを生成する
か遊離する化合物の測定としてであつて、パーオ
キシダーゼを用いて測定する方法である。例えば
過酸化水素の測定の場合、フエノールおよび色原
体、例えば、４−アミノアンチピリン共存下でパ
ーオキシダーゼを作用させるとH2O2→H2O＋
〔Ｏ〕の反応が起こり、〔Ｏ〕が酸化作用を示し、
フエノールおよび色原体を酸化縮合させて色素を
形成する。次いでこの呈色色素の特異的吸収波長
を測定することにより、間接的に過酸化水素の量
を測定することができる。過酸化水素を生成する
化合物の定量例としてグルコースの測定の例を挙
げる。β−Ｄ−グルコースは、グルコースオキシ
ダーゼの下記式〔〕にて示される作用により、
最終的に過酸化水素が生成される。 β−Ｄ−グルコース＋H2O＋O2→Ｄ−グルコ
ン酸＋過酸化水素〔〕この過酸化水素を先に述
べた方法で定量することにより、間接的にβ−Ｄ
−グルコースの濃度を定量することができる。 この方法は、過酸化水素を含有または過酸化水
素を生成ないしは遊離する反応系において有効な
測定法であり、最近、臨床生化学分野における分
析法の１つとして利用されている。 一方、フエノール系化合物を測定する場合は、
過酸化水素を試薬として利用する必要性が生じ
る。過酸化水素は不安定な物質であるため、この
方法でフエノール系化合物を測定することは良好
な測定法とはいえず、ほとんど利用されていな
い。 パーオキシダーゼを用いる以外の方法で色素を
形成させる酵素反応としては、ニコチンアデニン
ジヌクレオチドまたはニコチンアデニンジヌクレ
オチドホススフエート〔NAD（Ｐ）〕を用いる脱
水素酵素系を介してNAD（Ｐ）からの還元型
NAD（Ｐ）〔NAD（Ｐ）Ｈ〕への変化をもたらす
反応を利用し、生成したNAD（Ｐ）Ｈにジアホラ
ーゼと電子伝達系色素を作用させてホルマザン色
素を形成させ測定する方法が知られている。しか
し、この方法は、ホルマザン色素が不溶性であ
り、また、キユベツトやチユーブなどにこの色素
が付着し洗浄により良好にとれないなどの欠点が
あり不適当なものであつた。 本発明者らは、先に、ｐ−フエニレンジアミン
またはその誘導体が、意外にもアスコルビン酸オ
キシダーゼやラツカーゼなどの酸化酵素で酸化さ
れ色素を形成することを知り、これを利用したロ
イシンアミノペプチダターゼ活性測定法を見い出
した（特願昭57−115345号明細書特開昭59−6898
号公報参照）。 この測定法は、従来よりの化学的酸化手段のみ
による測定法に比べて酵素法で温和な条件にて行
なえることやレイト・アツセイによる自動分析を
も可能にしたところに特徴を有するものであつ
た。 上記発明において、フエノール誘導体を酸化酵
素によつて酸化せしめた場合には約350〜500nm
近辺に極大吸収をもつ化合物に変化するものであ
つた。 しかし、全く意外にも、本発明で使用されるア
スコルビン酸オキシダーゼやラツカーゼなどの酸
化酵素は、一般式〔〕で表わされる合成基質か
ら加水分解酵素の作用にて遊離される化合物とカ
プラー（ここでいうカプラーとは、一般式〔〕
で表わされる合成基質から加水分解酵素の作用に
て遊離される化合物と酵素的に酸化縮合するもの
であればいずれのものでもよい）とを温和な条件
にて酸化縮合させる特性をも発揮し、かつ従来の
極大吸収域とは全く異なる500〜750nm付近に極
大吸収を持つ化合物である色素を形成することを
知つたもので、このことは全く驚くべき事であつ
た。 一般式〔〕で表わされる合成基質から加水分
解酵素の作用にて遊離される化合物の中でも、例
えば、３，５−ジブロム−４−ヒドロキシアニリ
ンの如きは、カツプラーを用いない上記の酸化酵
素単独では測定系として有効な呈色を示さなかつ
たが、ところがカプラー共存下で酸化縮合を行な
わせると、600〜700nm附近に極大吸収を持つ色
素化合物を形成する全く驚くべき事を知つたもの
でこの反応は、従来、全く知られていない新規な
反応に基くものと推定されるものである。 さらに一般式〔〕で表わされる合成基質から
加水分解酵素の作用にて遊離される化合物を構成
因子として加水分解酵素の合成基質を得たとこ
ろ、この合成基質は対応する加水分解酵素の酵素
作用により良好に一般式〔〕で表わされる合成
基質から加水分解酵素の作用にて遊離される化合
物を遊離したもので、さらにこの遊離した化合物
を上記手段によつて良好に色素を形成せしめ得る
ことを知り、加水分解酵素の活性測定として有用
な定量法を見い出した。 本発明は、上記の知見に基づいて完成されたも
ので被検液中の加水分解酵素活性測定において、
下記一般式〔〕 （ただし式中、R1またはR2のいずれか一方は
R19CO−NH−基、（Ｓ）ｎ−Ｏ−基、R20−Ｏ−
PO（OH）−Ｏ−基またはR21CO−Ｏ−基で、
R19CO−はアミノ酸残基またはペプチド残基を示
し、Ｓは単糖類単位、ｎは１以上の整数を示し、
R20−Ｏ−はHO−基または置換または未置換グ
ルセロール残基を示し、R21CO−は脂肪酸残基を
示し、R1またはR2の他方、R3、R4、R5またはR6
は各々水素原子、ハロゲン原子、低級アルキル
基、低級アルコキシル基、アミノ基、置換アミノ
基、水酸基、カルボキシル基またはスルホ基を示
し、またはR5およびR6は一緒になつて六員環を
形成してもよい基を示す）で表される合成基質を
用い、下記一般式〔〕 （ただし式中、R7は水酸基、アミノ基または
置換アミノ基を示し、R8、R9、R10、R11または
R12は各々水素原子、ハロゲン原子、低級アルキ
ル基、低級アルコキシル基、アミノ基、置換アミ
ノ基、水酸基、カルボキシル基またはスルホ基を
示し、またはR11およびR12は一緒になつて六員
環を形成してもよい基を示し、但し、R7、R8、
R9、R10、R11、R12の各基において上記一般式
〔〕で表される合成基質から加水分解酵素の作
用にて遊離される化合物と同一化合物である場合
を除く）で表されるカプラーおよび酸素の共存
下、少なくとも上記一般式〔〕で表される合成
基質から加水分解酵素の作用にて遊離される化合
物と一般式〔〕で表されるカプラーとを酸素を
消費して色素を形成する酸化酵素を作用せしめ、
次いで反応系における検出可能な変化の量を測定
することを特徴とする被検液中の加水分解酵素活
性の測定法として有用なものである。 一般式〔〕で表わされる合成基質を定量する
際に用いられる酸化酵素としては、反応におい
て、少くとも一般式〔〕で表わされる合成基質
から加水分解酵素の作用にて遊離される化合物と
一般式〔〕で表されるカプラーとを酸素を消費
して色素を生成もしくは形成させる酸化酵素であ
ればよく、例えば、アスコルビン酸オキシダー
ゼ，ラツカーゼ，アミノフエノールオキシダー
ゼ，ポリフエノールオキシダーゼ，チロシナーゼ
などが挙げられる。また、これらの酸化酵素は限
定されるものではないが、特に、アスコルビン酸
オキシダーゼ、ラツカーゼまたはチロシナーゼは
良好な酵素として挙げられる。例えば、アスコル
ビン酸オキシダーゼとしては、カボチヤ、キユウ
リあるいはハヤトウリ（特開昭56−88793号公報）
などから得られた酵素等が挙げられ、また、ラツ
カーゼとしては、例えば、ウルシや担子菌コリカ
ラス・ベルシカラー，リゾプス属に属する生産菌
やポリポラス・ベルシカラー〔J.Biochem.，50，
264，（1961）；Biochem.Biophys.Acta.73，204，
（1963），Acta Chem.Scand.21，2367，（1967）〕
などから得られた酵素が挙げられ、また、これら
は市販の酵素を用いてもよい。 さらにこれらの酵素は固定化酵素として使用し
てもよい。この場合には、自動分析装置へ組み込
んで測定を行なうことが可能となり、酸素電極に
て電気化学的変化として測定を行なうことによ
り、高価な酵素の使用を著しく少量ならしめる。
さらに酵素電極たる固定化酵素と上記電極とを組
み合わせたセンサーとして用いることにより、迅
速に、しかも種々の試薬も必要とせず、さらに繰
り返し測定利用でき、さらにまた有色物質を含む
各種の測定試料にも適用できる。 さらに一般式〔〕で表わされる合成基質を定
量するに当つて、使用されるカプラーとしては一
般式〔〕で表わされる合成基質から加水分解酵
素の作用にて遊離される化合物と酸化縮合して色
素を形成されるものであればいずれのものでもよ
い。一般式〔〕で表わされる合成基質から加水
分解酵素の作用にて遊離される化合物において、
遊離したアミノ基を有し、またはR2、R3、R4、
R5もしくはR6のいずれかの基の１以上がアミノ
基を示す場合には水素原子を示してもよく、R2、
R3、R4、R5またはR6は前記と同じ基を示す一般
式〔〕で表わされる化合物（以下、アミノ化合
物〔−Ａ〕という）においては、カプラーとし
て下記一般式〔〕 （ただし式中、R7は水酸基、アミノ基または
置換アミノ基を示し、R8、R9、R10、R11または
R12は水素原子、ハロゲン原子、低級アルキル
基、低級アルコキシル基、アミノ基、置換アミノ
基、水酸基、カルボキシル基またはスルホ基を示
し、またはR11およびR12は一諸になつて環を形
成してもよい基を示す）で表わされる化合物が挙
げられる。その代表的なアミノ化合物〔−Ａ〕
のカプラーとしては、例えばフエノール、サリチ
ル酸、ｍ−ヒドロキシ安息香酸、２，６−ジヒド
ロキシ安息香酸、２−アミノ−３−ヒドロキシ安
息香酸、２−ヒドロキシ−５−アミノ安息香酸、
ｐ−ヒドロキシ安息香酸、サリチル酸メチル、ｏ
−メチルフエノール、ｍ−メチルフエノール、ｐ
−メチルフエノール、ｏ−メトキシフエノール、
ｍ−メトキシフエノール、ｐ−メトキシフエノー
ル、ｏ−クロロフエノール、ｍ−クロロフエノー
ル、ｐ−クロロフエノール、２，３−ジメチルフ
エノール、２，４−ジメチルフエノール、２，５
−ジメチルフエノール、２，６−ジメチルフエノ
ール、３，５−ジメチルフエノール、２，６−ジ
クロロフエノール、ｏ−アミノフエノール、ｍ−
アミノフエノール、ｐ−ブロムフエノール、ｏ−
エチルフエノール、ｍ−エチルフエノール、２，
４−ジクロロフエノール、２，４−ジブロムフエ
ノール、２，６−ジブロムフエノール、２，６−
ジブロム−４−アミノフエノール、２，６−ジク
ロロ−４−アミノフエノール、２，６−ジメトキ
シフエノール、２−メチル−６−クロロフエノー
ル、２−クロロ−５−メチルフエノール、２−ア
ミノ−４−クロロフエノール、Ｎ，Ｎ−ジエチル
−ｍ−アミノフエノール、２−アミノ−４−メチ
ルフエノール、ｏ−カルボキシメチルフエノー
ル、２−カルボキシ−４−アミノフエノール、
３，４−ジヒドロキシフエネチルアミン、α−ナ
フトール、β−ナフトール、４−クロロ−１−ナ
フトール、２−カルボキシ−１−ナフトール、１
−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸、１−ナフトール
−２−スルホン酸、１−ナフトール−３−スルホ
ン酸、１−ナフトール−４−スルホン酸、１−ナ
フトール−８−スルホン酸、２−ナフトール−６
−スルホン酸、−ナフトール−７−スルホン酸、
２−ナフトール−８−スルホン酸、２−ナフトー
ル−３，６−ジスルホン酸、２−ナフトール−
６，８−ジスルホン酸、Ｎ，Ｎ−ジエチル−ｍ−
アミノアニリン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−ｍ−アミノ
アニリン、ｏ−カルボキシアニリン、ｍ−カルボ
キシアニリン、ｏ−クロロアニリン、ｍ−クロロ
アニリン、ｍ−ブロムアニリン、ｏ−メチルアニ
リン、ｍ−メチルアニリン、Ｎ，Ｎ−ジメチルア
ニリン、Ｎ，Ｎ−ジエチルアニリン、Ｎ，Ｎ−エ
チル・エチルヒドロキシアニリン、Ｎ，Ｎ−エチ
ル・エチルヒドロキシメタトルイジン、３−アミ
ノ−４−クロロアニリン、２−メチル−３−クロ
ロアニリンなどが挙られる。また一般式〔〕で
表わされる合成基質から加水分解酵素の作用にて
遊離される化合物において遊離した水酸基を有
し、またはR2、R3、R4、R5もしくはR6のいずれ
かの基の１以上が水酸基を示す場合には水素原子
を示してもよく、R2、R3、R4、R5またはR6は前
記と同じ基を示す一般式〔〕で表わされる化合
物（以下、フエノール化合物−Ｆという）にお
いては、カプラーとして下記一般式〔〕 （ただし式中、R13はアミノ基または置換アミ
ノ基を示し、R14、R15、R16、R17またはR18は水
素原子、ハロゲン原子、低級アルキル基、低級ア
ルコキシル基、アミノ基、置換アミノ基、水酸
基、カルボキシル基またはスルホ基を示し、また
はR17およびR18は一諸になつて環を形成しても
よい基を示す）で表わされる化合物が挙られる。
この代表的なフエノール化合物〔−Ｆ〕のカプ
ラーとしては、例えば、Ｎ−エチルアニリン、
Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン、Ｎ，Ｎ−ジエチルア
ニリン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−ｏ−トルイジン、
Ｎ，Ｎ−ジメチル−ｐ−トルイジン、Ｎ，Ｎ−ジ
エチル−ｏ−トルイジンン、Ｎ，Ｎ−ジエチル−
ｍ−トルイジン、Ｎ，Ｎ−ジエチル−ｐ−トルイ
ジン、アントラニル酸、ｐ−ジメチルアミノ安息
香酸、ｐ−クロロ−ｏ−トルイジン、ｍ−フエニ
レンジアミン、ｐ−フエニレンジアミン、アニリ
ン、ｏ−メチルアニリン、ｍ−メチルアニリン、
ｏ−カルボキシアニリン、ｏ−クロロアニリン、
ｍ−クロロアニリン、ｍ−ブロモアニリン、２−
メチル−５−カルボキシアニリン、Ｎ，Ｎ−エチ
ル−ヒドロキシエチルアニリン、Ｎ，Ｎ−ジメチ
ル−ｍ−フエニレンジアミン、Ｎ，Ｎ−ジメチル
−ｐ−フエニレンジアミン、Ｎ，Ｎ−ジエチル−
ｐ−フエニレンジアミン、２−メチル−ｍ−フエ
ニレンジアミン、４−メチル−ｏ−フエニレンジ
アミン、４−メチル−ｍ−フエニレンジアミン、
２−メトキシ−５−クロロアニリン、２−エチル
アニリン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−ｍ−トルイジン、
２−クロロ−ｍ−フエニレンジアミン、２−メチ
ル−３−クロロアニリン、２，５−ジメトキシア
ニリン、１−アミノ−５−ナフタレンスルホン
酸、１−アミノ−６−ナフタレンスルホン酸、
Ｎ，Ｎ−エチル・エチルヒドロキシ−メタトルイ
ジン、３，５−ジブロム−４−ヒドロキシアニリ
ン、３，５−ジクロロ−４−ヒドロキシアニリ
ン、ｏ−ヒドロキシアニリン、ｍ−ヒドロキシア
ニリン、２−アミノ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリ
ン、ｐ−Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノアニリン、ｐ−
Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノアニリン、３−アミノ−
４−クロロ−アニリン、２−メチル−３−アミノ
アニリン、２−メチル−５−アミノアニリン、３
−カルボキシアニリン、３−カルボキシ−４−ヒ
ドロキシアニリン、２−メチル−５−カルボキシ
アニリン、などが挙られる。またこの一般式
〔〕で表わされる化合物をカプラーとして用い
たときの定量対象となるアミノ化合物〔−Ａ〕
としては、例えば、４−ヒドロキシ−３，５−ジ
クロロアニリン、４−ヒドロキシ−３，５−ジブ
ロムアニリン、ｐ−Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノアニ
リン、ｐ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノアニリン−ｍ
−フエニレンジアミン、ｐ−フエニレンジアミ
ン、ｏ−アミノフエノール、ｍ−アミノフエノー
ル、アニリン、ｏ−トルイジン、ｍ−トルイジ
ン、ｏ−カルボキシアニリン、ｏ−クロロアニリ
ン、ｍ−クロロアニリン、ｍ−ブロムアニリン、
ｍ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノアニリン、２−クロ
ロ−５−アミノアニリン、２−メチル−３−クロ
ロアニリン、２，５−ジメトキシアニリン、２−
メチル−３−アミノアニリン、２−メチル−５−
アミノアニリン、２−メチル−５−カルボキシア
ニリン、２−ヒドロキシ−６−カルボキシアニリ
ン、２−ヒドロキシ−５−メチルアニリン、３−
カルボキシアニリン、３−カルボキシ−４−ヒド
ロキシアニリン、２−ヒドロキシ−５−クロロア
ニリン、ｏ−エチルアニリン、２−メチル−５−
カルボキシアニリン、１−アミノ−６−ナフトー
ル−スルホン酸、３−アミノ−４−クロロアニリ
ンなどが挙られる。さらに、一般式〔〕で表わ
される化合物をカプラーとして用いたときの定量
対象となるフエノール化合物〔−Ｆ〕として
は、例えば４−アミノ−２，６−ジクロロフエノ
ール、４−アミノ−２，６−ジブロムフエノー
ル、ｏ−アミノフエノール、ｍ−アミノフエノー
ル、ｐ−アミノフエノール、ｍ−カルボキシフエ
ノール、ｐ−カルボキシフエノール、フエノー
ル、ｏ−クロロフエノール、ｍ−クロロフエノー
ル、ｐ−クロロフエノール、ｐ−ブロモフエノー
ル、ｏ−エチルフエノール、ｍ−エチルフエノー
ル、ｏ−メチルフエノール、ｍ−メチルフエノー
ル、ｐ−メチルフエノール、ｏ−メトキシフエノ
ール、サリチル酸、サリチル酸メチル、ｏ−カル
ボキシメチルフエノール、ｍ−Ｎ，Ｎ−ジエチル
アミノフエノール、２，４−ジクロロフエノー
ル、２，４−ジブロモフエノール、２，６−ジブ
ロモフエノール、２，６−ジメトキシフエノー
ル、３，５−ジメチルフエノール、２，５−ジメ
チルフエノール、２，４−ジメチルフエノール、
２，３−ジメチルフエノール、２，６−ジメチル
フエノール、２−メチル−６−クロロフエノー
ル、２−クロロ−５−メチルフエノール、２−ア
ミノ−３−カルボキシフエノール、２−アミノ−
４−メチル−フエノール、２−カルボキシ−４−
アミノフエノール、２−アミノ−４−クロロフエ
ノール、α−ナフトール、β−ナフトール、４−
クロロ−１−ナフトール、２−カルボキシ−１−
ナフトール、１−ナフトール−２−スルホン酸、
１−ナフトール−３−スルホン酸、１−ナフトー
ル−４−スルホン酸、１−ナフトール−８−スル
ホン酸、２−ナフトール−６−スルホン酸、２−
ナフトール−８−スルホン酸、２−ナフトール−
３，６−ジスルホン酸、８−ヒドロキシ−キノリ
ン−５−スルホン酸、などが挙られる。なお、定
量対象としてのアミノ化合物〔−Ａ〕やフエノ
ール化合物−Ｆにおいて、化合物中アミノ基お
よび水酸基の両基を少なくとも有している化合物
例えばｏ−，ｍ−，ｐ−アミノフエノール、２−
クロロ−４−アミノフエノール、２−アミノ−４
−カルボキシフエノール、２−アミノ−４−メチ
ルフエノール、２−カルボキシ−４−アミノフエ
ノール、２−アミノ−４−クロロフエノール、
２，６−ジクロロ−４−アミノフエノール、２，
６−ジブロモ−４−アミノフエノールなどのアミ
ノフエノール系化合物に関しては、アミノ化合物
〔−Ａ〕としても分類でき、またフエノール化
合物〔−Ｆ〕としても分類できるものである。
従つてこのようなアミノフエノール系化合物の定
量に当つては、アミノ化合物〔−Ａ〕およびフ
エノール化合物〔−Ｆ〕に対するいずれのカプ
ラーも使用できるものであるが、またこのような
アミノフエノール系化合物に対するカプラーの使
用組合せとしては、アミノフエノール系化合物と
カプラーとが同一化合物である場合の組合せ例は
除かれるものである。 次いで、一般式〔〕で表わされる合成基質
（以下合成基質〔〕と略す）を定量するに当つ
て、測定対象とする加水分解酵素を含有する被検
液に合成基質〔〕を加えて、一般式〔〕また
は一般式〔〕で表わされるカプラーの共存下に
酸素を消費して色素を生成する酸化酵素を作用せ
しめるのであるが、用いるカプラーの量として
は、合成基質〔〕に対して等モル比以上用いれ
ばよく、また上限使用量としては酵素活性を阻害
しない程度まで用いることができる。 また、これらのカプラーは、通常中性近辺の緩
衝液、例えばトリス−塩酸緩衝液、リン酸緩衝
液、ジメチルグルタール酸−NaOH緩衝液、酢
酸緩衝液、イミダゾール−塩酸緩衝液、ピペス−
NaOH緩衝液、クエン酸緩衝液などに溶解して
一定濃度に調製したものが用いられる。さらに用
いられる酸化酵素において、通常反応が充分進行
する量の酵素量が用いられ、例えば、合成基質
〔〕0.1mモル／濃度の0.1〜５mlを対象とする
に当つてアスコルビン酸オキシダーゼとしては10
〜1000単位程度、好ましくは50〜200単位程度、
またラツカーゼやチロシナーゼとしては10〜1000
単位程度好ましくは50〜500単位程度を含有せし
めればよい。また反応温度としては、25〜40℃、
通常37℃近辺にて行なえばよい。さらに反応時間
としては、用いる酵素量、温度条件や測定手法な
どによつて多少異なるが、通常１分以上であれば
よく、またレイトアツセイ手法による測定手段の
場合には、１分以上行なえばよく、またその他の
比色定量の手段による測定手段の場合には５分以
上行なうことが好ましい。 次いで反応後、反応系における検出可能な変化
の量を測定するのであるが、通常反応系における
消費された酸素の量または生成された色素の量を
もつて測定する。また酸素の量の測定に当つて
は、酸素電極による電気化学的変化として検出
し、定量することが簡便である。さらに生成され
た色素の量の測定に当つては、生成された色素の
有する特異的吸収波長域、例えば500〜750nm付
近の特異的吸収波長域にて比色定量すればよい。
その後この測定に基いて、被検液中の加水分解酵
素によつて反応した合成基質〔〕の量を、検量
線によつて算出すればよく、このようにして正確
かつ簡便に合成基質〔〕を定量し得るものであ
る。 また、この合成基質としては、加水分解酵素、
例えばペプチダーゼ、プロテアーゼ、アミラー
ゼ、グリコシダーゼなどの糖分解酵素、ホスフア
ターゼ、エステラーゼ、リパーゼなど加水分解酵
素の範ちゆうに包含される酵素によつて加水分解
され、よつて合成基質〔〕からアミノ化合物
〔−Ａ〕またはフエノール化合物〔−Ｆ〕を
遊離、生成するものである。さらにこれらの加水
分解酵素としては、例えば市販の酵素試薬、培養
による酵素含有培養物や酵素含有生細胞または組
織、血清、尿やだ液などの生体試料中含有されて
いる酵素が挙られる。本発明においては、これら
の加水分解酵素を含有する試料を被検液として、
これに対応する合成基質の一定量を加え、通常37
℃にて反応せしめ、次いで被検液中の酵素の作用
によつてアミノ化合物〔−Ａ〕またはフエノー
ル化合物〔−Ｆ〕を遊離生成せしめ、次いでこ
のアミノ化合物〔−Ａ〕またはフエノール化合
物〔−Ｆ〕を前記のカツプラーの共存下、少な
くとも酸素を消費して色素を生成する酸化酵素を
用いる方法によつて、定量し、それに基いて被検
液中の酵素活性を測定してなるものである。 次いでこれら種々の加水分解酵素の活性測定の
ための、各酵素活性の例、それに作用する合成基
質およびその製造例について述べる。 (1) ペプチダーゼ、プロテアーゼ ペプチダーゼにおいて、一般的にペプチド鎖
に作用して、アミノ基末端から切断し、アミノ
酸またはペプチドを遊離させる酵素の総称とし
てアミノペプチダーゼが古くから知られてい
る。例えば、シスチル−アミノペプチダーゼ
（EC3.4.11.3）、プロリンアミノペプチダーゼ
（EC3.4.11.5），アルギニンアミノペプチダーゼ
（EC3.4.11.6），トリペプチドアミノペプチダー
ゼ（EC3.4.11.4），Ｘ−プロリルジペプチジル
アミノペプチダーゼ、ジペプチダーゼ
（EC3.4.13.11）のアミノペプチダーゼなどであ
る。 例えば、シスチンアミノペプチダーゼ（以下
CAPと呼ぶ）は、妊娠中の異常において血液
中に増大が認られる酵素であり、そこで、
CAPの活性測定は、胎盤機能の追跡に有用で
あり、妊娠経過の診断把握に利用されている。 従来、この目的のための測定法として、Ｓ−
ベンジル−Ｌ−システイン−ｐ−ニトロアニリ
ドやＳ−ベンジル−Ｌ−システイン−Ｎ，Ｎ−
ジメチルアミノアニリドが合成基質として使用
されていた。測定方法としては、例えば、Ｓ−
ベンジル−Ｌ−システイン−ｐ−ニトロアニリ
ドを基質として用いた場合には、CAPによつ
て遊離するｐ−ニトロアニリンの黄色を測定す
ることにより、CAP活性を測定していた。し
かし、遊離したｐ−ニトロアニリンが呈する色
調は黄色であるためその測定時に、ビリルビン
血清や溶血血清などの影響を受ける欠点を有し
ていた。また、遊離したｐ−ニトロアニリンを
ｐ−ジメチルアミノシンナムアルデヒドと化学
的に反応させ、赤色素に変え565nmの吸光度を
測定する方法が知られているがこの方法は、化
学的発色法の為、レイト・アツセイによる測定
法としては全く不向きであつた。 また、Ｓ−ベンジル−Ｌ−システニル−ｐ−
ジメチルアミノアニリドを基質として用いた場
合には、CAPによつて遊離するｐ−ジメチル
アミノアニリンを鉄錯塩試薬と反応させる事に
より、青緑色に呈色させこれを測定する事によ
り、酵素活性を測定し得るものであるが、この
方法も化学発色の為、レイト・アツセイによる
測定法としては全く不向きであつた。 本発明では、アミノ化合物〔−Ａ〕を、そ
のアミノ基と、アミノ酸またはペプチドのカル
ボキシル基と結合せしめて得られるアミノ化合
物〔〕を構成因子とする化合物を合成基質と
する。この合成基質としては、下記一般式
〔〕 （ただし式中、R′1またはR′2のいずれか一方
はR19CO−NH−基を示し、他方は水素原子を
示し、R19CO−は、アミノ酸残基またはペプチ
ド残基を示し、R3、R4、R5、R6は前記と同じ
基を示す）で表わされる。 さらに基R19CO−の具体例としては、Ｓ−ベ
ンジル−Ｌ−システニル基、Ｌ−アラニル基、
Ｘ−Ｌ−プロリル基、（ただしＸは、酸性、中
性または塩基性のアミノ酸残基を示す）などが
挙られる。 この一般式〔〕で表わされる合成基質を用
いて、これにアミノペプチダーゼ含有被検液を
作用せしめ、次いで反応によつてアミノ化合物
〔−Ａ〕を遊離、生成せしめた後これを対応
するカプラーおよび酸化酵素によつて酵素的に
酸化縮合せしめる。 さらにこのように反応を行なつた結果、その
特異的吸収波長域は500〜750nm付近の長波長
域に認められるもので、この長波長域を測定波
長として測定するもので、特にレイト・アツセ
イによる自動化に適する優れた方法である。 また本発明における一般式〔〕で表わされ
る化合物たる合成基質合成法は、ペプチド合成
の常法によつて製造することができる。 例えば、Ｓ−ベンジル−Ｌ−システインなど
とアミノ化合物〔−Ａ〕との縮合反応により
行なわれる。Ｓ−ベンジル−Ｌ−システインを
得るには、Ｌ−システインのチオール基を通常
の方法でベンジル化して得る。反応に際して
は、必要に応じて官能基が保護される。一般
に、その保護誘導体となすに当つては、ペプチ
ド合成反応において汎用される通常の保護基が
挙げられる。例えば、Ｌ−システインのα−ア
ミノ基は、通常の保護基、例えば、ｔ−ブトキ
シカルボニル、ｔ−アミルオキシカルボニル，
ベンジルオキシカルボニル，アダマンタチルオ
キシカルボニル，ｏ−ニトロフエニルチオ，ニ
トロ置換ベンジルオキシカルボニル基などの通
常の保護基にて保護せしめればよい。 次いで、α−アミノ基が保護されたＳ−ベン
ジル−Ｌ−システインのα−カルボキシル基
を、例えば、酸アジド、酸無水物，酸ハロゲナ
イド，酸イミダゾリドや活性エステル、例えば
シアノメチルエステル，ｐ−ニトロフエニルエ
ステル，２，４−ジニトロフエニルエステル，
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル，Ｎ−
ヒドロキシフタル酸イミドエステルなどに変換
することによつて、あるいはカルボジイミド、
Ｎ，N′−カルボニル−ジイミダゾールまたは、
イソオキサゾリウム塩、例えばウツドワード反
応剤などにより、活性化せしめる。 さらに、この活性化した化合物とアミノ化合
物〔−Ａ〕と反応せしめるもので、好ましい
反応手段としてはカルボジイミド法、アジド
法、酸ハロゲナトド法活性エステル法や酸無水
物法である。また反応に当つては、不活性媒
体、例えばジメチルホルムアミド、ジメチルア
セトアミド、ジメチルスルホキサイド、テトラ
ヒドロフラン、ベンゼン、キシレン、トルエ
ン、ジエチルエーテルなどの溶媒中に両者ほぼ
等モル量を加え、約−30℃〜室温にて撹拌下反
応せしめればよい。一般に反応は30分〜50時間
で完了するもので、反応後α−アミノ基の保護
基を脱離せしめればよい。脱離に当つて、保護
アミノ基の場合では例えば保護基がｔ−ブトキ
シカルボニル基では2N−HClの酢酸溶液やト
リフルオロ酢酸を用いればよく、またベンジル
オキシカルボニル基ではパラジウム−炭素を用
いる接触還元の手段またはHBrの酢酸溶液を
用いて行なえばよい。 また、反応において、アミノ化合物〔−
Ａ〕が液状の際にはこれを反応媒体として兼用
してもよく、またはベンゼンやトルエンなどの
媒体を用いてもよく、さらに反応温度としては
50〜100℃程度でよく、20分〜５時間程度反応
せしめればよい。反応後、その保護基を脱離せ
しめればよく、これらは、必要に応じて精製す
る。 このようにして得られた合成基質としての目
的物は分離手段、例えば抽出、洗浄、、クロマ
ト操作、結晶化など操作により得ることができ
る。さらに目的物は、塩形成に適する酸、例え
ば塩酸、臭化水素酸、リン酸などの無機酸、ギ
酸、酢酸、プロピオン酸、シユウ酸などの有機
酸と反応させることによつて相当する塩を形成
することができる。 血清等被検液中の酵素活性の測定としては、
適当な緩衝液、例えば前記の緩衝液酵素と合成
基質とを接触させ、被検液の酵素の作用によつ
て遊離したアミノ化合物〔−Ａ〕を対応する
カツプラーおよび酸化酵素を用いることにより
定量測定される。 またＸ−プロリル−ジペプチジル−アミノペ
プチダーゼ（以下Ｘ−PDAPと称す。Ｘ：中
性，酸性あるいは塩基性アミノ酸）、特にグリ
シルプロリル−ジペプチジルアミノペプチダー
ゼ（以下GPDAPと略す）は、ペプチドのＮ末
端よりグリシルプロリンを水解遊離するジペプ
チジル・アミノペプチダーゼの一種である。 血清中のＸ−PDAP活性は、例えば急性およ
び慢性肝炎、肝硬変あるいは、胆管ガンなどに
おいて、その酵素活性が増加し、また、消化器
ガン，例えば胃ガン，膵ガンなどにあつては酵
素活性が低下するもので、本酵素活性を測定す
ることは疾患診断、特に消化器ガン診断に有用
である。 従来法として、ＸがグリシンであるGly−
Ｌ−Pro−α−ナフチルアミドGly−Ｌ−Pro
−ｐ−ニトロアニリドGly−Ｌ−Pro−ｐ−
フエニルアゾアニリドまた７−（Gly−Ｌ−
Pro）−４−メチルクマリンアミドなどを合成
基質として用いる測定法が報告されている。 例えば、のα−ナフチルアミドを用いる方
法は、酵素反応で遊離するα−ナフチルアミン
を３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラ
ゾン（MBTH）−FeCl3系にて化学的に発色さ
せ比色法で測定する方法である。しかし、α−
ナフチルアミンは発癌性物質の為、保健衛生
上、好ましくない。また、のｐ−ニトロアニ
リド系を使用する方法は、遊離する黄色のｐ−
ニトロアニリンを分光学的に測定する方法であ
るが、しかし、測定域が黄色のため、ビリルビ
ン血清や溶血血清の影響を受けやすい欠点を有
している。また同様、の方法としても種々
の欠点を有しているものであつた。 本発明における合成基質は、アミノ化合物
〔〕のアミノ基にＸ−Ｌ−プロリル基をアミ
ド結合にて結合せしめたもので基Ｘは、いかな
るアミノ酸の残基であつてもよくこのアミノ酸
としては例えば、グリシン，アラニンなどの中
性アミノ酸、アスパラギン酸，グルタミン酸な
どの酸性アミノ酸，あるいは、リジン，アルギ
ニンなどの塩基性アミノ酸などいずれのアミノ
酸であつても使用する事ができ、また、Ｌ，Ｄ
あるいはDL体のいかなるものも使用できる。
また、合成基質としての当該ジペプチド誘導体
は遊離体として使用されるのみならず、酵素反
応を阻害しない塩、例えばｐ−トルエンスルホ
ン酸、塩酸、臭化水素酸などとの塩の形で測定
系に導入することもできる。これら各種合成基
質の中では、Ｘがグリシン，アラニンなどの中
性アミノ酸であるジペプチド誘導体やＸがリジ
ン，アルギニンなどの塩基性アミノ酸であるジ
ペプチド誘導体が最も本酵素により加水分解を
受けやすく、Ｘが酸性アミノ酸であるジペプチ
ド誘導体は比較的分解されにくい。 本発明方法に用いられる合成基質としては、
ペプチド化学に於いてよく知られている方法に
より合成することができる。例えば、Ｎ−保護
−Ｘ−プロリル−アミノ化合物〔−Ａ〕を脱
保護することにより得られる。具体的には、Ｌ
−プロリル−アミノ化合物〔−Ａ〕とＮ−保
護アミノ酸とをペプチド化学で常用されている
カルボジイミド類などの縮合剤を用いて、或い
は、Ｎ−保護アミノ酸のカルボキシル基を活性
化し縮合せしめる活性エステル化法など使用ア
ミノ酸の種類により最も有利な方法でＮ−保護
アミノ酸−Ｌ−プロリル−アミノ化合物〔−
Ａ〕合成すればよい。この場合、Ｎ−保護基と
しては使用アミノ酸により適宜、公知の保護基
より選択すればよく、例えばベンジルオキシカ
ルボニル基、ｔ−ブチルオキシカルボニル基、
ｔ−アミルオキシカルボニル基、ホルミル基な
どが用いられる。 また、使用するアミノ酸に側鎖官能基が存在
する場合には、好ましくは予め常法により保護
した後、反応に供せられる。例えば、酸性アミ
ノ酸の場合にあつては、側鎖カルボキシル基を
ベンジルエステルなどのエステルに変換し用い
られる。 また、アルギニンのグアニジノ基にあつても
常用の保護基、例えばトシル基、ニトロ基、ｐ
−ニトロベンジルオキシカルボニル基、３，
４，５，６−テトラクロルベンゾイル基など、
特に前二者にて保護するのが好ましく、リジン
のＮ−ε−アミノ基は、好ましくは通常のアミ
ノ酸のα−アミノ基の保護基と同一の基にて保
護し用いればよい。斯くして得られたＮ−保護
−Ｘ−Ｌ−プロリル−アミノ化合物〔−Ａ〕
は、次に脱保護されるのであるが、保護基の脱
離方法はＮ−保護基、および側鎖官能基が存在
する場合にはその保護基の種類に応じ適宜公知
方法を選択組み合せることにより行えばよい。
その際、保護基のみを選定的に脱離する方法を
選定することが肝要である。一方、同様にＮ−
保護−Ｘ−Ｌ−プロリンをまず合成した後、ア
ミノ化合物〔−Ａ〕と縮反応せしめＮ−保護
−Ｘ−Ｌ−プロリル−アミノ化合物を得、次い
で上記の通り脱保護することによつて目的とす
るジペプチド誘導体は得ることができる。 プロテアーゼは、蛋白質やペプチドなどのペ
プチド結合を加水分解する酵素の総称で、例え
ばペプシン、トリプシン、α−キモトリプシ
ン、微生物由来のプロテアーゼ、トロンビン、
プラスミン、血漿，組織カリクレイン、ウロキ
ナーゼ，第Xa因子、コラゲナーゼ、エラスタ
ーゼ、カテプシンなどが挙られる。 また、診断として重要なプロテアーゼ類とし
ては、膵機能診断に関係するトリプシンやα−
キモトリプシン、血液凝固系，線溶系に関係す
るプロテアーゼ、例えば、プラスミン，トロン
ビン，血漿や組織カリクレイン，ウロキナー
ゼ，第Xa因子などが挙られる。 従来、これらの酵素活性測定用の合成基質と
しては、基本的には、発色性ペプチド誘導体が
用いられている。例えば、次の様な基質が挙ら
