JPH0359078B2 - - Google Patents
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- JPH0359078B2 JPH0359078B2 JP57118883A JP11888382A JPH0359078B2 JP H0359078 B2 JPH0359078 B2 JP H0359078B2 JP 57118883 A JP57118883 A JP 57118883A JP 11888382 A JP11888382 A JP 11888382A JP H0359078 B2 JPH0359078 B2 JP H0359078B2
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Landscapes
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は血小板血栓誘因の引金の一つである血
小板のコラーゲン粘着を阻止する能力を有する新
規、血小板粘着阻止蛋白質に関する。
小板のコラーゲン粘着を阻止する能力を有する新
規、血小板粘着阻止蛋白質に関する。
血小板は血管の破壊損傷によつて生ずる血液の
体外流出を防ぐ重要な機能を有している。すなわ
ち血管壁の内皮細胞の傷害によつて露出したコラ
ーゲンにまず血小板が粘着し、ADPを放出する
ことによつて血小板の凝集がおこり、さらに凝集
血小板が退縮し血栓を形成する。このような一連
の血小板の反応とは別に、血液中に存在する血液
凝固に関与する一連の血漿蛋白質が活性化され、
最終的にはフイブリノゲンがフイブリンに変換
し、さらにフイブリンの重合によつて網状構造を
有する不溶性の高分子を形成する。血管損傷はこ
の２つの系の協同作用によつて強固な血栓を生じ
止血の目的を達する。
体外流出を防ぐ重要な機能を有している。すなわ
ち血管壁の内皮細胞の傷害によつて露出したコラ
ーゲンにまず血小板が粘着し、ADPを放出する
ことによつて血小板の凝集がおこり、さらに凝集
血小板が退縮し血栓を形成する。このような一連
の血小板の反応とは別に、血液中に存在する血液
凝固に関与する一連の血漿蛋白質が活性化され、
最終的にはフイブリノゲンがフイブリンに変換
し、さらにフイブリンの重合によつて網状構造を
有する不溶性の高分子を形成する。血管損傷はこ
の２つの系の協同作用によつて強固な血栓を生じ
止血の目的を達する。
ところで現在死亡率第一位を占める各種血栓症
は、何等かの原因によつて血管内壁に血小板が粘
着凝集し、さらに血液凝固に関与する血漿蛋白質
が関与し、血管内で血栓を生ずる、血栓を生ずる
引金となる現象は血小板と血管内壁との相互作用
であり、そのいずれかに欠陥が生ずれば血小板の
血管内壁への粘着がおこる。血小板は正常な際の
血栓形成は血管壁の障害が想定され、血管壁内皮
下のコラーゲンがその粘着に重要な役割を果す。
血管壁の傷害は機械的傷害の外、血行力学的因
子、細菌などの微生物、細菌内毒素、ウイルス、
抗原一抗体複合物、ホモシスチンなど代謝物の高
値などで誘起されるといわれている。
は、何等かの原因によつて血管内壁に血小板が粘
着凝集し、さらに血液凝固に関与する血漿蛋白質
が関与し、血管内で血栓を生ずる、血栓を生ずる
引金となる現象は血小板と血管内壁との相互作用
であり、そのいずれかに欠陥が生ずれば血小板の
血管内壁への粘着がおこる。血小板は正常な際の
血栓形成は血管壁の障害が想定され、血管壁内皮
下のコラーゲンがその粘着に重要な役割を果す。
血管壁の傷害は機械的傷害の外、血行力学的因
子、細菌などの微生物、細菌内毒素、ウイルス、
抗原一抗体複合物、ホモシスチンなど代謝物の高
値などで誘起されるといわれている。
従つてコラーゲンと血小板との相互作用を阻止
する能力を有する物質が存在するならば、血栓形
成の予防に使用される可能性がある。
する能力を有する物質が存在するならば、血栓形
成の予防に使用される可能性がある。
かかる観点から、本発明者はコラーゲンと血小
板との相互作用を阻止する能力を有する物質を得
るべく研究を重ねて来たところ、血小板膜中にか
かる物質が存在することを知り、この物質を単
離、精製することに成功し、その物理化学的性質
から新規物質であることを確認し、これを血小板
粘着阻止蛋白質（以下、阻止蛋白質と略記する。）
と命名した。
板との相互作用を阻止する能力を有する物質を得
るべく研究を重ねて来たところ、血小板膜中にか
かる物質が存在することを知り、この物質を単
