JPH0358998A - 高純度タンパク質の安定化 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明の概要 マンニトールあるいはデキストラン−７０等の炭水化物
が第■因子等のタンパク質を精製する際に添加される。

タンパク質純度６０〜９９％の場合においても、炭水化
物はタンパク質を安定化する。炭水化物は種々の精製段
階において添加され、さらに凍結乾燥及び再生の際にタ
ンパク質を安定化するために最終容器中にも含まれる。

本発明の背景 ｌ１発明の技術分野 本発明は人体に使用する治療用タンパク質のような高純
度で生理活性を有するタンパク質産物に関する。特に、
本発明は第■因子：Ｃのような酵素前駆体及びモノクロ
ーナル抗体を安定化する炭水化物の利用に関する。

２、関連技術の説明：これまでの技術は３つの範躊に分
類されると考えられる。（１）第■因子濃縮物等の未精
製タンパク質の安定化；（２）高純度タンパク質の安定
化；及び（３）デキストランあるいはソルビトール等の
炭水化物の他用途。

（１）ロック（Ｒｏｃｋ）は米国特許第４．３５９゜４
６３号において酸性クエン酸デキストロース（ＡＣＤ）
あるいはリン酸化クエン酸デキストロス（ｃ　ｐ　Ｄ）
等のカルシウムをキレートする抗凝固剤を添加すること
によって血液あるいは血漿中の第■因子活性を安定化す
ることを開示している。またヘパリンも添加されるマン
ューズ（Ｍａｔｈｅｗｓ）らは米国特許第４．７４３，
６８０号において例えばＱＡＥ−セファデックス、高分
子電解質及びアミノヘキシル−セファロース樹脂ツカラ
ムクロマトを用いて血漿より第■因子を精製する方法を
開示している。糖、ポリヒドリックアルコール類及びア
ミノ酸はタンパク質がこれらのイオン交換クロマト担体
に対して選択的に結合することを促進する。−例として
は、ＩＭのソルビトールがＡＩ（ＯＨ）、吸着段階の試
料を含んだ緩衝液中に添加される（Ｃｏ１．５．１．６
３）　、シュークロース、マンノース及びデキストラン
を含む糖類がポリヒドリックアルコールのかわりに利用
できる（Ｃｏ１．１５．１．７）。

ラスムサン（Ｒａｓｍｕｓｓａｎ）らは米国特許第４，
６５０．８５８号においてアミノ酸あるいは炭水化物等
の「塩溶試薬」を用いたＰＥＧ沈殿法による高純度（５
０ｕ　／ｍｇ）第■因子の調製を開示している。適当な
炭水化物としては糖アルコール及びオリゴ糖がある。

トーツス（Ｔｈｏｍａｓ）は米国特許第４．０８９．９
４４号において再生溶液１００＋Ｊあたりθ〜５グラム
のデキストロースを添加することによって第■因子組成
物の溶解度を改良する方法を開示している。二糖及び短
鎖オリゴ糖（デキストリン）も利用できる。

ウィンケルマン（Ｗ　１ｎｋｅ　１ｍａｎ）は米国特許
第４゜７８９．７３３号において硫酸化多糖類、すなわ
ちヘパリンによる沈殿によって血漿より第■因子を回収
することを開示している。デキストラン硫酸も利用でき
ると報告されている。

シュウイア　（Ｓｃｈｗｉｎｎ）らは米国特許第４，２
９７．３４４号において第■因子含有の血漿タンパク質
の加熱処理を発表している。タンパク質を熱安定化する
ためにアミノ酸、単糖、オリゴ糖あるいは糖アルコール
を水溶液に添加する。２０〜６０　ｗ／ｖ％のシューク
ロースが好ましい。

フエルナンデス（Ｆｅｒｎａｎｄａｓ）らは米国特許第
４．４４０，６７９号において単一安定化剤としてポリ
オール存在下での（第■因子を含む）血漿タンパク質の
加熱処理を開示している。好ましい「ポリオール」はシ
ュークロースであり；発表された方法ではデキスラン、
スターチあるいはグリコーゲン等の高分子量ポリオール
の利用（Ｃｏ１．５．１．４４）は好ましくない。

ヨーロッパ特許第０７７．８７０号において中性アミノ
酸、単糖、オリゴ糖及び糖アルコールの一群から選択し
た少なくとも１つの安定化剤１０％（ｗ／ｖ）あるいは
それ以上さらに補助安定化剤として炭素原子数３〜ＩＯ
のカルボン酸ｌＯ％あるいはそれ以上の存在下での第■
因子の加熱処理が開示されている。