れる。 トロンビンに対する基質： Bz−Phe−Val−Arg−ｐ−ニトロアニリ
ド・HCl Ｈ−Ｄ−PHe−Pip−Arg−ｐ−ニトロアニ
リド・HCl Tos−Gly−Pro−Arg−ｐ−ニトロアニリ
ド・HCl Boc−Val−Pro−Arg−メチルクマリンア
ミド Ｈ−Ｄ−Phe−Pro−Arg−アミノイソフタ
ール酸ジメチルエステル 第Xa因子に対する基質： Bz−Ile−Glu−Gly−Arg−ｐ−ニトロアニ
リド・HCl Boc−Ile−Glu−Gly−Arg−メチルクマリ
ンアミド 血漿カリクレインに対する基質 Bz−Pro−Phe−Arg−ｐ−ニトロアニリ
ド・HCl Ｈ−Ｄ−Pro−Phe−Arg−ｐ−ニトロアニ
リド・2HCl Ｚ−Phe−Arg−メチルクマリンアミド プラスミンに対する基質： Ｈ−Ｄ−Val−Leu−Lys−ｐ−ニトロアニ
リド・2HCl Tos−Gly−Pro−Arg−ｐ−ニトロアニリ
ド・HCl Boc−Glu−Lys−Lys−メチルクマリンアミ
ド Boc−Val−Leu−Lys−メチルクマリンアミ
ド Ｈ−Ｄ−Val−Leu−Lys−アミノイソフタ
ル酸ジメチルエステル ウロキナーゼに対する基質： Bz−Val−Gly−Arg−ｐ−ニトロアニリド
HCl Pyro−Glu−Gly−Arg−ｐ−ニトロアニリ
ド・HCl Glutaryl−Gly−Arg−メチルクマリンアミ
ド 組織カリクレインに対する基質： Ｈ−Ｄ−Val−Leu−Arg−ｐ−ニトロアニ
リド・2HCl Pro−Phe−Arg−メチルクマリンアミド などがある。 測定法としては、被検液中の酵素の作用で遊
離するｐ−ニトロアニリン，アミノメチルクマ
リン，アミノイソフタル酸ジメチルエステルを
測定する方法が行なわれている。ｐ−ニトロア
ニリンの場合、発色が黄色の為、疾病に起因す
る色素、例えば、黄疸系濃黄色や溶血による赤
色などの影響を受けやすい欠点を有していた。
アミノメチルクマリンやアミノイソフタル酸ジ
メチルエステルの場合、測定が螢光測定法の
為、血清成分の影響を受けやすい欠点を有して
いた。その為、正確さを求める為には、除タン
パクなどの繁雑な操作を必要とした。またトリ
プシンやキモトリプシンの合成基質としても、
主としてアシル化塩基性アミノ酸−ｐ−ニトロ
アニリド、アシル化芳香族アミノ酸−ｐ−ニト
ロアニリドが使用されていたもので、反応によ
つて遊離するｐ−ニトロアニリンを測定するこ
とによつて行なわれていたもので、同様な欠点
を有するものであつた。 本発明の方法は、前記一般式〔〕で表わさ
れる化合物に包含されるアシル化塩基性アミノ
酸（Ｃ末端に塩基性アミノ酸を有するペプチド
体）−アミノ化合物〔−Ａ〕またはアシル化
芳香族アミノ酸−アミノ化合物〔−Ａ〕を合
成基質として用い、被検液中のトリプシン、キ
モトリプシンや血液凝固系・線溶系酵素である
プロテアーゼの作用により合成基質からアミノ
化合物〔−Ａ〕を遊離せしめ、このアミノ化
合物〔−Ａ〕を酸化酵素反応により、対応す
るカプラーの存在下で酸化縮合させて呈色せし
め、次いでこれを測定するもので、レイトアツ
セイによる自動分析にも適し、また、呈色色素
の特異的吸収波長が長波長（500〜750nm附近）
側であるため、血清中の共雑物の影響を受けず
に測定できる優れた方法である。 各酵素に対する、合成基質を構成する代表的
なアシル化塩基性アミノ酸を次に示す。 トロンビンの場合： Bz−Phe−Val−Arg−OH Ｈ−Ｄ−Phe−Pip−Arg−OH Tos−Gly−Pro−Arg−OH Boc−Val−Pro−Arg−OH Ｈ−Ｄ−Pro−Arg−OH 第Xa因子の場合： Bz−Ile−Glu−Gly−Arg−OH Boc−Ile−Glu−Gly−Arg−OH 血漿カリクレインの場合： Bz−Pro−Phe−Arg−OH Ｈ−Ｄ−Pro−Phe−Arg−OH Ｚ−Phe−Arg−OH プラスミンの場合： Tos−Gly−Pro−Arg−OH Boc−Glu−Lys−Lys−OH Boc−Val−Leu−Lys−OH Ｈ−Ｄ−Val−Leu−Lys−OH ウロキナーゼの場合： Bz−Val−Gly−Arg−OH Pyro−Glu−Gly−Arg−OH Glutaryl−Gly−Arg−OH 組織カリクレインの場合： Ｈ−Ｄ−Val−Leu−Arg−OH Pro−Phe−Arg−OH 本合成基質は、CAPやGPDAPの際に述べた
方法に従つて行なえば良い。その１例としてア
ミノ化合物〔−Ａ〕がＮ，Ｎ−ジエチルアミ
ノ−ｐ−フエニレンジアミンの場合について述
べると次の如くである。 反応媒体中にて、Boc−Arg（NO2）−OHと
Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノ−ｐ−フエニレンジア
ミン（DEAA）とを水溶性カルボジイミド
（WSC）にて脱水縮合して、Boc−Arg（NO2）
−DEAAを得る。この化合物のtert−ブチルオ
キシカルボニル基（Boc−）をHCl／酢酸エチ
ル系で水解しＨ−Arg（NO2）−DEAAを得る。 得られたＨ−Arg（NO2）−DEAAとアミノ基
が保護されたペプチド類を、CAPやGPDAPの
際に述べた方法に従つて、例えばブタノール中
などで水溶性カルボジイミドの存在下、脱水縮
合を行い、後、パラジウム触媒還元にて−
NO2基を切断し、アシル化塩基性アミノ酸−
アミノ化合物〔〕を得る。 さらに一般式〔〕で表わされる化合物を用
いる細菌内毒素（エンドトキシン）を検出する
方法に利用できるもので、従来よりカブトガニ
（Horseshoecrab）の血球抽出液（アメボサイ
ト・ライセート）が微量の細菌内毒素と反応し
てゲル化する現象をもとにした細菌内毒素の微
量検出方法が知られている。 近年臨床病理面でのエンドトキシン（細菌内
毒素）としては感染巣の明らかな疾患に由来す
る外因性エンドトキシン血症又エンドトキシン
シヨツクの病態把握を目的としての外科領域に
おけるリムラス・アメボサイト・ライセート・
テストが利用されており、また、内科領域にお
いては、肝障害におよぼす腸管内グラム陰性細
菌内毒素の影響や肝の細菌内毒素解毒排泄機能
などの網内系処理機能の低下と云つた内因性の
内毒素血症が問題となつており、血液凝固、線
溶系、キニン系、循環系および免疫反応系にお
いて臨床的に内毒素を検出測定することが必要
になつてきている。 この様な臨床診断を目的として、上記細菌内
毒素の測定法を適用する場合、検体試料として
患者体液、特に血液，腹水，尿，膵液，脳セキ
ズイ液，胆汁等を用いている。しかし、これら
の体液は、体液本来の着色を有していたり、疾
病に起因する色素例えば黄疸系濃黄色，溶血に
よる赤色などを含むことがあり、これらの色素
の妨害により分光学的方法による検出定量がし
ばしば困難となつていた。また、体液中には、
螢光性を有する物質が多種存在しているため、
合成基質の測定用残基として螢光性物質を選択
しても測定の妨害はさけられない。 本発明は、一般式〔〕で表わされる化合物
において、このR19CO−基がR′19−Gly−Arg
−（ただし式中R′19はＮ末端に保護基を有する
Ｌ−アミノ酸残基または、ペプチド残基を示
す）で表される合成基質とカブトガニのアメボ
サイト・ライセートおよび／または、該ライセ
ートより分離された酵素前駆体成分とを細菌内
毒素を含む被体に接触させることにより、その
合成基質からアミノ化合物〔−Ａ〕を生成遊
離せしめ、次いでこのアミノ化合物〔−Ａ〕
を、酸化酵素反応によりカプラー共存下で酸化
縮合させて測定するもので、レイトアツセイに
よる自動分析にも適し、また、長波長（500〜
750nm附近）側であるため、血清中の共雑物の
影響を受けずに測定できる優れた方法である。 アメボサイト・ライセートは、カブトガニ血
リンパ液中に含まれるアメボサイトを低張液で
処理する事により得ることができ、LAL−
Test（リムルス・アメボサイト・ライセート・
テスト）用の市販品を購入してもよい。例え
ば、プレゲル（帝国臓器）、パイロスタツト
（Worthington Biochem.Corp.U.S.A.）、パイ
ロテスト（Difco Lab.U.S.A.）パイロジエン
ト（Mallinchrdt.Inc.U.S.A.）などの商品名の
アメボサイト・ライセートが知られている。 酵素前駆体成分の分離は、アメボサイト・ラ
イセートをカラムクロマトグラフイー、電気泳
動法、エレクトロフオーカシング，アフイニテ
イクロマトグラフイーなどにより、精製，分離
して得ることができる。 これら、アメボサイト・ライセートもしく
は、該ライセートより分離される酵素前駆体が
細菌内毒素により活性化を受け、活性酵素とな
り、一般式〔〕で表わされる化合物に包含さ
れるペプチド性化合物である合成基質に特異的
に作用する。 式中、R′19としては例えばBoc−Leu−，
Boc−Val−Leu−，Boc−Ser−，Boc−Val
−Ser−，Bz−Leu−，Bz−Val−Leu−，Bz
−Ser−，Bz−Val−Ser−，などが挙られる。 本合成基質の合成は、プロテアーゼの際に述
べた方法に従つて行なえばよい。 ２ 糖加水分解酵素（アミラーゼ，グリコシダー
ゼなど） 糖加水分解酵素としては、アミラーゼ，デキ
ストラナーゼ（EC3.2.1.11）やセルラーゼ
（EC3.2.1.4）また、グリコシドなどを加水分解
するグリコシダーゼなどに分類されている。 アミラーゼには、α−アミラーゼ
（EC3.2.1.1）、β−アミラーゼ（EC3.2.1.2）、γ
−アミラーゼ（EC3.2.1.3）などが知られてい
るが、α−アミラーゼは、デン粉およびグルコ
ースの比較的低度の重合体およびオリゴマー中
のグルコース単位間のα〔１→４〕結合を加水
分解する酵素である。この酵素は、人体中で第
１義的には、膵臓およびだ液腺中で産生され、
病理学状態たとえば急性膵炎では上昇すること
が知られている。このα−アミラーゼ活性を測
定することは、臨床診断上、重要な検査となつ
ている。 このアミラーゼ活性値を測定するには、種々
の方法が知られている。例えば代表的な方法と
しては、ブルースターチ法が知られている。こ
れは、アミラーゼで反応した際に遊離する青色
を比色定量してその量から間接的にアミラーゼ
値を知る方法であり、広く使われている。しか
し、基質が不溶性のため、過などを行なつて
比色定量を行なわなければならず、操作が煩雑
でまた、自動化も困難なものであつた。また合
成基質を用いるアミラーゼの測定法としては、
ｐ−ニトロフエニルマルトペンタオシドを合成
基質としてα−アミラーゼを作用させ、さらに
α−グルコシダーゼによつて生じたｐ−ニトロ
フエノールを分光学的に測定する方法が知られ
ている。この方法は、血清アミラーゼを測定す
る場合、測定色素が黄色の為、例えば、ビリル
ビン血清や溶血血清の影響を受けやすい欠点が
あつた。また、２，４−ジクロロフエニルマル
トペンタオシドを合成基質とするα−アミラー
ゼを作用させ、さらにα−グルコシダーゼおよ
びβ−グルコシダーゼ作用によつて生じた２，
４−ジクロロフエノールを過ヨウ素酸ナトリウ
ムを用いて４−アミノアンチピリンと酸化縮合
させて500nmの吸光度を用いて測定する方法が
知られているがこの方法は自動分析には適さな
いものであつた。 本発明は、以上の欠点を解決するものでレー
トアツセイによる自動分析および長波長側での
測定を可能にしたものである。 本発明でアミラーゼ活性を測定するに当つ
て、マルトオリゴ糖の水酸基とフエノール化合
物〔−Ｆ〕のフエノール水酸基とを結合せし
めて得られる化合物を合成基質とし、用いるも
のである。この合成基質は、アミラーゼの作用
を受けてマルトオリゴ糖部分が加水分解され、
フエノール化合物〔−Ｆ〕と結合してなるグ
ルコシド，マルトシドもしくはマルトペンタオ
シドを生成するもので、次いでα−グルコシダ
ーゼおよびまたはβ−グルコシダーゼを作用さ
せて遊離するフエノール化合物〔−Ｆ〕を定
量する事によりアミラーゼ活性を測定するもの
である。 本発明に使用する合成基質に用いられるマル
トオリゴ糖とは、α−１，４−グルコシド結合
でＤ−グルコースが２〜10個程度結合した糖類
を含むものであり、例えば、マルトース，マル
トトリオース，マルトテトラオース，マルトペ
ンタオース，マルトヘキサオースなどがあり、
特にマルトテトラオース，マルトペンタオース
やマルトヘキサオースが好ましく、下記一般式
〔〕で表わされる化合物における単糖類単位
としての基（Ｓ）および整数ｎにて示されるも
のである。 本発明における合成基質の製造に用いられる
フエノール化合物〔−Ｆ〕としては、マルト
オリゴ糖とその還元末端にα−またはβ−結合
し、かつ、α−グルコシダーゼやβ−グルコシ
ダーゼにより容易に遊離し、定量が容易なもの
であればよい。この様なフエノール化合物〔
−Ｆ〕としては前記のアミノフエノール系化合
物を合む種々のフエノール化合物〔−Ｆ〕が
挙られる。 また本発明の合成基質を一般式にて示せば、
下記一般式〔〕 （ただし式中、R″1またはR″2のいずれか一
方は（Ｓ）ｎ−Ｏ−基を示し、他方は水素原子
を示し、Ｓは単糖類単位を示し、ｎは１以上の
整数を示し、R3，R4，R5，R6は前記と同じ基
を示す）で表わされる化合物であり、特に基Ｓ
としてグルコース単位、ｎ＝２〜８の整数が好
ましい例として挙られる。 本発明における一般式〔〕で表わされる合
成基質は、フエノール化合物〔−Ｆ〕とマル
トオリゴ糖を通常の方法に従つて合成する。例
えば、化学的にマルトオリゴ糖をアセチル化
し、このアセチル化マルトオリゴ糖とフエノー
ル化合物〔−Ｆ〕を結合させた後、脱アセチ
ルする事により合成できる。（実験化学講座第
24巻、304頁、1958年参照） また、サイクロマルトデキストリン・グルカ
ノトランスフエラーゼ（cyclomaltodextrin
gluconotransferase：EC2.4.1.19）をグルコシ
ル基１つを有するフエノール化合物〔−Ｆ〕
−α−Ｄ−グルコシドで表わされる化合物とマ
ルトデキストリンとを反応させ、一般式〔〕
で表わされる化合物を得ることもできる。
（Wallenfels et al.Carbohyd.Res.61，359，
1978参照）。 この場合例えば一般式〔〕で表わされる化
合物におけるｎ＝２〜８が生成されるので、従
来の分離、精製手段にて目的とする画分を得
る。 また例えば血清中のアミラーゼ活性測定にお
いては、適当な緩衝液例えば前記した緩衝液中
で酵素と合成基質、さらにα−グルコシダーゼ
とを接触させ、また必要に応じてβ−グルコシ
ダーゼを用いてもよく、この酵素作用によつて
遊離したフエノール化合物〔−Ｆ〕を対応す
るカツプラーおよび酸化酵素を用いることによ
り定量測定される。 またグルコシダーゼには、α−グルコシダー
ゼ（EC3.2.1.20），β−グルコシダーゼ
（EC3.2.1.21），α−カラクトシダーゼ
（EC3.2.1.22），β−ガラクトシダーゼ
（EC3.2.1.23），α−マンノシダーゼ
（EC3.2.1.24），β−マンノシダーゼ
（EC3.2.1.25），β−グルクロニダーゼ
（EC3.2.1.31），β−キシロシダーゼ
（EC3.2.1.37），α−Ｌ−フコシダーゼ
（EC3.2.1.51），α−Ｎ−アセチルガラクトサミ
ニダーゼ（EC3.2.1.49），α−アセチルグルコ
サミニダーゼ（EC3.2.1.50），β−Ｎ−アセチ
ルガラクトサミニダーゼ（EC3.2.1.53），β−
Ｎ−アセチルグルコミニダーゼ（EC3.2.1.30）
などが知られている。 これらの酵素活性を測定するには、合成基質
として、前記一般式〔〕で表わされる化合物
の内単糖類単位の基Ｓがペントース単位，ヘキ
ソース単位，ヘキソサミン単位，またはウロン
酸単位を示し、ｎ＝１にて示される化合物が挙
られる。また例えばペントース単位としてはキ
シロース単位が挙られ、ヘキソース単位として
はグルコース単位，ガラクトース単位，マンノ
ース単位，フコース単位などが挙られ、ヘキソ
サミン単位としてはＮ−アセチルガラクトサミ
ン単位，Ｎ−アセチルグルコサミン単位が挙ら
れ、さらにウロン酸単位としてはグルクロン酸
が挙られる。この合成基質を用いることによ
り、対象とすべきグルコシダーゼ作用を受けて
合成基質からフエノール化合物〔−Ｆ〕が遊
離・生成され、次いでこのフエノール化合物
〔−Ｆ〕を対応するカツプラーおよび酸化酵
素を用いることにより定量し、よつて対象とす
るグルコシダーゼ活性を測定するものである。
例えばα−グルコシダーゼ活性の測定の場合、
例えば市販のグルコシダーゼ活性測定用基質で
あるフエニル−β−Ｄ−グルコシドを合成基質
として使用してその酵素活性を測定するには、
適当な緩衝液中でグルコシダーゼを含有する被
検液と合成基質とを接触させ、通常37℃にて酵
素反応せしめ、この遊離したフエノールを対応
するカツプラーおよび酸化酵素を用いて呈色せ
しめ、次いでこれを測定すればよい。 ３） ホスフアターゼ ホスフアターゼは、リン酸エステル化合物を
加水分解する酵素の総称であつて、多くの場
合、単に加水分解に関与するだけでなく、その
逆の合成反応にも関与すると考えられ、反応方
向は基質および生成物の相対的濃度に支配され
る。 生体内では、種々のリン酸エステル化合物が
知られているが、これらの代謝に関与する各種
のホスフアターゼは、これが作用する基質の加
水分解部位の結合様式から (1) ホスホモエステラーゼ (2) ホスホジエステラーゼ (3) ピロホスフアターゼ (4) メタホスフアターゼ (5) ポリホスフアターゼ (6) ホスホアミダーゼ の６種類に分類され、このうち臨床検査に利用
されるものは(1)のホスホモノエステラーゼに属
するものであつて、これは例えばフエニルリン
酸，ｐ−ニトロフエニルリン酸，β−グルセロ
リン酸などを非特異的に加水分解する。 一般に、至適PHがアルカリ側にあるものをア
ルカリ性ホスフアターゼ（EC3.1.3.1）（AlPと
略す）、酸性側にあるものを酸性ホスフアター
ゼ（EC3.1.3.2）（ACPと略す）と呼ぶ。 AlPの大部分は骨、肝、胎盤、小腸、粘膜に
由来し、その存在部位が主として細胞膜である
ことから膜を通じての能動輸送、すなわち、物
質代謝に関与しているものと考えられており、
また血清AlPが病的な増加を示す疾患には、ク
ル病、骨軟化症、骨折などの骨疾患、肝・胆道
系疾患、腫瘍疾患などがあり、血清AlP定量
は、種々の疾患の鑑別診断、および経過観察に
重要である。また血清ACP活性の臨床検査と
しては主に前立腺癌の診断である。さらに女性
の場合には乳癌の転移時にも高値を示すと云わ
れている。この様に、血清中ACP定量は種々
の疾患の鑑別診断および経過観察に重要であ
る。 これら、ホスフアターゼ活性を測定する従来
法としては以下の方法が挙られる。 ホスフアターゼ活性測定において大別する
と、１つは、有機リン酸エステルを加水分解し
遊離したリン酸を測定する方法、もう１つはフ
エノール類の有機リン酸エステルを基質として
用い、遊離したフエノールを測定する方法であ
る。リン酸を含有する方法は、試料中に共存し
ているリン酸も測定されるので、試料中の無機
リンを同時に測定して差し引かねばならず、ま
た反応時間が長く、除蛋白操作が必要なことな
ど操作が煩雑で好ましい方法とは云えない。 また、フエノール類を測定する方法は、例え
ばフエニルリン酸を基質に使用した場合、遊離
したフエノールをフエリシアン化カリウム存在
下で４−アミノアンチピリンと酸化縮合させ、
生じた赤色キノンを比色するKind−King法が
ある。また、ホウ酸緩衝液導入により呈色の安
定化を行い基質中に４−アミノアンチピリンを
添加することで強アルカリ添加を除去した簡便
なKind−King変法もある。さらに、フエリシ
アン化カリウムの代りに、芳香族スルホンハロ
ゲンアミドアルカリ塩（クロラミンＴなど）
（特開昭52−155597）や過酸化水素−パーオキ
シダーゼ系を用いる方法も報告されている。フ
エリシアン化カリウム系はシアン化合物である
ため廃液の処理が問題を生じ、また、その分解
処理にも費用がかかるのが欠点であり、さら
に、廃液処理施設を持たない殆んどの小規模診
療機関などではそのまま下水中に放流される場
合が多く、環境汚染の一因ともなつている。こ
れらの理由からそれに代りうるものが望まれて
おり、かつ、これらの方法ではレートアツセイ
が行う事が出来ない欠点を有している。さらに
また過酸化水素−パーオキシダーゼは、過酸化
水素が不安定な為、実用上、問題があり現在使
用されていない。 ｐ−ニトロフエニルリン酸あるいはフエノー
ルフタレインリン酸を合成基質としてホスホモ
ノエステラーゼを含有する被検液を作用せし
め、反応後、各々遊離するｐ−ニトロフエノー
ル、フエノールフタレインをアルカリ性下直接
比色する方法としてはBessey−Lowry法，
Huggins−Talalay法が挙られる。しかし、こ
れらは、血清中のビリルビンやヘモグロビンの
影響を受けるため、必ずブランクをおかなけれ
ばならない欠点があつた。 その他、α−ナフチルリン酸を基質として遊
離するα−ナフトールを340nmで測定する方法
などがあるが、試料中の共存物の影響、α−ナ
フトールの発癌性などの問題などで好ましい測
定法ではない。 本発明は、以上の欠点を解決するるもので、
レートアツセイおよび長波長域での測定を可能
にしたものである。 本発明でホスフアターゼ活性を測定するに
は、下記一般式〔〕 （ただし式中、Ｒ1またはＲ2のいずれか
一方は
下記一般式〔〕 （ただし式中、R1またはR2のいずれか一方
はR19CO−NH−基、（Ｓ）ｎ−Ｏ−基、R20−
Ｏ−PO（OH）−Ｏ−基またはR21CO−Ｏ−基
で、R19CO−はアミノ酸残基またはペプチド残
基を示し、Ｓは単糖類単位、ｎは１以上の整数
を示し、R20−Ｏ−はHO−基または置換また
は未置換グリセロール残基を示し、R21CO−は
脂肪酸残基を示し、R1またはR2の他方、R3、
R4、R5またはR6は各々水素原子、ハロゲン原
子、低級アルキル基、低級アルコキシル基、ア
ミノ基、置換アミノ基、水酸基、カルボキシル
基またはスルホ基を示し、またはR5およびR6
は一緒になつて六員環を形成してもよい基を示
す）で表される合成基質を用い、下記一般式
〔〕 （ただし式中、R7は水酸基、アミノ基また
は置換アミノ基を示し、R8、R9、R10、R11ま
たはR12は各々水素原子、ハロゲン原子、低級
アルキル基、低級アルコキシル基、アミノ基、
置換アミノ基、水酸基、カルボキシル基または
スルホ基を示し、またはR11およびR12は一緒
になつて六員環を形成してもよい基を示し、但
し、R7、R8、R9、R10、R11、R12の各基におい
て上記一般式〔〕で表される合成基質から加
水分解酵素の作用にて遊離される化合物と同一
化合物である場合を除く）で表されるカプラー
および酸素の共存下、少なくとも上記一般式
〔〕で表される合成基質から加水分解酵素の
作用にて遊離される化合物と一般式〔〕で表
されるカプラーとを酸素を消費して色素を形成
する酸化酵素を作用せしめ、次いで反応系にお
ける検出可能な変化の量を測定することを特徴
とする被検液中の加水分解酵素活性の測定法を
提供するものである。 一般に、酵素を用いて色素を形成させて被検液
中の化合物を測定することは、酵素分析法として
多く行なわれるようになつたが、その大部分は、
過酸化水素やフエノールまたはそれらを生成する
か遊離する化合物の測定としてであつて、パーオ
キシダーゼを用いて測定する方法である。例えば
過酸化水素の測定の場合、フエノールおよび色原
体、例えば、４−アミノアンチピリン共存下でパ
ーオキシダーゼを作用させるとH2O2→H2O＋
〔Ｏ〕の反応が起こり、〔Ｏ〕が酸化作用を示し、
フエノールおよび色原体を酸化縮合させて色素を
形成する。次いでこの呈色色素の特異的吸収波長
を測定することにより、間接的に過酸化水素の量
を測定することができる。過酸化水素を生成する
化合物の定量例としてグルコースの測定の例を挙
げる。β−Ｄ−グルコースは、グルコースオキシ
ダーゼの下記式〔〕にて示される作用により、
最終的に過酸化水素が生成される。 β−Ｄ−グルコース＋H2O＋O2→Ｄ−グルコ
ン酸＋過酸化水素〔〕この過酸化水素を先に述
べた方法で定量することにより、間接的にβ−Ｄ
−グルコースの濃度を定量することができる。 この方法は、過酸化水素を含有または過酸化水
素を生成ないしは遊離する反応系において有効な
測定法であり、最近、臨床生化学分野における分
析法の１つとして利用されている。 一方、フエノール系化合物を測定する場合は、
過酸化水素を試薬として利用する必要性が生じ
る。過酸化水素は不安定な物質であるため、この
方法でフエノール系化合物を測定することは良好
な測定法とはいえず、ほとんど利用されていな
い。 パーオキシダーゼを用いる以外の方法で色素を
形成させる酵素反応としては、ニコチンアデニン
ジヌクレオチドまたはニコチンアデニンジヌクレ
オチドホススフエート〔NAD（Ｐ）〕を用いる脱
水素酵素系を介してNAD（Ｐ）からの還元型
NAD（Ｐ）〔NAD（Ｐ）Ｈ〕への変化をもたらす
反応を利用し、生成したNAD（Ｐ）Ｈにジアホラ
ーゼと電子伝達系色素を作用させてホルマザン色
素を形成させ測定する方法が知られている。しか
し、この方法は、ホルマザン色素が不溶性であ
り、また、キユベツトやチユーブなどにこの色素
が付着し洗浄により良好にとれないなどの欠点が
あり不適当なものであつた。 本発明者らは、先に、ｐ−フエニレンジアミン
またはその誘導体が、意外にもアスコルビン酸オ
キシダーゼやラツカーゼなどの酸化酵素で酸化さ
れ色素を形成することを知り、これを利用したロ
イシンアミノペプチダターゼ活性測定法を見い出
した（特願昭57−115345号明細書特開昭59−6898
号公報参照）。 この測定法は、従来よりの化学的酸化手段のみ
による測定法に比べて酵素法で温和な条件にて行
なえることやレイト・アツセイによる自動分析を
も可能にしたところに特徴を有するものであつ
た。 上記発明において、フエノール誘導体を酸化酵
素によつて酸化せしめた場合には約350〜500nm
近辺に極大吸収をもつ化合物に変化するものであ
つた。 しかし、全く意外にも、本発明で使用されるア
スコルビン酸オキシダーゼやラツカーゼなどの酸
化酵素は、一般式〔〕で表わされる合成基質か
ら加水分解酵素の作用にて遊離される化合物とカ
プラー（ここでいうカプラーとは、一般式〔〕
で表わされる合成基質から加水分解酵素の作用に
て遊離される化合物と酵素的に酸化縮合するもの
であればいずれのものでもよい）とを温和な条件
にて酸化縮合させる特性をも発揮し、かつ従来の
極大吸収域とは全く異なる500〜750nm付近に極
大吸収を持つ化合物である色素を形成することを
知つたもので、このことは全く驚くべき事であつ
た。 一般式〔〕で表わされる合成基質から加水分
解酵素の作用にて遊離される化合物の中でも、例
えば、３，５−ジブロム−４−ヒドロキシアニリ
ンの如きは、カツプラーを用いない上記の酸化酵
素単独では測定系として有効な呈色を示さなかつ
たが、ところがカプラー共存下で酸化縮合を行な
わせると、600〜700nm附近に極大吸収を持つ色
素化合物を形成する全く驚くべき事を知つたもの
でこの反応は、従来、全く知られていない新規な
反応に基くものと推定されるものである。 さらに一般式〔〕で表わされる合成基質から
加水分解酵素の作用にて遊離される化合物を構成
因子として加水分解酵素の合成基質を得たとこ
ろ、この合成基質は対応する加水分解酵素の酵素
作用により良好に一般式〔〕で表わされる合成
基質から加水分解酵素の作用にて遊離される化合
物を遊離したもので、さらにこの遊離した化合物
を上記手段によつて良好に色素を形成せしめ得る
ことを知り、加水分解酵素の活性測定として有用
な定量法を見い出した。 本発明は、上記の知見に基づいて完成されたも
ので被検液中の加水分解酵素活性測定において、
下記一般式〔〕 （ただし式中、R1またはR2のいずれか一方は
R19CO−NH−基、（Ｓ）ｎ−Ｏ−基、R20−Ｏ−
PO（OH）−Ｏ−基またはR21CO−Ｏ−基で、
R19CO−はアミノ酸残基またはペプチド残基を示
し、Ｓは単糖類単位、ｎは１以上の整数を示し、
R20−Ｏ−はHO−基または置換または未置換グ
ルセロール残基を示し、R21CO−は脂肪酸残基を
示し、R1またはR2の他方、R3、R4、R5またはR6
は各々水素原子、ハロゲン原子、低級アルキル
基、低級アルコキシル基、アミノ基、置換アミノ
基、水酸基、カルボキシル基またはスルホ基を示
し、またはR5およびR6は一緒になつて六員環を
形成してもよい基を示す）で表される合成基質を
用い、下記一般式〔〕 （ただし式中、R7は水酸基、アミノ基または
置換アミノ基を示し、R8、R9、R10、R11または
R12は各々水素原子、ハロゲン原子、低級アルキ
ル基、低級アルコキシル基、アミノ基、置換アミ
ノ基、水酸基、カルボキシル基またはスルホ基を
示し、またはR11およびR12は一緒になつて六員
環を形成してもよい基を示し、但し、R7、R8、
R9、R10、R11、R12の各基において上記一般式
〔〕で表される合成基質から加水分解酵素の作
用にて遊離される化合物と同一化合物である場合
を除く）で表されるカプラーおよび酸素の共存
下、少なくとも上記一般式〔〕で表される合成
基質から加水分解酵素の作用にて遊離される化合
物と一般式〔〕で表されるカプラーとを酸素を
消費して色素を形成する酸化酵素を作用せしめ、
次いで反応系における検出可能な変化の量を測定
することを特徴とする被検液中の加水分解酵素活
性の測定法として有用なものである。 一般式〔〕で表わされる合成基質を定量する
際に用いられる酸化酵素としては、反応におい
て、少くとも一般式〔〕で表わされる合成基質
から加水分解酵素の作用にて遊離される化合物と
一般式〔〕で表されるカプラーとを酸素を消費
して色素を生成もしくは形成させる酸化酵素であ
ればよく、例えば、アスコルビン酸オキシダー
ゼ，ラツカーゼ，アミノフエノールオキシダー
ゼ，ポリフエノールオキシダーゼ，チロシナーゼ
などが挙げられる。また、これらの酸化酵素は限
定されるものではないが、特に、アスコルビン酸
オキシダーゼ、ラツカーゼまたはチロシナーゼは
良好な酵素として挙げられる。例えば、アスコル
ビン酸オキシダーゼとしては、カボチヤ、キユウ
リあるいはハヤトウリ（特開昭56−88793号公報）
などから得られた酵素等が挙げられ、また、ラツ
カーゼとしては、例えば、ウルシや担子菌コリカ
ラス・ベルシカラー，リゾプス属に属する生産菌
やポリポラス・ベルシカラー〔J.Biochem.，50，
264，（1961）；Biochem.Biophys.Acta.73，204，
（1963），Acta Chem.Scand.21，2367，（1967）〕
などから得られた酵素が挙げられ、また、これら
は市販の酵素を用いてもよい。 さらにこれらの酵素は固定化酵素として使用し
てもよい。この場合には、自動分析装置へ組み込
んで測定を行なうことが可能となり、酸素電極に
て電気化学的変化として測定を行なうことによ
り、高価な酵素の使用を著しく少量ならしめる。
さらに酵素電極たる固定化酵素と上記電極とを組
み合わせたセンサーとして用いることにより、迅
速に、しかも種々の試薬も必要とせず、さらに繰
り返し測定利用でき、さらにまた有色物質を含む
各種の測定試料にも適用できる。 さらに一般式〔〕で表わされる合成基質を定
量するに当つて、使用されるカプラーとしては一
般式〔〕で表わされる合成基質から加水分解酵
素の作用にて遊離される化合物と酸化縮合して色
素を形成されるものであればいずれのものでもよ
い。一般式〔〕で表わされる合成基質から加水
分解酵素の作用にて遊離される化合物において、
遊離したアミノ基を有し、またはR2、R3、R4、
R5もしくはR6のいずれかの基の１以上がアミノ
基を示す場合には水素原子を示してもよく、R2、
R3、R4、R5またはR6は前記と同じ基を示す一般
式〔〕で表わされる化合物（以下、アミノ化合
物〔−Ａ〕という）においては、カプラーとし
て下記一般式〔〕 （ただし式中、R7は水酸基、アミノ基または
置換アミノ基を示し、R8、R9、R10、R11または
R12は水素原子、ハロゲン原子、低級アルキル
基、低級アルコキシル基、アミノ基、置換アミノ
基、水酸基、カルボキシル基またはスルホ基を示
し、またはR11およびR12は一諸になつて環を形
成してもよい基を示す）で表わされる化合物が挙
げられる。その代表的なアミノ化合物〔−Ａ〕
のカプラーとしては、例えばフエノール、サリチ
ル酸、ｍ−ヒドロキシ安息香酸、２，６−ジヒド
ロキシ安息香酸、２−アミノ−３−ヒドロキシ安
息香酸、２−ヒドロキシ−５−アミノ安息香酸、
ｐ−ヒドロキシ安息香酸、サリチル酸メチル、ｏ
−メチルフエノール、ｍ−メチルフエノール、ｐ
−メチルフエノール、ｏ−メトキシフエノール、
ｍ−メトキシフエノール、ｐ−メトキシフエノー
ル、ｏ−クロロフエノール、ｍ−クロロフエノー
ル、ｐ−クロロフエノール、２，３−ジメチルフ
エノール、２，４−ジメチルフエノール、２，５
−ジメチルフエノール、２，６−ジメチルフエノ
ール、３，５−ジメチルフエノール、２，６−ジ
クロロフエノール、ｏ−アミノフエノール、ｍ−
アミノフエノール、ｐ−ブロムフエノール、ｏ−
エチルフエノール、ｍ−エチルフエノール、２，
４−ジクロロフエノール、２，４−ジブロムフエ
ノール、２，６−ジブロムフエノール、２，６−
ジブロム−４−アミノフエノール、２，６−ジク
ロロ−４−アミノフエノール、２，６−ジメトキ
シフエノール、２−メチル−６−クロロフエノー
ル、２−クロロ−５−メチルフエノール、２−ア
ミノ−４−クロロフエノール、Ｎ，Ｎ−ジエチル
−ｍ−アミノフエノール、２−アミノ−４−メチ
ルフエノール、ｏ−カルボキシメチルフエノー
ル、２−カルボキシ−４−アミノフエノール、
３，４−ジヒドロキシフエネチルアミン、α−ナ
フトール、β−ナフトール、４−クロロ−１−ナ
フトール、２−カルボキシ−１−ナフトール、１
−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸、１−ナフトール
−２−スルホン酸、１−ナフトール−３−スルホ
ン酸、１−ナフトール−４−スルホン酸、１−ナ
フトール−８−スルホン酸、２−ナフトール−６
−スルホン酸、−ナフトール−７−スルホン酸、
２−ナフトール−８−スルホン酸、２−ナフトー
ル−３，６−ジスルホン酸、２−ナフトール−
６，８−ジスルホン酸、Ｎ，Ｎ−ジエチル−ｍ−
アミノアニリン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−ｍ−アミノ
アニリン、ｏ−カルボキシアニリン、ｍ−カルボ
キシアニリン、ｏ−クロロアニリン、ｍ−クロロ
アニリン、ｍ−ブロムアニリン、ｏ−メチルアニ
リン、ｍ−メチルアニリン、Ｎ，Ｎ−ジメチルア
ニリン、Ｎ，Ｎ−ジエチルアニリン、Ｎ，Ｎ−エ
チル・エチルヒドロキシアニリン、Ｎ，Ｎ−エチ
ル・エチルヒドロキシメタトルイジン、３−アミ
ノ−４−クロロアニリン、２−メチル−３−クロ
ロアニリンなどが挙られる。また一般式〔〕で
表わされる合成基質から加水分解酵素の作用にて
遊離される化合物において遊離した水酸基を有
し、またはR2、R3、R4、R5もしくはR6のいずれ
かの基の１以上が水酸基を示す場合には水素原子
を示してもよく、R2、R3、R4、R5またはR6は前
記と同じ基を示す一般式〔〕で表わされる化合
物（以下、フエノール化合物−Ｆという）にお