離、精製することに成功し、その物理化学的性質
から新規物質であることを確認し、これを血小板
粘着阻止蛋白質（以下、阻止蛋白質と略記する。）
と命名した。
本発明は、この阻止蛋白質に関するものであ
り、当該阻止蛋白質の特性は次の通りである。
り、当該阻止蛋白質の特性は次の通りである。
(ア) SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によ
る分子量は約30万である。
る分子量は約30万である。
(イ) SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によ
る分子量が約7.5万のサブユニツト４個にて構
成されている。
る分子量が約7.5万のサブユニツト４個にて構
成されている。
(ウ) 上記４個のサブユニツトはジスルフイド結合
によつて結合されている。
によつて結合されている。
(エ) 加水分解物のアミノ酸組成は、
Asp 11.7〜11.9
Thr 6.6〜6.8
Ser 7.3〜7.5
Glu 11.4〜11.6
Pro 4.6〜4.8
Gly 8.6〜8.8
Ala 4.4〜4.6
Cys 0.7〜0.9
CysH 0.1〜0.3
Val 4.7〜4.9
Met 2.0〜2.2
Ile 4.3〜4.5
Leu 6.6〜6.8
Tyr 3.7〜3.9
Phe 3.3〜3.5
Lys 6.6〜6.8
His 1.7〜1.9
Arg 5.1〜5.3
Trp 4.5〜4.7
（％）
である。
(オ) アンホラインを用いた等電点電気泳動法によ
る等電点は約６である。
る等電点は約６である。
(カ) コラーゲンに対して粘着性を示す。
ところで、血小板膜中には阻止蛋白質の他にコ
ラーゲンに対して粘着性を示す物質としてフイブ
ロネクチン〔Pro.Nat.Acad.USA75、5864〜5868
（1978）〕の存在が知られている。ところで、この
フイブロネクチンはその分子量約45万、サブユニ
ツトの分子量約22万であるところから、阻止蛋白
質とは異なる物質である。
ラーゲンに対して粘着性を示す物質としてフイブ
ロネクチン〔Pro.Nat.Acad.USA75、5864〜5868
（1978）〕の存在が知られている。ところで、この
フイブロネクチンはその分子量約45万、サブユニ
ツトの分子量約22万であるところから、阻止蛋白
質とは異なる物質である。
阻止蛋白質は、たとえば次の如くして得られ
る。洗浄した血小板、血小板膜画分などを水性溶
媒（たとえば、トリス−Acid Citrate
Dextorose緩衛液）に浮遊させ、非イオン性界面
活性剤、たとえば終濃度0.5〜2.0％濃度のイソオ
クチルフエニルポリエトキシアルコール
（Triton Ｘ−100；ローム アンド ハース社
製）で可溶化したのち、コラーゲン−Sepharose
〔Brass.L.F.らの方法によつて作製することがで
きる：J.Lab.Clin.Med.87、525−534（1976）〕に
吸着させ、３〜5M尿素を含む水溶液、たとえば
4M尿素を含むTris Acid Citrate Dextorose緩
衛液、PH7.35で溶離して単離することにて製造さ
れる。
る。洗浄した血小板、血小板膜画分などを水性溶
媒（たとえば、トリス−Acid Citrate
Dextorose緩衛液）に浮遊させ、非イオン性界面
活性剤、たとえば終濃度0.5〜2.0％濃度のイソオ
クチルフエニルポリエトキシアルコール
（Triton Ｘ−100；ローム アンド ハース社
製）で可溶化したのち、コラーゲン−Sepharose
〔Brass.L.F.らの方法によつて作製することがで
きる：J.Lab.Clin.Med.87、525−534（1976）〕に
吸着させ、３〜5M尿素を含む水溶液、たとえば
4M尿素を含むTris Acid Citrate Dextorose緩
衛液、PH7.35で溶離して単離することにて製造さ
れる。
本発明に係る阻止蛋白質はヒトを含む温血動物
に対して血小板のコラーゲンへの粘着を阻止する
作用を有し、たとえば血栓症の予防、治療剤とし
て使用されうる。
に対して血小板のコラーゲンへの粘着を阻止する
作用を有し、たとえば血栓症の予防、治療剤とし
て使用されうる。
実施例
(1) 洗浄血小板の調製
Acid Citrate Dextrose（ASD）を1/7量加え
て、採取した牛血液より、遠心をくり返すこと
により血小板多血漿（PRP）をまず調製する。
遠心は下記１〜４の４段階に分けて行われる。
