JPH062078B2 - ビリルビンオキシダ−ゼによる基質の定量法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明はビリルビンオキシダーゼによる基質の定量法に
関する。さらに詳しくはビリルビンオキシダーゼにより
ヒドロキシ化合物又はアミノ化合物を定量する方法に関
し、体液中の各種加水分解酵素活性の定量法に適用でき
る。

体液中の各種加水分解酵素活性の定量は有用な診断情報
を与えるものとして臨床的意義の重要性が高い、加水分
解酵素としては例えばロイシンアミノペプチダーゼ、γ
−グルタミルトランスペプチダーゼ、シスチンアミノペ
プチダーゼの様な各種（アミノ）ペプチダーゼやトリプ
シン、α−キモトリプシン、プラスミン、トロンビン、
カリクレイン、ウロキナーゼ、エンドトキシン、第Ｘａ
の因子、コラゲナーゼ、エラスターゼ、カチプシンの様
な各種プロテアーゼ、アミラーゼやグルコシダーゼの様
な各種糖加水分解酵素、アルカリフオスフアターゼ、酸
性フオスフアターゼの様な各種フオスフアターゼ、エス
テラーゼ、リパーゼの様な各種脂質加水分解酵素等が挙
げられる。これらの臨床的意義としては各種臓器疾患、
腫瘍等の診断して有効な情報を与える。

（従来の技術） 各種加水分解酵素の作用により遊離したフエ ノール又
はその誘導体、アニリン又はその誘導体の定量法として
は従来から次の方法がある。例えばフオスフアターゼ活
性の測定としてよく利用されているフエノール化合物を
フエリシアン化カリウム存在下、４−アミノアンチピリ
ンと酸化縮合させ比色定量する方法（例えば斎藤正行他
臨床化学分析IV（昭和46.7.21東京化学同人p100)やγ
−グルタミルトランスペプチダーゼ活性測定によく利用
されているアミノ化合物をメタ過コード酸により適当な
カプラーと酸化縮合させ比色定量をする方法（例えば高
林利行他、臨床病理（補）29、p538(1979))、あるいは
ロイシンアミノペプチダーゼ活性測定でみられるアミノ
化合物を亜硝酸塩でジアゾ化して適当なカプラーとカッ
プリングさせ、その後、比色定量する方法（例えばJ.A.
Goldbarg,Cancer II，p283(1958))などの化学的な方法
による比色定量法がある。

一方、酵素を利用する定量法としては例えばフオスフア
ターゼ活性を測定する場合、過酸化水素の存在下フエノ
ール化合物をペルオキシダーゼを用いて適当な、例えば
４−アミノアンチピリンと酸化縮合させ比色定量する方
法が知られている。

（発明が解決しようとする問題点） 化学的酸化剤（例えばフエリシアン化カリ、メタ過ヨー
ド酸）や亜硝酸塩を用いるジアゾカップリング法を用い
る化学的な方法では目的とする酵素活性は、目的とする
酵素の反応条件と検出して利用される酸化反応やジアゾ
カップリング反応条件が異なることや、検出反応として
利用される酸化剤やジアゾ化剤が目的とする酵素を阻害
する点などにより、検出反応と同時同一の反応条件下で
検出することが出来ない為に操作段階が多く、測定時間
も長く、全体に測定が繁雑となる、又フエシアン化カリ
ウムの様な有害な薬品を使用する点や塩酸酸性下でのジ
アゾ化反応の様に過酷な反応条件が必要な点で問題があ
る。一方、ペリオキシダーゼを用いる酵素法は反応に過
酸化水素が必要であるが、過酸化水素は非常に不安定な
物質である為に正確な測定が出来ずほとんど利用されて
いない。

（問題を解決する為の手段） 本発明者等はかかる従来の欠点を解消し、温和な反応条
件下で操作性、簡便性の点で優れ、正確度の高いヒドロ
キシ化合物又はアミノ化合物の定量法を見出すべく、鋭
位検討の結果、カプラーの共存下、下記化合物〔Ｉ〕ま
たは化合物〔II〕にビリルビンオキシダーゼを作用させ
ることによりその目的を達成することが見出された。

すなわち本発明は下記一般式〔Ｉ〕または〔II〕で表さ
れる基質に、カプラーとして第三級アミノ基を有するア
ニリン誘導体の共存下、ビリルビンオキシダーゼを作用
させ、生成する色素を測定することを特徴とするビリル
ビンオキシダーゼによる基質の定量法である。