いては、カプラーとして下記一般式〔〕 （ただし式中、R13はアミノ基または置換アミ
ノ基を示し、R14、R15、R16、R17またはR18は水
素原子、ハロゲン原子、低級アルキル基、低級ア
ルコキシル基、アミノ基、置換アミノ基、水酸
基、カルボキシル基またはスルホ基を示し、また
はR17およびR18は一諸になつて環を形成しても
よい基を示す）で表わされる化合物が挙られる。
この代表的なフエノール化合物〔−Ｆ〕のカプ
ラーとしては、例えば、Ｎ−エチルアニリン、
Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン、Ｎ，Ｎ−ジエチルア
ニリン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−ｏ−トルイジン、
Ｎ，Ｎ−ジメチル−ｐ−トルイジン、Ｎ，Ｎ−ジ
エチル−ｏ−トルイジンン、Ｎ，Ｎ−ジエチル−
ｍ−トルイジン、Ｎ，Ｎ−ジエチル−ｐ−トルイ
ジン、アントラニル酸、ｐ−ジメチルアミノ安息
香酸、ｐ−クロロ−ｏ−トルイジン、ｍ−フエニ
レンジアミン、ｐ−フエニレンジアミン、アニリ
ン、ｏ−メチルアニリン、ｍ−メチルアニリン、
ｏ−カルボキシアニリン、ｏ−クロロアニリン、
ｍ−クロロアニリン、ｍ−ブロモアニリン、２−
メチル−５−カルボキシアニリン、Ｎ，Ｎ−エチ
ル−ヒドロキシエチルアニリン、Ｎ，Ｎ−ジメチ
ル−ｍ−フエニレンジアミン、Ｎ，Ｎ−ジメチル
−ｐ−フエニレンジアミン、Ｎ，Ｎ−ジエチル−
ｐ−フエニレンジアミン、２−メチル−ｍ−フエ
ニレンジアミン、４−メチル−ｏ−フエニレンジ
アミン、４−メチル−ｍ−フエニレンジアミン、
２−メトキシ−５−クロロアニリン、２−エチル
アニリン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−ｍ−トルイジン、
２−クロロ−ｍ−フエニレンジアミン、２−メチ
ル−３−クロロアニリン、２，５−ジメトキシア
ニリン、１−アミノ−５−ナフタレンスルホン
酸、１−アミノ−６−ナフタレンスルホン酸、
Ｎ，Ｎ−エチル・エチルヒドロキシ−メタトルイ
ジン、３，５−ジブロム−４−ヒドロキシアニリ
ン、３，５−ジクロロ−４−ヒドロキシアニリ
ン、ｏ−ヒドロキシアニリン、ｍ−ヒドロキシア
ニリン、２−アミノ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリ
ン、ｐ−Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノアニリン、ｐ−
Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノアニリン、３−アミノ−
４−クロロ−アニリン、２−メチル−３−アミノ
アニリン、２−メチル−５−アミノアニリン、３
−カルボキシアニリン、３−カルボキシ−４−ヒ
ドロキシアニリン、２−メチル−５−カルボキシ
アニリン、などが挙られる。またこの一般式
〔〕で表わされる化合物をカプラーとして用い
たときの定量対象となるアミノ化合物〔−Ａ〕
としては、例えば、４−ヒドロキシ−３，５−ジ
クロロアニリン、４−ヒドロキシ−３，５−ジブ
ロムアニリン、ｐ−Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノアニ
リン、ｐ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノアニリン−ｍ
−フエニレンジアミン、ｐ−フエニレンジアミ
ン、ｏ−アミノフエノール、ｍ−アミノフエノー
ル、アニリン、ｏ−トルイジン、ｍ−トルイジ
ン、ｏ−カルボキシアニリン、ｏ−クロロアニリ
ン、ｍ−クロロアニリン、ｍ−ブロムアニリン、
ｍ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノアニリン、２−クロ
ロ−５−アミノアニリン、２−メチル−３−クロ
ロアニリン、２，５−ジメトキシアニリン、２−
メチル−３−アミノアニリン、２−メチル−５−
アミノアニリン、２−メチル−５−カルボキシア
ニリン、２−ヒドロキシ−６−カルボキシアニリ
ン、２−ヒドロキシ−５−メチルアニリン、３−
カルボキシアニリン、３−カルボキシ−４−ヒド
ロキシアニリン、２−ヒドロキシ−５−クロロア
ニリン、ｏ−エチルアニリン、２−メチル−５−
カルボキシアニリン、１−アミノ−６−ナフトー
ル−スルホン酸、３−アミノ−４−クロロアニリ
ンなどが挙られる。さらに、一般式〔〕で表わ
される化合物をカプラーとして用いたときの定量
対象となるフエノール化合物〔−Ｆ〕として
は、例えば４−アミノ−２，６−ジクロロフエノ
ール、４−アミノ−２，６−ジブロムフエノー
ル、ｏ−アミノフエノール、ｍ−アミノフエノー
ル、ｐ−アミノフエノール、ｍ−カルボキシフエ
ノール、ｐ−カルボキシフエノール、フエノー
ル、ｏ−クロロフエノール、ｍ−クロロフエノー
ル、ｐ−クロロフエノール、ｐ−ブロモフエノー
ル、ｏ−エチルフエノール、ｍ−エチルフエノー
ル、ｏ−メチルフエノール、ｍ−メチルフエノー
ル、ｐ−メチルフエノール、ｏ−メトキシフエノ
ール、サリチル酸、サリチル酸メチル、ｏ−カル
ボキシメチルフエノール、ｍ−Ｎ，Ｎ−ジエチル
アミノフエノール、２，４−ジクロロフエノー
ル、２，４−ジブロモフエノール、２，６−ジブ
ロモフエノール、２，６−ジメトキシフエノー
ル、３，５−ジメチルフエノール、２，５−ジメ
チルフエノール、２，４−ジメチルフエノール、
２，３−ジメチルフエノール、２，６−ジメチル
フエノール、２−メチル−６−クロロフエノー
ル、２−クロロ−５−メチルフエノール、２−ア
ミノ−３−カルボキシフエノール、２−アミノ−
４−メチル−フエノール、２−カルボキシ−４−
アミノフエノール、２−アミノ−４−クロロフエ
ノール、α−ナフトール、β−ナフトール、４−
クロロ−１−ナフトール、２−カルボキシ−１−
ナフトール、１−ナフトール−２−スルホン酸、
１−ナフトール−３−スルホン酸、１−ナフトー
ル−４−スルホン酸、１−ナフトール−８−スル
ホン酸、２−ナフトール−６−スルホン酸、２−
ナフトール−８−スルホン酸、２−ナフトール−
３，６−ジスルホン酸、８−ヒドロキシ−キノリ
ン−５−スルホン酸、などが挙られる。なお、定
量対象としてのアミノ化合物〔−Ａ〕やフエノ
ール化合物−Ｆにおいて、化合物中アミノ基お
よび水酸基の両基を少なくとも有している化合物
例えばｏ−，ｍ−，ｐ−アミノフエノール、２−
クロロ−４−アミノフエノール、２−アミノ−４
−カルボキシフエノール、２−アミノ−４−メチ
ルフエノール、２−カルボキシ−４−アミノフエ
ノール、２−アミノ−４−クロロフエノール、
２，６−ジクロロ−４−アミノフエノール、２，
６−ジブロモ−４−アミノフエノールなどのアミ
ノフエノール系化合物に関しては、アミノ化合物
〔−Ａ〕としても分類でき、またフエノール化
合物〔−Ｆ〕としても分類できるものである。
従つてこのようなアミノフエノール系化合物の定
量に当つては、アミノ化合物〔−Ａ〕およびフ
エノール化合物〔−Ｆ〕に対するいずれのカプ
ラーも使用できるものであるが、またこのような
アミノフエノール系化合物に対するカプラーの使
用組合せとしては、アミノフエノール系化合物と
カプラーとが同一化合物である場合の組合せ例は
除かれるものである。 次いで、一般式〔〕で表わされる合成基質
（以下合成基質〔〕と略す）を定量するに当つ
て、測定対象とする加水分解酵素を含有する被検
液に合成基質〔〕を加えて、一般式〔〕また
は一般式〔〕で表わされるカプラーの共存下に
酸素を消費して色素を生成する酸化酵素を作用せ
しめるのであるが、用いるカプラーの量として
は、合成基質〔〕に対して等モル比以上用いれ
ばよく、また上限使用量としては酵素活性を阻害
しない程度まで用いることができる。 また、これらのカプラーは、通常中性近辺の緩
衝液、例えばトリス−塩酸緩衝液、リン酸緩衝
液、ジメチルグルタール酸−NaOH緩衝液、酢
酸緩衝液、イミダゾール−塩酸緩衝液、ピペス−
NaOH緩衝液、クエン酸緩衝液などに溶解して
一定濃度に調製したものが用いられる。さらに用
いられる酸化酵素において、通常反応が充分進行
する量の酵素量が用いられ、例えば、合成基質
〔〕0.1mモル／濃度の0.1〜５mlを対象とする
に当つてアスコルビン酸オキシダーゼとしては10
〜1000単位程度、好ましくは50〜200単位程度、
またラツカーゼやチロシナーゼとしては10〜1000
単位程度好ましくは50〜500単位程度を含有せし
めればよい。また反応温度としては、25〜40℃、
通常37℃近辺にて行なえばよい。さらに反応時間
としては、用いる酵素量、温度条件や測定手法な
どによつて多少異なるが、通常１分以上であれば
よく、またレイトアツセイ手法による測定手段の
場合には、１分以上行なえばよく、またその他の
比色定量の手段による測定手段の場合には５分以
上行なうことが好ましい。 次いで反応後、反応系における検出可能な変化
の量を測定するのであるが、通常反応系における
消費された酸素の量または生成された色素の量を
もつて測定する。また酸素の量の測定に当つて
は、酸素電極による電気化学的変化として検出
し、定量することが簡便である。さらに生成され
た色素の量の測定に当つては、生成された色素の
有する特異的吸収波長域、例えば500〜750nm付
近の特異的吸収波長域にて比色定量すればよい。
その後この測定に基いて、被検液中の加水分解酵
素によつて反応した合成基質〔〕の量を、検量
線によつて算出すればよく、このようにして正確
かつ簡便に合成基質〔〕を定量し得るものであ
る。 また、この合成基質としては、加水分解酵素、
例えばペプチダーゼ、プロテアーゼ、アミラー
ゼ、グリコシダーゼなどの糖分解酵素、ホスフア
ターゼ、エステラーゼ、リパーゼなど加水分解酵
素の範ちゆうに包含される酵素によつて加水分解
され、よつて合成基質〔〕からアミノ化合物
〔−Ａ〕またはフエノール化合物〔−Ｆ〕を
遊離、生成するものである。さらにこれらの加水
分解酵素としては、例えば市販の酵素試薬、培養
による酵素含有培養物や酵素含有生細胞または組
織、血清、尿やだ液などの生体試料中含有されて
いる酵素が挙られる。本発明においては、これら
の加水分解酵素を含有する試料を被検液として、
これに対応する合成基質の一定量を加え、通常37
℃にて反応せしめ、次いで被検液中の酵素の作用
によつてアミノ化合物〔−Ａ〕またはフエノー
ル化合物〔−Ｆ〕を遊離生成せしめ、次いでこ
のアミノ化合物〔−Ａ〕またはフエノール化合
物〔−Ｆ〕を前記のカツプラーの共存下、少な
くとも酸素を消費して色素を生成する酸化酵素を
用いる方法によつて、定量し、それに基いて被検
液中の酵素活性を測定してなるものである。 次いでこれら種々の加水分解酵素の活性測定の
ための、各酵素活性の例、それに作用する合成基
質およびその製造例について述べる。 (1) ペプチダーゼ、プロテアーゼ ペプチダーゼにおいて、一般的にペプチド鎖
に作用して、アミノ基末端から切断し、アミノ
酸またはペプチドを遊離させる酵素の総称とし
てアミノペプチダーゼが古くから知られてい
る。例えば、シスチル−アミノペプチダーゼ
（EC3.4.11.3）、プロリンアミノペプチダーゼ
（EC3.4.11.5），アルギニンアミノペプチダーゼ
（EC3.4.11.6），トリペプチドアミノペプチダー
ゼ（EC3.4.11.4），Ｘ−プロリルジペプチジル
アミノペプチダーゼ、ジペプチダーゼ
（EC3.4.13.11）のアミノペプチダーゼなどであ
る。 例えば、シスチンアミノペプチダーゼ（以下
CAPと呼ぶ）は、妊娠中の異常において血液
中に増大が認られる酵素であり、そこで、
CAPの活性測定は、胎盤機能の追跡に有用で
あり、妊娠経過の診断把握に利用されている。 従来、この目的のための測定法として、Ｓ−
ベンジル−Ｌ−システイン−ｐ−ニトロアニリ
ドやＳ−ベンジル−Ｌ−システイン−Ｎ，Ｎ−
ジメチルアミノアニリドが合成基質として使用
されていた。測定方法としては、例えば、Ｓ−
ベンジル−Ｌ−システイン−ｐ−ニトロアニリ
ドを基質として用いた場合には、CAPによつ
て遊離するｐ−ニトロアニリンの黄色を測定す
ることにより、CAP活性を測定していた。し
かし、遊離したｐ−ニトロアニリンが呈する色
調は黄色であるためその測定時に、ビリルビン
血清や溶血血清などの影響を受ける欠点を有し
ていた。また、遊離したｐ−ニトロアニリンを
ｐ−ジメチルアミノシンナムアルデヒドと化学
的に反応させ、赤色素に変え565nmの吸光度を
測定する方法が知られているがこの方法は、化
学的発色法の為、レイト・アツセイによる測定
法としては全く不向きであつた。 また、Ｓ−ベンジル−Ｌ−システニル−ｐ−
ジメチルアミノアニリドを基質として用いた場
合には、CAPによつて遊離するｐ−ジメチル
アミノアニリンを鉄錯塩試薬と反応させる事に
より、青緑色に呈色させこれを測定する事によ
り、酵素活性を測定し得るものであるが、この
方法も化学発色の為、レイト・アツセイによる
測定法としては全く不向きであつた。 本発明では、アミノ化合物〔−Ａ〕を、そ
のアミノ基と、アミノ酸またはペプチドのカル
ボキシル基と結合せしめて得られるアミノ化合
物〔〕を構成因子とする化合物を合成基質と
する。この合成基質としては、下記一般式
〔〕 （ただし式中、R′1またはR′2のいずれか一方
はR19CO−NH−基を示し、他方は水素原子を
示し、R19CO−は、アミノ酸残基またはペプチ
ド残基を示し、R3、R4、R5、R6は前記と同じ
基を示す）で表わされる。 さらに基R19CO−の具体例としては、Ｓ−ベ
ンジル−Ｌ−システニル基、Ｌ−アラニル基、
Ｘ−Ｌ−プロリル基、（ただしＸは、酸性、中
性または塩基性のアミノ酸残基を示す）などが
挙られる。 この一般式〔〕で表わされる合成基質を用
いて、これにアミノペプチダーゼ含有被検液を
作用せしめ、次いで反応によつてアミノ化合物
〔−Ａ〕を遊離、生成せしめた後これを対応
するカプラーおよび酸化酵素によつて酵素的に
酸化縮合せしめる。 さらにこのように反応を行なつた結果、その
特異的吸収波長域は500〜750nm付近の長波長
域に認められるもので、この長波長域を測定波
長として測定するもので、特にレイト・アツセ
イによる自動化に適する優れた方法である。 また本発明における一般式〔〕で表わされ
る化合物たる合成基質合成法は、ペプチド合成
の常法によつて製造することができる。 例えば、Ｓ−ベンジル−Ｌ−システインなど
とアミノ化合物〔−Ａ〕との縮合反応により
行なわれる。Ｓ−ベンジル−Ｌ−システインを
得るには、Ｌ−システインのチオール基を通常
の方法でベンジル化して得る。反応に際して
は、必要に応じて官能基が保護される。一般
に、その保護誘導体となすに当つては、ペプチ
ド合成反応において汎用される通常の保護基が
挙げられる。例えば、Ｌ−システインのα−ア
ミノ基は、通常の保護基、例えば、ｔ−ブトキ
シカルボニル、ｔ−アミルオキシカルボニル，
ベンジルオキシカルボニル，アダマンタチルオ
キシカルボニル，ｏ−ニトロフエニルチオ，ニ
トロ置換ベンジルオキシカルボニル基などの通
常の保護基にて保護せしめればよい。 次いで、α−アミノ基が保護されたＳ−ベン
ジル−Ｌ−システインのα−カルボキシル基
を、例えば、酸アジド、酸無水物，酸ハロゲナ
イド，酸イミダゾリドや活性エステル、例えば
シアノメチルエステル，ｐ−ニトロフエニルエ
ステル，２，４−ジニトロフエニルエステル，
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル，Ｎ−
ヒドロキシフタル酸イミドエステルなどに変換
することによつて、あるいはカルボジイミド、
Ｎ，N′−カルボニル−ジイミダゾールまたは、
イソオキサゾリウム塩、例えばウツドワード反
応剤などにより、活性化せしめる。 さらに、この活性化した化合物とアミノ化合
物〔−Ａ〕と反応せしめるもので、好ましい
反応手段としてはカルボジイミド法、アジド
法、酸ハロゲナトド法活性エステル法や酸無水
物法である。また反応に当つては、不活性媒
体、例えばジメチルホルムアミド、ジメチルア
セトアミド、ジメチルスルホキサイド、テトラ
ヒドロフラン、ベンゼン、キシレン、トルエ
ン、ジエチルエーテルなどの溶媒中に両者ほぼ
等モル量を加え、約−30℃〜室温にて撹拌下反
応せしめればよい。一般に反応は30分〜50時間
で完了するもので、反応後α−アミノ基の保護
基を脱離せしめればよい。脱離に当つて、保護
アミノ基の場合では例えば保護基がｔ−ブトキ
シカルボニル基では2N−HClの酢酸溶液やト
リフルオロ酢酸を用いればよく、またベンジル
オキシカルボニル基ではパラジウム−炭素を用
いる接触還元の手段またはHBrの酢酸溶液を
用いて行なえばよい。 また、反応において、アミノ化合物〔−
Ａ〕が液状の際にはこれを反応媒体として兼用
してもよく、またはベンゼンやトルエンなどの
媒体を用いてもよく、さらに反応温度としては
50〜100℃程度でよく、20分〜５時間程度反応
せしめればよい。反応後、その保護基を脱離せ
しめればよく、これらは、必要に応じて精製す
る。 このようにして得られた合成基質としての目
的物は分離手段、例えば抽出、洗浄、、クロマ
ト操作、結晶化など操作により得ることができ
る。さらに目的物は、塩形成に適する酸、例え
ば塩酸、臭化水素酸、リン酸などの無機酸、ギ
酸、酢酸、プロピオン酸、シユウ酸などの有機
酸と反応させることによつて相当する塩を形成
することができる。 血清等被検液中の酵素活性の測定としては、
適当な緩衝液、例えば前記の緩衝液酵素と合成
基質とを接触させ、被検液の酵素の作用によつ
て遊離したアミノ化合物〔−Ａ〕を対応する
カツプラーおよび酸化酵素を用いることにより
定量測定される。 またＸ−プロリル−ジペプチジル−アミノペ
プチダーゼ（以下Ｘ−PDAPと称す。Ｘ：中
性，酸性あるいは塩基性アミノ酸）、特にグリ
シルプロリル−ジペプチジルアミノペプチダー
ゼ（以下GPDAPと略す）は、ペプチドのＮ末
端よりグリシルプロリンを水解遊離するジペプ
チジル・アミノペプチダーゼの一種である。 血清中のＸ−PDAP活性は、例えば急性およ
び慢性肝炎、肝硬変あるいは、胆管ガンなどに
おいて、その酵素活性が増加し、また、消化器
ガン，例えば胃ガン，膵ガンなどにあつては酵
素活性が低下するもので、本酵素活性を測定す
ることは疾患診断、特に消化器ガン診断に有用
である。 従来法として、ＸがグリシンであるGly−
Ｌ−Pro−α−ナフチルアミドGly−Ｌ−Pro
−ｐ−ニトロアニリドGly−Ｌ−Pro−ｐ−
フエニルアゾアニリドまた７−（Gly−Ｌ−
Pro）−４−メチルクマリンアミドなどを合成
基質として用いる測定法が報告されている。 例えば、のα−ナフチルアミドを用いる方
法は、酵素反応で遊離するα−ナフチルアミン
を３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラ
ゾン（MBTH）−FeCl3系にて化学的に発色さ
せ比色法で測定する方法である。しかし、α−
ナフチルアミンは発癌性物質の為、保健衛生
上、好ましくない。また、のｐ−ニトロアニ
リド系を使用する方法は、遊離する黄色のｐ−
ニトロアニリンを分光学的に測定する方法であ
るが、しかし、測定域が黄色のため、ビリルビ
ン血清や溶血血清の影響を受けやすい欠点を有
している。また同様、の方法としても種々
の欠点を有しているものであつた。 本発明における合成基質は、アミノ化合物
〔〕のアミノ基にＸ−Ｌ−プロリル基をアミ
ド結合にて結合せしめたもので基Ｘは、いかな
るアミノ酸の残基であつてもよくこのアミノ酸
としては例えば、グリシン，アラニンなどの中
性アミノ酸、アスパラギン酸，グルタミン酸な
どの酸性アミノ酸，あるいは、リジン，アルギ
ニンなどの塩基性アミノ酸などいずれのアミノ
酸であつても使用する事ができ、また、Ｌ，Ｄ
あるいはDL体のいかなるものも使用できる。
また、合成基質としての当該ジペプチド誘導体
は遊離体として使用されるのみならず、酵素反
応を阻害しない塩、例えばｐ−トルエンスルホ
ン酸、塩酸、臭化水素酸などとの塩の形で測定
系に導入することもできる。これら各種合成基
質の中では、Ｘがグリシン，アラニンなどの中
性アミノ酸であるジペプチド誘導体やＸがリジ
ン，アルギニンなどの塩基性アミノ酸であるジ
ペプチド誘導体が最も本酵素により加水分解を
受けやすく、Ｘが酸性アミノ酸であるジペプチ
ド誘導体は比較的分解されにくい。 本発明方法に用いられる合成基質としては、
ペプチド化学に於いてよく知られている方法に
より合成することができる。例えば、Ｎ−保護
−Ｘ−プロリル−アミノ化合物〔−Ａ〕を脱
保護することにより得られる。具体的には、Ｌ
−プロリル−アミノ化合物〔−Ａ〕とＮ−保
護アミノ酸とをペプチド化学で常用されている
カルボジイミド類などの縮合剤を用いて、或い
は、Ｎ−保護アミノ酸のカルボキシル基を活性
化し縮合せしめる活性エステル化法など使用ア
ミノ酸の種類により最も有利な方法でＮ−保護
アミノ酸−Ｌ−プロリル−アミノ化合物〔−
Ａ〕合成すればよい。この場合、Ｎ−保護基と
しては使用アミノ酸により適宜、公知の保護基
より選択すればよく、例えばベンジルオキシカ
ルボニル基、ｔ−ブチルオキシカルボニル基、
ｔ−アミルオキシカルボニル基、ホルミル基な
どが用いられる。 また、使用するアミノ酸に側鎖官能基が存在
する場合には、好ましくは予め常法により保護
した後、反応に供せられる。例えば、酸性アミ
ノ酸の場合にあつては、側鎖カルボキシル基を
ベンジルエステルなどのエステルに変換し用い
られる。 また、アルギニンのグアニジノ基にあつても
常用の保護基、例えばトシル基、ニトロ基、ｐ
−ニトロベンジルオキシカルボニル基、３，
４，５，６−テトラクロルベンゾイル基など、
特に前二者にて保護するのが好ましく、リジン
のＮ−ε−アミノ基は、好ましくは通常のアミ
ノ酸のα−アミノ基の保護基と同一の基にて保
護し用いればよい。斯くして得られたＮ−保護
−Ｘ−Ｌ−プロリル−アミノ化合物〔−Ａ〕
は、次に脱保護されるのであるが、保護基の脱
離方法はＮ−保護基、および側鎖官能基が存在
する場合にはその保護基の種類に応じ適宜公知
方法を選択組み合せることにより行えばよい。
その際、保護基のみを選定的に脱離する方法を
選定することが肝要である。一方、同様にＮ−
保護−Ｘ−Ｌ−プロリンをまず合成した後、ア
ミノ化合物〔−Ａ〕と縮反応せしめＮ−保護
−Ｘ−Ｌ−プロリル−アミノ化合物を得、次い
で上記の通り脱保護することによつて目的とす
るジペプチド誘導体は得ることができる。 プロテアーゼは、蛋白質やペプチドなどのペ
プチド結合を加水分解する酵素の総称で、例え
ばペプシン、トリプシン、α−キモトリプシ
ン、微生物由来のプロテアーゼ、トロンビン、
プラスミン、血漿，組織カリクレイン、ウロキ
ナーゼ，第Xa因子、コラゲナーゼ、エラスタ
ーゼ、カテプシンなどが挙られる。 また、診断として重要なプロテアーゼ類とし
ては、膵機能診断に関係するトリプシンやα−
キモトリプシン、血液凝固系，線溶系に関係す
るプロテアーゼ、例えば、プラスミン，トロン
ビン，血漿や組織カリクレイン，ウロキナー
ゼ，第Xa因子などが挙られる。 従来、これらの酵素活性測定用の合成基質と
しては、基本的には、発色性ペプチド誘導体が
用いられている。例えば、次の様な基質が挙ら
れる。 トロンビンに対する基質： Bz−Phe−Val−Arg−ｐ−ニトロアニリ
ド・HCl Ｈ−Ｄ−PHe−Pip−Arg−ｐ−ニトロアニ
リド・HCl Tos−Gly−Pro−Arg−ｐ−ニトロアニリ
ド・HCl Boc−Val−Pro−Arg−メチルクマリンア
ミド Ｈ−Ｄ−Phe−Pro−Arg−アミノイソフタ
ール酸ジメチルエステル 第Xa因子に対する基質： Bz−Ile−Glu−Gly−Arg−ｐ−ニトロアニ
リド・HCl Boc−Ile−Glu−Gly−Arg−メチルクマリ
ンアミド 血漿カリクレインに対する基質 Bz−Pro−Phe−Arg−ｐ−ニトロアニリ
ド・HCl Ｈ−Ｄ−Pro−Phe−Arg−ｐ−ニトロアニ
リド・2HCl Ｚ−Phe−Arg−メチルクマリンアミド プラスミンに対する基質： Ｈ−Ｄ−Val−Leu−Lys−ｐ−ニトロアニ
リド・2HCl Tos−Gly−Pro−Arg−ｐ−ニトロアニリ
ド・HCl Boc−Glu−Lys−Lys−メチルクマリンアミ
ド Boc−Val−Leu−Lys−メチルクマリンアミ
ド Ｈ−Ｄ−Val−Leu−Lys−アミノイソフタ
ル酸ジメチルエステル ウロキナーゼに対する基質： Bz−Val−Gly−Arg−ｐ−ニトロアニリド
HCl Pyro−Glu−Gly−Arg−ｐ−ニトロアニリ
ド・HCl Glutaryl−Gly−Arg−メチルクマリンアミ
ド 組織カリクレインに対する基質： Ｈ−Ｄ−Val−Leu−Arg−ｐ−ニトロアニ
リド・2HCl Pro−Phe−Arg−メチルクマリンアミド などがある。 測定法としては、被検液中の酵素の作用で遊
離するｐ−ニトロアニリン，アミノメチルクマ
リン，アミノイソフタル酸ジメチルエステルを
測定する方法が行なわれている。ｐ−ニトロア
ニリンの場合、発色が黄色の為、疾病に起因す
る色素、例えば、黄疸系濃黄色や溶血による赤
色などの影響を受けやすい欠点を有していた。
アミノメチルクマリンやアミノイソフタル酸ジ
メチルエステルの場合、測定が螢光測定法の
為、血清成分の影響を受けやすい欠点を有して
いた。その為、正確さを求める為には、除タン
パクなどの繁雑な操作を必要とした。またトリ
プシンやキモトリプシンの合成基質としても、
主としてアシル化塩基性アミノ酸−ｐ−ニトロ
アニリド、アシル化芳香族アミノ酸−ｐ−ニト
ロアニリドが使用されていたもので、反応によ
つて遊離するｐ−ニトロアニリンを測定するこ
とによつて行なわれていたもので、同様な欠点
を有するものであつた。 本発明の方法は、前記一般式〔〕で表わさ
れる化合物に包含されるアシル化塩基性アミノ
酸（Ｃ末端に塩基性アミノ酸を有するペプチド
体）−アミノ化合物〔−Ａ〕またはアシル化
芳香族アミノ酸−アミノ化合物〔−Ａ〕を合
成基質として用い、被検液中のトリプシン、キ
モトリプシンや血液凝固系・線溶系酵素である
プロテアーゼの作用により合成基質からアミノ
化合物〔−Ａ〕を遊離せしめ、このアミノ化
合物〔−Ａ〕を酸化酵素反応により、対応す
るカプラーの存在下で酸化縮合させて呈色せし
め、次いでこれを測定するもので、レイトアツ
セイによる自動分析にも適し、また、呈色色素
の特異的吸収波長が長波長（500〜750nm附近）
側であるため、血清中の共雑物の影響を受けず
に測定できる優れた方法である。 各酵素に対する、合成基質を構成する代表的
なアシル化塩基性アミノ酸を次に示す。 トロンビンの場合： Bz−Phe−Val−Arg−OH Ｈ−Ｄ−Phe−Pip−Arg−OH Tos−Gly−Pro−Arg−OH Boc−Val−Pro−Arg−OH Ｈ−Ｄ−Pro−Arg−OH 第Xa因子の場合： Bz−Ile−Glu−Gly−Arg−OH Boc−Ile−Glu−Gly−Arg−OH 血漿カリクレインの場合： Bz−Pro−Phe−Arg−OH Ｈ−Ｄ−Pro−Phe−Arg−OH Ｚ−Phe−Arg−OH プラスミンの場合： Tos−Gly−Pro−Arg−OH Boc−Glu−Lys−Lys−OH Boc−Val−Leu−Lys−OH Ｈ−Ｄ−Val−Leu−Lys−OH ウロキナーゼの場合： Bz−Val−Gly−Arg−OH Pyro−Glu−Gly−Arg−OH Glutaryl−Gly−Arg−OH 組織カリクレインの場合： Ｈ−Ｄ−Val−Leu−Arg−OH Pro−Phe−Arg−OH 本合成基質は、CAPやGPDAPの際に述べた
方法に従つて行なえば良い。その１例としてア
ミノ化合物〔−Ａ〕がＮ，Ｎ−ジエチルアミ
ノ−ｐ−フエニレンジアミンの場合について述
べると次の如くである。 反応媒体中にて、Boc−Arg（NO2）−OHと
Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノ−ｐ−フエニレンジア
ミン（DEAA）とを水溶性カルボジイミド
（WSC）にて脱水縮合して、Boc−Arg（NO2）
−DEAAを得る。この化合物のtert−ブチルオ
キシカルボニル基（Boc−）をHCl／酢酸エチ
ル系で水解しＨ−Arg（NO2）−DEAAを得る。 得られたＨ−Arg（NO2）−DEAAとアミノ基
が保護されたペプチド類を、CAPやGPDAPの
際に述べた方法に従つて、例えばブタノール中
などで水溶性カルボジイミドの存在下、脱水縮
合を行い、後、パラジウム触媒還元にて−
NO2基を切断し、アシル化塩基性アミノ酸−
アミノ化合物〔〕を得る。 さらに一般式〔〕で表わされる化合物を用
いる細菌内毒素（エンドトキシン）を検出する
方法に利用できるもので、従来よりカブトガニ
（Horseshoecrab）の血球抽出液（アメボサイ
ト・ライセート）が微量の細菌内毒素と反応し
てゲル化する現象をもとにした細菌内毒素の微
量検出方法が知られている。 近年臨床病理面でのエンドトキシン（細菌内
毒素）としては感染巣の明らかな疾患に由来す
る外因性エンドトキシン血症又エンドトキシン
シヨツクの病態把握を目的としての外科領域に
おけるリムラス・アメボサイト・ライセート・
テストが利用されており、また、内科領域にお
いては、肝障害におよぼす腸管内グラム陰性細
菌内毒素の影響や肝の細菌内毒素解毒排泄機能
などの網内系処理機能の低下と云つた内因性の
内毒素血症が問題となつており、血液凝固、線
溶系、キニン系、循環系および免疫反応系にお
いて臨床的に内毒素を検出測定することが必要
になつてきている。 この様な臨床診断を目的として、上記細菌内
毒素の測定法を適用する場合、検体試料として
患者体液、特に血液，腹水，尿，膵液，脳セキ
ズイ液，胆汁等を用いている。しかし、これら
の体液は、体液本来の着色を有していたり、疾
病に起因する色素例えば黄疸系濃黄色，溶血に
よる赤色などを含むことがあり、これらの色素
の妨害により分光学的方法による検出定量がし
ばしば困難となつていた。また、体液中には、
螢光性を有する物質が多種存在しているため、
合成基質の測定用残基として螢光性物質を選択
しても測定の妨害はさけられない。 本発明は、一般式〔〕で表わされる化合物
において、このR19CO−基がR′19−Gly−Arg
−（ただし式中R′19はＮ末端に保護基を有する
Ｌ−アミノ酸残基または、ペプチド残基を示
す）で表される合成基質とカブトガニのアメボ
サイト・ライセートおよび／または、該ライセ
ートより分離された酵素前駆体成分とを細菌内
毒素を含む被体に接触させることにより、その
合成基質からアミノ化合物〔−Ａ〕を生成遊
離せしめ、次いでこのアミノ化合物〔−Ａ〕
を、酸化酵素反応によりカプラー共存下で酸化
縮合させて測定するもので、レイトアツセイに
よる自動分析にも適し、また、長波長（500〜
750nm附近）側であるため、血清中の共雑物の
影響を受けずに測定できる優れた方法である。 アメボサイト・ライセートは、カブトガニ血
リンパ液中に含まれるアメボサイトを低張液で
処理する事により得ることができ、LAL−
Test（リムルス・アメボサイト・ライセート・
テスト）用の市販品を購入してもよい。例え
ば、プレゲル（帝国臓器）、パイロスタツト
（Worthington Biochem.Corp.U.S.A.）、パイ
ロテスト（Difco Lab.U.S.A.）パイロジエン
ト（Mallinchrdt.Inc.U.S.A.）などの商品名の
アメボサイト・ライセートが知られている。 酵素前駆体成分の分離は、アメボサイト・ラ
イセートをカラムクロマトグラフイー、電気泳
動法、エレクトロフオーカシング，アフイニテ
イクロマトグラフイーなどにより、精製，分離
して得ることができる。 これら、アメボサイト・ライセートもしく
は、該ライセートより分離される酵素前駆体が
細菌内毒素により活性化を受け、活性酵素とな
り、一般式〔〕で表わされる化合物に包含さ
れるペプチド性化合物である合成基質に特異的
に作用する。 式中、R′19としては例えばBoc−Leu−，
Boc−Val−Leu−，Boc−Ser−，Boc−Val
−Ser−，Bz−Leu−，Bz−Val−Leu−，Bz
−Ser−，Bz−Val−Ser−，などが挙られる。 本合成基質の合成は、プロテアーゼの際に述
べた方法に従つて行なえばよい。 ２ 糖加水分解酵素（アミラーゼ，グリコシダー
ゼなど） 糖加水分解酵素としては、アミラーゼ，デキ
ストラナーゼ（EC3.2.1.11）やセルラーゼ
（EC3.2.1.4）また、グリコシドなどを加水分解
するグリコシダーゼなどに分類されている。 アミラーゼには、α−アミラーゼ
（EC3.2.1.1）、β−アミラーゼ（EC3.2.1.2）、γ
−アミラーゼ（EC3.2.1.3）などが知られてい
るが、α−アミラーゼは、デン粉およびグルコ
ースの比較的低度の重合体およびオリゴマー中
のグルコース単位間のα〔１→４〕結合を加水
分解する酵素である。この酵素は、人体中で第
１義的には、膵臓およびだ液腺中で産生され、
病理学状態たとえば急性膵炎では上昇すること
が知られている。このα−アミラーゼ活性を測
定することは、臨床診断上、重要な検査となつ
ている。 このアミラーゼ活性値を測定するには、種々
の方法が知られている。例えば代表的な方法と
しては、ブルースターチ法が知られている。こ
れは、アミラーゼで反応した際に遊離する青色
を比色定量してその量から間接的にアミラーゼ
値を知る方法であり、広く使われている。しか
し、基質が不溶性のため、過などを行なつて
比色定量を行なわなければならず、操作が煩雑
でまた、自動化も困難なものであつた。また合
成基質を用いるアミラーゼの測定法としては、
ｐ−ニトロフエニルマルトペンタオシドを合成
基質としてα−アミラーゼを作用させ、さらに
α−グルコシダーゼによつて生じたｐ−ニトロ
フエノールを分光学的に測定する方法が知られ
ている。この方法は、血清アミラーゼを測定す
る場合、測定色素が黄色の為、例えば、ビリル
ビン血清や溶血血清の影響を受けやすい欠点が
あつた。また、２，４−ジクロロフエニルマル
トペンタオシドを合成基質とするα−アミラー
ゼを作用させ、さらにα−グルコシダーゼおよ
びβ−グルコシダーゼ作用によつて生じた２，
４−ジクロロフエノールを過ヨウ素酸ナトリウ
ムを用いて４−アミノアンチピリンと酸化縮合
させて500nmの吸光度を用いて測定する方法が
知られているがこの方法は自動分析には適さな
いものであつた。 本発明は、以上の欠点を解決するものでレー
トアツセイによる自動分析および長波長側での
測定を可能にしたものである。 本発明でアミラーゼ活性を測定するに当つ
て、マルトオリゴ糖の水酸基とフエノール化合
物〔−Ｆ〕のフエノール水酸基とを結合せし
めて得られる化合物を合成基質とし、用いるも
のである。この合成基質は、アミラーゼの作用
を受けてマルトオリゴ糖部分が加水分解され、
フエノール化合物〔−Ｆ〕と結合してなるグ
ルコシド，マルトシドもしくはマルトペンタオ
シドを生成するもので、次いでα−グルコシダ
ーゼおよびまたはβ−グルコシダーゼを作用さ
せて遊離するフエノール化合物〔−Ｆ〕を定
量する事によりアミラーゼ活性を測定するもの
である。 本発明に使用する合成基質に用いられるマル
トオリゴ糖とは、α−１，４−グルコシド結合
でＤ−グルコースが２〜10個程度結合した糖類
を含むものであり、例えば、マルトース，マル