て、採取した牛血液より、遠心をくり返すこと
により血小板多血漿（PRP）をまず調製する。
遠心は下記１〜４の４段階に分けて行われる。
第１段階：3000×ｇ、10分の遠心を行う。これ
により上層に血漿、下層に赤血球、その中間
に血小板、白血球がくる。この中間層をスポ
イトで取り次の段階に用いる。
により上層に血漿、下層に赤血球、その中間
に血小板、白血球がくる。この中間層をスポ
イトで取り次の段階に用いる。
第２段階：1500×ｇ、５分の遠心を行う。これ
により、第１段階と同様に分離するが、中間
層の血小板、白血球の割合は多くなる。この
層を同様に採取する。
により、第１段階と同様に分離するが、中間
層の血小板、白血球の割合は多くなる。この
層を同様に採取する。
第３段階：200〜400×ｇ、５分の遠心を行う。
今度の場合は、血小板は沈まず赤血球、白血
球だけが沈む。上層に残つた血小板多血漿
（PRP）を採取する。遠心速度は200〜400×
ｇの間で適当に選択する。
今度の場合は、血小板は沈まず赤血球、白血
球だけが沈む。上層に残つた血小板多血漿
（PRP）を採取する。遠心速度は200〜400×
ｇの間で適当に選択する。
第４段階：前段階で採取したPRPを前段階と
同条件で遠心し、PRP中に残つた赤血球を
沈ませる。
同条件で遠心し、PRP中に残つた赤血球を
沈ませる。
このようにして得られたPRPを1500×ｇ、５
分で遠心し、血小板を沈殿させペレツトにする。
上部に残つた血漿をすてて、変わりにTris−
ACD bufferを加え、もう一度浮遊させる。この
操作を３回くり返し、洗浄血小板浮遊液を調製す
る。
分で遠心し、血小板を沈殿させペレツトにする。
上部に残つた血漿をすてて、変わりにTris−
ACD bufferを加え、もう一度浮遊させる。この
操作を３回くり返し、洗浄血小板浮遊液を調製す
る。
(2) 血小板粘着阻止蛋白質の単離
洗浄血小板浮遊液（109〜1010cells／45ml
Tris−ACD buffer）に10％Triton Ｘ−100含
有Tris−ACD buffer5ml加え、撹拌後室温で
約30分間放置する。5000×ｇ、10分で遠心し、
不溶化分画を取り除き、0.5％Triton Ｘ−100
含有Tris−ACD bufferで平衡化したコラーゲ
ン−セフアロースにかける。
Tris−ACD buffer）に10％Triton Ｘ−100含
有Tris−ACD buffer5ml加え、撹拌後室温で
約30分間放置する。5000×ｇ、10分で遠心し、
不溶化分画を取り除き、0.5％Triton Ｘ−100
含有Tris−ACD bufferで平衡化したコラーゲ
ン−セフアロースにかける。
コラーゲン−セフアロースは同bufferで洗浄
後、さらにTris−ACD bufferで充分洗浄す
る。
後、さらにTris−ACD bufferで充分洗浄す
る。
阻止蛋白質の溶出はbufferを4M尿素含有
Tris−ACD buffer（PH7.35）に変えることによ
り行なわれる。この分画はTris−ACD buffer
に透析後、濃縮して保存する（−80℃）。
Tris−ACD buffer（PH7.35）に変えることによ
り行なわれる。この分画はTris−ACD buffer
に透析後、濃縮して保存する（−80℃）。
かくして得られた阻止蛋白質の分子量を以下の
通り測定した。即ち、SDS−ポリアクリルアミド
ゲルを支持体として電気泳動したところ、分子量
約30万の位置に単一のバンドを与えた。またこの
蛋白質を0.1Mβ−メルカプトエタノールで還元し
たのち、同じくSDS−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動を行つたところ、分子量約7.5万の位置に
単一のバンドを与えた。
通り測定した。即ち、SDS−ポリアクリルアミド
ゲルを支持体として電気泳動したところ、分子量
約30万の位置に単一のバンドを与えた。またこの
蛋白質を0.1Mβ−メルカプトエタノールで還元し
たのち、同じくSDS−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動を行つたところ、分子量約7.5万の位置に
単一のバンドを与えた。
また、阻止蛋白質を常套手段によりアミノ酸組
成の決定を行なつた。即ち、6N塩酸を用いて、
110℃にて24時間還流を行い、加水分解物を得た。
得られた加水分解に発色団あるいは蛍光基を導入
し、逆相HPLCに付して分析定量を行なつた。糖
の存在を無視して、分子中に存在するアミノ酸残