一般式〔Ｉ〕 （式中、Ｚ_１は少なくとも１つが置換アミノ基を示し、
残りが水素原子、低級アルキル基または低級アルコキシ
基を示す。ｎ＝１〜５である。） 一般式〔II〕 （式中、Ｚ_２は水素原子、ハロゲン原子、カルボキシル
基またはスルホン酸基を示す。ｍ＝１〜５である。） 従来、ビリルビンオキシダーゼはビリルビンをビリベリ
ジンに変換する酸化酵素(N,Tanaka,Agric.Biol.Chem.,4
5,2383(1981))として知られ、その基質特異性について
は日本臨床化学会年会記録、第２３巻、第７頁に４−ア
ミノアンチピリンがビリルビン以外の基質として成り得
ることが記載されているが、その特異性はビリルビンを
１００％とした場合、わずか２％以下で、実際にはビリ
ルビンに非常に高い基質特異性がある酸化酵素として知
られていた。ところが本発明者らは意外にもビリルビン
オキシダーゼが上記化合物〔Ｉ〕または〔II〕で示され
る様な構造をもったアミノ化合物、ヒドロキシ化合物を
基質として作用することを見出した。

その化合物の特徴は芳香族化合物でアミノ基、水酸基を
もつ化合物である点であり、上記の４−アミノアンチピ
リンと異なる構造式をもつものであり、しかも実用的に
実施可能な高い反応性を示すものである。

本発明の基質とは、一般式〔Ｉ〕で表わされるアニリン
誘導体または一般式〔II〕で表わされるフェノールまた
はフェノール誘導体である。

一般式〔Ｉ〕で表されるアニリン誘導体としては、例え
ばｐ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノアニリン、ｐ−Ｎ，Ｎ−
ジエチルアミノアニリン、ｐ−アミノ−Ｎ−エチル−Ｎ
−ヒドロキシエチルアニリン、ｐ−モルフォリノアニリ
ン、４−アミノ−３−メチル−Ｎ−（β−ヒドロキシエ
チル）−Ｎ−エチルアニリン、４−アミノ−Ｎ−エチル
−Ｎ−（β−メタンスルホンアミドエチル）−ｍ−トル
イジンなどが挙げられる。

一般式〔II〕で表されるフェノールまたはフェノール誘
導体としては、例えばフェノール、ｐ−クロロフェノー
ル、２，４−ジクロロフェノール、３，５−ジクロロフ
ェノールスルホン酸、３−ヒドロキシ−２，４，６−ト
リヨード安息香酸、ｏ−クレゾール、ｍ−クレゾール、
３−メトキシ フェノール、ｏ−アミノフェノール、サ
リチル酸、５−アミノ−サリチル酸、ｍ−ヒドロキシ安
息香酸、ｐ−ヒドロキシ安息香酸、２−ヒドロキシベン
ゼンスルホン酸、４−ヒドロキシベンゼンスルホン酸、
１−ナフトール−２−スルホン酸、４−アミノ−３，５
−ジブロモフェノールなどが挙げられる。

本発明では被検液中の一般式〔Ｉ〕または〔II〕で表さ
れる化合物にカプラーの共存下、ビリルビンオキシダー
ゼを作用させることにより温和な反応条件下で操作性簡
便性に優れ、正確度の高い上記化合物〔Ｉ〕または〔I
I〕の定量法を行うことができる。

本発明において使用されるビリルビンオキシダーゼとし
ては、反応において酵素の存在下、化合物〔Ｉ〕または
〔II〕と共存するカプラーと反応させて新たな分光学的
な吸収を示す酸化縮合物を生成するものであれば、いか
なる起源のものでもよい。例えばミロセシウム(Myrothe
cium)属由来（Agric.Biol.Chem.,45,2383(1981))のもの
が知られている。

次に使用されるカプラーとしては一般式〔Ｉ〕または
〔II〕で表される化合物と酸化縮合して分光学的に新た
な吸収をもつ化合物を形成するものであって、具体的に
は第三級アミノ基を有するアニリン誘導体である。

このようなカプラーとしてはＮ，Ｎ−ジメチルアニリ
ン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−ｍ−トルイジン、Ｎ−エチル−
Ｎ−（３−スルホプロピル）−ｍ−アニシジン，Ｎ−エ
チル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−
ｍ−トルイジン，３−メチル−Ｎ−エチル−Ｎ−（２−
ヒドロキシエチル）アニリン、ｐ−Ｎ，Ｎ−ジエチルア
ミノアニリンの様なアニリン誘導体が挙げられる。

ビリルビンオキシダーゼを作用させる条件としては、特
に限定はないが被検液中の加水分解酵素活性が求める様
な場合は、該加水分解酵素が作用する条件のｐＨを保つ
緩衝液で使用することが多い。通常ｐＨは４．０〜１
０．０に保つ様な緩衝液が用いられる。使用量としては
反応が充分進行する量であればよく、例えば反応液１ml
当り０．１〜１００単位もあれば充分である。反応温度
としては通常臨床化学分析に利用される温度、例えば２
０〜５０℃の範囲で行えば良い。用いられるカップラー
の濃度としては化合物〔Ｉ〕または〔II〕に対して等モ
ル以上を用いればよく、場合によっては上限として酵素
活性を阻害しない程度の量となる。