トトリオース，マルトテトラオース，マルトペ
ンタオース，マルトヘキサオースなどがあり、
特にマルトテトラオース，マルトペンタオース
やマルトヘキサオースが好ましく、下記一般式
〔〕で表わされる化合物における単糖類単位
としての基（Ｓ）および整数ｎにて示されるも
のである。 本発明における合成基質の製造に用いられる
フエノール化合物〔−Ｆ〕としては、マルト
オリゴ糖とその還元末端にα−またはβ−結合
し、かつ、α−グルコシダーゼやβ−グルコシ
ダーゼにより容易に遊離し、定量が容易なもの
であればよい。この様なフエノール化合物〔
−Ｆ〕としては前記のアミノフエノール系化合
物を合む種々のフエノール化合物〔−Ｆ〕が
挙られる。 また本発明の合成基質を一般式にて示せば、
下記一般式〔〕 （ただし式中、R″1またはR″2のいずれか一
方は（Ｓ）ｎ−Ｏ−基を示し、他方は水素原子
を示し、Ｓは単糖類単位を示し、ｎは１以上の
整数を示し、R3，R4，R5，R6は前記と同じ基
を示す）で表わされる化合物であり、特に基Ｓ
としてグルコース単位、ｎ＝２〜８の整数が好
ましい例として挙られる。 本発明における一般式〔〕で表わされる合
成基質は、フエノール化合物〔−Ｆ〕とマル
トオリゴ糖を通常の方法に従つて合成する。例
えば、化学的にマルトオリゴ糖をアセチル化
し、このアセチル化マルトオリゴ糖とフエノー
ル化合物〔−Ｆ〕を結合させた後、脱アセチ
ルする事により合成できる。（実験化学講座第
24巻、304頁、1958年参照） また、サイクロマルトデキストリン・グルカ
ノトランスフエラーゼ（cyclomaltodextrin
gluconotransferase：EC2.4.1.19）をグルコシ
ル基１つを有するフエノール化合物〔−Ｆ〕
−α−Ｄ−グルコシドで表わされる化合物とマ
ルトデキストリンとを反応させ、一般式〔〕
で表わされる化合物を得ることもできる。
（Wallenfels et al.Carbohyd.Res.61，359，
1978参照）。 この場合例えば一般式〔〕で表わされる化
合物におけるｎ＝２〜８が生成されるので、従
来の分離、精製手段にて目的とする画分を得
る。 また例えば血清中のアミラーゼ活性測定にお
いては、適当な緩衝液例えば前記した緩衝液中
で酵素と合成基質、さらにα−グルコシダーゼ
とを接触させ、また必要に応じてβ−グルコシ
ダーゼを用いてもよく、この酵素作用によつて
遊離したフエノール化合物〔−Ｆ〕を対応す
るカツプラーおよび酸化酵素を用いることによ
り定量測定される。 またグルコシダーゼには、α−グルコシダー
ゼ（EC3.2.1.20），β−グルコシダーゼ
（EC3.2.1.21），α−カラクトシダーゼ
（EC3.2.1.22），β−ガラクトシダーゼ
（EC3.2.1.23），α−マンノシダーゼ
（EC3.2.1.24），β−マンノシダーゼ
（EC3.2.1.25），β−グルクロニダーゼ
（EC3.2.1.31），β−キシロシダーゼ
（EC3.2.1.37），α−Ｌ−フコシダーゼ
（EC3.2.1.51），α−Ｎ−アセチルガラクトサミ
ニダーゼ（EC3.2.1.49），α−アセチルグルコ
サミニダーゼ（EC3.2.1.50），β−Ｎ−アセチ
ルガラクトサミニダーゼ（EC3.2.1.53），β−
Ｎ−アセチルグルコミニダーゼ（EC3.2.1.30）
などが知られている。 これらの酵素活性を測定するには、合成基質
として、前記一般式〔〕で表わされる化合物
の内単糖類単位の基Ｓがペントース単位，ヘキ
ソース単位，ヘキソサミン単位，またはウロン
酸単位を示し、ｎ＝１にて示される化合物が挙
られる。また例えばペントース単位としてはキ
シロース単位が挙られ、ヘキソース単位として
はグルコース単位，ガラクトース単位，マンノ
ース単位，フコース単位などが挙られ、ヘキソ
サミン単位としてはＮ−アセチルガラクトサミ
ン単位，Ｎ−アセチルグルコサミン単位が挙ら
れ、さらにウロン酸単位としてはグルクロン酸
が挙られる。この合成基質を用いることによ
り、対象とすべきグルコシダーゼ作用を受けて
合成基質からフエノール化合物〔−Ｆ〕が遊
離・生成され、次いでこのフエノール化合物
〔−Ｆ〕を対応するカツプラーおよび酸化酵
素を用いることにより定量し、よつて対象とす
るグルコシダーゼ活性を測定するものである。
例えばα−グルコシダーゼ活性の測定の場合、
例えば市販のグルコシダーゼ活性測定用基質で
あるフエニル−β−Ｄ−グルコシドを合成基質
として使用してその酵素活性を測定するには、
適当な緩衝液中でグルコシダーゼを含有する被
検液と合成基質とを接触させ、通常37℃にて酵
素反応せしめ、この遊離したフエノールを対応
するカツプラーおよび酸化酵素を用いて呈色せ
しめ、次いでこれを測定すればよい。 ３） ホスフアターゼ ホスフアターゼは、リン酸エステル化合物を
加水分解する酵素の総称であつて、多くの場
合、単に加水分解に関与するだけでなく、その
逆の合成反応にも関与すると考えられ、反応方
向は基質および生成物の相対的濃度に支配され
る。 生体内では、種々のリン酸エステル化合物が
知られているが、これらの代謝に関与する各種
のホスフアターゼは、これが作用する基質の加
水分解部位の結合様式から (1) ホスホモエステラーゼ (2) ホスホジエステラーゼ (3) ピロホスフアターゼ (4) メタホスフアターゼ (5) ポリホスフアターゼ (6) ホスホアミダーゼ の６種類に分類され、このうち臨床検査に利用
されるものは(1)のホスホモノエステラーゼに属
するものであつて、これは例えばフエニルリン
酸，ｐ−ニトロフエニルリン酸，β−グルセロ
リン酸などを非特異的に加水分解する。 一般に、至適PHがアルカリ側にあるものをア
ルカリ性ホスフアターゼ（EC3.1.3.1）（AlPと
略す）、酸性側にあるものを酸性ホスフアター
ゼ（EC3.1.3.2）（ACPと略す）と呼ぶ。 AlPの大部分は骨、肝、胎盤、小腸、粘膜に
由来し、その存在部位が主として細胞膜である
ことから膜を通じての能動輸送、すなわち、物
質代謝に関与しているものと考えられており、
また血清AlPが病的な増加を示す疾患には、ク
ル病、骨軟化症、骨折などの骨疾患、肝・胆道
系疾患、腫瘍疾患などがあり、血清AlP定量
は、種々の疾患の鑑別診断、および経過観察に
重要である。また血清ACP活性の臨床検査と
しては主に前立腺癌の診断である。さらに女性
の場合には乳癌の転移時にも高値を示すと云わ
れている。この様に、血清中ACP定量は種々
の疾患の鑑別診断および経過観察に重要であ
る。 これら、ホスフアターゼ活性を測定する従来
法としては以下の方法が挙られる。 ホスフアターゼ活性測定において大別する
と、１つは、有機リン酸エステルを加水分解し
遊離したリン酸を測定する方法、もう１つはフ
エノール類の有機リン酸エステルを基質として
用い、遊離したフエノールを測定する方法であ
る。リン酸を含有する方法は、試料中に共存し
ているリン酸も測定されるので、試料中の無機
リンを同時に測定して差し引かねばならず、ま
た反応時間が長く、除蛋白操作が必要なことな
ど操作が煩雑で好ましい方法とは云えない。 また、フエノール類を測定する方法は、例え
ばフエニルリン酸を基質に使用した場合、遊離
したフエノールをフエリシアン化カリウム存在
下で４−アミノアンチピリンと酸化縮合させ、
生じた赤色キノンを比色するKind−King法が
ある。また、ホウ酸緩衝液導入により呈色の安
定化を行い基質中に４−アミノアンチピリンを
添加することで強アルカリ添加を除去した簡便
なKind−King変法もある。さらに、フエリシ
アン化カリウムの代りに、芳香族スルホンハロ
ゲンアミドアルカリ塩（クロラミンＴなど）
（特開昭52−155597）や過酸化水素−パーオキ
シダーゼ系を用いる方法も報告されている。フ
エリシアン化カリウム系はシアン化合物である
ため廃液の処理が問題を生じ、また、その分解
処理にも費用がかかるのが欠点であり、さら
に、廃液処理施設を持たない殆んどの小規模診
療機関などではそのまま下水中に放流される場
合が多く、環境汚染の一因ともなつている。こ
れらの理由からそれに代りうるものが望まれて
おり、かつ、これらの方法ではレートアツセイ
が行う事が出来ない欠点を有している。さらに
また過酸化水素−パーオキシダーゼは、過酸化
水素が不安定な為、実用上、問題があり現在使
用されていない。 ｐ−ニトロフエニルリン酸あるいはフエノー
ルフタレインリン酸を合成基質としてホスホモ
ノエステラーゼを含有する被検液を作用せし
め、反応後、各々遊離するｐ−ニトロフエノー
ル、フエノールフタレインをアルカリ性下直接
比色する方法としてはBessey−Lowry法，
Huggins−Talalay法が挙られる。しかし、こ
れらは、血清中のビリルビンやヘモグロビンの
影響を受けるため、必ずブランクをおかなけれ
ばならない欠点があつた。 その他、α−ナフチルリン酸を基質として遊
離するα−ナフトールを340nmで測定する方法
などがあるが、試料中の共存物の影響、α−ナ
フトールの発癌性などの問題などで好ましい測
定法ではない。 本発明は、以上の欠点を解決するるもので、
レートアツセイおよび長波長域での測定を可能
にしたものである。 本発明でホスフアターゼ活性を測定するに
は、下記一般式〔〕 （ただし式中、Ｒ1またはＲ2のいずれか
一方は
【式】基を示し、他方は水
素原子を示し、R20−Ｏ−はHO−基または置
換または未置換グリセロール残基を示し、R3、
R4、R5、R6は前記と同じ基を示す）で表わさ
れる化合物を合成基質とする。 この合成基質における基R20−Ｏ−がHO−
基を示す場合において、ホスホモノエステラー
ゼを含有する被検液中の酵素作用により、この
合成基質からフエノール化合物〔−Ｆ〕を遊
離、生成するものでこのフエノール化合物〔
−Ｆ〕を対応するカツプラーおよび酸化酵素を
用いて呈色せしめ、測定し、ホスホモノエステ
ラーゼ活性を測定するものである。 本発明における一般式〔〕で表わされる合
成基質としては、フエノール化合物〔−Ｆ〕
とリン酸またはグリセロリン酸もしくはその脂
肪酸エステル置換化合物であるモノ−またはジ
グリセリドリン酸との結合体であればよい。こ
のフエノール化合物〔−Ｆ〕としては前記の
種々の化合物が挙られるものである。この結合
体である一般式〔〕で表わされる化合物は、
フエノール化合物〔−Ｆ〕とリン酸またはグ
リセロリン酸もしくはその脂肪酸エステル置換
化合物とを用いて通常の方法に従つて合成すれ
ばよく、また市販の試薬を用いてもよい。この
酵素活性測定に当つては、前記の適当な緩衝液
中にて通常37℃にてホスホモノエステラーゼ含
有被検液およびその合成基質とを接触せしめ
て、フエノール化合物〔−Ｆ〕を遊離、生成
せしめ、これを前記方法によつて定量すればよ
い。 また、ホスホジエステラーゼに分類される酵
素としてはホスホリパーゼＣ（EC3.1.4.3）ホス
ホリパーゼＤ（EC3.1.4.4）などが挙られる。こ
れらの合成基質としては、前記一般式〔〕で
表わされる化合物における基R20−Ｏ−が置換
または未置換グリセロール残基で示される化合
物が挙られるもので、置換グリセロール残基と
してはグリセロールの脂肪酸のエステル体が挙
られるもので、そのモノ−またはジ−置換体が
挙られる。この合成基質は、前記のホスホモノ
エステラーゼの場合の合成基質の代りに用い
て、同様に行なうことにより、ホスホジエステ
ラーゼ活性の測定がなし得るものであるが、ホ
スホリパーゼＤの場合には合成基質よりすみや
かにフエノール化合物〔−Ｆ〕を遊離、生成
せしめるが、ホスホリパーゼＣの場合にはホス
フアターゼを併合することによりフエノール化
合物〔−Ｆ〕を遊離、生成せしめてなるもの
である。 ４） エステラーゼ、リパーゼ 脂肪酸とアルコールとのエステルを分解ある
いは合成する酵素を一般にエステラーゼと呼ん
でいる。低級脂肪酸と１価アルコールとのエス
テルを分解する酵素を狭義の意味でエステラー
ゼと呼び、高級脂肪酸３分子と３価アルコー
ル、例えばグリセリンとのエステルである脂肪
を分解する酵素を狭義の意味でリパーゼと呼ん
でいる。しかし、これは必ずしも明確なもので
はない。 酵素としては、膵液，ヒマシ中のリパーゼ，
肝，胃，血清中にあるエステラーゼなどが代表
的なものであるが、その他動物の殆んどあらゆ
る組織および植物の種子中に広く存在し、脂肪
ないしは、エステルの分解代謝に関与してい
る。リパーゼは、臨床生化学分析において、膵
疾患の診断に重要な酵素として知られている。 従来、エステラーゼ，リパーゼの測定法とし
ては、主として脂肪酸エステルを合成基質とし
て用い、酵素反応で遊離する脂肪酸を滴定法な
どで測定する方法がとられていた。しかしこの
方法は、滴定旨験値の高いこと、操作が繁雑な
こと、また多数の検体処理に適さないことなど
の不便さがあり、簡易な比色定量法が期待され
ていた。 発色用の合成基質を用いる方法として、ｐ−
ニトロフエニル酢酸エステル（ｐ−
nitorophenylacetate）、ｐ−ニトロフエニルラ
ウリン酸エステルや、ｐ−ニトロフエニルパル
ミチン酸エステルなどを合成基質として、酵素
作用により遊離するｐ−ニトロフエノールを比
色定量する方法があるが、発色が黄色な為、試
料中の有色素（血清の場合、黄疸血清、溶血血
清など）などの影響を受け、正確な測定が出来
ない欠点があつた。 また、フエノールあるいはα−ナフトールや
β−ナフトールの脂肪酸エステル、例えばフエ
ニルラウリン酸エステル、β−ナフチルラウリ
ン酸エステルや、α−ナフテルパルミテートを
合成基質と用いて、酵素作用により遊離するフ
エノールやα−又はβ−ナフトールを定量する
方法がある。フエノールはFoline−Cinocalteu
の試薬で比色定量する方法がとられているが、
試薬調製や操作に時間がかかるなど繁雑なた
め、ほとんど使用されていない。 α−ナフトールは、アルカリ条件下でFast
Violet Ｂと反応させ、生ずるジアゾニウム塩
の赤色を２％Triton Ｘ−100溶液で透明化し、
520nmで比色定量する方法が知られている。さ
らに、β−ナフトールは、テトラゾ化オルソア
ニシジンと結合させ、生ずる赤血不溶性色素を
作り、これを酢酸エチルで抽出して比色定量す
る方法がある。しかしいずれの方法も操作が繁
雑であつたり、発癌性があつたりしてほとんど
使用されていない。 本発明の方法は、脂肪酸とフエノール化合物
〔−Ｆ〕とそのエステル結合体を合成基質と
して用いるもので、下記一般式〔〕 （ただし式中、Ｒ′′′′1またはＲ′′′′2のいず
れか
一方はR21CO−Ｏ−基を示し、他方は水素原子
を示し、R21CO−基は脂肪酸残基を示し、R3、
R4、R5、R6は前記と同じ基を示す。）で表わさ
れる化合物を合成基質とするものである。この
合成基質は、被検液中のエステラーゼ、リパー
ゼの作用により、フエノール化合物〔−Ｆ〕
遊離し、このフエノール化合物〔−Ｆ〕を、
酸化酵素反応によりカツプラー存在下で酸化縮
合させて測定するもので、レイトアツセイによ
る自動分析にも適し、また、長波長（500〜
750nm附近）側である為、血清中の共雑物の影
響を受けずに測定できる優れた方法である。本
合成基質は、常法に従つて合成し、又、市販品
を使用しても良い。 合成基質の合成に用いられる脂肪酸の種類と
しては、例えば、酢酸，プロピオン酸，酪酸，
吉草酸，カプロン酸，エナント酸，カプリル
酸，ペラルゴン酸，カプリル酸，ウンデシル
酸，ラウリル酸，トリデカン酸，ミリスチン
酸，ペンタデカン酸，パルミチン酸などが挙ら
れ、これらの合成基質を合成するに当つては、
通常のエステル合成手段が用いられ、また必要
に応じて精製すればよい。 以上の種々の加水分解酵素の活性測定のため
の合成基質を用いる場合において、用いる緩衝
液としては前記の種々の緩衝液が適宜選択使用
される。また合成基質の使用量としては、被検
液の量およびその対象とする酵素の活性値や反
応時間によつて異なるが、通常１テス当り
0.1mモル〜20mモル／の濃度として0.01ml〜
５ml程度を用いればよい。さらに反応温度とし
ては通常37℃近辺で行なえばよく、また反応時
間としては用いる合成基質からアミノ化合物
〔−Ａ〕またはフエノール化合物〔−Ｆ〕
が遊離、生成されるに充分な時間であればよ
く、通常１分以上行なえばよい。 これらの反応の後、前記のアミノ化合物〔
−Ａ〕またはフエノール化合物〔−Ｆ〕の定
量手段を組合せて反応を行なえばよい。また組
合せ反応に当つて、用いる合成基質からアミノ
化合物〔−Ａ〕またはフエノール化合物〔
−Ｆ〕の酵素による遊離のための反応と遊離し
たアミノ化合物〔−Ａ〕またはフエノール化
合物〔−Ｆ〕を定量する反応とを別々に行な
つてもよいが、好ましくはあらかじめ両反応に
必要な試薬、酵素を混合使用して一段反応とし
て行なえばよい。 さらに定量に当つても、酵素電極による酵素
の消費量の測定や自動化によるレイトアツセイ
法やその他の比色定量の手法により測定しても
よい。 さらにこれらの酵素活性測定において用いら
れる試薬および酸化酵素は、液状またはそれら
をした固形状、またはフイルムもしくは紙な
どに塗布して乾燥した固相一体型をした適宜な
形にして使用できる。さらにこのように加工、
使用に当つて、合成基質の可溶化や親水性を増
大せしめるために非イオン系界面活性剤を用い
てもよく、その他酸化酵素の安定化剤を添加使
用してもよい。 次いで本発明の実施例、参考例を挙げて本発明
の反応条件、合成基質〔〕、アミノ化合物〔
−Ａ〕、フエノール化合物〔−Ｆ〕などについ
て例示するが、本発明はこれによつて何ら限定さ
れるものではない。 参考例 １ 2.6−ジブロム−４−アミノフエノール，アス
コルビン酸オキシダーゼ，（以下ASODと略す）
１−ナフトール−２−スルホン酸を用いる呈色
反応 2.6−ジブロム−４−アミノフエノール塩酸塩
を0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）に溶解して0.5mM
溶液とした。１−ナフトール−２−スルホン酸カ
リウムを0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）に溶解し、
0.5mM溶液とした。2.6−ジブロム−４−アミノ
フエノール塩酸塩溶液1.0mlおよび１−ナフトー
ル−２−スルホン酸カリウム溶液1.0mlの混合液
にハヤトウリ由来のASOD（特開昭56−88793号公
報参照）100μl（130U）を加えて、37℃で10分間
反応させた。生成した色素の吸収波長を第１図の
実線にて示した。また対照として、１−ナフトー
ル−２−スルホン酸カリウム溶液の代りに0.1M
リン酸緩衝液（PH7.0）を用いて同様の反応をさ
せた結果は、第１図の点線にて示す通りであつ
た。以上の結果から、ASODおよび１−ナフトー
ル−２−スルホン酸カリウムを用いることにより
630nm付近に特異的吸収を示したもので、この
630nm付近の吸収波長域に基いて2.6−ジブロム
−４−アミノフエノールを定量的に測定すること
ができ、このことから、合成基質から加水分解酵
素の作用にて遊離される化合物が2.6−ジブロム
−４−アミノフエノールである場合の酵素的定量
性を示すものであつた。また各種濃度の2.6−ジ
ブロム−４−アミノフエノール溶液（２ml）を用
いて、１−ナフトール−２−スルホン酸溶液
（0.5mM，１ml）およびASOD（100μl，130U）を
37℃、10分間反応せしめ、反応後波長630nmにて
吸光度測定して、2.6−ジブロム−４−アミノフ
エノールの検量線を得た（第５３図に示した）。 参考例 ２ 2.6−ジブロム−４−アミノフエノール，
ASOD，フエノールを用いる呈色反応 参考例１の１−ナフトール−２−スルホン酸カ
リウムの代りにフエノール（10mM）を作用させ
た以外は同様に行なつた。 生成した色素の吸収波長を第２図の実線にて示
した。また、フエノール溶液の代りに0.1Mリン
酸緩衝液（PH7.0）を用いて同様の反応をさせた
結果は第２図の点線にて示す通りであつた。以上
の結果から、ASOD、フエノールを用いることに
より610nm付近にて2.6−ジブロム−４−アミノ
フエノールを定量的に測定することができるもの
であつた。 さらに2.6−ジブロム−４−アミノフエノール
溶液の代りに0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）を用い
たフエノールとASODとの吸収波長は第２図の一
点鎖線（−・−）にて示す通りであつた。 以上のことより、2.6−ジブロム−４−アミノ
フエノール，フエノール，ASODの組合せにて、
2.6−ジブロム−４−アミノフエノールとフエノ
ールのいずれか一方の定量がなし得るものであつ
た。 参考例 ３ 2.6−ジブロム−４−アミノフエノール，ラツ
カーゼ，１−ナフトール−２−スルホン酸を用
いる呈色反応 2.6−ジブロム−４−アミノフエノール塩酸塩
を0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）に溶解して0.5mM
溶液とした。１−ナフトール−２−スルホン酸カ
リウムを0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）に溶解し、
0.5mM溶液とした。2.6−ジブロム−４−アミノ
フエノール塩酸塩溶液1.0mlおよび１−ナフトー
ル−２−スルホン酸カリウム溶液1.0mlの混合液
にポリポラスベルシカラー（polyporus
versicolor）由来のラツカーゼ100μ（80U）を
加えて、37℃で20分間反応させた。 生成した色素の吸収波長を第３図の実線にて示
した。また対照として、１−ナフトール−２−ス
ルホン酸カリウム溶液の代りに0.1Mリン酸緩衝
液（PH7.0）を用いて同様の反応をさせた結果は、
第３図の点線にて示す通りであつた。以上の結果
から、ラツカーゼ，１−ナフトール−２−スルホ
ン酸カリウムを用いることにより630nm付近にて
2.6−ジブロム−４−アミノフエノールを定量的
に測定することができるものであつた。 参考例 ４ 2.6−ジブロム−４−アミノフエノール，ラツ
カーゼ，2.5−ジメチルフエノールを用いる呈
色反応 参考例３の１−ナフトール−２−スルホン酸カ
リウムの代りに2.5−ジメチルフエノール
（10mM）を作用させた以外は同様に行なつた。 生成した色素の吸収波長を第４図の実施にて示
した。また、2.5−ジメチルフエノール溶液の代
りに0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）を用いて同様の
反応をさせた結果は第４図の点線にて示す通りで
あつた。以上の結果から、ラツカーゼ，2.5−ジ
メチルフエノールを用いることにより585nm付近
にて2.6−ジブロム−４−アミノフエノールを定
量的に測定することができるものであつた。 また、上記のラツカーゼの代りに、チロシナー
ゼ（50μl，100U）を用いて、以下同様に反応せ
しめた結果、第４図と同様の吸収曲線（特異な吸
収波長585nm、△OD585nm＝0.8）を示した。 また1mM2.6−ジブロム−４−アミノフエノー
ルおよび10mM2.5−ジメチルフエノールとを含
有する0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）１mlを酸素電
極を備えた反応セルに加え37℃に予加温した。そ
の後これにASOD溶液（100μ、250U）を加え
て37℃で反応せしめた。次いでASOD添加時をゼ
ロダイムとして酸素電極により反応時間経過に対
する電気化学的化を測定し、その酸素消費率を求
めた。その結果を第６０図に示した。 さらに上記のASODの代りにラツカーゼ
（100μ、200U）を用い、以下同様に行なつた結
果、その酸素電極の電気化学的変化による酸素消
費率は第６１図に示した。 参考例 ５ 2.6−ジブロム−４−アミノフエノール，ラツ
カーゼ，フエノールを用いる呈色反応 参考例３の１−ナフトール−２−スルホン酸カ
リウムの代りにフエノール（10mM）を作用させ
た以外は同様に行なつた。 生成した色素の吸収波長を第５図の実線にて示
した。また、フエノール溶液の代りに0.1Mリン
酸緩衝液（PH7.0）を用いて同様の反応をさせた
結果は第５図の点線にて示す通りであつた。以上
の結果からラツカーゼ，フエノールを用いること
により600nm付近にて2.6−ジブロム−４−アミ
ノフエノールを定量的に測定することができ、ま
たラツカーゼと2.6−ジブロム−４−アミノフエ
ノールを用いることにより600nm付近にてフエノ
ールを定量的に測定することができるものであつ
た。 参考例 ６ Ｎ，Ｎ−ジエチル−ｐ−フエニレンジアミン，
ASOD，フエノールを用いる呈色反応 Ｎ，Ｎ−ジエチル−ｐ−フエニレンジアミン・
２塩酸塩を0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）に溶解し
て1mM溶液とした。フエノールを0.1Mリン酸緩
衝液（PH7.0）に溶解し、10mM溶液とした。Ｎ，
Ｎ−ジエチル−ｐ−フエニレンジアミン・２塩酸
塩溶液1.0mlおよびフエノール溶液1.0mlの混合液
にASOD100μ（130U）を加えて、37℃で20分
間反応させた。生成した色素の吸収波長を第６図
の実線にて示した。またフエノール溶液の代りに
0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）を用いて同様の反応
をさせた結果は、第６図の点線にて示した通りで
ある。以上の結果から、ASOD，フエノールを用
いることにより670nm付近にてＮ，Ｎ−ジエチル
−ｐ−フエニレンジアミンを定量的に、また
ASOD，Ｎ，Ｎ−ジエチル−ｐ−フエニレンジア
ミンを用いることにより670nm付近にてフエノー
ルを定量的に測定することができるものであつ
た。また、以下に上記方法によるＮ，Ｎ−ジエチ
ル−ｐ−フエニレンジアミンやフエノールの定量
による検量線の作成について述べる。 各種濃度のＮ，Ｎ−ジエチル−ｐ−フエニレン
ジアミン溶液（２ml）を用いて、フエノール溶液
（10mM，1.0ml）およびASOD（100μ，130U）
を加えて37℃、10分間反応せしめ、反応後波長
670nmにて吸光度測定して、Ｎ，Ｎ−ジエチル−
ｐ−フエニレンジアミンの検量線を得た（第５４
図）。 また各種濃度のフエノール溶液１mlを用いて、
Ｎ，Ｎ−ジエチル−ｐ−フエニレンジアミン溶液
（1mM、２ml）およびASOD（100μ，130U）を
加えて37℃、10分間反応せしめ、反応後波長
670nmにて吸光測定してフエノールの検量線を得
た。（第５５図）。 参考例 ７ Ｎ，Ｎ−ジメチル−ｐ−フエニレンジアミン，
ASOD，フエノールを用いる呈色反応 Ｎ，Ｎ−ジメチル−ｐ−フエニレンジアミン・
２塩酸塩を0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）に溶解し
て1mM溶液とした。フエノールを0.1Mリン酸緩
衝液（PH7.0）に溶解し、10mM溶液とした。Ｎ，
Ｎ−ジメチル−ｐ−フエニレンジアミン・２塩酸
塩溶液1.0mlおよびフエノール溶液1.0mlにハヤト
ウリ由来のASOD100μ（130U）を加えて、37
℃で30分間反応させた。生成した色素の吸収波長
を第７図の実線にて示した。またフエノール溶液
の代りに0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）を用いて同
様の反応をさせた結果は第７図の点線にて示す通
りであつた。以上の結果から、ASOD，フエノー
ルを用いることにより655nm付近にてＮ，Ｎ−ジ
メチル−ｐ−フエニレンジアミンを定量的に測定
することができ、またASOD，Ｎ，Ｎ−ジメチル
−ｐ−フエニレンジアミンを用いることにより
655nm付近にてフエノールを定量的に測定するこ
とができるものであつた。 参考例 ８ 2.6−ジブロム−４−アミノフエノール，
ASOD，ｏ−メチルアニリンを用いる呈色反応 参考例１の１−ナフトール−２−スルホン酸カ
リウムの代りにｏ−メチルアニリン（0.5mM）
を作用させた以外は同様に行なつた。 生成した色素の吸収波長を第８図の実線にて示
した。また、ｏ−メチルアニリン溶液の代りに
0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）を用いて同様の反応
をさせた結果は、第８図の点線にて示す通りであ
つた。以上の結果から、ASOD，ｏ−メチルアニ
リンを用いることにより670nm付近にて2.6−ジ
ブロム−４−アミノフエノールを定量的に測定す
ることができるものであつた。 参考例 ９ 2.6−ジブロム−４−アミノフエノール，
ASOD，ｍ−メチルアニリンを用いる呈色反応 参考例１の１−ナフトール−２−スルホン酸カ
リウムの代りにｍ−メチルアニリン（0.5mM）
を作用させた以外は同様に行なつた。生成した色
素の吸収波長を第９図の実線にて示した。また、
ｍ−メチルアニリン溶液の代りに0.1Mリン酸緩
衝液（PH7.0）を用いて同様の反応をさせた結果
は第９図の点線にて示す通りであつた。以上の結
果から、ASOD，ｍ−メチルアニリンを用いるこ
とにより670nm付近にて2.6−ジブロム−４−ア
ミノフエノールを定量的に測定することができる
ものであつた。 参考例 10 ２，６−ジブロム−４−アミノフエノール，
ASOD，４−クロロ−１−ナフトールを用いる
呈色反応 参考例１の１−ナフトール−２−スルホン酸カ
リウムの代りに４−クロロ−１−ナフトール
（0.5mM）を作用させた以外は同様に行なつた。 生成した色素の吸収波長を第１０図の実線にて
示した。また、４−クロロ−１−ナフトール溶液
の代りに0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）を用いて同
様の反応をさせた結果は第１０図の点線にて示す
通りであつた。以上の結果から、ASOD4−クロ
ロ−１−ナフトールを用いることにより580nm付
近にて２，６−ジブロム−４−アミノフエノール
を定量的に測定することができるものであつた。 参考例 11 ２，６−ジブロム−４−アミノフエノール，
ASOD，クレーブ酸を用いる呈色反応 参考例１の１−ナフトール−２−スルホン酸カ
リウムの代りにクレーブ酸（0.5mM）を作用さ
せた以外は同様に行なつた。 生成した色素の吸収波長を第１１図の実線にて
示した。また、クレーブ酸溶液の代りに0.1Mリ
ン酸緩衝液（PH7.0）を用いて同様の反応をさせ
た結果は第１１図の点線にて示す通りであつた。
以上の結果から、ASODクレーブ酸を用いること
により560nm付近にて２，６−ジブロム−４−ア
ミノフエノールを定量的に測定することができる
ものであつた。 参考例 12 ２，６−ジブロム−４−アミノフエノール，
ASOD，１−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸を用
いる呈色反応 参考例１の１−ナフトール−２−スルホン酸カ
リウムの代りに１−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸
を作用させた以外は同様に行なつた。 生成した色素の吸収波長を第１２図の実線にて
示した。また、１−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸
溶液の代りに0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）を用い
て同様の反応をさせた結果は、第１２図の点線に
て示す通りであつた。以上の結果から、ASOD、
１−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸を用いることに
より590nm付近にて２，６−ジブロム−４−アミ
ノフエノールを定量的に測定することができるも
のであつた。 参考例 13 Ｎ，Ｎ−ジエチル−ｐ−フエニレンジアミン，
ラツカーゼ，１−ナフトール−２−スルホン酸
を用いる呈色反応 参考例３の２，６−ジブロム−４−アミノフエ
ノール・塩酸塩の代りに、Ｎ，Ｎ−ジエチル−ｐ
−フエニレンジアミン・２塩酸塩（1mM）を作
用させた以外は同様に行なつた。 生成した色素の吸収波長を第１３図の実線にて
示した。また、１−ナフトール−２−スルホン酸
カリウム溶液の代りに0.1Mリン酸緩衝液（PH
7.0）を用いて同様の反応をさせた結果は第１３
図の点線にて示す通りであつた。以上の結果か
ら、ラツカーゼ，１−ナフトール−２−スルホン
酸カリウムを用いることにより660nm付近にて
Ｎ，Ｎ−ジエチル−ｐ−フエニレンジアミンを定
量的に測定することができるものであつた。 参考例 14 ２，６−ジブロム−４−アミノフエノール，
ASOD，ｏ−クロルフエノールを用いる呈色反
応 参考例１の１−ナフトール−２−スルホン酸カ
リウムの代りにｏ−クロルフエノール（0.1mM）
を作用させた以外は同様に行なつた。 生成した色素の吸収波長を第１４図の実線にて
示した。また、ｏ−クロルフエノール溶液の代り
に0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）を用いて同様の反
応をさせた結果は、第１４図の点線にて示す通り
であつた。以上の結果から、ASOD，ｏ−クロル
フエノールを用いることにより650nm付近にて
２，６−ジブロム−４−アミノフエノールを定量
的に測定することができるものであつた。 参考例 15 ２，６−ジブロム−４−アミノフエノール，
ASOD，ｍ−アミノフエノールを用いる呈色反
応 参考例１の１−ナフトール−２−スルホン酸カ
リウムの代りにｍ−アミノフエノール（0.5mM）
を作用させた以外は同様に行なつた。 生成した色素の吸収波長を第１５図の実線にて
示した。また、ｍ−アミノフエノール溶液の代り
に0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）を用いて同様の反
応をさせた結果は、第１５図の点線にて示す通り
であつた。以上の結果から、ASOD，ｍ−アミノ
フエノールを用いることにより565nm付近にて
２，６−ジブロム−４−アミノフエノールを定量
的に測定することができるものであつた。 参考例 16 ２，６−ジブロム−４−アミノフエノール，
ASOD，ｍ−フエニレンジアミンを用いる呈色
反応 参考例１の１−ナフトール−２−スルホン酸カ
リウムの代りにｍ−フエニレンジアミン
（0.5mM）を作用させた以外は同様に行なつた。 生成した色素の吸収波長を第１６図の実線にて
示した。また、ｍ−フエニレンジアミン溶液の代
りに0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）を用いて同様の
反応をさせた結果は、第１６図の点線にて示す通
りであつた。以上の結果から、ASODおよびｍ−
フエニレンジアミンを用いることにより610nm付
近にて２，６−ジブロム−４−アミノフエノール
を定量的に測定することができるものであつた。 またASOD，ｍ−フエニレンジアミンを用いて
反応させた結果は第１６図の一点鎖線にて示す通
りであつた。 参考例 17 ２，６−ジブロム−４−アミノフエノール，
ASOD，２，６−ジブロムフエノールを用いる
呈色反応 参考例１の１−ナフトール−２−スルホン酸カ
リウムの代りに２，６−ジブロムフエノール
（0.1mM）を作用させた以外は同様に行なつた。 生成した色素の吸収波長を第１７図の点線にて