ナイトウ（Ｎａｉｔｏ）らは米国特許第４．４４６゜１
３４において中性アミノ酸、単糖、オリゴ糖あるいは糖
アルコールからなる糖から選ばれた１０〜６０％（ｖ／
ｖ）の安定化剤による第■因子濃縮物の加熱処理を開示
している。カルボン酸を補助安定化剤として用いている
。

ング（Ｎｇ）らはＴｈｒｏｍｂ、　Ｒｅｓ、　３９　：
　４３９４４７、（１９８５）において安定化剤として
シュ−クロースを用いる溶液中での第■因子の加熱処理
方法を開示している。

７オスター（Ｆｏｓｔｅｒ）らはＶｏｘ　Ｓａｎｇ、　
５５　：８１−８９　（１９８８）においてヒト血漿よ
り第■因子を精製する際の第■因子の安定性を考察して
いる。精製段階における失活はカルシウムの添加によっ
て最小にした。カルシウムは分画段階の際に添加するク
エン酸ナトリウムによって第■因子：Ｃの不活性化を阻
害した。種々の安定化剤（例えばヘパリン、グリシン、
及び糖）が引用されている。

（２）高純度治療用タンパク質に関しては、組み換えＤ
ＮＡによるタンパク質産物を人体に用いる場合、それが
細菌、酵母あるいは動物細胞由来にかかわらず、モノク
ローナル抗体と同様に少なくとも９９％の精製度でなけ
ればならないことが一般的に受は入れられている。−船
釣に高純度溶液中で起こる変性あるいは凝集に対してそ
のような精製タンパク質を安定化するためにヒト血清ア
ルブミンを添加する。ヒト血清アルブミンを安定化剤と
して利用することはコストの面で欠点がある。さらに、
アルブミンは治療用タンパク質とともに使用するのは充
分満足のいくものではない。

というのは血漿由来のタンパク質にかわって組み換えＤ
ＮＡ由来のタンパク質を用いるわずかながらの利益が最
終溜器中の組成に血漿由来のアルブミンを含めることで
かなり減少してしまうからである。

プラン（ｐｌａｎ）らは米国特許第３，９９２，３６７
号において熱安定化のため添加するカプリル酸存在下で
加熱した精製アルブミンについて発表をしている。

ベムラ（Ｖｅｍｕｒａ）らは米国特許第４．３６１．６
５２号においてＮａＣ（２等の無機塩による血漿由来の
プラスミノーゲンの熱安定化について発表している。

クワアン（Ｋｗａｎ）は米国特許第４．４９６，５３７
号においてグリシンあるいはアラニンの添加によるσイ
ンターフェロン調製物の凍結乾燥段階における安定化に
ついて発表している。ｌ−１０ｍｇ／ｌｌ１ｌのアルブ
ミンも安定化剤として添加する。

そり（Ｍｏｒｉ）らは米国特許第４．５０５．８９３号
において１　”　ｌ　Ｏｍｇ／ｍｌのアルブミンによっ
て安定化される精製プラスミノーゲン活性化因子につい
て発表している。

ムラキミ（Ｍｕｒａｋｉｍｉ）らは米国特許第４，５５
２．７６０号においてゼラチンの添加によって組織プラ
スミノーゲン活性化因子の安定化方法について発表して
いる。

またアルブミンはトロンボキサン等の医薬品及び有機化
合物を安定化することが知られている。

７オルコ（Ｆｏｌｃｏ）らＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　
８３　（２）　　：３２１〜３２４　（１９７７）を参
照されたい。さらに、高純度の血漿由来の第■因子：Ｃ
産物はアルブミンによって安定化されることが知られて
いる。

（３）炭水化物の利用に関しては、バドル（Ｂａｔｔｌ
ｅ）らがＴｈｒｏｍｂ、　Ｈａｅｍｏｔ　５４　（３）
　：　６９７−６９９　（１９８５）にむいて５００−
の６％デキストラン７０（分子量７００００）を正常成
人に注入するとｖＦＷ複合体が明らかに減少することを
発表している。その最大効果は約６′時間後である。ま
た第■因子活性も約６時間後に減少した。

アルツソン（Ａｒｔｕｓｓｏｎ）らはＪ、Ｐｈａｒｍ、
Ｓｃｉ　７３（１１）：ｌ５０７−１５１３　（１９８
４）において、生物的分解可能な架橋スターチの微粒子
がタンパク質及び低分子量医薬のキャリアーとして利用
できることを報告している。用いられたスターチはアク
リル化したマルトデキストリンあるいはアクリル化した
ヒドロキシエチルスターチであった。粒子はカルボ！ツ
タアンヒドラーゼを固定するのに使用されており、粒子
は医薬キャリアー系として有用であると結論されている
。