ビリルビンオキシダーゼを使用させた後の化合物〔Ｉ〕
または〔II〕の実際の定量は生成してくる酸化縮合物の
分光学的な吸光度の変化を測定するか、またはビリルビ
ンオキシダーゼにより消費される酸素を酸素電極等で測
定するかして対応する化合物〔Ｉ〕または〔II〕あるい
は加水分解酵素活性を求める。

（発明の効果） 本発明に従えば温和な条件で簡単な操作で簡便に正確度
高く化合物〔Ｉ〕または〔II〕の定量が可能となり、臨
床検査の診断分野における加水分解酵素、例えば前述の
ロイシンアミノペプチダーゼ、γ−グルタミントランス
ペプチダーゼなどの各種アミノペプチダーゼ、トリプシ
ン、α−キモトリプシンなどのプロテアーゼ、アミラー
ゼ、グリコシダーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ
などの糖加水分解酵素、アルカリフォファターゼ、酸性
フォスファターゼなどのフォスファターゼ、エステラー
ゼ、リパーゼなどの脂質分解酵素等の分析にとって極め
て有意義である。

（実施例） 以下、実施例により本発明を説明する。

実施例 １． 被検液中の各種アミノ化合物として下記化合物を用い、
下記各種カプラーおよびビリルビンオキシダーゼを含む
試薬を反応させた。

Ａ．アミノ化合物 １．ｐ−Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノアニリン ２．ｐ−モルフォリノアニリン ３．４−アミノ−Ｎ−エチル−Ｎ−（β−メタンスル
ホンアミドエチル）−ｍ−トルイジン Ｂ．カプラー １．ｐ−キシレノール（参考例） ２．２，５−ジクロロフエノールスルホン酸（参考
例） ３．Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホ
プロピル）−ｍ−トルイジン（本発明） Ｃ．試薬 ビリルビンオキシダーゼ（天野製薬製）1U／ml カプラー 4mM ０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０） Ｄ．測定方法 上記試薬（Ｃ）２．５mlに各種アミノ化合物(0.15mM相
当）０．５mlを加えて３７℃で反応させる。生成した色
素の吸収波長を第１図〜第９図に示す。アミノ化合物と
カプラーの組合せは第１表に示す。

実施例 ２． 被検液中の各種ヒドロキシ化合物（Ａ）を下記試薬
（Ｃ）を用い、下記各種カプラー（Ｂ）とビリルビンオ
キシダーゼと反応させた。

Ａ．ヒドロキシ化合物 １．ｐ−クロロフエノール ２．３-ハイドロキシ-2,4,6-トリヨ-ド安息香酸 ３．３，５-ジクロロフエノ-ルスルホン酸 Ｂ．カプラー １．ジエチルフェニレンジアミン（本発明） ２．2,6-ジブロモアミノフエノ-ル（参考例） Ｃ．試薬 ビリルビンオキシダ-ゼ（天野製薬製） 1U／ml カプラー 0.05mM 0.1Mリン酸緩衝液(pH7.0) Ｄ．測定方法 上記試薬（Ｃ）２．５mlに各種ヒドロキシ化合物（Ａ）
（20mM相当）０．９mlを加えて３７℃で反応させる。生
成した色素の吸収曲線を第１０図〜第１４図に示す。ヒ
ドロキシ化合物とカプラーの組合せは第２表に示す。

実施例 ３． 被検溶中のγ−ＧＴＰを下記試薬を用い、下記方法によ
り定量した。

１．試薬 0.15Mグリシルグリミン緩衝液(pH7.9) N-エチル-N-(2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル)-m-トルイジン 3.6mM ビリルビンオキシダーゼ（天野製薬製）1U／ml L-γ-グルタミル-P-N-エチル-N-ヒドロキシエチルアミノアニリド （和光純薬製） ６ｍＭ ｐＨは苛性ソーダで調整する。

２．測定方法 上記試薬２．９mlに被検液５０μｌを加え、３７℃で反
応させ、波長７４５ｎｍでの吸光度の変化を測定し、レ
ートアッセイ法によりγ−ＧＴＰ活性を定量する。

第１５図にその検量線を示す。

【図面の簡単な説明】

第１図〜第９図は本発明の実施例１における生成した色
素の吸収波長を示す。 第１０図〜第１４図は本発明の実施例２における生成し
た色素の吸収波長を示す。 第１５図は本発明の実施例３における生成した色素の吸
収波長を示す。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】下記一般式〔Ｉ〕または下記一般式〔II〕
   で表される基質に、カプラーとして第三級アミノ基を有
   するアニリン誘導体の共存下、ビリルビンオキシダーゼ
   を作用させ、生成する色素を測定することを特徴とする
   ビリルビンオキシダーゼによる基質の定量法。 一般式〔Ｉ〕 （式中、Ｚ_１は少なくとも１つが置換アミノ基を示し、
   残りが水素原子、低級アルキル基または低級アルコキシ
   基を示す。ｎ＝１〜５である。） 一般式〔II〕 （式中、Ｚ_２は水素原子、ハロゲン原子、カルボキシル
   基またはスルホン酸基を示す。ｍ＝１〜５である。）