示した。また、２，６−ジブロムフエノール溶液
の代りに0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）を用いて同
様の反応をさせた結果は第１７図の点線にて示す
通りであつた。以上の結果から、ASOD，２，６
−ジブロムフエノールを用いることにより670nm
付近にて２，６−ジブロム−４−アミノフエノー
ルを定量的に測定することができるものであつ
た。 参考例 18 ２，６−ジブロム−４−アミノフエノール，
ASOD，２，６−ジメトキシフエノールを用い
る呈色反応 参考例１の１−ナフトール−２−スルホン酸カ
リウムの代りに２，６−ジメトキシフエノール
（0.1mM）を作用させた以外は同様に行なつた。 生成した色素の吸収波長を第１８図の実線にて
示した。また、２，６−ジメトキシフエノール溶
液の代りに0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）を用いて
同様の反応をさせた結果は、第１８図の点線にて
示す通りであつた。以上の結果から、ASOD，
２，６−ジメトキシフエノールを用いることによ
り580nm付近にて２，６−ジブロム−４−アミノ
フエノールを定量的に測定することができるもの
であつた。 参考例 19 ２，６−ジブロム−４−アミノフエノール，
ASOD，３，５−ジメチルフエノールを用いる
呈色反応 参考例１の１−ナフトール−２−スルホン酸カ
リウムの代りに３，５−ジメチルフエノール
（0.5mM）を作用させた以外は同様に行なつた。 生成した色素の吸収波長を第１９図の実線にて
示した。また、３，５−ジメチルフエノール溶液
の代りに0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）を用いて同
様の反応をさせた結果は、第１９図の点線にて示
す通りであつた。以上の結果から、ASOD，３，
５−ジメチルフエノールを用いることにより
620nm付近にて２，６−ジブロム−４−アミノフ
エノールを定量的に測定することができるもので
あつた。 参考例 20 ２，６−ジブロム−４−アミノフエノール，
ASOD，２，６−ジメチルフエノールを用いる
呈色反応 参考例１の１−ナフトール−２−スルホン酸カ
リウムの代りに２，６−ジメチルフエノール
（0.5mM）を作用させた以外は同様に行なつた。 生成した色素の吸収波長を第２０図の実線にて
示した。また、２，６−ジメチルフエノール溶液
の代りに0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）を用いて同
様の反応をさせた結果は、第２０図の点線にて示
す通りであつた。以上の結果から、ASOD，２，
６−ジメチルフエノールを用いることにより
580nm付近にて２，６−ジブロム−４−アミノフ
エノールを定量的に測定することができるもので
あつた。 参考例 21 ２，６−ジブロム−４−アミノフエノール，
ASOD，２，４−ジメチルフエノールを用いる
呈色反応 参考例１の１−ナフトール−２−スルホン酸カ
リウムの代りに２，４−ジメチルフエノール
（0.5mM）を作用させた以外は同様に行なつた。 生成した色素の吸収波長を第２１図の実線にて
示した。また、２，４−ジメチルフエノール溶液
の代りに0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）を用いて同
様の反応をさせた結果は、第２１図の点線にて示
す通りであつた。以上の結果から、ASOD，２，
４−ジメチルフエノールを用いることにより
585nm付近にて２，６−ジブロム−４−アミノフ
エノールを定量的に測定することができるもので
あつた。 参考例 22 ２，６−ジブロム−４−アミノフエノール，
ASOD，２，３−ジメチルフエノールを用いる
呈色反応 参考例１の１−ナフトール−２−スルホン酸カ
リウムの代りに２，３−ジメチルフエノール
（0.5mM）を作用させた以外は同様に行なつた。 生成した色素の吸収波長を第２２図の実線にて
示した。また、２，３−ジメチルフエノール溶液
の代りに0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）を用いて同
様の反応をさせた結果は、第２２図の点線にて示
す通りであつた。以上の結果から、ASOD，２，
３−ジメチルフエノールを用いることにより
590nm付近にて２，６−ジブロム−４−アミノフ
エノールを定量的に測定することができるもので
あつた。 参考例 23 ２，６−ジブロム−４−アミノフエノール，
ASOD，２，５−ジメチルフエノールを用いる
呈色反応 参考例１の１−ナフトール−２−スルホン酸カ
リウムの代りに２，５−ジメチルフエノール
（10mM）を作用させた以外は同様に行なつた。 生成した色素の吸収波長を第２３図の実線にて
示した。また、２，５−ジメチルフエノール溶液
の代りに0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）を用いて同
様の反応をさせた結果は第２３図の点線にて示す
通りであつた。以上の結果から、ASOD，２，５
−ジメチルフエノールを用いることにより585nm
付近にて２，６−ジブロム−４−アミノフエノー
ルを定量的に測定することができるものであつ
た。 また各種濃度の２，６−ジブロム−４−アミノ
フエノール溶液（２ml）を用いて、２，５−ジメ
チルフエノール溶液（13.3mM，１ml）および
ASOD（100μ，130U）を37℃、10分間反応せし
め、反応後波長585nmにて吸光度測定して、２，
６−ジブロム−４−アミノフエノールの検量線を
得た（第５６図に示した）。 参考例 24 ２，６−ジブロム−４−アミノフエノール，
ASOD，アントラニル酸を用いる呈色反応 参考例１の１−ナフトール−２−スルホン酸カ
リウムの代りにアントラニル酸（0.5mM）を作
用させた以外は同様に行なつた。 生成した色素の吸収波長を第２４図の実線にて
示した。また、アントラニル酸溶液の代りに
0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）を用いて同様の反応
をさせた。その結果は第２４図の点線にて示す通
りであつた。以上の結果から、ASOD，アントラ
ニル酸を用いることにより640nm付近にて２，６
−ジブロム−４−アミノフエノールを定量的に測
定することができるものであつた。 参考例 25 ２，６−ジブロム−４−アミノフエノール，
ASOD，Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリンを用いる呈
色反応 参考例１の１−ナフトール−２−スルホン酸カ
リウムの代りにＮ，Ｎ−ジメチルアニリン
（0.5mM）を作用させた以外は同様に行なつた。 生成した色素の吸収波長を第２５図の実線にて
示した。また、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン溶液の
代りに0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）を用いて同様
の反応をさせた結果は、第２５図の点線にて示す
通りであつた。以上の結果から、ASOD，Ｎ，Ｎ
−ジメチルアニリンを用いることにより700nm付
近にて２，６−ジブロム−４−アミノフエノール
を定量的に測定することができるものであつた。 参考例 26 ２，６−ジブロム−４−アミノフエノール，
ASOD，アニリンを用いる呈色反応 参考例１の１−ナフトール−２−スルホン酸カ
リウムの代りにアニリン（0.5mM）を作用させ
た以外は同様に行なつた。 生成した色素の吸収波長を第２６図の実線にて
示した。また、アニリン溶液の代りに0.1Mリン
酸緩衝液（PH7.0）を用いて同様の反応をさせた
結果は第２６図の点線にて示す通りであつた。以
上の結果から、ASOD，アニリンを用いることに
より630nm付近にて２，６−ジブロム−４−アミ
ノフエノールを定量的に測定することができるも
のであつた。 参考例 27 ２，６−ジブロム−４−アミノフエノール，
ASOD，ｍ−クロロアニリンを用いる呈色反応 参考例１の１−ナフトール−２−スルホン酸カ
リウムの代りにｍ−クロロアニリン（0.5mM）
を作用させた以外は同様に行なつた。 生成した色素の吸収波長を第２７図の実線にて
示した。また、ｍ−クロロアニリン溶液の代りに
0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）を用いて同様の反応
をさせた結果は、第２７図の点線にて示す通りで
あつた。以上の結果から、ASOD，ｍ−クロロア
ニリンを用いることにより635nm付近にて２，６
−ジブロム−４−アミノフエノールを定量的に測
定することができるものであつた。 参考例 28 ２，６−ジブロム−４−アミノフエノール，
ASOD，ｏ−アミノフエノールを用いる呈色反
応 参考例１の１−ナフトール−２−スルホン酸カ
リウムの代りにｏ−アミノフエノール（0.5mM）
を作用させた以外は同様に行なつた。 生成した色素の吸収波長を第２８図の実線にて
示した。また、ｏ−アミノフエノール溶液の代り
に0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）を用いて同様の反
応をさせた結果は第２８図の点線にて示す通りで
あつた。以上の結果から、ASOD，ｏ−アミノフ
エノールを用いることにより580nm付近にて２，
６−ジブロム−４−アミノフエノールを定量的に
測定することができるものであつた。 またASOD，ｏ−アミノフエノールを用いた反
応の結果は、第２８図の一点鎖線にて示す通りで
あつた。 参考例 29 Ｎ，Ｎ−ジエチル−ｐ−フエニレンジアミン，
ASOD，ｏ−クロロフエノールを用いる呈色反
応 参考例６のフエノールの代りにＯ−クロロフエ
ノール（0.1mM）を用いて作用させた以外は、
同様に行なつた。 生成した色素の吸収波長を第２９図の実線にて
示した。また、ｏ−クロロフエノール溶液の代り
に0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）を用いて同様の反
応をさせた結果は第２９図の点線にて示す通りで
あつた。以上の結果から、ASOD，ｏ−クロロフ
エノールを用いることにより690nm付近にてＮ，
Ｎ−ジエチル−ｐ−フエニレンジアミンを定量的
に測定することができるものであつた。 参考例 30 Ｎ，Ｎ−ジエチル−ｐ−フエニレンジアミン，
ASOD，ｍ−フエニレンジアミンを用いる呈色
反応 参考例６のフエノールの代りにｍ−フエニレン
ジアミン（0.5mM）を作用させた以外は、同様
に行なつた。 生成した色素の吸収波長を第３０図の実線にて
示した。また、ｍ−フエニレンジアミン溶液の代
りに0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）を用いて同様の
反応をさせた結果は、第３０図の点線にて示す通
りであつた。以上の結果から、ASOD，ｍ−フエ
ニレンジアミンを用いることにより665nm付近に
てＮ，Ｎ−ジエチル−ｐ−フエニレンジアミンを
定量的に測定することができるものであつた。 参考例 31 Ｎ，Ｎ−ジエチル−ｐ−フエニレンジアミン，
ASOD，ｏ−メチルアニリンを用いる呈色反応 参考例６のフエノールの代りにｏ−メチルアニ
リン（0.5mM）を作用させた以外は、同様に行
なつた。 生成した色素の吸収波長を第３１図の実線にて
示した。また、ｏ−メチルアニリン溶液の代りに
0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）を用いて同様の反応
をさせた結果は第３１図の点線にて示す通りであ
つた。以上の結果から、ASOD，ｏ−メチルアニ
リンを用いることにより700nm付近にてＮ，Ｎ−
ジエチル−ｐ−フエニレンジアミンを定量的に測
定することができるものであつた。 参考例 32 Ｎ，Ｎ−ジエチル−ｐ−フエニレンジアミン，
ASOD，ｍ−メチルアニリンを用いる呈色反応 参考例６のフエノールの代りにｍ−メチルアニ
リン（0.5mM）を作用させた以外は、同様に行
なつた。 生成した色素の吸収波長を第３２図の実線にて
示した。また、ｍ−メチルアニリン溶液の代りに
0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）を用いて同様の反応
をさせた結果は第３２図の点線にて示す通りであ
つた。以上の結果から、ASOD，ｍ−メチルアニ
リンを用いることにより710nm付近にてＮ，Ｎ−
ジエチル−ｐ−フエニレンジアミンを定量的に測
定することができるものであつた。 参考例 33 Ｎ，Ｎ−ジエチル−ｐ−フエニレンジアミン，
ASOD，クレーブ酸を用いる呈色反応 参考例６のフエノールの代りにクレーブ酸
（0.5mM）を作用させた以外は、同様に行なつ
た。 生成した色素の吸収波長を第３３図の実線にて
示した。また、クレーブ酸溶液の代りに0.1Mリ
ン酸緩衝液（PH7.0）を用いて同様の反応をさせ
た結果は、第３３図の点線にて示す通りであつ
た。以上の結果から、ASOD，クレーブ酸を用い
ることにより755nm付近にてＮ，Ｎ−ジエチル−
ｐ−フエニレンジアミンを定量的に測定すること
ができるものであつた。 参考例 34 Ｎ，Ｎ−ジエチル−ｐ−フエニレンジアミン，
ASOD，１−ナフトール−２−スルホン酸を用
いる呈色反応 参考例６のフエノールの代りに１−ナフトール
−２−スルホン酸カリウム塩（0.5mM）を作用
させた以外は、同様に行なつた。 生成した色素の吸収波長を第３４図の実線にて
示した。また、１−ナフトール−２−スルホン酸
カリウム溶液の代りに0.1Mリン酸緩衝液（PH
7.0）を用いて同様の反応をさせた結果は第３４
図の点線にて示す通りであつた。以上の結果か
ら、ASOD，１−ナフトール−２−スルホン酸カ
リウムを用いることにより655nm付近にてＮ，Ｎ
−ジエチル−ｐ−フエニレンジアミンを定量的に
測定することができるものであつた。 参考例 35 Ｎ，Ｎ−ジエチル−ｐ−フエニレンジアミン，
ASOD，２，６−ジブロムフエノールを用いる
呈色反応 参考例６のフエノールの代りに２，６−ジブロ
ムフエノール（0.5mM）を作用させた以外は、
同様に行なつた。 生成した色素の吸収波長を第３５図の実線にて
示した。また、２，６−ジブロムフエノール溶液
の代りに0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）を用いて同
様の反応をさせた。その結果は第３５図の点線に
て示す通りであつた。以上の結果から、ASOD，
２，６−ジブロムフエノールを用いることにより
700nm付近にてＮ，Ｎ−ジエチル−ｐ−フエニレ
ンジアミンを定量的に測定することができるもの
であつた。 参考例 36 Ｎ，Ｎ−ジエチル−ｐ−フエニレンジアミン，
ASOD，２，６−ジメトキシフエノールを用い
る呈色反応 参考例６のフエノールの代りに２，６−ジメト
キシフエノール（0.5mM）を作用させた以外は、
同様に行なつた。 生成した色素の吸収波長を第３６図の実線にて
示した。また、２，６−ジメトキシフエノール溶
液の代りに0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）を用いて
同様の反応をさせた結果は第３６図の点線にて示
す通りであつた。以上の結果から、ASOD，２，
６−ジメトキシフエノールを用いることにより
630nm付近にてＮ，Ｎ−ジエチル−ｐ−フエニレ
ンジアミンを定量的に測定することができるもの
であつた。 またASOD，２，６−ジメトキシフエノールを
用いて反応させた結果は、第３６図の一点鎖線に
て示す通りであつた。 参考例 37 Ｎ，Ｎ−ジエチル−ｐ−フエニレンジアミン，
ASOD，２，６−ジメチルフエノールを用いる
呈色反応 参考例６のフエノールの代りに２，６−ジメチ
ルフエノール（10mM）を作用させた以外は、同
様に行なつた。 生成した色素の吸収波長を第３７図の実線にて
示した。また、２，６−ジメチルフエノール溶液
の代りに0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）を用いて同
様の反応をさせた結果は第３７図の点線にて示す
通りであつた。以上の結果から、ASOD，２，６
−ジメチルフエノールを用いることにより630nm
付近にてＮ，Ｎ−ジエチル−ｐ−フエニレンジア
ミンを定量的に測定することができるものであつ
た。 参考例 38 Ｎ，Ｎ−ジエチル−ｐ−フエニレンジアミン，
ASOD，２，５−ジメチルフエノールを用いる
呈色反応 参考例６のフエノールの代りに２，５−ジメチ
ルフエノール（10mM）を作用させた以外は、同
様に行なつた。 生成した色素の吸収波長を第３８図の実線にて
示した。また、２，５−ジメチルフエノール溶液
の代りに0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）を用いて同
様の反応をさせた結果は、第３８図の点線にて示
す通りであつた。以上の結果から、ASOD，２，
５−ジメチルフエノールを用いることにより
640nm付近にてＮ，Ｎ−ジエチル−ｐ−フエニレ
ンジアミンを定量的に測定することができるもの
であつた。 参考例 39 Ｎ，Ｎ−ジエチル−ｐ−フエニレンジアミン，
ASOD，Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリンを用いる呈
色反応 参考例６のフエノールの代りにＮ，Ｎ−ジメチ
ルアニリン（0.5mM）を作用させた以外は、同
様に行なつた。 生成した色素の吸収波長を第３９図の実線にて
示した。また、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン溶液の
代りに0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）を用いて同様
の反応をさせた結果は、第３９図の点線にて示す
通りであつた。以上の結果から、ASOD，Ｎ，Ｎ
−ジメチルアニリンを用いることにより730nm付
近にてＮ，Ｎ−ジエチル−ｐ−フエニレンジアミ
ンを定量的に測定することができるものであつ
た。 参考例 40 Ｎ，Ｎ−ジエチル−ｐ−フエニレンジアミン，
ASOD，アニリンを用いる呈色反応 参考例６のフエノールの代りにアニリン
（0.5mM）を作用させた以外は、同様に行なつ
た。 生成した色素の吸収波長を第４０図の実線にて
示した。また、アニリン溶液の代りに0.1Mリン
酸緩衝液（PH7.0）を用いて同様の反応をさせた
結果は第４０図の点線にて示す通りであつた。以
上の結果からASOD，アニリンを用いることによ
り690nm付近にてＮ，Ｎ−ジエチル−ｐ−フエニ
レンジアミンを定量的に測定することができるも
のであつた。 また、ASOD，アニリンを用いた反応の結果は
第４０図の一点鎖線にて示す通りであつた。 参考例 41 Ｎ，Ｎ−ジメチル−ｐ−フエニレンジアミン，
ASOD，ｏ−クロロフエノールを用いる呈色反
応 参考例７のフエノールの代りにｏ−クロロフエ
ノール（0.1mM）を作用させた以外は同様に行
なつた。 生成した色素の吸収波長を第４１図の実線にて
示した。また、ｏ−クロロフエノール溶液の代り
に0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）を用いて同様の反
応をさせた結果は、第４１図の点線にて示す通り
であつた。以上の結果からASOD，ｏ−クロロフ
エノールを用いることにより680nm付近にてＮ，
Ｎ−ジエチル−ｐ−フエニレンジアミンを定量的
に測定することができるものであつた。 参考例 42 Ｎ，Ｎ−ジメチル−ｐ−フエニレンジアミン，
ASOD，２，６−ジブロムフエノールを用いる
呈色反応 参考例７のフエノールの代りに２，６−ジブロ
ムフエノール（0.5mM）を作用させた以外は同
様に行なつた。 生成した色素の吸収波長を第４２図の実線にて
示した。また、２，６−ジブロムフエノール溶液
の代りに0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）を用いて同
様の反応をさせた結果は、第４２図の点線にて示
す通りであつた。以上の結果から、ASOD2，６
−ジブロムフエノールを用いることにより695nm
付近にてＮ，Ｎ−ジメチル−ｐ−フエニレンジア
ミンを定量的に測定することができるものであつ
た。 参考例 43 Ｎ，Ｎ−ジメチル−ｐ−フエニレンジアミン，
ASOD，アントラニル酸を用いる呈色反応 参考例７のフエノールの代りにアントラニル酸
（0.5mM）を作用させた以外は同様に行なつた。 生成した色素の吸収波長を第４３図の実線にて
示した。また、アントラニル酸溶液の代りに
0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）を用いて同様の反応
をさせた結果は、第４３図の点線にて示す通りで
あつた。以上の結果から、ASOD，アントラニル
酸を用いることにより680nm付近にてＮ，Ｎ−ジ
メチル−ｐ−フエニレンジアミンを定量的に測定
することができるものであつた。 参考例 44 Ｎ，Ｎ−ジメチル−ｐ−フエニレンジアミン，
ASOD，アニリンを用いる呈色反応 参考例７のフエノールの代りにアニリンを作用
させた以外は同様に行なつた。 生成した色素の吸収波長を第４４図の実線にて
示した。また、アニリン溶液の代りに0.1Mリン
酸緩衝液（PH7.0）を用いて同様の反応をさせた
結果は、第４４図の点線にて示す通りであつた。
以上の結果から、ASOD，アニリンを用いること
により690nm付近にてＮ，Ｎ−ジメチル−ｐ−フ
エニレンジアミンを定量的に測定することができ
るものであつた。 参考例 45 Ｎ，Ｎ−ジメチル−ｐ−フエニレンジアミン，
ASOD，２−ナフトールを用いる呈色反応 参考例７のフエノールの代りに２−ナフトール
（0.5mM）を作用させた以外は同様に行なつた。 生成した色素の吸収波長を第４５図の実線にて
示した。また、２−ナフトール溶液の代りに
0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）を用いて同様の反応
をさせた結果は、第４５図の点線にて示す通りで
あつた。以上の結果から、ASOD，２−ナフトー
ルを用いることにより630nm付近にてＮ，Ｎ−ジ
メチル−ｐ−フエニレンジアミンを定量的に測定
することができるものであつた。 参考例 46 Ｎ，Ｎ−ジメチル−ｐ−フエニレンジアミン，
ASOD，４−クロロ−１−ナフトールを用いる
呈色反応 参考例７のフエノールの代りに４−クロロ−１
−ナフトール（0.5mM）を作用させた以外は同
様に行なつた。 生成した色素の吸収波長を第４６図の実線にて
示した。また、４−クロロ−１−ナフトール溶液
の代りに0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）を用いて同
様の反応をさせた結果は第４６図の点線にて示す
通りであつた。以上の結果から、ASOD，４−ク
ロロ−１−ナフトールを用いることにより640nm
付近にてＮ，Ｎ−ジメチル−ｐ−フエニレンジア
ミンを定量的に測定することができるものであつ
た。 参考例 47 Ｎ，Ｎ−ジメチル−ｐ−フエニレンジアミン，
ASOD，１−ナフトール−２−スルホン酸を用
いる呈色反応 参考例７のフエノールの代りに１−ナフトール
−２−スルホン酸カリウム（0.5mM）を作用さ
せた以外は同様に行なつた。 生成した色素の吸収波長を第４７図の実線にて
示した。また、１−ナフトール−２−スルホン酸
カリウム溶液の代りに0.1Mリン酸緩衝液（PH
7.0）を用いて同様の反応をさせた結果は、第４
７図の点線にて示す通りであつた。以上の結果か
ら、ASOD，１−ナフトール−２−スルホン酸カ
リウムを用いることにより650nm付近にてＮ，Ｎ
−ジメチル−ｐ−フエニレンジアミンを定量的に
測定することができるものであつた。 参考例 48 Ｎ，Ｎ−ジメチル−ｐ−フエニレンジアミン，
ASOD，ｍ−フエニレンジアミンを用いる呈色
反応 参考例７のフエノールの代りにｍ−フエニレン
ジアミン（0.5mM）を作用させた以外は同様に
行なつた。 生成した色素の吸収波長を第４８図の実線にて
示した。また、ｍ−フエニレンジアミン溶液の代
りに0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）を用いて同様の
反応をさせた結果は、第４８図の点線にて示す通
りであつた。以上の結果からASOD，ｍ−フエニ
レンジアミンを用いることにより650nm付近にて
Ｎ，Ｎ−ジメチル−ｐ−フエニレンジアミンを定
量的に測定することができるものであつた。 参考例 49 Ｎ，Ｎ−ジメチル−ｐ−フエニレンジアミン，
ASOD，ｏ−メチルアニリンを用いる呈色反応 参考例７のフエノールの代りにｏ−メチルアニ
リン（0.5mM）を作用させた以外は同様に行な
つた。 生成した色素の吸収波長を第４９図の実線にて
示した。また、ｏ−メチルアニリン溶液の代りに
0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）を用いて同様の反応
をさせた結果は第４９図の点線にて示す通りであ
つた。以上の結果から、ASOD，ｏ−メチルアニ
リンを用いることにより695nm付近にてＮ，Ｎ−
ジメチル−ｐ−フエニレンジアミンを定量的に測
定することができるものであつた。 参考例 50 Ｎ，Ｎ−ジメチル−ｐ−フエニレンジアミン，
ASOD，ｍ−メチルアニリンを用いる呈色反応 参考例７のフエノールの代りにｍ−メチルアニ
リン（0.5mM）を作用させた以外は同様に行な
つた。 生成した色素の吸収波長を第５０図の実線にて
示した。また、ｍ−メチルアニリン溶液の代りに
0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）を用いて同様の反応
をさせた結果は、第５０図の点線にて示す通りで
あつた。以上の結果からASOD，ｍ−メチルアニ
リンを用いることにより705nm付近にてＮ，Ｎ−
ジメチル−ｐ−フエニレンジアミンを定量的に測
定することができるものであつた。 参考例 51 ２，６−ジブロム−４−アミノフエノール，
ASOD，ｍ−ブロムアニリンを用いる呈色反応 参考例１の１−ナフトール−２−スルホン酸カ
リウムの代りにｍ−ブロムアニリン（0.5mM）
を作用させた以外は同様に行なつた。 生成した色素の吸収波長を第５１図の実線にて
示した。また、ｍ−ブロムアニリン溶液の代りに
0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）を用いて同様の反応
をさせた結果は第５１図の点線にて示す通りであ
つた。以上の結果からASOD，ｍ−ブロムアニリ
ンを用いることにより635nm付近にて２，６−ジ
ブロム−４−アミノフエノールを定量的に測定す
ることができるものであつた。 参考例 52 ２，６−ジブロム−４−アミノフエノール，チ
ロシナーゼ，Ｎ，Ｎ−エチル−ヒドロキシエチ
ルアニリンを用いる呈色反応 ２，６−ジブロム−４−アミノフエール塩酸塩
を0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）に溶解して0.05M
溶液とした。Ｎ，Ｎ−エチル−ヒドロキシエチル
アニリンを0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）に溶解し
て5mM溶液とした。２，６−ジブロム−４−ア
ミノフエール塩酸塩溶液1.0mlおよびＮ，Ｎ−エ
チル−ヒドロキシエチルアニリン溶液1.0mlの混
合液にチロシナーゼ溶液（50μ，100U）を加え
て37℃、10分間反応せしめた。 生成した色素の吸収波長を第５２図に示すもの
で705nm付近に特異的吸収を示したもので、この
705nm付近の吸収波長に基いて定量できるもので
あつた。 またチロシナーゼの代りに、ASODやラツカー
ゼを用いた結果においても、同様の特異的吸収を
示す色素形成を示したものであつた。 参考例 53 ２，６−ジブロム−４−アミノフエノール，
ASOD，ｍ−クロルフエノールを用いる呈色反
応 参考例１の１−ナフトール−２−スルホン酸カ
リウムの代りにｍ−クロルフエノール（0.1mM）
を作用させた以外は同様に行なつた。 生成した色素の特異的吸収波長を650nm付近で
あつた。その結果、ASOD，ｍ−クロルフエノー
ルを用いることにより650nm付近にて２，６−ジ
ブロムーｐ−アミノフエノールを定量的に測定す
ることができるものであつた。 参考例 54 ２，６−ジブロム−４−アミノフエノール，
ASOD，ｏ−クロルアニリンを用いる呈色反応 参考例１の１−ナフトール−２−スルホン酸カ
リウムの代りにｏ−クロルアニリン（0.5mM）
を作用させた以外は同様に行なつた。 生成した色素の特異的吸収波長を630nm付近で
あつた。その結果、ASOD，ｏ−クロルアニリン
を用いることにより630nm付近にて２，６−ジブ
ロムー４−アミノフエノールを定量的に測定する
ことができるものであつた。 参考例 55 ２，６−ジブロム−４−アミノフエノール，
ASOD，ｐ−クロロフエノールを用いる呈色反
応 参考例１の１−ナフトール−２−スルホン酸カ
リウムの代りにｐ−クロロフエノール（1mM）
を作用させた以外は同様に行なつた。 生成した色素の特異的吸収波長を620nm付近で
あつた。その結果、ASOD，ｐ−クロルフエノー
ルを用いることにより620nm付近にて２，６−ジ
ブロムー４−アミノフエノールを定量的に測定す
ることができるものであつた。 参考例 56 ２，６−ジブロム−４−アミノフエノール，
ASOD，ｐ−ブロムフエノールを用いる呈色反
応 参考例１の１−ナフトール−２−スルホン酸カ
リウムの代りにｐ−ブロムフエノール（1mM）
を作用させた以外は同様に行なつた。 生成した色素の特異的吸収波長を600nm付近で
あつた。その結果、ASOD，ｐ−ブロムフエノー
ルを用いることにより600nm付近にて２，６−ジ
ブロムー４−アミノフエノールを定量的に測定す
ることができるものであつた。 参考例 57 ２，６−ジブロム−４−アミノフエノール，
ASOD，２，４−ジクロロフエノールを用いる
呈色反応 参考例１の１−ナフトール−２−スルホン酸カ
リウムの代りに２，４−ジクロロフエノール
（0.1mM）を作用させた以外は同様に行なつた。 生成した色素の特異的吸収波長を660nm付近で
あつた。その結果、ASOD，２，４−ジクロルフ
エノールを用いることにより660nm付近にて２，
６−ジブロムー４−アミノフエノールを定量的に
測定することができるものであつた。 参考例 58 ２，６−ジブロム−４−アミノフエノール，
ASOD，２，４−ジブロム−フエノールを用い
る呈色反応 参考例１の１−ナフトール−２−スルホン酸カ
リウムの代りに２，４−ジブロムフエノール
（1mM）を作用させた以外は同様に行なつた。 生成した色素の特異的吸収波長を660nm付近で
あつた。その結果、ASOD，２，４−ジブロムフ
エノールを用いることにより660nm付近にて２，
６−ジブロムー４−アミノフエノールを定量的に
測定することができるものであつた。 参考例 59 Ｎ，Ｎ−ジエチル−ｐ−フエニレンジアミン，
ASOD，α−ナフトールを用いる呈色反応 参考例６のフエノールの代りにα−ナフトール
（0.5mM）を作用させた以外は、同様に行なつ
た。 生成した色素の特異的吸収波長は620nm付近で
あつた。その結果、ASOD，α−ナフトールを用
いることにより620nm付近にて、Ｎ，Ｎ−ジエチ
ル−ｐ−フエニレンジアミンを定量的に測定する
ことができるものであつた。 参考例 60 Ｎ，Ｎ−ジエチル−ｐ−フエニレンジアミン，
ASOD，ｍ−クロロフエノールを用いる呈色反
応 参考例６のフエノールの代りにｍ−クロロフエ
ノール（0.5mM）を作用させた以外は、同様に
行なつた。 生成した色素の特異的吸収波長は695nm付近で
あつた。その結果、ASOD，ｍ−クロロフエノー
ルを用いることにより695nm付近にてＮ，Ｎ−ジ
エチル−ｐ−フエニレンジアミンを定量的に測定
することができるものであつた。 参考例 61 Ｎ，Ｎ−ジエチル−ｐ−フエニレンジアミン，
ASOD，２，３−ジメチルフエノールを用いる
呈色反応 参考例６のフエノールの代りに２，３−ジメチ
ルフエノール（10mM）を作用させた以外は、同
様に行なつた。 生成した色素の特異的吸収波長は625nm付近で
あつた。その結果、ASOD，２，３−ジメチルフ
エノールを用いることにより625nm付近にてＮ，
Ｎ−ジエチル−ｐ−フエニレンジアミンを定量的
に測定することができるものであつた。 参考例 62 Ｎ，Ｎ−ジエチル−ｐ−フエニレンジアミン，
ASOD，アントラニル酸を用いる呈色反応 参考例６のフエノールの代りにアントラニル酸
（0.5mM）を作用させた以外は、同様に行なつ
た。 生成した色素の特異的吸収波長は680nm付近で
あつた。その結果、ASOD，アントラニル酸を用
いることにより680nm付近にてＮ，Ｎ−ジエチル
−ｐ−フエニレンジアミンを定量的に測定するこ
とができるものであつた。 参考例 63 Ｎ，Ｎ−ジエチル−ｐ−フエニレンジアミン，
ASOD，２，４−ジメチルフエノールを用いる
呈色反応 参考例６のフエノールの代りに２，４−ジメチ
ルフエノール（10mM）を作用させた以外は、同
様に行なつた。 生成した色素の特異的吸収波長は630nm付近で
あつた。その結果、ASOD，２，４−ジメチルフ
エノールを用いることにより630nm付近にてＮ，
Ｎ−ジメチル−ｐ−フエニレンジアミンを定量的
に測定することができるものであつた。 参考例 64 Ｎ，Ｎ−ジメチル−ｐ−フエニレンジアミン，
ASOD，Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリンを用いる呈
色反応 参考例７のフエノールの代りにＮ，Ｎ−ジメチ
ルアニリン（0.5mM）を作用させた以外は同様
に行なつた。 生成した色素の特異的吸収波長は725nm付近で
あつた。その結果、ASOD，Ｎ，Ｎ−ジメチルア
ニリンを用いることにより725nm付近にてＮ，Ｎ
−ジメチル−ｐ−フエニレンジアミンを定量的に
測定することができるものであつた。 実施例 １ CAP活性測定法 Ｎ，Ｎ−ジメチル−ｐ−フエニレンジアミン・
二塩酸，Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｓ−ベ
ンジル−Ｌ−システインをジシクロヘキシカルボ
ジイミドのもとで常法に従い脱水縮合反応を行
い、脱保護し得たＳ−ベンジル−Ｌ−システイン
−ｐ−ジメチルアミノアニリド100mgを、ジオキ
サン３mlおよび0.16N塩酸の混液に溶解し、さら
に1.25％ツウイン（Tween）80（界面活性剤）を
含有する0.1Mトリエタノールアミン−クエン酸
緩衝液（PH7.4）100mlと混合して合成基質の溶液
を調製した。この合成基質溶液２ml、ｐ−キシレ
ノール（5mM）0.1ml、ラツカーゼ（2000U／ml）
100μを比色用セルに加え、良く混合し、37℃
にて恒温した。恒温後、CAP含有の妊婦血清
（238mU／ml）50μを加え反応を開始した。30
分反応後の吸光度を600nmで測定したところ、0.