アベルグ（Ａｂｅｒｇ）らは、Ａｎｎ、Ｓｕｒｇ、ｌ　
８９（２）：２４３〜２４７　（１９７９）において、
第■因子活性に対する５００ｍＡの６％デキストランの
注入の効果に関する研究を記述している。その研究は血
小板機能に対するデキストランの効果に関する機構を明
らかにする試みである。第■因子抗原の量はデキストラ
ン注入後著しく減少してい　ｌこ　。

ラーシュ（Ｒａａｓｃｈ）はＡｍ、Ｊ、Ｈｏ５ｐ、Ｐｈ
ａｒｍ、　３６　：８９−９１　（１９７９）において
、デキストラン７０の注入は第■因子活性を減少する場
合があることを報告している。

要約すると、上述したこれまでの技術はタンパク質を熱
処理する際に安定化するために精製途中の最終容器中の
タンパク質溶液に添加する種々の炭水化物の利用につい
ての発表である。高純度の細胞培養由来のタンパク質は
凍結乾燥段階でアルブミンあるいはゼラチン、グリシン
、アラニン、ＮａＣＱ等の化合物で安定化される。高分
子量の炭水化物は医薬キャリアーとして使用される。

従って本発明の目的は細胞培養由来のタンパク質を通常
の方法で精製する際に安定化剤として添加し、さらに精
製タンパク質の安定性、すなわち分子の本来の性質及び
生物活性を保持する化合物を提供することにある。

本発明の他の目的は生物（すなわち血漿）由来ではない
が静脈注射に使用することは認知されている安定化剤を
提供することにある。

さらに本発明の他の目的は最終産物組成の一部として精
製段階中に保持されうる安定化剤を提供することにある
。

本発明の要約 本発明は高純度の状態（すなわち全タンパク質の少なく
とも９０％）のタンパク質の安定化のために選択された
炭水化物の利用についてである。

本発明においてその利用に適した高分子量の炭水化物は
グルコースのポリマー及びデキストラン、スターチ、セ
ルロース誘導体であり、そして最も好ましいものはデキ
ストランである。分子量２５゜０００からｌ　ＯＯ，０
００ダルトン（２５−１００ｋｄ）のデキストランを利
用する際の重要な点はそのような化合物が精製されるタ
ンパク質の分子量に近いために選択されるということで
ある。糖アルコール、すなわちソルビトールやマンニト
ールのような５−あるいは６−炭糖から誘導されるアル
コールもまた本発明で用いられる。マンニトールを用い
る重要な利点はマンニトールが人体に注射する際、非常
に適していると考えられていることである。

ソルビトール、マンニトール、分子量１８２は以下のよ
うに示される。

ＣＨ２０ＨＣＨ，０Ｈ ）１０Ｃ）Ｉ　　　　　　　　ＨＣＯＨＨＣＯＨＨＣＯ
Ｈ ＣＨ２０ＨＣＨｚＯＨ マンニトール　　　ソルビトール これらの糖アルコールは種々の段階に再度添加しても比
較的安価であり、生理的安全性毒性がよくわかっている
。

本発明で重要な点は安全化されるタンパク質が測定可能
な生物活性を発現するのに必要な分子的性質を持つこと
である。本発明で用いるのに選択されたタンパク質は第
■因子二０１天然の状態では非常に大きく（約３００Ｋ
Ｄ）、高純度標品中には４０〜２１０ＫＤのペプチドの
混合物とじて検出され非常に変化しやすい凝血因子であ
る。第■因子：Ｃの全容はこのペプチド混合物をゲル上
で分析して見る。モノクローナル抗体に関しては生物活
性は結合活性として測定し、性質は凝集させることによ
って調べられる。ＩｇＧ単量体が凝集するとそのような
タンパク質を静脈内投与するのは不適である。同様に、
そのような単量体はそれぞれＨ及びＬ鎖に分離するかさ
もなければ部分活性しかないかあるいは失活した断片に
分解してしまう。

本発明は以下の安定剤の利用について考察する；デキス
トラン１　５０ｍｇ／ｍｌ、及びマンニトールあるいは
ソルビトールｌ　−１０ｍｇ／ｍｌ好ましくは５−１０
ｍｇ／ｌＩ＋Ｊ２゜ 本安定化剤は安定化効果としては少なくともアルブミン
と同等であることが示めされている。本安定化剤は高純
度タンパク質の安定化剤として従来から用いられている
グリシンのような他の化合物よりもすぐれていることが
、示されている。