基100個中の各アミノ酸の残基数（％）で示した。
尚、TrpはEdelhochの方法（Spectroscopic
determination of tryptophan and tyrosine in
proteins.Biochemistry、６、1948−1954、1967）
で、Cysは５，5′−ジチオビス（２−ニトロ安息
香酸）による滴定によつて測定した。その結果を
下記に示す。
成の決定を行なつた。即ち、6N塩酸を用いて、
110℃にて24時間還流を行い、加水分解物を得た。
得られた加水分解に発色団あるいは蛍光基を導入
し、逆相HPLCに付して分析定量を行なつた。糖
の存在を無視して、分子中に存在するアミノ酸残
基100個中の各アミノ酸の残基数（％）で示した。
尚、TrpはEdelhochの方法（Spectroscopic
determination of tryptophan and tyrosine in
proteins.Biochemistry、６、1948−1954、1967）
で、Cysは５，5′−ジチオビス（２−ニトロ安息
香酸）による滴定によつて測定した。その結果を
下記に示す。
Asp 11.7〜11.9
Thr 6.6〜6.8
Ser 7.3〜7.5
Glu 11.4〜11.6
Pro 4.6〜4.8
Gly 8.6〜8.8
Ala 4.4〜4.6
Cys 0.7〜0.9
CysH 0.1〜0.3
Val 4.7〜4.9
Met 2.0〜2.2
Ile 4.3〜4.5
Leu 6.6〜6.8
Tyr 3.7〜3.9
Phe 3.3〜3.5
Lys 6.6〜6.8
His 1.7〜1.9
Arg 5.1〜5.3
Trp 4.5〜4.7
（％）
さらに、アンホラインを用いて等電点電気泳動
法により泳動を行なつた結果、等電点は約６であ
つた。
法により泳動を行なつた結果、等電点は約６であ
つた。
実験例
牛の腱より単離したコラーゲンをセフアロース
4Bと化学的に臭化ブロムを用いて結合させコラ
ーゲン−セフアロース複合体を調製する。この複
合体をつめたカラム2.0mlに種々の濃度の阻止蛋
白質（3.0〜150μｇ）を加え、コラーゲンと結合
状態に保つておく。次にその系に洗浄血小板懸濁
液（7.8×107個）を加え、本来コラーゲンと結合
する血小板が阻止蛋白質の存在によつてどの程度
血小板の粘着が阻害されるかを観察した。その結
果25μｇの阻止蛋白質によつて完全に阻害され、
5μｇの存在で50％阻害が観察される。
4Bと化学的に臭化ブロムを用いて結合させコラ
ーゲン−セフアロース複合体を調製する。この複
合体をつめたカラム2.0mlに種々の濃度の阻止蛋
白質（3.0〜150μｇ）を加え、コラーゲンと結合
状態に保つておく。次にその系に洗浄血小板懸濁
液（7.8×107個）を加え、本来コラーゲンと結合
する血小板が阻止蛋白質の存在によつてどの程度
血小板の粘着が阻害されるかを観察した。その結
果25μｇの阻止蛋白質によつて完全に阻害され、
5μｇの存在で50％阻害が観察される。
以上の実験結果は阻止蛋白質が血小板のコラー
ゲンへの粘着を劇的に阻止することを示すもので
ある。実際血管壁内皮の損傷によつて露出するコ
ラーゲンは上記実験での条件と異なり、ごくわず
かの量のコラーゲンが露出するに過ぎないと思わ
れるので、血栓形成の初期の反応を抑制するに十
分の効果があると期待される。
ゲンへの粘着を劇的に阻止することを示すもので
ある。実際血管壁内皮の損傷によつて露出するコ
ラーゲンは上記実験での条件と異なり、ごくわず
かの量のコラーゲンが露出するに過ぎないと思わ
れるので、血栓形成の初期の反応を抑制するに十
分の効果があると期待される。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 下記ア〜カの特性を有する血小板粘着阻止蛋
白質。 (ア) SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によ
る分子量は約30万である。 (イ) SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によ
る分子量が約7.5万のサブユニツト４個にて構
成されている。 (ウ) 上記４個のサブユニツトはジスルフイド結合