D600＝0.18であつた。この結果より、本法は
CAP活性を良好に測定できる定量法であつた。 実施例 ２ CAP活性測定法 ３，５−ジブロム−４−ヒドロキシアニリン，
Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｓ−ベンジル−
Ｌ−システインをジシクロヘキシルカルボジイミ
ドのもとで常法に従い脱水縮合反応を行い、脱保
護し得たＳ−ベンジル−Ｌ−システイン−３，５
−ジブロム−４−ヒドロキシアニリド100mgをジ
オキサン３mlおよび0.16N塩酸の混液に溶解し、
さらに1.25％ツウイン80を含有する0.1Mトリエ
タノールアミン−クエン酸緩衝液（PH7.4）100ml
と混合し、合成基質溶液を調製した。 この合成基質溶液２ml、ｐ−キシレノール
（5mM）0.1ml、ラツカーゼ（2000U／ml）100μ
を比色用セルに入れ、良く混合し、37℃にて恒
温した。恒温後、CAP含有の妊婦血清
（238mU／ml）50μを加え、反応を開始した。
30分反応後の吸光度を585nmで測定したところ、
0.D585＝0.195であつた。この結果より、本法は
CAP活性を良好に測定できるものであつた。 実施例 ３ CAP活性測定法 実施例２のラツカーゼの代りにASOD
（1320U／ml）を使用した以外は同様に行なつた。
その結果、0.D585＝0.173を示したもので本法は
CAP活性に良好に測定できるものであつた。 実施例 ４ CAP活性測定法 Ｎ，Ｎ−ジエチル−ｐ−フエニレンジアミン，
Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｓ−ベンジン−
Ｌ−システインをジシクロヘキシルカルボジイミ
ドのもとで常法に従い脱水縮合反応を行い、脱保
護し得たＳ−ベンジル−Ｌ−システイン−ｐ−ジ
エチルアミノアニリド100mgをジオキサン３mlお
よび0.16N塩酸の混液に溶解し、さらに1.25％ツ
イーン80を含有する0.1Mトリエタノールアミン
−クエン酸緩衝液（PH7.4）100mlと混合して合成
基質溶液を調製した。 この合成基質溶液２ml、１−ナフトール−２−
スルホン酸（2mM）0.1ml、ラツカーゼ
（2000U／ml）100μを比色用セルに入れ、良く
混合し37℃にて恒温した。恒温後、CAP含有の
妊婦血清（238mU／ml）50μを加え反応を開始
した。30分反応後の吸光度を655nmで測定したと
ころ、0.D655＝0.205であり、本法はCAP活性を
良好に測定できるものであつた。 実施例 ５ α−キモトリプシン活性の測定 ｐ−ジメチルアミノアニリン・２塩酸塩、Ｎ−
ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−チロシンをジシ
クロヘキシルカルボジイミドのもとで常法に従
い、脱水縮合反応を行い、パラジウム−炭素触媒
で脱保護を行い、次いで、ベンゾイルクロライド
と反応を行い、得たＮ−ベンゾイル−Ｌ−チロシ
ン−ｐ−ジメチルアミノアニリド30mgを５mlアセ
トンに溶解し、合成基質の原液とした。この原液
に0.1M Tris−HCl緩衝液（PH7.8）100ml（5mM
塩化カルシウムおよび１％ツウイン80を含む）を
加え合成基質溶液とした。 この合成基質溶液２ml、ｐ−キシレノール
（5mM）0.1ml、ラツカーゼ（2000U／ml）100μ
を比色用セルに入れ、良く混合し、37℃にて恒
温した。恒温後、α−キモトリプシン（３mg／
ml）50μを加え反応を開始した。30分後の吸光
度を600nmで測定したところ、0.D600＝0.48であ
つた。この結果より、本法はα−キモトリプシン
を良好に測定できるものであつた。 実施例 ６ トリプシン活性の測定 Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−トリプト
フアン、Ｎ，Ｎ−ジエチル−ｐ−フエニレンジア
ミンを、氷冷下にジシクロヘキシルカルボジイミ
ドのもとで常法に従い脱水縮合反応を行い、後、
パラジウム−炭素触媒で脱保護を行い、次いで、
無水酢酸でアセチル化を行い、得たＮ−アセチル
−Ｌ−トリプトフアン−ｐ−ジエチルアミノアニ
リド30mgを５mlアセトンに溶解し、基質原液とし
た。この基質原液に0.1Mトリス−HCl緩衝液
（PH7.8）100ml（5mM塩化カルシウムおよび１％
ツウイン80を含む）を加え合成基質溶液とした。 この合成基質溶液２ml、１−ナフトール−２−
スルホン酸（2mM）0.1ml、ラツカーゼ
（2000U／ml）100μを比色用セルに入れ良く混
合し、37℃にて恒温した。恒温後、トリプシン
50μを加え反応を開始した。30分後の吸光度を
655nmで測定したところ、0.D655＝0.38であつ
た。この結果より本法は、トリプシンを良好に測
定できる方法であつた。 実施例 ７ α−キモトリプシン活性の測定 ｐ−ジエチルアミノアニリン，Ｎ−ベンジルオ
キシカルボニル−Ｌ−チロシンをジシクロヘキシ
カルボジイミドのもとで常法に従い、脱水縮合反
応を行い、後、パラジウム−炭素触媒で脱保護を
行い、次いで、ベンゾイルクロライドと反応を行
い、得たＮ−ベンゾイル−Ｌ−チロシン−ｐ−ジ
エチルアミノアニリド30mgを５mlアセトンに溶解
し、基質原液とした。この基質原液に0.1Mトリ
ス−HCl緩衝液（PH7.8）100ml（5mM塩化カル
シウム、および１％ツウイン80を含む）を加え合
成基質溶液とした。 この合成基質溶液２ml、１−ナフトール−２−
スルホン酸（2mM）0.1ml、ラツカーゼ
（2000U／ml）100μを比色用セルに入れ、良く
混合し、37℃にて恒温した。恒温後、α−キモト
リプシン（３mg／ml）50μを加え、反応を開始
した。30分後の吸光度を655nmで測定したとこ
ろ、0.D655＝0.52であつた。この結果より、本法
はα−キモトリプシンを良好に測定できる方法で
あつた。 実施例 ８ α−キモトリプシン活性の測定 ３，５−ジブロム−４−ヒドロキシアニリン，
Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−チロシンを
ジシクロヘキシカルボジイミドのもとで常法に従
い脱水縮合反応を行い、後、パラジウム−炭素触
媒で脱保護を行い、次いでベンゾイルクロライド
と反応を行い、得たＮ−ベンゾイル−Ｌ−チロシ
ン−３，５−ジブロム−４−ヒドロキシアニリド
30mgを５mlアセトンに溶解し、基質原液とした。
この基質原液に0.1Mトリス−HCl緩衝液（PH7.8）
100ml（5mM塩化カルシウムおよび１％ツウイン
80を含む）を加え合成基質溶液とした。 この合成基質溶液２ml、ｐ−キシレノール
（5mM）0.1ml、ラツカーゼ（2000U／ml）100μ
を比色用セルに入れ、良く混合し、37℃にて恒
温した。恒温後、α−キモトリプシン（３mg／
ml）50μを加え、反応を開始した。30分後の吸
光度を585nmで測定したところ、0.D585＝0.465
であつた。この結果より本法はα−キモトリプシ
ンを良好に測定できる方法であつた。 実施例 ９ α−キモトリプシン活性測定法 実施例８のラツカーゼの代りにASOD
（1320U／ml）100μを使用した以外は同様に行
なつたその結果、0.D585＝0.452であつた。この
結果より本法はα−キモトリプシン活性を良好に
測定できる方法であつた。 実施例 10 フエニル−α−Ｄ−グルコシド，ASODを用い
るα−グルコシダーゼ活性の測定 0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）に溶解したフエニ
ル−α−Ｄ−グルコシド（半井化学薬品株式会
社）溶液（0.24mM）２ml，２，６−ジブロム−
４−アミノフエノール溶液（1mM）１ml，ハヤ
トウリ由来のASOD（1320U／ml）100μを比色
用セムに入れ良く混合し、30℃に恒温した。恒温
後、α−グルコシダーゼ（東洋紡製）（3000U／
ml）10μを添加し、反応を開始し、２分ごと
に、吸収波長の変化を測定した。その結果を第５
７図に示した。この結果より、フエニル−α−Ｄ
−グルコシドを合成基質とし、反応で遊離するフ
エノールを、ASODとカプラー存在下で反応させ
ることにより、波長610nm付近でα−グルコシダ
ーゼ活性の測定が良好にできるものであつた。 実施例 11 α−アミラーゼ活性の測定 マルトペンタオースを酢酸ナトリウム，無水酢
酸下で常法通りの操作で、まずマルトペンタオー
スの水酸基をアセチル化し、次いで得られたマル
トペンタオース−β−ペプタデカアセテートとフ
エノールそれに無水塩化亜鉛を加え、常法に従い
カツプリング反応を行い、αおよびβ−フエニル
ヘキサデカアセチルマルトペンタオシドを得、次
いで常法通りの方法で、例えばメタノール中のナ
トリウムメトキシド溶液で脱アセチル化をするこ
とにより得られるフエニルヘキサデカマルトペン
タオキシドを、α−サイクロデキストリン２％を
含有する0.05Mグリセロリン酸緩衝液（PH7.0）
に溶解し0.4％合成基質溶液を調製した。 この合成基質溶液２mlにα−グルコシダーゼ
（500U／ml）およびβ−グルコシダーゼ
（100U／ml）を含有する酵素液50μ、２，６−
ジブロム−４−アミノフエノール（5mM）50μ
、ラツカーゼ（2000U／ml）100μを比色用セ
ルに入れ良く混合し、37℃に恒温した。恒温後、
α−アミラーゼ（ベーリレガー製、5000I.U.／
）50μを加え、反応を開始した。20分後の吸
光度を測定したところ、0.D610＝0.412であつた。
この結果より本法は、アミラーゼ活性を良好に測
定できる方法であつた。 実施例 12 ｏ−クロロフエニルマルトペンタオキシド，
２，６−ジブロム−４−アミノフエノール，ラ
ツカーゼを用いたアミラーゼ活性測定 α−サイクロデキストリン２％を含有する
0.05Mグリセロリン酸緩衝液（PH7.0）にｏ−ク
ロロフエニルマルトペンタオシドα，β−混合物
を溶解させて0.4％合成基質溶液を調製した。こ
の合成基質溶液２mlに、α−グルコシダーゼ
（500U／ml）およびβ−グルコシダーゼ
（100U／ml）を含有する酵素液50μ、２，６−
ジブロム−４−アミノフエノール（5mM）50μ
、ラツカーゼ（2000U／ml）100μを比色用セ
ルに入れ良く混合し、37℃に恒温した。恒温後、
α−アミラーゼ（ベーリンガー製）（5000I.U.／
）50μを加え、反応を開始した。20分後の吸
光度を650nmで測定したところ、0.D650＝0.38で
あつた。この結果より、本法は、アミラーゼ活性
を良好に測定できる方法であつた。 実施例 13 α−アミラーゼ活性の測定 マルトペンタオースを酢酸ナトリウム、無水酢
酸下で常法通りの操作で、まずマルトペンタオー
スの水酸基をアセチル化し、次いで得られたマル
トペンタオース−β−ヘプタデカアセテートと
２，６−ジブロムフエノールそれに無水塩化亜鉛
を加え、常法に従いカツプリング反応を行い、α
−およびβ−２，６−ジブロムフエニルヘキサデ
カアセチルマルトペンタオシドを得、次いで常法
通りの方法で例えばメタノール中のナトリウムメ
トキシド溶液で脱アセチル化をすることにより得
られる２，６−ジブロムフエニルヘキサデカマル
トペンタオキシドを、α−サイクロデキストリン
２％を含有する0.05Mグリセロリン酸緩衝液（PH
7.0）に溶解し、0.4％合成基質溶液を調製した。 この合成基質溶液２mlに、α−グルコシダーゼ
（500U／ml）及びβ−グルコシダーゼ（100U／
ml）を含有する酵素液50μ、２，６−ジブロム
−４−アミノフエノール（5mM）50μ、ラツカ
ーゼ（2000U／ml）100μを比色用セルに入れ良
く混合し、37℃に恒温した。恒温後、α−アミラ
ーゼ（ベーリンガー製、5000I.U.／）50μを
加え、反応を開始した。20分後の吸光度を測定し
たところ、0.D670＝0.387であつた。この結果よ
り、本法は、アミラーゼ活性を良好に測定できる
方法であつた。 実施例 14 α−アミラーゼ活性の測定 実施例13のラツカーゼをASOD（1310U／ml）
におきかえた以外は同様にして行なつた。 反応後の吸光度を測定したところ、0.D670＝
0.378であつた。この結果より、本法はアミラー
ゼ活性を良好に測定できる方法であつた。 実施例 15 フエニルリン酸，ASODを用いたAlP活性測定 0.1MトリスHCl緩衝液（PH8.0）に溶解したフ
エニルリン酸・2Na溶液（5mM），２ml，２，６
−ジブロム−４−アミノフエノール（1mM）１
ml，ハヤトウリ由来のASOD（1320U／ml）100μ
を比色用セルに入れ良く混合し、30℃に恒温し
た。恒温後、AlP（ベーリンガー社製）（400U／
0.17ml）10μを添加し、反応を開始し、５分ご
とに各波長による変化を測定した。その結果を、
第５８図に示した。この結果より、フエニルリン
酸を基質とし、反応で遊離するフエノールを、
ASODとカプラー存在下で反応させることによ
り、AlP活性の測定ができるものであつた。 実施例 16 AlP活性測定法 常法に従つてリン酸と２，６−ジブロムフエノ
ールとからエステル化して得た、２，６−ジブロ
ムフエニルリン酸を0.1Mトリス−HCl緩衝液
（PH8.0）に溶解し合成基質溶液（5mM）を調製
した。この合成基質溶液２ml、２，６−ジブロム
−４−アミノフエノール（1mM）１ml、ラツカ
ーゼ（2000U／ml）100μを比色用セルに入れ良
く混合し、37℃に恒温した。恒温後、AlP（ベー
リンガー社製）（400U／0.17ml）10μを添加し、
反応を開始した。30分後の吸光度を測定したとこ
ろ、0.D670＝1.253であつた。この結果本法は、
ホスフアターゼ活性を測定するのに良好な方法で
あつた。 実施例 17 酢酸フエニル、ASODを用いるエステラーゼ活
性測定 0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）に溶解した酢酸フ
エニル（東京化成製）（5mM）１ml，２，６−ジ
ブロム−４−アミノフエノール（0.5mM）１ml，
ハヤトウリ由来のASOD（60U／ml）20μを比色
用セルに入れ、良く混合し30℃に恒温した。恒温
後、リパーゼ（東洋醸造社製；2545U／ml）100μ
を添加し、反応を開始し、２分ごとに各波長で
の変化を測定した。その結果を第５９図に示し
た。この結果より、酢酸フエニルを基質とし、反
応で遊離するフエノールを、ASODとカプラー存
在下で反応させることにより、リパーゼ（エステ
ラーゼ）活性の測定ができるものであつた。 実施例 18 細菌内毒素の測定方法 Boc−Arg（NO2）−OHとＮ，Ｎ−ジエチルア
ミノ−ｐ−フエニレンジアミンとを常法に従い水
溶性カルボジイミドにて脱水縮合して、次いで脱
保護し、まずＨ−Arg（NO2）−ジエチルアミノア
ニリドを得、一方、Boc−Len−OHとグリシン
エチルエステルとを、これも常法通りに水溶性カ
ルボジイミドにて脱水縮合してBoc−Leu−Gly
−エステルにし、さらにアルカリで脱エステル化
しBoc−Leu−Gly−OHを得、次いで両者を、ブ
タノール中、常法に従い、水溶性カルボジイミド
の存在下で脱水縮合を行い、Boc−Leu−Gly−
Arg（NO2）−ジエチルアミノアニリドを得、次い
でパラジウム触媒還元にて−NO2基を切断し、
Boc−Leu−Cly−Arg−ジエチルアミノアニリド
を得、これを0.2Mトリス−HCl緩衝液（PH7.3）、
0.005MCaCl2含有緩衝液に溶解し、合成基質溶液
を調製した（2.5mM）。この合成基質溶液２ml、
１−ナフトール−２−スルホン酸（2mM）１ml、
ラツカーゼ（2000U／ml）100μを比色用セルに
入れ良く混合し、37℃に恒温した。恒温後、内毒
素活性酵素50μを加え、30分間反応させた。反
応後の吸光度を655nmで測定したところ、0.D655
＝0.268であつた。この結果より、本法は、細菌
内毒素を測定できる方法であつた。 なお、内毒素活性化酵素は、以下の如くに従つ
て調製した。 特公昭51−40131号に準じ日本産カブトガニ
Tachypleus tridentatus（体重約２Kg程度）から
厳重に汚染を避けて約100ml程度の血リンパ液を
採取した。遠心分離によりアメボサイトを分離
し、３％塩化ナトリウム溶液で洗浄しアメボサイ
ト・ペレツトを得た。このアメボサイト・ペレツ
トに緩衝液（Tris−HCl，0.05M；CaCl2，
0.001M；NaCl，0.15M；PH7.2）を原血リンパ液
の1/10容加え、減菌したホモジナイザーでよく撹
拌し、凍結融解し、その後50000r.p.m.で15分間
遠心して、上清を得た。これをアメボサイト・ラ
イセート・Tachypleus（以下ALTと略称する）
とした。このALTをヤングらの方法〔N.S.
Young etal；J.Clin.，Invest.，51，1790（1972）〕
に準じSephadex Ｇ−50（フアルマシア・フアイ
ンケミカル社の商品名）を用いてゲル過を行
い、アミダーゼ前駆物質を含む分画（Fraction−
１）（以下ALT−F1と略称する。）を得、これに、
M.Niwaらの方法（Japan.J.Med.Sci.Biol.26，
20，1973）に準じて調製したサルモネラミネンタ
R595の内毒素を作用させて内毒素活性酵素を得
た。
換または未置換グリセロール残基を示し、R3、
R4、R5、R6は前記と同じ基を示す）で表わさ
れる化合物を合成基質とする。 この合成基質における基R20−Ｏ−がHO−
基を示す場合において、ホスホモノエステラー
ゼを含有する被検液中の酵素作用により、この
合成基質からフエノール化合物〔−Ｆ〕を遊
離、生成するものでこのフエノール化合物〔
−Ｆ〕を対応するカツプラーおよび酸化酵素を
用いて呈色せしめ、測定し、ホスホモノエステ
ラーゼ活性を測定するものである。 本発明における一般式〔〕で表わされる合
成基質としては、フエノール化合物〔−Ｆ〕
とリン酸またはグリセロリン酸もしくはその脂
肪酸エステル置換化合物であるモノ−またはジ
グリセリドリン酸との結合体であればよい。こ
のフエノール化合物〔−Ｆ〕としては前記の
種々の化合物が挙られるものである。この結合
体である一般式〔〕で表わされる化合物は、
フエノール化合物〔−Ｆ〕とリン酸またはグ
リセロリン酸もしくはその脂肪酸エステル置換
化合物とを用いて通常の方法に従つて合成すれ
ばよく、また市販の試薬を用いてもよい。この
酵素活性測定に当つては、前記の適当な緩衝液
中にて通常37℃にてホスホモノエステラーゼ含
有被検液およびその合成基質とを接触せしめ
て、フエノール化合物〔−Ｆ〕を遊離、生成
せしめ、これを前記方法によつて定量すればよ
い。 また、ホスホジエステラーゼに分類される酵
素としてはホスホリパーゼＣ（EC3.1.4.3）ホス
ホリパーゼＤ（EC3.1.4.4）などが挙られる。こ
れらの合成基質としては、前記一般式〔〕で
表わされる化合物における基R20−Ｏ−が置換
または未置換グリセロール残基で示される化合
物が挙られるもので、置換グリセロール残基と
してはグリセロールの脂肪酸のエステル体が挙
られるもので、そのモノ−またはジ−置換体が
挙られる。この合成基質は、前記のホスホモノ
エステラーゼの場合の合成基質の代りに用い
て、同様に行なうことにより、ホスホジエステ
ラーゼ活性の測定がなし得るものであるが、ホ
スホリパーゼＤの場合には合成基質よりすみや
かにフエノール化合物〔−Ｆ〕を遊離、生成
せしめるが、ホスホリパーゼＣの場合にはホス
フアターゼを併合することによりフエノール化
合物〔−Ｆ〕を遊離、生成せしめてなるもの
である。 ４） エステラーゼ、リパーゼ 脂肪酸とアルコールとのエステルを分解ある
いは合成する酵素を一般にエステラーゼと呼ん
でいる。低級脂肪酸と１価アルコールとのエス
テルを分解する酵素を狭義の意味でエステラー
ゼと呼び、高級脂肪酸３分子と３価アルコー
ル、例えばグリセリンとのエステルである脂肪
を分解する酵素を狭義の意味でリパーゼと呼ん
でいる。しかし、これは必ずしも明確なもので
はない。 酵素としては、膵液，ヒマシ中のリパーゼ，
肝，胃，血清中にあるエステラーゼなどが代表
的なものであるが、その他動物の殆んどあらゆ
る組織および植物の種子中に広く存在し、脂肪
ないしは、エステルの分解代謝に関与してい
る。リパーゼは、臨床生化学分析において、膵
疾患の診断に重要な酵素として知られている。 従来、エステラーゼ，リパーゼの測定法とし
ては、主として脂肪酸エステルを合成基質とし
て用い、酵素反応で遊離する脂肪酸を滴定法な
どで測定する方法がとられていた。しかしこの
方法は、滴定旨験値の高いこと、操作が繁雑な
こと、また多数の検体処理に適さないことなど
の不便さがあり、簡易な比色定量法が期待され
ていた。 発色用の合成基質を用いる方法として、ｐ−
ニトロフエニル酢酸エステル（ｐ−
nitorophenylacetate）、ｐ−ニトロフエニルラ
ウリン酸エステルや、ｐ−ニトロフエニルパル
ミチン酸エステルなどを合成基質として、酵素
作用により遊離するｐ−ニトロフエノールを比
色定量する方法があるが、発色が黄色な為、試
料中の有色素（血清の場合、黄疸血清、溶血血
清など）などの影響を受け、正確な測定が出来
ない欠点があつた。 また、フエノールあるいはα−ナフトールや
β−ナフトールの脂肪酸エステル、例えばフエ
ニルラウリン酸エステル、β−ナフチルラウリ
ン酸エステルや、α−ナフテルパルミテートを
合成基質と用いて、酵素作用により遊離するフ
エノールやα−又はβ−ナフトールを定量する
方法がある。フエノールはFoline−Cinocalteu
の試薬で比色定量する方法がとられているが、
試薬調製や操作に時間がかかるなど繁雑なた
め、ほとんど使用されていない。 α−ナフトールは、アルカリ条件下でFast
Violet Ｂと反応させ、生ずるジアゾニウム塩
の赤色を２％Triton Ｘ−100溶液で透明化し、
520nmで比色定量する方法が知られている。さ
らに、β−ナフトールは、テトラゾ化オルソア
ニシジンと結合させ、生ずる赤血不溶性色素を
作り、これを酢酸エチルで抽出して比色定量す
る方法がある。しかしいずれの方法も操作が繁
雑であつたり、発癌性があつたりしてほとんど
使用されていない。 本発明の方法は、脂肪酸とフエノール化合物
〔−Ｆ〕とそのエステル結合体を合成基質と
して用いるもので、下記一般式〔〕 （ただし式中、Ｒ′′′′1またはＲ′′′′2のいず
れか
一方はR21CO−Ｏ−基を示し、他方は水素原子
を示し、R21CO−基は脂肪酸残基を示し、R3、
R4、R5、R6は前記と同じ基を示す。）で表わさ
れる化合物を合成基質とするものである。この
合成基質は、被検液中のエステラーゼ、リパー
ゼの作用により、フエノール化合物〔−Ｆ〕
遊離し、このフエノール化合物〔−Ｆ〕を、
酸化酵素反応によりカツプラー存在下で酸化縮
合させて測定するもので、レイトアツセイによ
る自動分析にも適し、また、長波長（500〜
750nm附近）側である為、血清中の共雑物の影
響を受けずに測定できる優れた方法である。本
合成基質は、常法に従つて合成し、又、市販品
を使用しても良い。 合成基質の合成に用いられる脂肪酸の種類と
しては、例えば、酢酸，プロピオン酸，酪酸，
吉草酸，カプロン酸，エナント酸，カプリル
酸，ペラルゴン酸，カプリル酸，ウンデシル
酸，ラウリル酸，トリデカン酸，ミリスチン
酸，ペンタデカン酸，パルミチン酸などが挙ら
れ、これらの合成基質を合成するに当つては、
通常のエステル合成手段が用いられ、また必要
に応じて精製すればよい。 以上の種々の加水分解酵素の活性測定のため
の合成基質を用いる場合において、用いる緩衝
液としては前記の種々の緩衝液が適宜選択使用
される。また合成基質の使用量としては、被検
液の量およびその対象とする酵素の活性値や反
応時間によつて異なるが、通常１テス当り
0.1mモル〜20mモル／の濃度として0.01ml〜
５ml程度を用いればよい。さらに反応温度とし
ては通常37℃近辺で行なえばよく、また反応時
間としては用いる合成基質からアミノ化合物
〔−Ａ〕またはフエノール化合物〔−Ｆ〕
が遊離、生成されるに充分な時間であればよ
く、通常１分以上行なえばよい。 これらの反応の後、前記のアミノ化合物〔
−Ａ〕またはフエノール化合物〔−Ｆ〕の定
量手段を組合せて反応を行なえばよい。また組
合せ反応に当つて、用いる合成基質からアミノ
化合物〔−Ａ〕またはフエノール化合物〔
−Ｆ〕の酵素による遊離のための反応と遊離し
たアミノ化合物〔−Ａ〕またはフエノール化
合物〔−Ｆ〕を定量する反応とを別々に行な
つてもよいが、好ましくはあらかじめ両反応に
必要な試薬、酵素を混合使用して一段反応とし
て行なえばよい。 さらに定量に当つても、酵素電極による酵素
の消費量の測定や自動化によるレイトアツセイ
法やその他の比色定量の手法により測定しても
よい。 さらにこれらの酵素活性測定において用いら
れる試薬および酸化酵素は、液状またはそれら
をした固形状、またはフイルムもしくは紙な
どに塗布して乾燥した固相一体型をした適宜な
形にして使用できる。さらにこのように加工、
使用に当つて、合成基質の可溶化や親水性を増
大せしめるために非イオン系界面活性剤を用い
てもよく、その他酸化酵素の安定化剤を添加使
用してもよい。 次いで本発明の実施例、参考例を挙げて本発明
の反応条件、合成基質〔〕、アミノ化合物〔
−Ａ〕、フエノール化合物〔−Ｆ〕などについ
て例示するが、本発明はこれによつて何ら限定さ
れるものではない。 参考例 １ 2.6−ジブロム−４−アミノフエノール，アス
コルビン酸オキシダーゼ，（以下ASODと略す）
１−ナフトール−２−スルホン酸を用いる呈色
反応 2.6−ジブロム−４−アミノフエノール塩酸塩
を0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）に溶解して0.5mM
溶液とした。１−ナフトール−２−スルホン酸カ
リウムを0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）に溶解し、
0.5mM溶液とした。2.6−ジブロム−４−アミノ
フエノール塩酸塩溶液1.0mlおよび１−ナフトー
ル−２−スルホン酸カリウム溶液1.0mlの混合液
にハヤトウリ由来のASOD（特開昭56−88793号公
報参照）100μl（130U）を加えて、37℃で10分間
反応させた。生成した色素の吸収波長を第１図の
実線にて示した。また対照として、１−ナフトー
ル−２−スルホン酸カリウム溶液の代りに0.1M
リン酸緩衝液（PH7.0）を用いて同様の反応をさ
せた結果は、第１図の点線にて示す通りであつ
た。以上の結果から、ASODおよび１−ナフトー
ル−２−スルホン酸カリウムを用いることにより
630nm付近に特異的吸収を示したもので、この
630nm付近の吸収波長域に基いて2.6−ジブロム
−４−アミノフエノールを定量的に測定すること
ができ、このことから、合成基質から加水分解酵
素の作用にて遊離される化合物が2.6−ジブロム
−４−アミノフエノールである場合の酵素的定量
性を示すものであつた。また各種濃度の2.6−ジ
ブロム−４−アミノフエノール溶液（２ml）を用
いて、１−ナフトール−２−スルホン酸溶液
（0.5mM，１ml）およびASOD（100μl，130U）を
37℃、10分間反応せしめ、反応後波長630nmにて
吸光度測定して、2.6−ジブロム−４−アミノフ
エノールの検量線を得た（第５３図に示した）。 参考例 ２ 2.6−ジブロム−４−アミノフエノール，
ASOD，フエノールを用いる呈色反応 参考例１の１−ナフトール−２−スルホン酸カ
リウムの代りにフエノール（10mM）を作用させ
た以外は同様に行なつた。 生成した色素の吸収波長を第２図の実線にて示
した。また、フエノール溶液の代りに0.1Mリン
酸緩衝液（PH7.0）を用いて同様の反応をさせた
結果は第２図の点線にて示す通りであつた。以上
の結果から、ASOD、フエノールを用いることに
より610nm付近にて2.6−ジブロム−４−アミノ
フエノールを定量的に測定することができるもの
であつた。 さらに2.6−ジブロム−４−アミノフエノール
溶液の代りに0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）を用い
たフエノールとASODとの吸収波長は第２図の一
点鎖線（−・−）にて示す通りであつた。 以上のことより、2.6−ジブロム−４−アミノ
フエノール，フエノール，ASODの組合せにて、
2.6−ジブロム−４−アミノフエノールとフエノ
ールのいずれか一方の定量がなし得るものであつ
た。 参考例 ３ 2.6−ジブロム−４−アミノフエノール，ラツ
カーゼ，１−ナフトール−２−スルホン酸を用
いる呈色反応 2.6−ジブロム−４−アミノフエノール塩酸塩
を0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）に溶解して0.5mM
溶液とした。１−ナフトール−２−スルホン酸カ
リウムを0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）に溶解し、
0.5mM溶液とした。2.6−ジブロム−４−アミノ
フエノール塩酸塩溶液1.0mlおよび１−ナフトー
ル−２−スルホン酸カリウム溶液1.0mlの混合液
にポリポラスベルシカラー（polyporus
versicolor）由来のラツカーゼ100μ（80U）を
加えて、37℃で20分間反応させた。 生成した色素の吸収波長を第３図の実線にて示
した。また対照として、１−ナフトール−２−ス
ルホン酸カリウム溶液の代りに0.1Mリン酸緩衝
液（PH7.0）を用いて同様の反応をさせた結果は、
第３図の点線にて示す通りであつた。以上の結果
から、ラツカーゼ，１−ナフトール−２−スルホ
ン酸カリウムを用いることにより630nm付近にて
2.6−ジブロム−４−アミノフエノールを定量的
に測定することができるものであつた。 参考例 ４ 2.6−ジブロム−４−アミノフエノール，ラツ
カーゼ，2.5−ジメチルフエノールを用いる呈
色反応 参考例３の１−ナフトール−２−スルホン酸カ
リウムの代りに2.5−ジメチルフエノール
（10mM）を作用させた以外は同様に行なつた。 生成した色素の吸収波長を第４図の実施にて示
した。また、2.5−ジメチルフエノール溶液の代
りに0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）を用いて同様の
反応をさせた結果は第４図の点線にて示す通りで
あつた。以上の結果から、ラツカーゼ，2.5−ジ
メチルフエノールを用いることにより585nm付近
にて2.6−ジブロム−４−アミノフエノールを定
量的に測定することができるものであつた。 また、上記のラツカーゼの代りに、チロシナー
ゼ（50μl，100U）を用いて、以下同様に反応せ
しめた結果、第４図と同様の吸収曲線（特異な吸
収波長585nm、△OD585nm＝0.8）を示した。 また1mM2.6−ジブロム−４−アミノフエノー
ルおよび10mM2.5−ジメチルフエノールとを含
有する0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）１mlを酸素電
極を備えた反応セルに加え37℃に予加温した。そ
の後これにASOD溶液（100μ、250U）を加え
て37℃で反応せしめた。次いでASOD添加時をゼ
ロダイムとして酸素電極により反応時間経過に対
する電気化学的化を測定し、その酸素消費率を求
めた。その結果を第６０図に示した。 さらに上記のASODの代りにラツカーゼ
（100μ、200U）を用い、以下同様に行なつた結
果、その酸素電極の電気化学的変化による酸素消
費率は第６１図に示した。 参考例 ５ 2.6−ジブロム−４−アミノフエノール，ラツ
カーゼ，フエノールを用いる呈色反応 参考例３の１−ナフトール−２−スルホン酸カ
リウムの代りにフエノール（10mM）を作用させ
た以外は同様に行なつた。 生成した色素の吸収波長を第５図の実線にて示
した。また、フエノール溶液の代りに0.1Mリン
酸緩衝液（PH7.0）を用いて同様の反応をさせた
結果は第５図の点線にて示す通りであつた。以上
の結果からラツカーゼ，フエノールを用いること
により600nm付近にて2.6−ジブロム−４−アミ
ノフエノールを定量的に測定することができ、ま
たラツカーゼと2.6−ジブロム−４−アミノフエ
ノールを用いることにより600nm付近にてフエノ
ールを定量的に測定することができるものであつ
た。 参考例 ６ Ｎ，Ｎ−ジエチル−ｐ−フエニレンジアミン，
ASOD，フエノールを用いる呈色反応 Ｎ，Ｎ−ジエチル−ｐ−フエニレンジアミン・
２塩酸塩を0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）に溶解し
て1mM溶液とした。フエノールを0.1Mリン酸緩
衝液（PH7.0）に溶解し、10mM溶液とした。Ｎ，
Ｎ−ジエチル−ｐ−フエニレンジアミン・２塩酸
塩溶液1.0mlおよびフエノール溶液1.0mlの混合液
にASOD100μ（130U）を加えて、37℃で20分
間反応させた。生成した色素の吸収波長を第６図
の実線にて示した。またフエノール溶液の代りに
0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）を用いて同様の反応
をさせた結果は、第６図の点線にて示した通りで
ある。以上の結果から、ASOD，フエノールを用
いることにより670nm付近にてＮ，Ｎ−ジエチル
−ｐ−フエニレンジアミンを定量的に、また
ASOD，Ｎ，Ｎ−ジエチル−ｐ−フエニレンジア
ミンを用いることにより670nm付近にてフエノー
ルを定量的に測定することができるものであつ
た。また、以下に上記方法によるＮ，Ｎ−ジエチ
ル−ｐ−フエニレンジアミンやフエノールの定量
による検量線の作成について述べる。 各種濃度のＮ，Ｎ−ジエチル−ｐ−フエニレン
ジアミン溶液（２ml）を用いて、フエノール溶液
（10mM，1.0ml）およびASOD（100μ，130U）
を加えて37℃、10分間反応せしめ、反応後波長
670nmにて吸光度測定して、Ｎ，Ｎ−ジエチル−
ｐ−フエニレンジアミンの検量線を得た（第５４
図）。 また各種濃度のフエノール溶液１mlを用いて、
Ｎ，Ｎ−ジエチル−ｐ−フエニレンジアミン溶液
（1mM、２ml）およびASOD（100μ，130U）を
加えて37℃、10分間反応せしめ、反応後波長
670nmにて吸光測定してフエノールの検量線を得
た。（第５５図）。 参考例 ７ Ｎ，Ｎ−ジメチル−ｐ−フエニレンジアミン，
ASOD，フエノールを用いる呈色反応 Ｎ，Ｎ−ジメチル−ｐ−フエニレンジアミン・
２塩酸塩を0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）に溶解し
て1mM溶液とした。フエノールを0.1Mリン酸緩
衝液（PH7.0）に溶解し、10mM溶液とした。Ｎ，
Ｎ−ジメチル−ｐ−フエニレンジアミン・２塩酸
塩溶液1.0mlおよびフエノール溶液1.0mlにハヤト
ウリ由来のASOD100μ（130U）を加えて、37
℃で30分間反応させた。生成した色素の吸収波長
を第７図の実線にて示した。またフエノール溶液
の代りに0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）を用いて同
様の反応をさせた結果は第７図の点線にて示す通
りであつた。以上の結果から、ASOD，フエノー
ルを用いることにより655nm付近にてＮ，Ｎ−ジ
メチル−ｐ−フエニレンジアミンを定量的に測定
することができ、またASOD，Ｎ，Ｎ−ジメチル
−ｐ−フエニレンジアミンを用いることにより
655nm付近にてフエノールを定量的に測定するこ
とができるものであつた。 参考例 ８ 2.6−ジブロム−４−アミノフエノール，
ASOD，ｏ−メチルアニリンを用いる呈色反応 参考例１の１−ナフトール−２−スルホン酸カ
リウムの代りにｏ−メチルアニリン（0.5mM）
を作用させた以外は同様に行なつた。 生成した色素の吸収波長を第８図の実線にて示
した。また、ｏ−メチルアニリン溶液の代りに
0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）を用いて同様の反応
をさせた結果は、第８図の点線にて示す通りであ
つた。以上の結果から、ASOD，ｏ−メチルアニ
リンを用いることにより670nm付近にて2.6−ジ
ブロム−４−アミノフエノールを定量的に測定す
ることができるものであつた。 参考例 ９ 2.6−ジブロム−４−アミノフエノール，
ASOD，ｍ−メチルアニリンを用いる呈色反応 参考例１の１−ナフトール−２−スルホン酸カ
リウムの代りにｍ−メチルアニリン（0.5mM）
を作用させた以外は同様に行なつた。生成した色
素の吸収波長を第９図の実線にて示した。また、
ｍ−メチルアニリン溶液の代りに0.1Mリン酸緩
衝液（PH7.0）を用いて同様の反応をさせた結果
は第９図の点線にて示す通りであつた。以上の結
果から、ASOD，ｍ−メチルアニリンを用いるこ
とにより670nm付近にて2.6−ジブロム−４−ア
ミノフエノールを定量的に測定することができる
ものであつた。 参考例 10 ２，６−ジブロム−４−アミノフエノール，
ASOD，４−クロロ−１−ナフトールを用いる
呈色反応 参考例１の１−ナフトール−２−スルホン酸カ
リウムの代りに４−クロロ−１−ナフトール
（0.5mM）を作用させた以外は同様に行なつた。 生成した色素の吸収波長を第１０図の実線にて
示した。また、４−クロロ−１−ナフトール溶液
の代りに0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）を用いて同
様の反応をさせた結果は第１０図の点線にて示す
通りであつた。以上の結果から、ASOD4−クロ
ロ−１−ナフトールを用いることにより580nm付
近にて２，６−ジブロム−４−アミノフエノール
を定量的に測定することができるものであつた。 参考例 11 ２，６−ジブロム−４−アミノフエノール，
ASOD，クレーブ酸を用いる呈色反応 参考例１の１−ナフトール−２−スルホン酸カ
リウムの代りにクレーブ酸（0.5mM）を作用さ
せた以外は同様に行なつた。 生成した色素の吸収波長を第１１図の実線にて
示した。また、クレーブ酸溶液の代りに0.1Mリ
ン酸緩衝液（PH7.0）を用いて同様の反応をさせ
た結果は第１１図の点線にて示す通りであつた。
以上の結果から、ASODクレーブ酸を用いること
により560nm付近にて２，６−ジブロム−４−ア
ミノフエノールを定量的に測定することができる
ものであつた。 参考例 12 ２，６−ジブロム−４−アミノフエノール，
ASOD，１−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸を用
いる呈色反応 参考例１の１−ナフトール−２−スルホン酸カ
リウムの代りに１−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸
を作用させた以外は同様に行なつた。 生成した色素の吸収波長を第１２図の実線にて
示した。また、１−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸
溶液の代りに0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）を用い