好ましい実施態様 材料と方法 組み換え第■因子（ｒＦ■）はヒト第■因子をコードす
るＣＤＮＡによって形質転換されたＢＨＫ−２１ｉｆｔ
胞で生産された［ヴエール（Ｖｅｈａｒ）ら、Ｎａｔｕ
ｒｅ　３１２　：　３３７−３４２　（１９８４）、ウ
ッド（Ｗｏｏｄ）ら、Ｎａｔｕｒｅ　３１２　：　３３
０−３３７（１９８４）］。

清澄な組織培養溶液を平衡化されているＤＥＡＥ−セフ
ァロースカラムにかけ、以下に示すように洗浄し、溶出
した。平衡化と洗浄は０．０２Ｍイミダゾール、０．０
１　Ｍ　ＣａＣＪ２　ｘ、０．０７５ＭＮａＣ１、ｐＨ
６，９によって行った。溶出は０．０２Ｍイミダゾール
、Ｏ−０１Ｍ　ＣａＣ４２，０，２５ＭＮａＣβ、ｐＨ
６，９によって行った。

ｒＦ■（Ｃ７Ｆ７）に結合するモノクローナル抗体（Ｍ
Ａｂ）への免疫吸着は、固定化Ｃ７Ｆ７抗体によって行
った。［イートン（Ｅａｔｏｎ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ　２５　（２）　：　５０５　５１２　（１９
８６）、ＥＰＯ１６０４５７を参照１゜カラムは以下の
ように平衡化、洗浄しさらに溶出した。平衡化および洗
浄は０．０２Ｍイミダゾール、０．０１　Ｍ　ＣａＣｊ
！　ｔ、０．５ＭＮａＣ１、ｐＨ６゜９によって行った
。溶出は０．０２Ｍイミダゾール、ｌ　Ｍ　Ｃａ１ｌ　
！、０．７　Ｍ　ＮａＣｊ！　、　ｐＨ６，９によって
行った。

Ｃ７Ｆ７溶出物をゲル濾過カラム、ファルマシアに供し
た。０．０２Ｍ・イミダゾール、０．ＯＩＭＣａＣｌｘ
、０．０５Ｍ　ＮａＣｊ２．０．０１％ツイーン８０、
ｐＨ６，９によって平衡化し洗浄した。透析濾過と限外
濾過はＹＭ−３０の膜を用いたアミコンの撹拌器によっ
て行った。

グリシンＶＳＰはシグマケミカル社（ＳｉｇｍａＣｈｅ
ｍｉｃａｌ　Ｃｏｒｐ）より入手した。ＣａＣｊ２２は
フィッシャーサイエンティフィック（Ｆｉｓｈｅｒ　５
ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）より入手した。ＮａＣＱはＪ、Ｔ
、ベーカー（Ｊ、Ｔ。

Ｂａｋｅｒ）より入手した。アルブミンは医薬級のアル
ブミン２５％のプラスブミン（Ｐｌａｓｂｕｍｉｎ）Ｃ
ｕｔｔｅｒ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ製であった。ソルビ
トールおよびマンニトールはベーカーケミカル社（Ｂａ
ｋｅｒＣｈａｍｉｃａｌ）より入手した試薬級であった
。

デキストラン７０は平均分子量７００００で、グルコー
ス単位から成る側鎖多糖のデキストラン画分と定義され
ている（Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ　ｓ　ＤｅｓｋＲｅｆｅｒ
ｅｎｃｅ、　　１９８９．４３版、１６３０ページ）。

デキストラン７０はファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃ　ｉ
ａ）より入手した。

第■因子：Ｃの活性はＷＨＯＸが標準を用いた一段階凝
血法によって測定した。活性ｌユニットは正常血漿１社
中の第■因子（Ｆ、■）の凝血活性と定義されている。

比活性は全タンパク質あたりの活性のユニットとして定
義する。第■因子は５０００国際単位／ＩＩＩｇの比活
性で本質的に純品と称する。精製度はまた抗原性によっ
ても定義される。Ｆ、■は精製度６０％以上において本
炭水化物の添加によって安定化される。

実施例１ 本実施例は凍結乾燥段階においてＦ、■の安定化に用い
られる種々の化合物に関する研究を説明する。

清澄組織培養液（ｔｃｆ）由来のＦ、■はＤＥＡＥイオ
ン交換カラムによって溶出された。ＤＥＡＥ画分を得、
タンパク質をＣ７Ｆ７と称する抗Ｆ。

■モノクローナル抗体（４０ｍβのカラム容積）によっ
て精製した。この溶出物に対してグリセロールを１５％
となるように添加した。次に、Ｇ−２５のゲル濾過によ
る脱塩（６００−のカラム）後、０．２７５Ｍ　グリシ
ンを含有するように両分を調製した。次に４５−づつ３
つに小分けにした。第１のものにアルブミンを１ｍｇ／
ｍｌとなるように添加した。これはそれぞれの実験にお
けるコントロールあるいは標準であった。それぞれの段
階においてＦ、■の回収物をアルブミンコントロールと
して１．０に調製した。第２及び（または）第３のもの
には、試験すべき他の賦形剤及び（または）他の濃度で
添加した。それはデキストラン（Ｍ。