によつて結合されている。 (エ) 加水分解物のアミノ酸組成は、 Asp 11.7〜11.9 Thr 6.6〜6.8 Ser 7.3〜7.5 Glu 11.4〜11.6 Pro 4.6〜4.8 Gly 8.6〜8.8 Ala 4.4〜4.6 Cys 0.7〜0.9 CysH 0.1〜0.3 Val 4.7〜4.9 Met 2.0〜2.2 Ile 4.3〜4.5 Leu 6.6〜6.8 Tyr 3.7〜3.9 Phe 3.3〜3.5 Lys 6.6〜6.8 His 1.7〜1.9 Arg 5.1〜5.3 Trp 4.5〜4.7 （％） である。 (オ) アンホラインを用いた等電点電気泳動法によ
る等電点は約６である。 (カ) コラーゲンに対して粘着性を示す。 ２ 血小板を非イオン性界面活性剤で可溶化し、
その可溶化物をコラーゲン・セフアロースに吸着
させ、３〜5M尿素含有水溶液で溶離することを
特徴とする下記ア〜カの特性を有する血小板粘着
阻止蛋白質の製造法。 (ア) SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によ
る分子量は約30万である。 (イ) SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によ
る分子量が約7.5万のサブユニツト４個にて構
成されている。 (ウ) 上記４個のサブユニツトはジスルフイド結合
によつて結合されている。 (エ) 加水分解物のアミノ酸組成は、 Asp 11.7〜11.9 Thr 6.6〜6.8 Ser 7.3〜7.5 Glu 11.4〜11.6 Pro 4.6〜4.8 Gly 8.6〜8.8 Ala 4.4〜4.6 Cys 0.7〜0.9 CysH 0.1〜0.3 Val 4.7〜4.9 Met 2.0〜2.2 Ile 4.3〜4.5 Leu 6.6〜6.8 Tyr 3.7〜3.9 Phe 3.3〜3.5 Lys 6.6〜6.8 His 1.7〜1.9 Arg 5.1〜5.3 Trp 4.5〜4.7 （％） である。 (オ) アンホラインを用いた等電点電気泳動法によ
る等電点は約６である。 (カ) コラーゲンに対して粘着性を示す。 ３ 該非イオン性界面活性剤がイソオクチルフエ
ニルポリエトキシアルコールである特許請求の範
囲第２項に記載の製造法。 ４ 該尿素含有水溶液が4M尿素含有緩衝液（PH
7.35）である特許請求の範囲第２項に記載の製造
法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57118883A JPS5910522A (ja) | 1982-07-07 | 1982-07-07 | 血小板粘着阻止蛋白質及びその製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57118883A JPS5910522A (ja) | 1982-07-07 | 1982-07-07 | 血小板粘着阻止蛋白質及びその製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5910522A JPS5910522A (ja) | 1984-01-20 |
| JPH0359078B2 true JPH0359078B2 (ja) | 1991-09-09 |
Family
ID=14747490
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP57118883A Granted JPS5910522A (ja) | 1982-07-07 | 1982-07-07 | 血小板粘着阻止蛋白質及びその製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5910522A (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5321127A (en) * | 1991-03-18 | 1994-06-14 | Brigham And Women's Hospital | Antiplatelet and antithrombotic activity of platelet glycoprotein Ib receptor fragments |
-
1982
- 1982-07-07 JP JP57118883A patent/JPS5910522A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS5910522A (ja) | 1984-01-20 |
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