て同様の反応をさせた結果は、第１２図の点線に
て示す通りであつた。以上の結果から、ASOD、
１−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸を用いることに
より590nm付近にて２，６−ジブロム−４−アミ
ノフエノールを定量的に測定することができるも
のであつた。 参考例 13 Ｎ，Ｎ−ジエチル−ｐ−フエニレンジアミン，
ラツカーゼ，１−ナフトール−２−スルホン酸
を用いる呈色反応 参考例３の２，６−ジブロム−４−アミノフエ
ノール・塩酸塩の代りに、Ｎ，Ｎ−ジエチル−ｐ
−フエニレンジアミン・２塩酸塩（1mM）を作
用させた以外は同様に行なつた。 生成した色素の吸収波長を第１３図の実線にて
示した。また、１−ナフトール−２−スルホン酸
カリウム溶液の代りに0.1Mリン酸緩衝液（PH
7.0）を用いて同様の反応をさせた結果は第１３
図の点線にて示す通りであつた。以上の結果か
ら、ラツカーゼ，１−ナフトール−２−スルホン
酸カリウムを用いることにより660nm付近にて
Ｎ，Ｎ−ジエチル−ｐ−フエニレンジアミンを定
量的に測定することができるものであつた。 参考例 14 ２，６−ジブロム−４−アミノフエノール，
ASOD，ｏ−クロルフエノールを用いる呈色反
応 参考例１の１−ナフトール−２−スルホン酸カ
リウムの代りにｏ−クロルフエノール（0.1mM）
を作用させた以外は同様に行なつた。 生成した色素の吸収波長を第１４図の実線にて
示した。また、ｏ−クロルフエノール溶液の代り
に0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）を用いて同様の反
応をさせた結果は、第１４図の点線にて示す通り
であつた。以上の結果から、ASOD，ｏ−クロル
フエノールを用いることにより650nm付近にて
２，６−ジブロム−４−アミノフエノールを定量
的に測定することができるものであつた。 参考例 15 ２，６−ジブロム−４−アミノフエノール，
ASOD，ｍ−アミノフエノールを用いる呈色反
応 参考例１の１−ナフトール−２−スルホン酸カ
リウムの代りにｍ−アミノフエノール（0.5mM）
を作用させた以外は同様に行なつた。 生成した色素の吸収波長を第１５図の実線にて
示した。また、ｍ−アミノフエノール溶液の代り
に0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）を用いて同様の反
応をさせた結果は、第１５図の点線にて示す通り
であつた。以上の結果から、ASOD，ｍ−アミノ
フエノールを用いることにより565nm付近にて
２，６−ジブロム−４−アミノフエノールを定量
的に測定することができるものであつた。 参考例 16 ２，６−ジブロム−４−アミノフエノール，
ASOD，ｍ−フエニレンジアミンを用いる呈色
反応 参考例１の１−ナフトール−２−スルホン酸カ
リウムの代りにｍ−フエニレンジアミン
（0.5mM）を作用させた以外は同様に行なつた。 生成した色素の吸収波長を第１６図の実線にて
示した。また、ｍ−フエニレンジアミン溶液の代
りに0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）を用いて同様の
反応をさせた結果は、第１６図の点線にて示す通
りであつた。以上の結果から、ASODおよびｍ−
フエニレンジアミンを用いることにより610nm付
近にて２，６−ジブロム−４−アミノフエノール
を定量的に測定することができるものであつた。 またASOD，ｍ−フエニレンジアミンを用いて
反応させた結果は第１６図の一点鎖線にて示す通
りであつた。 参考例 17 ２，６−ジブロム−４−アミノフエノール，
ASOD，２，６−ジブロムフエノールを用いる
呈色反応 参考例１の１−ナフトール−２−スルホン酸カ
リウムの代りに２，６−ジブロムフエノール
（0.1mM）を作用させた以外は同様に行なつた。 生成した色素の吸収波長を第１７図の点線にて
示した。また、２，６−ジブロムフエノール溶液
の代りに0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）を用いて同
様の反応をさせた結果は第１７図の点線にて示す
通りであつた。以上の結果から、ASOD，２，６
−ジブロムフエノールを用いることにより670nm
付近にて２，６−ジブロム−４−アミノフエノー
ルを定量的に測定することができるものであつ
た。 参考例 18 ２，６−ジブロム−４−アミノフエノール，
ASOD，２，６−ジメトキシフエノールを用い
る呈色反応 参考例１の１−ナフトール−２−スルホン酸カ
リウムの代りに２，６−ジメトキシフエノール
（0.1mM）を作用させた以外は同様に行なつた。 生成した色素の吸収波長を第１８図の実線にて
示した。また、２，６−ジメトキシフエノール溶
液の代りに0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）を用いて
同様の反応をさせた結果は、第１８図の点線にて
示す通りであつた。以上の結果から、ASOD，
２，６−ジメトキシフエノールを用いることによ
り580nm付近にて２，６−ジブロム−４−アミノ
フエノールを定量的に測定することができるもの
であつた。 参考例 19 ２，６−ジブロム−４−アミノフエノール，
ASOD，３，５−ジメチルフエノールを用いる
呈色反応 参考例１の１−ナフトール−２−スルホン酸カ
リウムの代りに３，５−ジメチルフエノール
（0.5mM）を作用させた以外は同様に行なつた。 生成した色素の吸収波長を第１９図の実線にて
示した。また、３，５−ジメチルフエノール溶液
の代りに0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）を用いて同
様の反応をさせた結果は、第１９図の点線にて示
す通りであつた。以上の結果から、ASOD，３，
５−ジメチルフエノールを用いることにより
620nm付近にて２，６−ジブロム−４−アミノフ
エノールを定量的に測定することができるもので
あつた。 参考例 20 ２，６−ジブロム−４−アミノフエノール，
ASOD，２，６−ジメチルフエノールを用いる
呈色反応 参考例１の１−ナフトール−２−スルホン酸カ
リウムの代りに２，６−ジメチルフエノール
（0.5mM）を作用させた以外は同様に行なつた。 生成した色素の吸収波長を第２０図の実線にて
示した。また、２，６−ジメチルフエノール溶液
の代りに0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）を用いて同
様の反応をさせた結果は、第２０図の点線にて示
す通りであつた。以上の結果から、ASOD，２，
６−ジメチルフエノールを用いることにより
580nm付近にて２，６−ジブロム−４−アミノフ
エノールを定量的に測定することができるもので
あつた。 参考例 21 ２，６−ジブロム−４−アミノフエノール，
ASOD，２，４−ジメチルフエノールを用いる
呈色反応 参考例１の１−ナフトール−２−スルホン酸カ
リウムの代りに２，４−ジメチルフエノール
（0.5mM）を作用させた以外は同様に行なつた。 生成した色素の吸収波長を第２１図の実線にて
示した。また、２，４−ジメチルフエノール溶液
の代りに0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）を用いて同
様の反応をさせた結果は、第２１図の点線にて示
す通りであつた。以上の結果から、ASOD，２，
４−ジメチルフエノールを用いることにより
585nm付近にて２，６−ジブロム−４−アミノフ
エノールを定量的に測定することができるもので
あつた。 参考例 22 ２，６−ジブロム−４−アミノフエノール，
ASOD，２，３−ジメチルフエノールを用いる
呈色反応 参考例１の１−ナフトール−２−スルホン酸カ
リウムの代りに２，３−ジメチルフエノール
（0.5mM）を作用させた以外は同様に行なつた。 生成した色素の吸収波長を第２２図の実線にて
示した。また、２，３−ジメチルフエノール溶液
の代りに0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）を用いて同
様の反応をさせた結果は、第２２図の点線にて示
す通りであつた。以上の結果から、ASOD，２，
３−ジメチルフエノールを用いることにより
590nm付近にて２，６−ジブロム−４−アミノフ
エノールを定量的に測定することができるもので
あつた。 参考例 23 ２，６−ジブロム−４−アミノフエノール，
ASOD，２，５−ジメチルフエノールを用いる
呈色反応 参考例１の１−ナフトール−２−スルホン酸カ
リウムの代りに２，５−ジメチルフエノール
（10mM）を作用させた以外は同様に行なつた。 生成した色素の吸収波長を第２３図の実線にて
示した。また、２，５−ジメチルフエノール溶液
の代りに0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）を用いて同
様の反応をさせた結果は第２３図の点線にて示す
通りであつた。以上の結果から、ASOD，２，５
−ジメチルフエノールを用いることにより585nm
付近にて２，６−ジブロム−４−アミノフエノー
ルを定量的に測定することができるものであつ
た。 また各種濃度の２，６−ジブロム−４−アミノ
フエノール溶液（２ml）を用いて、２，５−ジメ
チルフエノール溶液（13.3mM，１ml）および
ASOD（100μ，130U）を37℃、10分間反応せし
め、反応後波長585nmにて吸光度測定して、２，
６−ジブロム−４−アミノフエノールの検量線を
得た（第５６図に示した）。 参考例 24 ２，６−ジブロム−４−アミノフエノール，
ASOD，アントラニル酸を用いる呈色反応 参考例１の１−ナフトール−２−スルホン酸カ
リウムの代りにアントラニル酸（0.5mM）を作
用させた以外は同様に行なつた。 生成した色素の吸収波長を第２４図の実線にて
示した。また、アントラニル酸溶液の代りに
0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）を用いて同様の反応
をさせた。その結果は第２４図の点線にて示す通
りであつた。以上の結果から、ASOD，アントラ
ニル酸を用いることにより640nm付近にて２，６
−ジブロム−４−アミノフエノールを定量的に測
定することができるものであつた。 参考例 25 ２，６−ジブロム−４−アミノフエノール，
ASOD，Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリンを用いる呈
色反応 参考例１の１−ナフトール−２−スルホン酸カ
リウムの代りにＮ，Ｎ−ジメチルアニリン
（0.5mM）を作用させた以外は同様に行なつた。 生成した色素の吸収波長を第２５図の実線にて
示した。また、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン溶液の
代りに0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）を用いて同様
の反応をさせた結果は、第２５図の点線にて示す
通りであつた。以上の結果から、ASOD，Ｎ，Ｎ
−ジメチルアニリンを用いることにより700nm付
近にて２，６−ジブロム−４−アミノフエノール
を定量的に測定することができるものであつた。 参考例 26 ２，６−ジブロム−４−アミノフエノール，
ASOD，アニリンを用いる呈色反応 参考例１の１−ナフトール−２−スルホン酸カ
リウムの代りにアニリン（0.5mM）を作用させ
た以外は同様に行なつた。 生成した色素の吸収波長を第２６図の実線にて
示した。また、アニリン溶液の代りに0.1Mリン
酸緩衝液（PH7.0）を用いて同様の反応をさせた
結果は第２６図の点線にて示す通りであつた。以
上の結果から、ASOD，アニリンを用いることに
より630nm付近にて２，６−ジブロム−４−アミ
ノフエノールを定量的に測定することができるも
のであつた。 参考例 27 ２，６−ジブロム−４−アミノフエノール，
ASOD，ｍ−クロロアニリンを用いる呈色反応 参考例１の１−ナフトール−２−スルホン酸カ
リウムの代りにｍ−クロロアニリン（0.5mM）
を作用させた以外は同様に行なつた。 生成した色素の吸収波長を第２７図の実線にて
示した。また、ｍ−クロロアニリン溶液の代りに
0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）を用いて同様の反応
をさせた結果は、第２７図の点線にて示す通りで
あつた。以上の結果から、ASOD，ｍ−クロロア
ニリンを用いることにより635nm付近にて２，６
−ジブロム−４−アミノフエノールを定量的に測
定することができるものであつた。 参考例 28 ２，６−ジブロム−４−アミノフエノール，
ASOD，ｏ−アミノフエノールを用いる呈色反
応 参考例１の１−ナフトール−２−スルホン酸カ
リウムの代りにｏ−アミノフエノール（0.5mM）
を作用させた以外は同様に行なつた。 生成した色素の吸収波長を第２８図の実線にて
示した。また、ｏ−アミノフエノール溶液の代り
に0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）を用いて同様の反
応をさせた結果は第２８図の点線にて示す通りで
あつた。以上の結果から、ASOD，ｏ−アミノフ
エノールを用いることにより580nm付近にて２，
６−ジブロム−４−アミノフエノールを定量的に
測定することができるものであつた。 またASOD，ｏ−アミノフエノールを用いた反
応の結果は、第２８図の一点鎖線にて示す通りで
あつた。 参考例 29 Ｎ，Ｎ−ジエチル−ｐ−フエニレンジアミン，
ASOD，ｏ−クロロフエノールを用いる呈色反
応 参考例６のフエノールの代りにＯ−クロロフエ
ノール（0.1mM）を用いて作用させた以外は、
同様に行なつた。 生成した色素の吸収波長を第２９図の実線にて
示した。また、ｏ−クロロフエノール溶液の代り
に0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）を用いて同様の反
応をさせた結果は第２９図の点線にて示す通りで
あつた。以上の結果から、ASOD，ｏ−クロロフ
エノールを用いることにより690nm付近にてＮ，
Ｎ−ジエチル−ｐ−フエニレンジアミンを定量的
に測定することができるものであつた。 参考例 30 Ｎ，Ｎ−ジエチル−ｐ−フエニレンジアミン，
ASOD，ｍ−フエニレンジアミンを用いる呈色
反応 参考例６のフエノールの代りにｍ−フエニレン
ジアミン（0.5mM）を作用させた以外は、同様
に行なつた。 生成した色素の吸収波長を第３０図の実線にて
示した。また、ｍ−フエニレンジアミン溶液の代
りに0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）を用いて同様の
反応をさせた結果は、第３０図の点線にて示す通
りであつた。以上の結果から、ASOD，ｍ−フエ
ニレンジアミンを用いることにより665nm付近に
てＮ，Ｎ−ジエチル−ｐ−フエニレンジアミンを
定量的に測定することができるものであつた。 参考例 31 Ｎ，Ｎ−ジエチル−ｐ−フエニレンジアミン，
ASOD，ｏ−メチルアニリンを用いる呈色反応 参考例６のフエノールの代りにｏ−メチルアニ
リン（0.5mM）を作用させた以外は、同様に行
なつた。 生成した色素の吸収波長を第３１図の実線にて
示した。また、ｏ−メチルアニリン溶液の代りに
0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）を用いて同様の反応
をさせた結果は第３１図の点線にて示す通りであ
つた。以上の結果から、ASOD，ｏ−メチルアニ
リンを用いることにより700nm付近にてＮ，Ｎ−
ジエチル−ｐ−フエニレンジアミンを定量的に測
定することができるものであつた。 参考例 32 Ｎ，Ｎ−ジエチル−ｐ−フエニレンジアミン，
ASOD，ｍ−メチルアニリンを用いる呈色反応 参考例６のフエノールの代りにｍ−メチルアニ
リン（0.5mM）を作用させた以外は、同様に行
なつた。 生成した色素の吸収波長を第３２図の実線にて
示した。また、ｍ−メチルアニリン溶液の代りに
0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）を用いて同様の反応
をさせた結果は第３２図の点線にて示す通りであ
つた。以上の結果から、ASOD，ｍ−メチルアニ
リンを用いることにより710nm付近にてＮ，Ｎ−
ジエチル−ｐ−フエニレンジアミンを定量的に測
定することができるものであつた。 参考例 33 Ｎ，Ｎ−ジエチル−ｐ−フエニレンジアミン，
ASOD，クレーブ酸を用いる呈色反応 参考例６のフエノールの代りにクレーブ酸
（0.5mM）を作用させた以外は、同様に行なつ
た。 生成した色素の吸収波長を第３３図の実線にて
示した。また、クレーブ酸溶液の代りに0.1Mリ
ン酸緩衝液（PH7.0）を用いて同様の反応をさせ
た結果は、第３３図の点線にて示す通りであつ
た。以上の結果から、ASOD，クレーブ酸を用い
ることにより755nm付近にてＮ，Ｎ−ジエチル−
ｐ−フエニレンジアミンを定量的に測定すること
ができるものであつた。 参考例 34 Ｎ，Ｎ−ジエチル−ｐ−フエニレンジアミン，
ASOD，１−ナフトール−２−スルホン酸を用
いる呈色反応 参考例６のフエノールの代りに１−ナフトール
−２−スルホン酸カリウム塩（0.5mM）を作用
させた以外は、同様に行なつた。 生成した色素の吸収波長を第３４図の実線にて
示した。また、１−ナフトール−２−スルホン酸
カリウム溶液の代りに0.1Mリン酸緩衝液（PH
7.0）を用いて同様の反応をさせた結果は第３４
図の点線にて示す通りであつた。以上の結果か
ら、ASOD，１−ナフトール−２−スルホン酸カ
リウムを用いることにより655nm付近にてＮ，Ｎ
−ジエチル−ｐ−フエニレンジアミンを定量的に
測定することができるものであつた。 参考例 35 Ｎ，Ｎ−ジエチル−ｐ−フエニレンジアミン，
ASOD，２，６−ジブロムフエノールを用いる
呈色反応 参考例６のフエノールの代りに２，６−ジブロ
ムフエノール（0.5mM）を作用させた以外は、
同様に行なつた。 生成した色素の吸収波長を第３５図の実線にて
示した。また、２，６−ジブロムフエノール溶液
の代りに0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）を用いて同
様の反応をさせた。その結果は第３５図の点線に
て示す通りであつた。以上の結果から、ASOD，
２，６−ジブロムフエノールを用いることにより
700nm付近にてＮ，Ｎ−ジエチル−ｐ−フエニレ
ンジアミンを定量的に測定することができるもの
であつた。 参考例 36 Ｎ，Ｎ−ジエチル−ｐ−フエニレンジアミン，
ASOD，２，６−ジメトキシフエノールを用い
る呈色反応 参考例６のフエノールの代りに２，６−ジメト
キシフエノール（0.5mM）を作用させた以外は、
同様に行なつた。 生成した色素の吸収波長を第３６図の実線にて
示した。また、２，６−ジメトキシフエノール溶
液の代りに0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）を用いて
同様の反応をさせた結果は第３６図の点線にて示
す通りであつた。以上の結果から、ASOD，２，
６−ジメトキシフエノールを用いることにより
630nm付近にてＮ，Ｎ−ジエチル−ｐ−フエニレ
ンジアミンを定量的に測定することができるもの
であつた。 またASOD，２，６−ジメトキシフエノールを
用いて反応させた結果は、第３６図の一点鎖線に
て示す通りであつた。 参考例 37 Ｎ，Ｎ−ジエチル−ｐ−フエニレンジアミン，
ASOD，２，６−ジメチルフエノールを用いる
呈色反応 参考例６のフエノールの代りに２，６−ジメチ
ルフエノール（10mM）を作用させた以外は、同
様に行なつた。 生成した色素の吸収波長を第３７図の実線にて
示した。また、２，６−ジメチルフエノール溶液
の代りに0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）を用いて同
様の反応をさせた結果は第３７図の点線にて示す
通りであつた。以上の結果から、ASOD，２，６
−ジメチルフエノールを用いることにより630nm
付近にてＮ，Ｎ−ジエチル−ｐ−フエニレンジア
ミンを定量的に測定することができるものであつ
た。 参考例 38 Ｎ，Ｎ−ジエチル−ｐ−フエニレンジアミン，
ASOD，２，５−ジメチルフエノールを用いる
呈色反応 参考例６のフエノールの代りに２，５−ジメチ
ルフエノール（10mM）を作用させた以外は、同
様に行なつた。 生成した色素の吸収波長を第３８図の実線にて
示した。また、２，５−ジメチルフエノール溶液
の代りに0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）を用いて同
様の反応をさせた結果は、第３８図の点線にて示
す通りであつた。以上の結果から、ASOD，２，
５−ジメチルフエノールを用いることにより
640nm付近にてＮ，Ｎ−ジエチル−ｐ−フエニレ
ンジアミンを定量的に測定することができるもの
であつた。 参考例 39 Ｎ，Ｎ−ジエチル−ｐ−フエニレンジアミン，
ASOD，Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリンを用いる呈
色反応 参考例６のフエノールの代りにＮ，Ｎ−ジメチ
ルアニリン（0.5mM）を作用させた以外は、同
様に行なつた。 生成した色素の吸収波長を第３９図の実線にて
示した。また、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン溶液の
代りに0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）を用いて同様
の反応をさせた結果は、第３９図の点線にて示す
通りであつた。以上の結果から、ASOD，Ｎ，Ｎ
−ジメチルアニリンを用いることにより730nm付
近にてＮ，Ｎ−ジエチル−ｐ−フエニレンジアミ
ンを定量的に測定することができるものであつ
た。 参考例 40 Ｎ，Ｎ−ジエチル−ｐ−フエニレンジアミン，
ASOD，アニリンを用いる呈色反応 参考例６のフエノールの代りにアニリン
（0.5mM）を作用させた以外は、同様に行なつ
た。 生成した色素の吸収波長を第４０図の実線にて
示した。また、アニリン溶液の代りに0.1Mリン
酸緩衝液（PH7.0）を用いて同様の反応をさせた
結果は第４０図の点線にて示す通りであつた。以
上の結果からASOD，アニリンを用いることによ
り690nm付近にてＮ，Ｎ−ジエチル−ｐ−フエニ
レンジアミンを定量的に測定することができるも
のであつた。 また、ASOD，アニリンを用いた反応の結果は
第４０図の一点鎖線にて示す通りであつた。 参考例 41 Ｎ，Ｎ−ジメチル−ｐ−フエニレンジアミン，
ASOD，ｏ−クロロフエノールを用いる呈色反
応 参考例７のフエノールの代りにｏ−クロロフエ
ノール（0.1mM）を作用させた以外は同様に行
なつた。 生成した色素の吸収波長を第４１図の実線にて
示した。また、ｏ−クロロフエノール溶液の代り
に0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）を用いて同様の反
応をさせた結果は、第４１図の点線にて示す通り
であつた。以上の結果からASOD，ｏ−クロロフ
エノールを用いることにより680nm付近にてＮ，
Ｎ−ジエチル−ｐ−フエニレンジアミンを定量的
に測定することができるものであつた。 参考例 42 Ｎ，Ｎ−ジメチル−ｐ−フエニレンジアミン，
ASOD，２，６−ジブロムフエノールを用いる
呈色反応 参考例７のフエノールの代りに２，６−ジブロ
ムフエノール（0.5mM）を作用させた以外は同
様に行なつた。 生成した色素の吸収波長を第４２図の実線にて
示した。また、２，６−ジブロムフエノール溶液
の代りに0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）を用いて同
様の反応をさせた結果は、第４２図の点線にて示
す通りであつた。以上の結果から、ASOD2，６
−ジブロムフエノールを用いることにより695nm
付近にてＮ，Ｎ−ジメチル−ｐ−フエニレンジア
ミンを定量的に測定することができるものであつ
た。 参考例 43 Ｎ，Ｎ−ジメチル−ｐ−フエニレンジアミン，
ASOD，アントラニル酸を用いる呈色反応 参考例７のフエノールの代りにアントラニル酸
（0.5mM）を作用させた以外は同様に行なつた。 生成した色素の吸収波長を第４３図の実線にて
示した。また、アントラニル酸溶液の代りに
0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）を用いて同様の反応
をさせた結果は、第４３図の点線にて示す通りで
あつた。以上の結果から、ASOD，アントラニル
酸を用いることにより680nm付近にてＮ，Ｎ−ジ
メチル−ｐ−フエニレンジアミンを定量的に測定
することができるものであつた。 参考例 44 Ｎ，Ｎ−ジメチル−ｐ−フエニレンジアミン，
ASOD，アニリンを用いる呈色反応 参考例７のフエノールの代りにアニリンを作用
させた以外は同様に行なつた。 生成した色素の吸収波長を第４４図の実線にて
示した。また、アニリン溶液の代りに0.1Mリン
酸緩衝液（PH7.0）を用いて同様の反応をさせた
結果は、第４４図の点線にて示す通りであつた。
以上の結果から、ASOD，アニリンを用いること
により690nm付近にてＮ，Ｎ−ジメチル−ｐ−フ
エニレンジアミンを定量的に測定することができ
るものであつた。 参考例 45 Ｎ，Ｎ−ジメチル−ｐ−フエニレンジアミン，
ASOD，２−ナフトールを用いる呈色反応 参考例７のフエノールの代りに２−ナフトール
（0.5mM）を作用させた以外は同様に行なつた。 生成した色素の吸収波長を第４５図の実線にて
示した。また、２−ナフトール溶液の代りに
0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）を用いて同様の反応
をさせた結果は、第４５図の点線にて示す通りで
あつた。以上の結果から、ASOD，２−ナフトー
ルを用いることにより630nm付近にてＮ，Ｎ−ジ
メチル−ｐ−フエニレンジアミンを定量的に測定
することができるものであつた。 参考例 46 Ｎ，Ｎ−ジメチル−ｐ−フエニレンジアミン，
ASOD，４−クロロ−１−ナフトールを用いる
呈色反応 参考例７のフエノールの代りに４−クロロ−１
−ナフトール（0.5mM）を作用させた以外は同
様に行なつた。 生成した色素の吸収波長を第４６図の実線にて
示した。また、４−クロロ−１−ナフトール溶液
の代りに0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）を用いて同
様の反応をさせた結果は第４６図の点線にて示す
通りであつた。以上の結果から、ASOD，４−ク
ロロ−１−ナフトールを用いることにより640nm
付近にてＮ，Ｎ−ジメチル−ｐ−フエニレンジア
ミンを定量的に測定することができるものであつ
た。 参考例 47 Ｎ，Ｎ−ジメチル−ｐ−フエニレンジアミン，
ASOD，１−ナフトール−２−スルホン酸を用
いる呈色反応 参考例７のフエノールの代りに１−ナフトール
−２−スルホン酸カリウム（0.5mM）を作用さ
せた以外は同様に行なつた。 生成した色素の吸収波長を第４７図の実線にて
示した。また、１−ナフトール−２−スルホン酸
カリウム溶液の代りに0.1Mリン酸緩衝液（PH
7.0）を用いて同様の反応をさせた結果は、第４
７図の点線にて示す通りであつた。以上の結果か
ら、ASOD，１−ナフトール−２−スルホン酸カ
リウムを用いることにより650nm付近にてＮ，Ｎ
−ジメチル−ｐ−フエニレンジアミンを定量的に
測定することができるものであつた。 参考例 48 Ｎ，Ｎ−ジメチル−ｐ−フエニレンジアミン，
ASOD，ｍ−フエニレンジアミンを用いる呈色
反応 参考例７のフエノールの代りにｍ−フエニレン
ジアミン（0.5mM）を作用させた以外は同様に
行なつた。 生成した色素の吸収波長を第４８図の実線にて
示した。また、ｍ−フエニレンジアミン溶液の代
りに0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）を用いて同様の
反応をさせた結果は、第４８図の点線にて示す通
りであつた。以上の結果からASOD，ｍ−フエニ
レンジアミンを用いることにより650nm付近にて
Ｎ，Ｎ−ジメチル−ｐ−フエニレンジアミンを定
量的に測定することができるものであつた。 参考例 49 Ｎ，Ｎ−ジメチル−ｐ−フエニレンジアミン，
ASOD，ｏ−メチルアニリンを用いる呈色反応 参考例７のフエノールの代りにｏ−メチルアニ
リン（0.5mM）を作用させた以外は同様に行な
つた。 生成した色素の吸収波長を第４９図の実線にて
示した。また、ｏ−メチルアニリン溶液の代りに
0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）を用いて同様の反応
をさせた結果は第４９図の点線にて示す通りであ
つた。以上の結果から、ASOD，ｏ−メチルアニ
リンを用いることにより695nm付近にてＮ，Ｎ−
ジメチル−ｐ−フエニレンジアミンを定量的に測
定することができるものであつた。 参考例 50 Ｎ，Ｎ−ジメチル−ｐ−フエニレンジアミン，
ASOD，ｍ−メチルアニリンを用いる呈色反応 参考例７のフエノールの代りにｍ−メチルアニ
リン（0.5mM）を作用させた以外は同様に行な
つた。 生成した色素の吸収波長を第５０図の実線にて
示した。また、ｍ−メチルアニリン溶液の代りに
0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）を用いて同様の反応
をさせた結果は、第５０図の点線にて示す通りで
あつた。以上の結果からASOD，ｍ−メチルアニ
リンを用いることにより705nm付近にてＮ，Ｎ−
ジメチル−ｐ−フエニレンジアミンを定量的に測
定することができるものであつた。 参考例 51 ２，６−ジブロム−４−アミノフエノール，
ASOD，ｍ−ブロムアニリンを用いる呈色反応 参考例１の１−ナフトール−２−スルホン酸カ
リウムの代りにｍ−ブロムアニリン（0.5mM）
を作用させた以外は同様に行なつた。 生成した色素の吸収波長を第５１図の実線にて
示した。また、ｍ−ブロムアニリン溶液の代りに
0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）を用いて同様の反応
をさせた結果は第５１図の点線にて示す通りであ
つた。以上の結果からASOD，ｍ−ブロムアニリ
ンを用いることにより635nm付近にて２，６−ジ
ブロム−４−アミノフエノールを定量的に測定す
ることができるものであつた。 参考例 52 ２，６−ジブロム−４−アミノフエノール，チ
ロシナーゼ，Ｎ，Ｎ−エチル−ヒドロキシエチ
ルアニリンを用いる呈色反応 ２，６−ジブロム−４−アミノフエール塩酸塩
を0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）に溶解して0.05M
溶液とした。Ｎ，Ｎ−エチル−ヒドロキシエチル
アニリンを0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）に溶解し
て5mM溶液とした。２，６−ジブロム−４−ア
ミノフエール塩酸塩溶液1.0mlおよびＮ，Ｎ−エ
チル−ヒドロキシエチルアニリン溶液1.0mlの混
合液にチロシナーゼ溶液（50μ，100U）を加え
て37℃、10分間反応せしめた。 生成した色素の吸収波長を第５２図に示すもの
で705nm付近に特異的吸収を示したもので、この
705nm付近の吸収波長に基いて定量できるもので
あつた。 またチロシナーゼの代りに、ASODやラツカー
ゼを用いた結果においても、同様の特異的吸収を
示す色素形成を示したものであつた。 参考例 53 ２，６−ジブロム−４−アミノフエノール，
ASOD，ｍ−クロルフエノールを用いる呈色反
応 参考例１の１−ナフトール−２−スルホン酸カ
リウムの代りにｍ−クロルフエノール（0.1mM）
を作用させた以外は同様に行なつた。 生成した色素の特異的吸収波長を650nm付近で
あつた。その結果、ASOD，ｍ−クロルフエノー
ルを用いることにより650nm付近にて２，６−ジ
ブロムーｐ−アミノフエノールを定量的に測定す
ることができるものであつた。 参考例 54 ２，６−ジブロム−４−アミノフエノール，
ASOD，ｏ−クロルアニリンを用いる呈色反応 参考例１の１−ナフトール−２−スルホン酸カ
リウムの代りにｏ−クロルアニリン（0.5mM）
を作用させた以外は同様に行なつた。 生成した色素の特異的吸収波長を630nm付近で
あつた。その結果、ASOD，ｏ−クロルアニリン
を用いることにより630nm付近にて２，６−ジブ
ロムー４−アミノフエノールを定量的に測定する
ことができるものであつた。 参考例 55 ２，６−ジブロム−４−アミノフエノール，
ASOD，ｐ−クロロフエノールを用いる呈色反
応 参考例１の１−ナフトール−２−スルホン酸カ
リウムの代りにｐ−クロロフエノール（1mM）
を作用させた以外は同様に行なつた。 生成した色素の特異的吸収波長を620nm付近で
あつた。その結果、ASOD，ｐ−クロルフエノー
ルを用いることにより620nm付近にて２，６−ジ
ブロムー４−アミノフエノールを定量的に測定す
ることができるものであつた。 参考例 56 ２，６−ジブロム−４−アミノフエノール，
ASOD，ｐ−ブロムフエノールを用いる呈色反
応 参考例１の１−ナフトール−２−スルホン酸カ
リウムの代りにｐ−ブロムフエノール（1mM）
を作用させた以外は同様に行なつた。 生成した色素の特異的吸収波長を600nm付近で
あつた。その結果、ASOD，ｐ−ブロムフエノー
ルを用いることにより600nm付近にて２，６−ジ
ブロムー４−アミノフエノールを定量的に測定す
ることができるものであつた。 参考例 57 ２，６−ジブロム−４−アミノフエノール，
ASOD，２，４−ジクロロフエノールを用いる
呈色反応 参考例１の１−ナフトール−２−スルホン酸カ
リウムの代りに２，４−ジクロロフエノール
（0.1mM）を作用させた以外は同様に行なつた。 生成した色素の特異的吸収波長を660nm付近で
あつた。その結果、ASOD，２，４−ジクロルフ
エノールを用いることにより660nm付近にて２，
６−ジブロムー４−アミノフエノールを定量的に
測定することができるものであつた。 参考例 58 ２，６−ジブロム−４−アミノフエノール，
ASOD，２，４−ジブロム−フエノールを用い
る呈色反応 参考例１の１−ナフトール−２−スルホン酸カ
リウムの代りに２，４−ジブロムフエノール
（1mM）を作用させた以外は同様に行なつた。 生成した色素の特異的吸収波長を660nm付近で
あつた。その結果、ASOD，２，４−ジブロムフ
エノールを用いることにより660nm付近にて２，
６−ジブロムー４−アミノフエノールを定量的に
測定することができるものであつた。 参考例 59 Ｎ，Ｎ−ジエチル−ｐ−フエニレンジアミン，
ASOD，α−ナフトールを用いる呈色反応 参考例６のフエノールの代りにα−ナフトール
（0.5mM）を作用させた以外は、同様に行なつ
た。 生成した色素の特異的吸収波長は620nm付近で
あつた。その結果、ASOD，α−ナフトールを用
いることにより620nm付近にて、Ｎ，Ｎ−ジエチ
ル−ｐ−フエニレンジアミンを定量的に測定する
ことができるものであつた。 参考例 60 Ｎ，Ｎ−ジエチル−ｐ−フエニレンジアミン，
ASOD，ｍ−クロロフエノールを用いる呈色反
応 参考例６のフエノールの代りにｍ−クロロフエ
ノール（0.5mM）を作用させた以外は、同様に
行なつた。 生成した色素の特異的吸収波長は695nm付近で
あつた。その結果、ASOD，ｍ−クロロフエノー
ルを用いることにより695nm付近にてＮ，Ｎ−ジ
エチル−ｐ−フエニレンジアミンを定量的に測定
することができるものであつた。 参考例 61 Ｎ，Ｎ−ジエチル−ｐ−フエニレンジアミン，
ASOD，２，３−ジメチルフエノールを用いる
呈色反応 参考例６のフエノールの代りに２，３−ジメチ
ルフエノール（10mM）を作用させた以外は、同
様に行なつた。 生成した色素の特異的吸収波長は625nm付近で
あつた。その結果、ASOD，２，３−ジメチルフ
エノールを用いることにより625nm付近にてＮ，
Ｎ−ジエチル−ｐ−フエニレンジアミンを定量的
に測定することができるものであつた。 参考例 62 Ｎ，Ｎ−ジエチル−ｐ−フエニレンジアミン，
ASOD，アントラニル酸を用いる呈色反応 参考例６のフエノールの代りにアントラニル酸
（0.5mM）を作用させた以外は、同様に行なつ
た。 生成した色素の特異的吸収波長は680nm付近で
あつた。その結果、ASOD，アントラニル酸を用
いることにより680nm付近にてＮ，Ｎ−ジエチル
−ｐ−フエニレンジアミンを定量的に測定するこ
とができるものであつた。 参考例 63 Ｎ，Ｎ−ジエチル−ｐ−フエニレンジアミン，
ASOD，２，４−ジメチルフエノールを用いる
呈色反応 参考例６のフエノールの代りに２，４−ジメチ
ルフエノール（10mM）を作用させた以外は、同
様に行なつた。 生成した色素の特異的吸収波長は630nm付近で
あつた。その結果、ASOD，２，４−ジメチルフ
エノールを用いることにより630nm付近にてＮ，
Ｎ−ジメチル−ｐ−フエニレンジアミンを定量的
に測定することができるものであつた。 参考例 64 Ｎ，Ｎ−ジメチル−ｐ−フエニレンジアミン，
ASOD，Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリンを用いる呈
色反応 参考例７のフエノールの代りにＮ，Ｎ−ジメチ
ルアニリン（0.5mM）を作用させた以外は同様
に行なつた。 生成した色素の特異的吸収波長は725nm付近で
あつた。その結果、ASOD，Ｎ，Ｎ−ジメチルア
ニリンを用いることにより725nm付近にてＮ，Ｎ
−ジメチル−ｐ−フエニレンジアミンを定量的に
測定することができるものであつた。 実施例 １ CAP活性測定法 Ｎ，Ｎ−ジメチル−ｐ−フエニレンジアミン・
二塩酸，Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｓ−ベ
ンジル−Ｌ−システインをジシクロヘキシカルボ
ジイミドのもとで常法に従い脱水縮合反応を行
い、脱保護し得たＳ−ベンジル−Ｌ−システイン
−ｐ−ジメチルアミノアニリド100mgを、ジオキ
サン３mlおよび0.16N塩酸の混液に溶解し、さら
に1.25％ツウイン（Tween）80（界面活性剤）を
含有する0.1Mトリエタノールアミン−クエン酸
緩衝液（PH7.4）100mlと混合して合成基質の溶液
を調製した。この合成基質溶液２ml、ｐ−キシレ
ノール（5mM）0.1ml、ラツカーゼ（2000U／ml）
100μを比色用セルに加え、良く混合し、37℃
にて恒温した。恒温後、CAP含有の妊婦血清
（238mU／ml）50μを加え反応を開始した。30
分反応後の吸光度を600nmで測定したところ、0.