Ｗ、１０３００）、ソルビトール、マンニトール、デキ
ストロース及びメチルセルロースを意味していた。また
無添加のものはコントロールとした。

次に撹拌器とＹＭ−３０の膜を用いた限外濾過（ｕｆ）
によってそれぞれの小分けにした４５ｍ１を３倍に濃縮
した。得られた１５ｍｊ２を５ｄづつ小分けにして凍結
乾燥した。濃縮後及び凍結乾燥後行う測定を表中にアル
ブミンコントロール（１，０に調製）に対して比較する
。

下記表１のデータは安定他剤無添加ではほとんど回収さ
れなく、マンニトール、ソルビトール及びデキストラン
すべては第■因子活性をその凍結乾燥段階において保護
していることを示している。

挙げである安定化剤はアルブミンよりすぐれている。こ
れらの結果は安定剤とも思われるグリセロール１５％存
在下で得られたものであることにも注目すべきである。

上記グリ、七ロールを用いるより良好な結果が得られた
。

デキストラン 表　　１ 限外濾過後 凍結乾燥後 １．２２ ２．９４ １．４５ １．１４ １．５ ０．９１ ０．６４ ■、６４ １．２ １．５９ ０．８１ ０．６１ ０．３３ ソルビトール ５　（０＋ｎｇ／ｍｊ） ■ ０．４５ ０．７２ ０．９９ ０．９６ ０．７２ ０．５４ マンニトール １０　ｍｇ　／　ｍＪ２ １．１４ １．１９ １．２８ １．４６ メチルセルロース １０ｍｇ／ｍｌ １．３１ ０．７９ 測定されず 測定されず 無添加コントロ ル ０．０５　；　０．３　；　０．１ デキストラン７０ ５ａ＋ｇ／ｍ１ １．３１ １．６４ １．３２ １．３４ ０．８５ ２．３１ ２、Ｏｌ ２．１３ １．６１ １．３０ 実施例２ 本実例では前お実施例で凍結乾燥安定化剤と認められた
デキストラン７０を用いる。

６０ＩＩｌｌのＣ７Ｆ７溶出物を前記実施例通りに清澄
組織培養液のＤＥＡＥカラムクロマト後得た。

グリセロールをＣ７Ｆ７溶出物に最終濃度１５％となる
ように添加した。これを２つに小分けした。

一方に対してアルブミンを最終濃度ｌｌｌ１ｇ／ｍｌと
なるように添加し、片方にはデキストラン７ｏを最終濃
度１ｍｇ／ａ！！となるように添加した。それぞれを上
述したように１５０ｍβのＧ−２５ゲル濾過カラムに供
し、次のＣ７Ｆ７カラムにＦ、■が結合する緩衝液と塩
濃度にするため緩衝液置換した。

それぞれのこのカラムからの画分を別の８ＩＩｌｊ２の
Ｃ７Ｆ７カラムに供した。第１の両分は１３ｍｊ２の溶
出物となった。２５％アルブミンを５２μＱ添加してＩ
ｍｇｌ−のアルブミンとした。第２の溶出物は２３−の
溶出物となった。最終デキストラン濃度１　ｍｇ　／　
ｍｊ！となるように６％デキストラン７ｏを４４２μＱ
添加した。グリセロールを最終濃度１５％となるように
それぞれに添加した。次に、２回目のＧ−２５カラムに
供し緩衝液を置換し、ＤＥＡＥセファロースに適合し結
合させるようにした。

アルブミンコントロール（小分けした１木目）−ｒは１
９ｍＪ２の溶出物が得られた。２５％アルブミンを０．
３ｍｊ２添加し、最終濃度４　ｍｇ／　ｍＡとした。同
様にして小分けにし２木目の両分には１．５−の６％デ
キストランを２１．５−の両分に添加し、最終濃度４　
ｍｇ　／　ｍＡのデキストランとした。それぞれの試料
はＹＭ３０の膜を用いて５倍容の緩衝液で透析濾過し、
２０ｍＡに濃縮あるいは希釈した。