D600＝0.18であつた。この結果より、本法は
CAP活性を良好に測定できる定量法であつた。 実施例 ２ CAP活性測定法 ３，５−ジブロム−４−ヒドロキシアニリン，
Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｓ−ベンジル−
Ｌ−システインをジシクロヘキシルカルボジイミ
ドのもとで常法に従い脱水縮合反応を行い、脱保
護し得たＳ−ベンジル−Ｌ−システイン−３，５
−ジブロム−４−ヒドロキシアニリド100mgをジ
オキサン３mlおよび0.16N塩酸の混液に溶解し、
さらに1.25％ツウイン80を含有する0.1Mトリエ
タノールアミン−クエン酸緩衝液（PH7.4）100ml
と混合し、合成基質溶液を調製した。 この合成基質溶液２ml、ｐ−キシレノール
（5mM）0.1ml、ラツカーゼ（2000U／ml）100μ
を比色用セルに入れ、良く混合し、37℃にて恒
温した。恒温後、CAP含有の妊婦血清
（238mU／ml）50μを加え、反応を開始した。
30分反応後の吸光度を585nmで測定したところ、
0.D585＝0.195であつた。この結果より、本法は
CAP活性を良好に測定できるものであつた。 実施例 ３ CAP活性測定法 実施例２のラツカーゼの代りにASOD
（1320U／ml）を使用した以外は同様に行なつた。
その結果、0.D585＝0.173を示したもので本法は
CAP活性に良好に測定できるものであつた。 実施例 ４ CAP活性測定法 Ｎ，Ｎ−ジエチル−ｐ−フエニレンジアミン，
Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｓ−ベンジン−
Ｌ−システインをジシクロヘキシルカルボジイミ
ドのもとで常法に従い脱水縮合反応を行い、脱保
護し得たＳ−ベンジル−Ｌ−システイン−ｐ−ジ
エチルアミノアニリド100mgをジオキサン３mlお
よび0.16N塩酸の混液に溶解し、さらに1.25％ツ
イーン80を含有する0.1Mトリエタノールアミン
−クエン酸緩衝液（PH7.4）100mlと混合して合成
基質溶液を調製した。 この合成基質溶液２ml、１−ナフトール−２−
スルホン酸（2mM）0.1ml、ラツカーゼ
（2000U／ml）100μを比色用セルに入れ、良く
混合し37℃にて恒温した。恒温後、CAP含有の
妊婦血清（238mU／ml）50μを加え反応を開始
した。30分反応後の吸光度を655nmで測定したと
ころ、0.D655＝0.205であり、本法はCAP活性を
良好に測定できるものであつた。 実施例 ５ α−キモトリプシン活性の測定 ｐ−ジメチルアミノアニリン・２塩酸塩、Ｎ−
ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−チロシンをジシ
クロヘキシルカルボジイミドのもとで常法に従
い、脱水縮合反応を行い、パラジウム−炭素触媒
で脱保護を行い、次いで、ベンゾイルクロライド
と反応を行い、得たＮ−ベンゾイル−Ｌ−チロシ
ン−ｐ−ジメチルアミノアニリド30mgを５mlアセ
トンに溶解し、合成基質の原液とした。この原液
に0.1M Tris−HCl緩衝液（PH7.8）100ml（5mM
塩化カルシウムおよび１％ツウイン80を含む）を
加え合成基質溶液とした。 この合成基質溶液２ml、ｐ−キシレノール
（5mM）0.1ml、ラツカーゼ（2000U／ml）100μ
を比色用セルに入れ、良く混合し、37℃にて恒
温した。恒温後、α−キモトリプシン（３mg／
ml）50μを加え反応を開始した。30分後の吸光
度を600nmで測定したところ、0.D600＝0.48であ
つた。この結果より、本法はα−キモトリプシン
を良好に測定できるものであつた。 実施例 ６ トリプシン活性の測定 Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−トリプト
フアン、Ｎ，Ｎ−ジエチル−ｐ−フエニレンジア
ミンを、氷冷下にジシクロヘキシルカルボジイミ
ドのもとで常法に従い脱水縮合反応を行い、後、
パラジウム−炭素触媒で脱保護を行い、次いで、
無水酢酸でアセチル化を行い、得たＮ−アセチル
−Ｌ−トリプトフアン−ｐ−ジエチルアミノアニ
リド30mgを５mlアセトンに溶解し、基質原液とし
た。この基質原液に0.1Mトリス−HCl緩衝液
（PH7.8）100ml（5mM塩化カルシウムおよび１％
ツウイン80を含む）を加え合成基質溶液とした。 この合成基質溶液２ml、１−ナフトール−２−
スルホン酸（2mM）0.1ml、ラツカーゼ
（2000U／ml）100μを比色用セルに入れ良く混
合し、37℃にて恒温した。恒温後、トリプシン
50μを加え反応を開始した。30分後の吸光度を
655nmで測定したところ、0.D655＝0.38であつ
た。この結果より本法は、トリプシンを良好に測
定できる方法であつた。 実施例 ７ α−キモトリプシン活性の測定 ｐ−ジエチルアミノアニリン，Ｎ−ベンジルオ
キシカルボニル−Ｌ−チロシンをジシクロヘキシ
カルボジイミドのもとで常法に従い、脱水縮合反
応を行い、後、パラジウム−炭素触媒で脱保護を
行い、次いで、ベンゾイルクロライドと反応を行
い、得たＮ−ベンゾイル−Ｌ−チロシン−ｐ−ジ
エチルアミノアニリド30mgを５mlアセトンに溶解
し、基質原液とした。この基質原液に0.1Mトリ
ス−HCl緩衝液（PH7.8）100ml（5mM塩化カル
シウム、および１％ツウイン80を含む）を加え合
成基質溶液とした。 この合成基質溶液２ml、１−ナフトール−２−
スルホン酸（2mM）0.1ml、ラツカーゼ
（2000U／ml）100μを比色用セルに入れ、良く
混合し、37℃にて恒温した。恒温後、α−キモト
リプシン（３mg／ml）50μを加え、反応を開始
した。30分後の吸光度を655nmで測定したとこ
ろ、0.D655＝0.52であつた。この結果より、本法
はα−キモトリプシンを良好に測定できる方法で
あつた。 実施例 ８ α−キモトリプシン活性の測定 ３，５−ジブロム−４−ヒドロキシアニリン，
Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−チロシンを
ジシクロヘキシカルボジイミドのもとで常法に従
い脱水縮合反応を行い、後、パラジウム−炭素触
媒で脱保護を行い、次いでベンゾイルクロライド
と反応を行い、得たＮ−ベンゾイル−Ｌ−チロシ
ン−３，５−ジブロム−４−ヒドロキシアニリド
30mgを５mlアセトンに溶解し、基質原液とした。
この基質原液に0.1Mトリス−HCl緩衝液（PH7.8）
100ml（5mM塩化カルシウムおよび１％ツウイン
80を含む）を加え合成基質溶液とした。 この合成基質溶液２ml、ｐ−キシレノール
（5mM）0.1ml、ラツカーゼ（2000U／ml）100μ
を比色用セルに入れ、良く混合し、37℃にて恒
温した。恒温後、α−キモトリプシン（３mg／
ml）50μを加え、反応を開始した。30分後の吸
光度を585nmで測定したところ、0.D585＝0.465
であつた。この結果より本法はα−キモトリプシ
ンを良好に測定できる方法であつた。 実施例 ９ α−キモトリプシン活性測定法 実施例８のラツカーゼの代りにASOD
（1320U／ml）100μを使用した以外は同様に行
なつたその結果、0.D585＝0.452であつた。この
結果より本法はα−キモトリプシン活性を良好に
測定できる方法であつた。 実施例 10 フエニル−α−Ｄ−グルコシド，ASODを用い
るα−グルコシダーゼ活性の測定 0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）に溶解したフエニ
ル−α−Ｄ−グルコシド（半井化学薬品株式会
社）溶液（0.24mM）２ml，２，６−ジブロム−
４−アミノフエノール溶液（1mM）１ml，ハヤ
トウリ由来のASOD（1320U／ml）100μを比色
用セムに入れ良く混合し、30℃に恒温した。恒温
後、α−グルコシダーゼ（東洋紡製）（3000U／
ml）10μを添加し、反応を開始し、２分ごと
に、吸収波長の変化を測定した。その結果を第５
７図に示した。この結果より、フエニル−α−Ｄ
−グルコシドを合成基質とし、反応で遊離するフ
エノールを、ASODとカプラー存在下で反応させ
ることにより、波長610nm付近でα−グルコシダ
ーゼ活性の測定が良好にできるものであつた。 実施例 11 α−アミラーゼ活性の測定 マルトペンタオースを酢酸ナトリウム，無水酢
酸下で常法通りの操作で、まずマルトペンタオー
スの水酸基をアセチル化し、次いで得られたマル
トペンタオース−β−ペプタデカアセテートとフ
エノールそれに無水塩化亜鉛を加え、常法に従い
カツプリング反応を行い、αおよびβ−フエニル
ヘキサデカアセチルマルトペンタオシドを得、次
いで常法通りの方法で、例えばメタノール中のナ
トリウムメトキシド溶液で脱アセチル化をするこ
とにより得られるフエニルヘキサデカマルトペン
タオキシドを、α−サイクロデキストリン２％を
含有する0.05Mグリセロリン酸緩衝液（PH7.0）
に溶解し0.4％合成基質溶液を調製した。 この合成基質溶液２mlにα−グルコシダーゼ
（500U／ml）およびβ−グルコシダーゼ
（100U／ml）を含有する酵素液50μ、２，６−
ジブロム−４−アミノフエノール（5mM）50μ
、ラツカーゼ（2000U／ml）100μを比色用セ
ルに入れ良く混合し、37℃に恒温した。恒温後、
α−アミラーゼ（ベーリレガー製、5000I.U.／
）50μを加え、反応を開始した。20分後の吸
光度を測定したところ、0.D610＝0.412であつた。
この結果より本法は、アミラーゼ活性を良好に測
定できる方法であつた。 実施例 12 ｏ−クロロフエニルマルトペンタオキシド，
２，６−ジブロム−４−アミノフエノール，ラ
ツカーゼを用いたアミラーゼ活性測定 α−サイクロデキストリン２％を含有する
0.05Mグリセロリン酸緩衝液（PH7.0）にｏ−ク
ロロフエニルマルトペンタオシドα，β−混合物
を溶解させて0.4％合成基質溶液を調製した。こ
の合成基質溶液２mlに、α−グルコシダーゼ
（500U／ml）およびβ−グルコシダーゼ
（100U／ml）を含有する酵素液50μ、２，６−
ジブロム−４−アミノフエノール（5mM）50μ
、ラツカーゼ（2000U／ml）100μを比色用セ
ルに入れ良く混合し、37℃に恒温した。恒温後、
α−アミラーゼ（ベーリンガー製）（5000I.U.／
）50μを加え、反応を開始した。20分後の吸
光度を650nmで測定したところ、0.D650＝0.38で
あつた。この結果より、本法は、アミラーゼ活性
を良好に測定できる方法であつた。 実施例 13 α−アミラーゼ活性の測定 マルトペンタオースを酢酸ナトリウム、無水酢
酸下で常法通りの操作で、まずマルトペンタオー
スの水酸基をアセチル化し、次いで得られたマル
トペンタオース−β−ヘプタデカアセテートと
２，６−ジブロムフエノールそれに無水塩化亜鉛
を加え、常法に従いカツプリング反応を行い、α
−およびβ−２，６−ジブロムフエニルヘキサデ
カアセチルマルトペンタオシドを得、次いで常法
通りの方法で例えばメタノール中のナトリウムメ
トキシド溶液で脱アセチル化をすることにより得
られる２，６−ジブロムフエニルヘキサデカマル
トペンタオキシドを、α−サイクロデキストリン
２％を含有する0.05Mグリセロリン酸緩衝液（PH
7.0）に溶解し、0.4％合成基質溶液を調製した。 この合成基質溶液２mlに、α−グルコシダーゼ
（500U／ml）及びβ−グルコシダーゼ（100U／
ml）を含有する酵素液50μ、２，６−ジブロム
−４−アミノフエノール（5mM）50μ、ラツカ
ーゼ（2000U／ml）100μを比色用セルに入れ良
く混合し、37℃に恒温した。恒温後、α−アミラ
ーゼ（ベーリンガー製、5000I.U.／）50μを
加え、反応を開始した。20分後の吸光度を測定し
たところ、0.D670＝0.387であつた。この結果よ
り、本法は、アミラーゼ活性を良好に測定できる
方法であつた。 実施例 14 α−アミラーゼ活性の測定 実施例13のラツカーゼをASOD（1310U／ml）
におきかえた以外は同様にして行なつた。 反応後の吸光度を測定したところ、0.D670＝
0.378であつた。この結果より、本法はアミラー
ゼ活性を良好に測定できる方法であつた。 実施例 15 フエニルリン酸，ASODを用いたAlP活性測定 0.1MトリスHCl緩衝液（PH8.0）に溶解したフ
エニルリン酸・2Na溶液（5mM），２ml，２，６
−ジブロム−４−アミノフエノール（1mM）１
ml，ハヤトウリ由来のASOD（1320U／ml）100μ
を比色用セルに入れ良く混合し、30℃に恒温し
た。恒温後、AlP（ベーリンガー社製）（400U／
0.17ml）10μを添加し、反応を開始し、５分ご
とに各波長による変化を測定した。その結果を、
第５８図に示した。この結果より、フエニルリン
酸を基質とし、反応で遊離するフエノールを、
ASODとカプラー存在下で反応させることによ
り、AlP活性の測定ができるものであつた。 実施例 16 AlP活性測定法 常法に従つてリン酸と２，６−ジブロムフエノ
ールとからエステル化して得た、２，６−ジブロ
ムフエニルリン酸を0.1Mトリス−HCl緩衝液
（PH8.0）に溶解し合成基質溶液（5mM）を調製
した。この合成基質溶液２ml、２，６−ジブロム
−４−アミノフエノール（1mM）１ml、ラツカ
ーゼ（2000U／ml）100μを比色用セルに入れ良
く混合し、37℃に恒温した。恒温後、AlP（ベー
リンガー社製）（400U／0.17ml）10μを添加し、
反応を開始した。30分後の吸光度を測定したとこ
ろ、0.D670＝1.253であつた。この結果本法は、
ホスフアターゼ活性を測定するのに良好な方法で
あつた。 実施例 17 酢酸フエニル、ASODを用いるエステラーゼ活
性測定 0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）に溶解した酢酸フ
エニル（東京化成製）（5mM）１ml，２，６−ジ
ブロム−４−アミノフエノール（0.5mM）１ml，
ハヤトウリ由来のASOD（60U／ml）20μを比色
用セルに入れ、良く混合し30℃に恒温した。恒温
後、リパーゼ（東洋醸造社製；2545U／ml）100μ
を添加し、反応を開始し、２分ごとに各波長で
の変化を測定した。その結果を第５９図に示し
た。この結果より、酢酸フエニルを基質とし、反
応で遊離するフエノールを、ASODとカプラー存
在下で反応させることにより、リパーゼ（エステ
ラーゼ）活性の測定ができるものであつた。 実施例 18 細菌内毒素の測定方法 Boc−Arg（NO2）−OHとＮ，Ｎ−ジエチルア
ミノ−ｐ−フエニレンジアミンとを常法に従い水
溶性カルボジイミドにて脱水縮合して、次いで脱
保護し、まずＨ−Arg（NO2）−ジエチルアミノア
ニリドを得、一方、Boc−Len−OHとグリシン
エチルエステルとを、これも常法通りに水溶性カ
ルボジイミドにて脱水縮合してBoc−Leu−Gly
−エステルにし、さらにアルカリで脱エステル化
しBoc−Leu−Gly−OHを得、次いで両者を、ブ
タノール中、常法に従い、水溶性カルボジイミド
の存在下で脱水縮合を行い、Boc−Leu−Gly−
Arg（NO2）−ジエチルアミノアニリドを得、次い
でパラジウム触媒還元にて−NO2基を切断し、
Boc−Leu−Cly−Arg−ジエチルアミノアニリド
を得、これを0.2Mトリス−HCl緩衝液（PH7.3）、
0.005MCaCl2含有緩衝液に溶解し、合成基質溶液
を調製した（2.5mM）。この合成基質溶液２ml、
１−ナフトール−２−スルホン酸（2mM）１ml、
ラツカーゼ（2000U／ml）100μを比色用セルに
入れ良く混合し、37℃に恒温した。恒温後、内毒
素活性酵素50μを加え、30分間反応させた。反
応後の吸光度を655nmで測定したところ、0.D655
＝0.268であつた。この結果より、本法は、細菌
内毒素を測定できる方法であつた。 なお、内毒素活性化酵素は、以下の如くに従つ
て調製した。 特公昭51−40131号に準じ日本産カブトガニ
Tachypleus tridentatus（体重約２Kg程度）から
厳重に汚染を避けて約100ml程度の血リンパ液を
採取した。遠心分離によりアメボサイトを分離
し、３％塩化ナトリウム溶液で洗浄しアメボサイ
ト・ペレツトを得た。このアメボサイト・ペレツ
トに緩衝液（Tris−HCl，0.05M；CaCl2，
0.001M；NaCl，0.15M；PH7.2）を原血リンパ液
の1/10容加え、減菌したホモジナイザーでよく撹
拌し、凍結融解し、その後50000r.p.m.で15分間
遠心して、上清を得た。これをアメボサイト・ラ
イセート・Tachypleus（以下ALTと略称する）
とした。このALTをヤングらの方法〔N.S.
Young etal；J.Clin.，Invest.，51，1790（1972）〕
に準じSephadex Ｇ−50（フアルマシア・フアイ
ンケミカル社の商品名）を用いてゲル過を行
い、アミダーゼ前駆物質を含む分画（Fraction−
１）（以下ALT−F1と略称する。）を得、これに、
M.Niwaらの方法（Japan.J.Med.Sci.Biol.26，
20，1973）に準じて調製したサルモネラミネンタ
R595の内毒素を作用させて内毒素活性酵素を得
た。
【表】
【表】
【表】
【表】
【表】
【表】
【表】
【表】
【表】
【表】
【表】
第１図は２，６−ジブロム−４−アミノフエノ
ール、ASOD、１−ナフトール−２−スルホン酸
を用いる生成色素の吸収波長（実線）を示し、第
２図は２，６−ジブロム−４−アミノフエノー
ル、ASOD、フエノールを用いる生成色素の吸収
波長（実線）を示し、第３図は２，６−ジブロム
−４−アミノフエノール、ラツカーゼ、１−ナフ
トール−２−スルホン酸を用いる生成色素の吸収
波長（実線）を示し、第４図は２，６−ジブロム
−４−アミノフエノール、ラツカーゼ、２，５−
ジメチルフエノールを用いる生成色素の吸収波長
（実線）を示し、第５図は２，６−ジブロム−４
−アミノフエノール、ラツカーゼ、フエノールを
用いる生成色素の吸収波長（実線）を示し、第６
図はＮ，Ｎ−ジエチル−ｐ−フエニレンジアミ
ン、ASOD、フエノールを用いる生成色素の吸収
波長（実線）を示し、第７図はＮ，Ｎ−ジメチル
−ｐ−フエニレンジアミン、ASOD、フエノール
を用いる生成色素の吸収波長（実線）を示し、第
８図は２，６−ジブロム−４−アミノフエノー
ル、ASOD、ｏ−メチルアニリンを用いる生成色
素の吸収波長（実線）を示し、第９図は２，６−
ジブロム−４−アミノフエノール、ASOD、ｍ−
メチルアニリンを用いる生成色素の吸収波長（実
線）を示し、第１０図は２，６−ジブロム−４−
アミノフエノール、ASOD、４−クロロ−１−ナ
フトールを用いる生成色素の吸収波長（実線）を
示し、第１１図は２，６−ジブロム−４−アミノ
フエノール、ASOD、クレーブ酸を用いる生成色
素の吸収波長（実線）を示し、第１２図は２，６
−ジブロム−４−アミノフエノール、ASOD、１
−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸を用いる生成色素
の吸収波長（実線）を示し、第１３図はＮ，Ｎ−
ジエチル−ｐ−フエニレンジアミン、ラツカー
ゼ、１−ナフトール−２−スルホン酸を用いる生
成色素の吸収波長（実線）を示し、第１４図は
２，６−ジブロム−４−アミノフエノール、
ASOD、ｏ−クロロフエノールを用いる生成色素
の吸収波長（実線）を示し、第１５図は２，６−
ジブロム−４−アミノフエノール、ASOD、ｍ−
アミノフエノールを用いる生成色素の吸収波長
（実線）を示した、第１６図は２，６−ジブロム
−４−アミノフエノール、ASOD、ｍ−フエニレ
ンジアミンを用いる生成色素の吸収波長（実線）
を示し、第１７図は２，６−ジブロム−４−アミ
ノフエノール、ASOD、２，６−ジブロムフエノ
ールを用いる生成色素の吸収波長（実線）を示
し、第１８図は２，６−ジブロム−４−アミノフ
エノール、ASOD、２，６−ジメトキシフエノー
ルを用いる生成色素の吸収波長（実線）を示し、
第１９図は２，６−ジブロム−４−アミノフエノ
ール、ASOD、３，５−ジメチルフエノールを用
いる生成色素の吸収波長（実線）を示し、第２０
図は２，６−ジブロム−４−アミノフエノール、
ASOD、２，６−ジメチルフエノールを用いる生
成色素の吸収波長（実線）を示し、第２１図は
２，６−ジブロム−４−アミノフエノール、
ASOD、２，４−ジメチルフエノールを用いる生
成色素の吸収波長（実線）を示し、第２２図は
２，６−ジブロム−４−アミノフエノール、
ASOD、２，３−ジメチルフエノールを用いる生
成色素の吸収波長（実線）を示し、第２３図は
２，６−ジブロム−４−アミノフエノール、
ASOD、２，５−ジメチルフエノールを用いる生
成色素の吸収波長（実線）を示し、第２４図は
２，６−ジブロム−４−アミノフエノール、
ASOD、アントラニル酸を用いる生成色素の吸収
波長（実線）を示し、第２５図は２，６−ジブロ
ム−４−アミノフエノール、ASOD、Ｎ，Ｎ−ジ
メチルアニリンを用いる生成色素の吸収波長（実
線）を示し、第２６図は２，６−ジブロム−４−
アミノフエノール、ASOD、アニリンを用いる生
成色素の吸収波長（実線）を示し、第２７図は
２，６−ジブロム−４−アミノフエノール、
ASOD、ｍ−クロロアニリンを用いる生成色素の
吸収波長（実線）を示し、第２８図は２，６−ジ
ブロム−４−アミノフエノール、ASOD、ｏ−ア
ミノフエノールを用いる生成色素の吸収波長（実
線）を示し、第２９図はＮ，Ｎ−ジエチル−ｐ−
フエニレンジアミン、ASOD、ｏ−クロロフエノ
ールを用いる生成色素の吸収波長（実線）を示
し、第３０図はＮ，Ｎ−ジエチル−ｐ−フエニレ
ンジアミン、ASOD、ｍ−フエニレンジアミンを
用いる生成色素の吸収波長（実線）を示し、第３
１図はＮ，Ｎ−ジエチル−ｐ−フエニレンジアミ
ン、ASOD、ｏ−メチルアニリンを用いる生成色
素の吸収波長（実線）を示し、第３２図はＮ，Ｎ
−ジエチル−ｐ−フエニレンジアミン、ASOD、
ｍ−メチルアニリンを用いる生成色素の吸収波長
（実線）を示し、第３３図はＮ，Ｎ−ジエチル−
ｐ−フエニレンジアミン、ASOD、クレーブ酸を
用いる生成色素の吸収波長（実線）を示し、第３
４図はＮ，Ｎ−ジエチル−ｐ−フエニレンジアミ
ン、ASOD、１−ナフトール−２−スルホン酸を
用いる生成色素の吸収波長（実線）を示し、第３
５図はＮ，Ｎ−ジエチル−ｐ−フエニレンジアミ
ン、ASOD、２，６−ジブロムフエノールを用い
る生成色素の吸収波長（実線）を示し、第３６図
はＮ，Ｎ−ジエチル−ｐ−フエニレンジアミン、
ASOD、２，６−ジメトキシフエノールを用いる
生成色素の吸収波長（実線）を示し、第３７図は
Ｎ，Ｎ−ジエチル−ｐ−フエニレンジアミン、
ASOD、２，６−ジメチルフエノールを用いる生
成色素の吸収波長（実線）を示し、第３８図は
Ｎ，Ｎ−ジエチル−ｐ−フエニレンジアミン、
ASOD、２，５−ジメチルフエノールを用いる生
成色素の吸収波長（実線）を示し、第３９図は
Ｎ，Ｎ−ジエチル−ｐ−フエニレンジアミン、
ASOD、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリンを用いる生成
色素の吸収波長（実線）を示し、第４０図はＮ，
Ｎ−ジエチル−ｐ−フエニレンジアミン、
ASOD、アニリンを用いる生成色素の吸収波長
（実線）を示し、第４１図はＮ，Ｎ−ジメチル−
ｐ−フエニレンジアミン、ASOD、ｏ−クロロフ
エノールを用いる生成色素の吸収波長（実線）を
示し、第４２図はＮ，Ｎ−ジメチル−ｐ−フエニ
レンジアミン、ASOD、２，６−ジブロムフエノ
ールを用いる生成色素の吸収波長（実線）を示
し、第４３図はＮ，Ｎ−ジメチル−ｐ−フエニレ
ンジアミン、ASOD、アントラニル酸を用いる生
成色素の吸収波長（実線）を示し、第４４図は
Ｎ，Ｎ−ジメチル−ｐ−フエニレンジアミン、
ASOD、アニリンを用いる生成色素の吸収波長
（実線）を示し、第４５図はＮ，Ｎ−ジメチル−
ｐ−フエニレンジアミン、ASOD、α−ナフトー
ルを用いる生成色素の吸収波長（実線）を示し、
第４６図はＮ，Ｎ−ジメチル−ｐ−フエニレンジ
アミン、ASOD、４−クロロ−１−ナフトールを
用いる生成色素の吸収波長（実線）を示し、第４
７図はＮ，Ｎ−ジメチル−ｐ−フエニレンジアミ
ン、ASOD、１−ナフトール−２−スルホン酸を
用いる生成色素の吸収波長（実線）を示し、第４
８図はＮ，Ｎ−ジメチル−ｐ−フエニレンジアミ
ン、ASOD、ｍ−フエニレンジアミンを用いる生
成色素の吸収波長（実線）を示し、第４９図は
Ｎ，Ｎ−ジメチル−ｐ−フエニレンジアミン、
ASOD、ｏ−メチルアニリンを用いる生成色素の
吸収波長（実線）を示し、第５０図はＮ，Ｎ−ジ
メチル−ｐ−フエニレンジアミン、ASOD、ｍ−
メチルアニリンを用いる生成色素の吸収波長（実
線）を示し、第５１図は２，６−ジブロム−４−
アミノフエノール、ASOD、ｍ−ブロムアニリン
を用いる生成色素の吸収波長（実線）を示し、第
５２図は２，６−ジブロム−４−アミノフエノー
ル、チロシナーゼ、Ｎ，Ｎ−エチル−ヒドロキシ
エチルアニリンを用いる生成色素の吸収波長（実
線）を示し、第５３図は１−ナフトール−２−ス
ルホン酸、ASODを用いる２，６−ジブロム−４
−アミノフエノールの検量線を示し、第５４図は
フエノール、ASODを用いるＮ，Ｎ−ジエチル−
ｐ−フエニレンジアミンの検量線を示し、第５５
図はＮ，Ｎ−ジエチル−ｐ−フエニレンジアミ
ン、ASODを用いるフエノールの検量線を示し、
第５６図は２，５−ジメチルフエノール、ASOD
を用いる２，６−ジブロム−４−アミノフエノー
ルの検量線を示し、第５７図はフエニル−α−グ
ルコシド、ASODを用いるα−グルコシダーゼ活
性の測定における反応時間（２分間隔）に対する
生成色素の吸収波長の変化を表わす曲線を示し、
第５８図はフエニルリン酸、ASODを用いるAlP
活性測定における反応時間（５分間隔）に対する
生成色素の吸収波長の変化を表わす曲線を示し、
第５９図は酢酸フエニル、ASODを用いるエステ
ラーゼ活性測定における反応時間（２分間隔）に
対する生成色素の吸収波長の変化を表わす曲線を
示し、第６０図は２，６−ジブロム−４−アミノ
フエノール、２，５−ジメチルフエノール、
ASODを用いる反応時間経過に対する酸素消費率
を示し、第６１図は２，６−ジブロム−４−アミ
ノフエノール、２，５−ジメチルフエノール、ラ
ツカーゼを用いる反応時間経過に対する酸素消費
率を示す。
ール、ASOD、１−ナフトール−２−スルホン酸
を用いる生成色素の吸収波長（実線）を示し、第
２図は２，６−ジブロム−４−アミノフエノー
ル、ASOD、フエノールを用いる生成色素の吸収
波長（実線）を示し、第３図は２，６−ジブロム
−４−アミノフエノール、ラツカーゼ、１−ナフ
トール−２−スルホン酸を用いる生成色素の吸収
波長（実線）を示し、第４図は２，６−ジブロム
−４−アミノフエノール、ラツカーゼ、２，５−
ジメチルフエノールを用いる生成色素の吸収波長
（実線）を示し、第５図は２，６−ジブロム−４
−アミノフエノール、ラツカーゼ、フエノールを
用いる生成色素の吸収波長（実線）を示し、第６
図はＮ，Ｎ−ジエチル−ｐ−フエニレンジアミ
ン、ASOD、フエノールを用いる生成色素の吸収
波長（実線）を示し、第７図はＮ，Ｎ−ジメチル
−ｐ−フエニレンジアミン、ASOD、フエノール
を用いる生成色素の吸収波長（実線）を示し、第
８図は２，６−ジブロム−４−アミノフエノー
ル、ASOD、ｏ−メチルアニリンを用いる生成色
素の吸収波長（実線）を示し、第９図は２，６−
ジブロム−４−アミノフエノール、ASOD、ｍ−
メチルアニリンを用いる生成色素の吸収波長（実
線）を示し、第１０図は２，６−ジブロム−４−
アミノフエノール、ASOD、４−クロロ−１−ナ
フトールを用いる生成色素の吸収波長（実線）を
示し、第１１図は２，６−ジブロム−４−アミノ
フエノール、ASOD、クレーブ酸を用いる生成色
素の吸収波長（実線）を示し、第１２図は２，６
−ジブロム−４−アミノフエノール、ASOD、１
−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸を用いる生成色素
の吸収波長（実線）を示し、第１３図はＮ，Ｎ−
ジエチル−ｐ−フエニレンジアミン、ラツカー
ゼ、１−ナフトール−２−スルホン酸を用いる生
成色素の吸収波長（実線）を示し、第１４図は
２，６−ジブロム−４−アミノフエノール、
ASOD、ｏ−クロロフエノールを用いる生成色素
の吸収波長（実線）を示し、第１５図は２，６−
ジブロム−４−アミノフエノール、ASOD、ｍ−
アミノフエノールを用いる生成色素の吸収波長
（実線）を示した、第１６図は２，６−ジブロム
−４−アミノフエノール、ASOD、ｍ−フエニレ
ンジアミンを用いる生成色素の吸収波長（実線）
を示し、第１７図は２，６−ジブロム−４−アミ
ノフエノール、ASOD、２，６−ジブロムフエノ
ールを用いる生成色素の吸収波長（実線）を示
し、第１８図は２，６−ジブロム−４−アミノフ
エノール、ASOD、２，６−ジメトキシフエノー
ルを用いる生成色素の吸収波長（実線）を示し、
第１９図は２，６−ジブロム−４−アミノフエノ
ール、ASOD、３，５−ジメチルフエノールを用
いる生成色素の吸収波長（実線）を示し、第２０
図は２，６−ジブロム−４−アミノフエノール、
ASOD、２，６−ジメチルフエノールを用いる生
成色素の吸収波長（実線）を示し、第２１図は
２，６−ジブロム−４−アミノフエノール、
ASOD、２，４−ジメチルフエノールを用いる生
成色素の吸収波長（実線）を示し、第２２図は
２，６−ジブロム−４−アミノフエノール、
ASOD、２，３−ジメチルフエノールを用いる生
成色素の吸収波長（実線）を示し、第２３図は
２，６−ジブロム−４−アミノフエノール、
ASOD、２，５−ジメチルフエノールを用いる生
成色素の吸収波長（実線）を示し、第２４図は
２，６−ジブロム−４−アミノフエノール、
ASOD、アントラニル酸を用いる生成色素の吸収
波長（実線）を示し、第２５図は２，６−ジブロ
ム−４−アミノフエノール、ASOD、Ｎ，Ｎ−ジ
メチルアニリンを用いる生成色素の吸収波長（実
線）を示し、第２６図は２，６−ジブロム−４−
アミノフエノール、ASOD、アニリンを用いる生
成色素の吸収波長（実線）を示し、第２７図は
２，６−ジブロム−４−アミノフエノール、
ASOD、ｍ−クロロアニリンを用いる生成色素の
吸収波長（実線）を示し、第２８図は２，６−ジ
ブロム−４−アミノフエノール、ASOD、ｏ−ア
ミノフエノールを用いる生成色素の吸収波長（実
線）を示し、第２９図はＮ，Ｎ−ジエチル−ｐ−
フエニレンジアミン、ASOD、ｏ−クロロフエノ
ールを用いる生成色素の吸収波長（実線）を示
し、第３０図はＮ，Ｎ−ジエチル−ｐ−フエニレ
ンジアミン、ASOD、ｍ−フエニレンジアミンを
用いる生成色素の吸収波長（実線）を示し、第３
１図はＮ，Ｎ−ジエチル−ｐ−フエニレンジアミ
ン、ASOD、ｏ−メチルアニリンを用いる生成色
素の吸収波長（実線）を示し、第３２図はＮ，Ｎ
−ジエチル−ｐ−フエニレンジアミン、ASOD、
ｍ−メチルアニリンを用いる生成色素の吸収波長
（実線）を示し、第３３図はＮ，Ｎ−ジエチル−
ｐ−フエニレンジアミン、ASOD、クレーブ酸を
用いる生成色素の吸収波長（実線）を示し、第３
４図はＮ，Ｎ−ジエチル−ｐ−フエニレンジアミ
ン、ASOD、１−ナフトール−２−スルホン酸を
用いる生成色素の吸収波長（実線）を示し、第３
５図はＮ，Ｎ−ジエチル−ｐ−フエニレンジアミ
ン、ASOD、２，６−ジブロムフエノールを用い
る生成色素の吸収波長（実線）を示し、第３６図
はＮ，Ｎ−ジエチル−ｐ−フエニレンジアミン、
ASOD、２，６−ジメトキシフエノールを用いる
生成色素の吸収波長（実線）を示し、第３７図は
Ｎ，Ｎ−ジエチル−ｐ−フエニレンジアミン、
ASOD、２，６−ジメチルフエノールを用いる生
成色素の吸収波長（実線）を示し、第３８図は
Ｎ，Ｎ−ジエチル−ｐ−フエニレンジアミン、
ASOD、２，５−ジメチルフエノールを用いる生
成色素の吸収波長（実線）を示し、第３９図は
Ｎ，Ｎ−ジエチル−ｐ−フエニレンジアミン、
ASOD、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリンを用いる生成
色素の吸収波長（実線）を示し、第４０図はＮ，
Ｎ−ジエチル−ｐ−フエニレンジアミン、
ASOD、アニリンを用いる生成色素の吸収波長
（実線）を示し、第４１図はＮ，Ｎ−ジメチル−
ｐ−フエニレンジアミン、ASOD、ｏ−クロロフ
エノールを用いる生成色素の吸収波長（実線）を
示し、第４２図はＮ，Ｎ−ジメチル−ｐ−フエニ
レンジアミン、ASOD、２，６−ジブロムフエノ
ールを用いる生成色素の吸収波長（実線）を示
し、第４３図はＮ，Ｎ−ジメチル−ｐ−フエニレ
ンジアミン、ASOD、アントラニル酸を用いる生
成色素の吸収波長（実線）を示し、第４４図は
Ｎ，Ｎ−ジメチル−ｐ−フエニレンジアミン、
ASOD、アニリンを用いる生成色素の吸収波長
（実線）を示し、第４５図はＮ，Ｎ−ジメチル−
ｐ−フエニレンジアミン、ASOD、α−ナフトー
ルを用いる生成色素の吸収波長（実線）を示し、
第４６図はＮ，Ｎ−ジメチル−ｐ−フエニレンジ
アミン、ASOD、４−クロロ−１−ナフトールを
用いる生成色素の吸収波長（実線）を示し、第４
７図はＮ，Ｎ−ジメチル−ｐ−フエニレンジアミ
ン、ASOD、１−ナフトール−２−スルホン酸を
用いる生成色素の吸収波長（実線）を示し、第４
８図はＮ，Ｎ−ジメチル−ｐ−フエニレンジアミ
ン、ASOD、ｍ−フエニレンジアミンを用いる生
成色素の吸収波長（実線）を示し、第４９図は
Ｎ，Ｎ−ジメチル−ｐ−フエニレンジアミン、
ASOD、ｏ−メチルアニリンを用いる生成色素の
吸収波長（実線）を示し、第５０図はＮ，Ｎ−ジ
メチル−ｐ−フエニレンジアミン、ASOD、ｍ−
メチルアニリンを用いる生成色素の吸収波長（実
線）を示し、第５１図は２，６−ジブロム−４−
アミノフエノール、ASOD、ｍ−ブロムアニリン
を用いる生成色素の吸収波長（実線）を示し、第
５２図は２，６−ジブロム−４−アミノフエノー
ル、チロシナーゼ、Ｎ，Ｎ−エチル−ヒドロキシ
エチルアニリンを用いる生成色素の吸収波長（実
線）を示し、第５３図は１−ナフトール−２−ス
ルホン酸、ASODを用いる２，６−ジブロム−４
−アミノフエノールの検量線を示し、第５４図は
フエノール、ASODを用いるＮ，Ｎ−ジエチル−
ｐ−フエニレンジアミンの検量線を示し、第５５
図はＮ，Ｎ−ジエチル−ｐ−フエニレンジアミ
ン、ASODを用いるフエノールの検量線を示し、
第５６図は２，５−ジメチルフエノール、ASOD
を用いる２，６−ジブロム−４−アミノフエノー
ルの検量線を示し、第５７図はフエニル−α−グ
ルコシド、ASODを用いるα−グルコシダーゼ活
性の測定における反応時間（２分間隔）に対する
生成色素の吸収波長の変化を表わす曲線を示し、
第５８図はフエニルリン酸、ASODを用いるAlP
活性測定における反応時間（５分間隔）に対する
生成色素の吸収波長の変化を表わす曲線を示し、
第５９図は酢酸フエニル、ASODを用いるエステ
ラーゼ活性測定における反応時間（２分間隔）に
対する生成色素の吸収波長の変化を表わす曲線を
示し、第６０図は２，６−ジブロム−４−アミノ
フエノール、２，５−ジメチルフエノール、
ASODを用いる反応時間経過に対する酸素消費率
を示し、第６１図は２，６−ジブロム−４−アミ
ノフエノール、２，５−ジメチルフエノール、ラ
ツカーゼを用いる反応時間経過に対する酸素消費
率を示す。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 被検液中の加水分解酵素活性測定において、 下記一般式〔〕 （ただし式中、R1またはR2のいずれか一方は
R19CO−NH−基、（Ｓ）ｎ−Ｏ−基、R20−Ｏ−
PO（OH）−Ｏ−基またはR21CO−Ｏ−基で、
R19CO−はアミノ酸残基またはペプチド残基を示
し、Ｓは単糖類単位、ｎは１以上の整数を示し、
R20−Ｏ−はHO−基または置換または未置換グ
リセロール残基を示し、R21CO−は脂肪酸残基を
示し、R1またはR2の他方、R3、R4、R5またはR6
は各々水素原子、ハロゲン原子、低級アルキル
基、低級アルコキシル基、アミノ基、置換アミノ
基、水酸基、カルボキシル基またはスルホ基を示
し、またはR5およびR6は一緒になつて六員環を
形成してもよい基を示す）で表される合成基質を
用い、下記一般式〔〕 （ただし式中、R7は水酸基、アミノ基または
置換アミノ基を示し、R8、R9、R10、R11または
R12は各々水素原子、ハロゲン原子、低級アルキ
ル基、低級アルコキシル基、アミノ基、置換アミ
ノ基、水酸基、カルボキシル基またはスルホ基を
示し、またはR11およびR12は一緒になつて六員
環を形成してもよい基を示し、但し、R7、R8、
R9、R10、R11、R12の各基において上記一般式
〔〕で表される合成基質から加水分解酵素の作
用にて遊離される化合物と同一化合物である場合
を除く）で表されるカプラーおよび酵素の共存
下、少なくとも上記一般式〔〕で表される合成
基質から加水分解酵素の作用にて遊離される化合
物と一般式〔〕で表されるカプラーとを酸素を
消費して色素を形成する酸化酵素を作用せしめ、
次いで反応系における検出可能な変化の量を測定
することを特徴とする被検液中の加水分解酵素活
性の測定法。 ２ 少なくとも上記一般式〔〕で表される合成
基質から加水分解酵素の作用にて遊離される化合
物と一般式〔〕で表されるカプラーとを酸素を
消費して色素を形成する酸化酵素が、水酸基また
はアミノ基置換芳香核化合物の酸化酵素である特
許請求の範囲第１項記載の測定法。 ３ 水酸基またはアミノ基置換芳香核化合物の酸
化酵素が、アスコルピン酸オキシダーゼ、ラツカ
ーゼまたはチロシナーゼである特許請求の範囲第
２項記載の測定法。 ４ 検出可能な変化の量の測定が、酸素の消費量
または生成した色素の量の測定である特許請求の
範囲第１項記載の測定法。 ５ 酸素の消費量の測定が、電気化学的測定であ
る特許請求の範囲第４項記載の測定法。 ６ 電気化学的測定が、酸素電極による測定であ
る特許請求の範囲第５項記載の測定法。 ７ 生成した色素の量の測定が、呈色色素の特異
的吸収波長による吸光度測定である特許請求の範
囲第４項記載の測定法。 ８ 加水分解酵素がペプチターゼまたはプロテア
ーゼであり、一般式〔〕で表される合成基質に
おけるR1またはR2がR19CO−NH−基である合成
基質である特許請求の範囲第１項記載の測定法。 ９ 加水分解酵素が糖加水分解酵素であり、一般
式〔〕で表される合成基質におけるR1または
R2が（Ｓ）ｎ−Ｏ−基である合成基質である特
許請求の範囲第１項記載の測定法。 １０ 加水分解酵素がホスフアターゼであり、一
般式〔〕で表される合成基質におけるR1また
はR2がR20−Ｏ−PO（OH）−Ｏ−基である合成基
質である特許請求の範囲第１項記載の測定法。 １１ 加水分解酵素がエステラーゼまたはリパー
ゼであり、一般式〔〕で表される合成基質にお
けるR1またはR2がR21CO−Ｏ−基である合成基
質である特許請求の範囲第１項記載の測定法。
Priority Applications (3)
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|---|---|---|---|
| JP57173569A JPS5963198A (ja) | 1982-10-01 | 1982-10-01 | 酵素を用いる定量法 |
| US06/538,680 US4681841A (en) | 1982-10-01 | 1983-10-03 | Enzymatic assay method |
| US07/203,071 USRE33635E (en) | 1982-10-01 | 1988-06-06 | Enzymatic assay method |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57173569A JPS5963198A (ja) | 1982-10-01 | 1982-10-01 | 酵素を用いる定量法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
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| JPS5963198A JPS5963198A (ja) | 1984-04-10 |
| JPH0358720B2 true JPH0358720B2 (ja) | 1991-09-06 |
Family
ID=15962986
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
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| DE3940010A1 (de) * | 1989-12-02 | 1991-06-06 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verwendung eines schwer loeslichen salzes einer heteropolysaeure zur bestimmung eines analyts, entsprechendes bestimmungsverfahren sowie hierfuer geeignetes mittel |
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| US5654164A (en) * | 1995-01-09 | 1997-08-05 | Board Of Trustees Operating Michigan State University | Method and device for reducing oxygen with a reduced oxidase with color formation |
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- 1982-10-01 JP JP57173569A patent/JPS5963198A/ja active Granted
-
1983
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS5963198A (ja) | 1984-04-10 |
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