得られた材料は標準的な実験室用凍結乾燥機（Ｖｉｒｔ
ｉｓ　ＵｎｉｔｒａｐｌＩ　−７０℃、０　、１　ｍｍ
Ｈｇ）で凍結乾燥した。

結果を以下の表２に示す。

Ｉ　　　／　　　　）く　　　’ａＲ≧（ド　　　Ｉ　
　　ｔｏｏツ（：）　　　　Ｃｎ　　　　Ｃ’５　　　
　（１”５　　　０Ｃ−Ｊｏｎｏａｎｃｍｍｏｌｉ＆ 回　　回　　回　　回　　都　　回　￥５　　智−１−
（’Ｊへ１０密迷 表２の回収率は段階回収率／累積回収率として表わされ
ている。各実験において安定化剤はその精製過程ではｌ
　＋ｎｇ　／　＋Ｊであり、凍結乾燥においては４ｍｇ
／ｍｌｌに増加した。デキストランは精製過程および凍
結乾燥の両方においてアルブミンよりすぐれている。

実施例３ 本実施例は実施例２の実験の再試であるが、安定他剤濃
度が異なっている。本実験において、１回目のＣ７Ｆ７
溶出物を２つに小分けした３１゜５ｍＮを得、デキスト
ランあるいはアルブミン存在下で３回目のＤＥＡＥ溶出
を行った。小分けにした１本口より得た２２＋ｎβの溶
出物を０．４４ｍ１の２５％アルブミンと混合し、５　
ｖＢ　／　ｔｏβとした。小分けにした２本口の溶出物
を１．７３ｉＪの６％デキストランと混合しく２６−の
溶出物）、４ｍｇ／ａ＋ｊ２とした。それぞれを５倍容
の緩衝液に対して透析濾過し、それぞれ１５−に濃縮し
、凍結乾燥した。データを表３に示す。

ｘ　　　　ｘ　　　　ｘ　　　　／　　　　ｘ　　　　
／　　　　／　　　　ｘＣ）Ｃ’Ｊ■−０■トω これらのデータはデキストラン及びアルブミンそれぞれ
４　ｖｇ　／　ｔｏ！、５　ｍｇ　／　ｍｌで同様であ
ることを示す。

実施例４ 本実施例は最終容器中の組成を示す。

以下の表４はアルブミンをデキストランに替えた最終容
器中の組成の見本を示す。異なる濃度の他の賦形剤を使
用できる。賦形剤及び安定化剤は最終段階で容器に入れ
る直前に調製する。次に容器を凍結乾燥する。

表４ 第■因子 グリシン ＣａＣβ２ ａＣ１２ アルブミン デキストラン １００　　ｕ／＋＋＋４２ ０．２７５　　Ｍ Ｏ，００２５Ｍ Ｏ，１１Ｊ ５−８ｍｇ／’ｍβ ０　０ ｔｏｏ　　ｕ／　ｍｌ２ ０．２７５　　Ｍ ０．００２５　Ｍ Ｏ，Ｉ　　Ｍ １−５ｍｇ／ａ＋忍 他の最終容器組成にはアルブミンあるいはデキストラン
のかわりに５〜８ｍｇ／−のマンニトールあるｌ、Ｎは
ソルビトールが含まれている。最終容器組成は５０＋ｎ
ｇ／ｍｌもの安定化剤を含む。

ソルビトールは代謝されてフルクトースになり、ある患
者ではフルクトース不耐性の原因となることから本適用
にはソルビトールよりマンニトールの方がすぐれている
と考えられている。

実施例５ 一連の本実験において、マンニトールは２回目のＤＥＡ
Ｅ画分を処理する際に使用され、Ｃ７Ｆ７カラムにかけ
られた。溶出物（１０−１５ｍＡ）に対して、５ｏ１ｇ
／ｍｌのマンニトールを添加した。

本溶出物をＣＬ６Ｂゲル濾過カラムに供し、分画、限外
濾過、透析濾過（ＵＦ／ＤＦ）Ｌ凍結屹燥した。実験に
よってはさらにマンニトールを５ｍｇ／ｍｌとなるよう
に透析濾過緩衝液および（あるいは）ＣＬ６Ｂ洗浄緩衝
液に添加した。結果を下の表５に示す。

初発材料 ７Ｆ７ Ｌ６Ｂ 表５ 実験Ａ　　実験Ｂ　　実験Ｃ １００／１００　　１００／ｌｏｏ　　　１００／１０
０８１／８１本　　　１２４／１２４本　　ＮＡ／ＮＡ
木６２１５０本　　　　　４０１５０　　　　　　ＮＡ
／６５木限外濾過／ 透析濾過　　　７９／４０＊　　　　６／３　　　２５
／１６凍結乾燥 ６７／２７　　　　　　ＮＡ　　　　　　　　ＮＡ結果
は段階回収率／累積回収率として表わされている。星印
（木）はマンニトールを添加する段階を示す。１００％
を越える収率は測定の可変性による。

結果はＣＬ６Ｂ洗浄緩衝液及び限外濾過／透析濾過の緩
衝液にマンニトールを添加することが回収率を上げるの
に必須であることを示す。マンニトールを付加的な緩衝
液に添加すると回収率が上がり、さらにマンニトールを
各段階に続けて添加すると本行程全体にわたって回収率
を非常に上げる。一連の本実験におけるマンニトールに
よる回収率はＣ７Ｆ７段階でアルブミンを添加する対照
実験で得られた回収率と同様であった。ソルビトールに
よる実験では実験Ａにおけるマンニトールによるものと
同様の結果が得られた。ソルビトルによる典型的な回収
率は：初発材料　１００／１００ＳＣ７Ｆ７　９１／９
１木、ＣＬ６Ｂ８６／７７＊、限外濾過／透析濾過　８
８／６８＊であった。

実施例６ 腫瘍壊死因子に対する精製マウス■ｇＧモノクローナル
抗体の分子的性質をＨＰＬＣによって研究した。すべて
の試料は０．２７Ｍグリシン存在下ｐＨ４，０で調製し
た。以下の表は凍結融解後の分子サイズの分布を示す。

数字は種々のＨＰＬＣピークのパーセントタンパク質量
であり、それは高分子量（凝集体）、ＩｇＧ、低分子量
（断片）と称しである。

試　　　料 溶液コントロール 、２７Ｍグリシン デキストラン　５　ｍｇ／ｍｌ ソルビトール　１０　＋ａｇ／ｍＮ 表６ 高分子量　　憂 ３　　　　　９７ ８　　　　９０ ９７ ３　　　　　９７ 断片 ル　　　　　　　　２ １ １　ｍｇ／ｍｊ２　　　　７ ５　「ｆ１ｇ／ｍｊ２　　　　４ １０　　＋ａ　ｇ／ｍｊ２　　　　　２１　ｍｇｈｎｌ
　　　　　９ ５　＋ｎｇ／ｌｏβ　　　　５ ５　ｍｇ／ｍ１７ 溶液コント０ ．２７Ｍグリシン ソルビトール ソルビトール ソルビトール デキストラン デキストラン マンニトール ９６　　　２ ８７　　　２ ９１　　　　２ ９６　　　２ ９６　　　２ ８８　　　３ ９２　　　３ ９０　　　３ 溶液コントロールは凍結していない。デキストラン５　
ｍＢ　／　ｍβ及びソルビトール５あるいは１０ｎ＋Ｈ
／　ｍＡで単量体の量（ＩｇＧ）が最も高かった。ソル
ビトールあるいはデキストラン１ｍｇ／ｌｏβでは保護
効果がほとんどあるいは全くなかった。

すべての試料中には以前に安定化剤としても３己載され
ている０、２７Ｍのグリシンが含まれていることに注目
することは重要である。既にグリシンが含有している試
料に本発明の化合物を添加するとよりすぐれた結果が得
られた。

λμ 高純度タンパク質は非常に不安定であることはよく知ら
れている。本実施例において、用いたｒＦ、■は免疫吸
着段階において通常２０００５０００の比活性をもち、
それはおよそ６０〜９９％の精製度に相当する。本発明
の安定化剤は七ツクローナル抗体のような生物活性をも
つ他の高純度タンパク質にも利用できる。本発明が応用
できる他の生物活性をもつ精製タンパク質としては例え
ば以下に示す組み換えＤＮＡによるタンパク質がある：
α、β及びγインターフェロン、組織型プラスミノーゲ
ン活性化因子、腫瘍壊死因子、ヒト成長ホルモン、エリ
スロポエチン、コロニ刺激因子、第■因子、プロティン
Ｃ、スーパーオキシドジスムターゼ、ＩＬ−２、上皮成
長因子等。

ここに記述した精製方法は典型的なタンパク質精製段階
、すなわちアニオン交換クロマトグラフィー、アフイニ
テイクロマトグラフイー、ゲル濾過、限外濾過等の単な
る見本である。プロティンＡクロマトグラフィー（Ｉｇ
Ｇ精製）、ＨＰＬＣ等の他へ段階も使える。用いた抗Ｆ
、■：ＣＣ７Ｆフイムノ精製モノクローナル抗体に特に
限らなくてもよく：他のモノクローナル抗体も同様に使
用できる。

用いた個々の安定化剤のうち、マンニトールが被検者の
耐容性の点でよいと考えられていることから、それがも
つとも好ましい。デキストランあるいはその同類物は高
分子量であるため、対象の高分子量タンパク質、すなわ
ち、Ｆ、■二〇の精製過程で添加することができること
から好まれている。Ｆ、■：Ｃは一般的に精製された状
態では８０〜９０ＫＤ鎖が主である分子量の巾をもって
いる。それゆえ、用いたデキストラン７０ＫＤの分子量
であり、安定化されるタンパク質鎖の分子量とほぼ一致
している。

本発明の主なる特徴および態様は以下のとおりである。

１、少なくとも６０％の純度までタンパク質を精製する
方法における改良点： （ａ）前記タンパク質の粗溶液に分子量２５〜１００キ
ロダルトン（ｋｄ）の糖アルコール及びグルコースの重
合体からなる群から選ばれた炭水化物を添加し；　（ｂ
）イオン交換クロマトグラフィ、アフイニテイクロマト
グラフイー、及びサイズ排除クロマトグラフィーからな
る群から選ばれて少なくとも１つのクロマトグラフィー
工程前記工程（ａ）の溶液を通過せしめかくして前記タ
ンパク質を少なくとも６０％の純度とし；および（ｃ）
前記炭水化物を最終容器中の溶液に凍結乾燥のために添
加する ことを特徴とする改良法。

２、前記炭水化物はデキストランである上記第１項記載
の方法。

３、前記炭水化物はマンニトールである上記第２項記載
の方法。

４、前記タンパク質は第■因子である上記第３項記載の
方法。

５、（ａ）少なくとも６０％純度を有する治療学的に活
性のあるタンパク質、（ｂ）グリシン、塩化カルシウム
及び塩化ナトリウムからなる群から選ばれた１〜５％の
賦形剤、および（Ｃ）グルコスの重合体及び糖アルコー
ルからなる群から選ばれて炭水化物の５〜５０＋ｎｇ／
＋Ｊの最終容器中の溶液、 よりなることを特徴とする組成物。

６、前記タンパク質は理論的な最大値の少なくとも９９
％の比活性をもつ上記第５項記載の組成物。

７、前記炭水化物をデキストラン、マンニトール及びソ
ルビトールの一群から選択する上記第５項ｇ載の組成物
。

８、前記タンパク質は第■因子：Ｃである上記第６項記
載の組成物。

９、前記炭水化物をデキストラン、マンニトール及びソ
ルビトールの一群から選択する上記第８項記載の組成物
。

１０．（ａ）理論的な最大比活性の少なくとも６０％に
までタンパク質を精製し；そして（ｂ）　最終容器中の
タンパク質活性１００〜３００ユニット／ｍ！のそれぞ
れの容器に対して、最終液状調製物中に安定剤が１〜５
０ｍｇ／ｍ！存在するように、分子量２５０００〜ｌ　
０００００ダルトンの炭水化物である安定化剤を添加す
る、 ことを特徴とするタンパク質組成物の調製方法。

１１、組成物を凍結乾燥する段階を含む上記第１０項記
載の方法。

１２、安定化剤を凍結乾燥する直前に添加する上記第１
１項記載の方法。

１３、安定化剤を１〜５　ｍｇ　／　ｍｌの濃度で添加
する上記第１０項記載の方法。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、少なくとも６０％の純度までタンパク質を精製する
   方法において、（ａ）前記タンパク質の粗溶液に分子量
   ２５〜１００キロダルトン（ｋｄ）の糖アルコール及び
   グルコースの重合体からなる群から選ばれた炭水化物を
   添加し；（ｂ）イオン交換クロマトグラフィー、アフイ
   ニテイクロマトグラフイー、及びサイズ排除クロマトグ
   ラフィーからなる群から選ばれて少なくとも１つのクロ
   マトグラフィー工程前記工程（ａ）の溶液を通過せしめ
   、かくして前記タンパク質を少なくとも６０％の純度と
   し；および（ｃ）前記炭水化物を最終容器中の溶液に凍
   結乾燥のために添加する、ことを特徴とする改良法。 ２、（ａ）少なくとも６０％の純度を有する治療学的に
   活性のあるタンパク質、（ｂ）グリシン、塩化カルシウ
   ム及び塩化ナトリウムからなる群から選ばれた１〜５％
   の賦形剤、および（ｃ）グルコースの重合体及び糖アル
   コールからなる群から選ばれて炭水化物の５〜５０ｍｇ
   ／ｍｌの最終容器中の溶液、 よりなることを特徴とする組成物。 ３、（ａ）理論的な最大比活性の少なくとも６０％にま
   でタンパク質を精製し；そして（ｂ）最終容器中のタン
   パク質活性１００〜３００ユニット／ｍｌのそれぞれの
   容器に対して、最終液状調製物中に安定剤が１〜５０ｍ
   ｇ／ｍｌ存在するように、分子量２５０００〜１０００
   ００ダルトンの炭水化物である安定化剤を添加する、 ことを特徴とするタンパク質組成物の調製方法。