JPH01250399A - トリグラミン、血小板凝集抑制性ポリペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ■ 本発明は、血小板の凝集の有効な抑制剤である低分子量
ポリペプチドであるトリグラミンに関する。

発」Ｌ例］Ｌ皿 糖蛋白質ＩＩ　ｂ−■ａ　（ＧＰＩＩ　ｂ−ＧＰｍａ）
複合体と会合する特異的受容体とフィブリノーゲンとの
相互作用が血小板の凝集にとって必須であることが証明
されている。刺激されていない血小板はフィブリ／−ゲ
ンと結合せず、したがって循環系で凝集しない、血小板
がＡＤＰ、エピネフリン、トロンビン又はプロスタグラ
ンジンエンドペルオキシドのようなアゴニストによって
刺激されると、ＧＰｎ　ｂ−ＧＰｍａ複合体と会合した
フィブリノーゲン受容体が血小板表面に露出するように
なり、フィブリノーゲンと結合し、続いて血小板を凝集
させることになる。一般に説明されているのは、ＡＤＰ
が生理学的条件下でのフィブリノーゲン受容体の露出に
必須の媒介物であるということである０組織の損傷中に
ＡＤＰが血小板の凝集を起させるのに十分な量で形成さ
れることが証拠により示唆されている。

シー、オーヤン（ｃ　、　ｏ　ｕ　ｙ　ａ　ｎ　ｇ）及
びティー、ハン（Ｔ、Ｈｕａｎｇ）の両氏は、バイオシ
ミカ暑二〇バイオフィジカ・アクタ（Ｂ　ｉ　ｏ　ｃ　
ｈｉｍ、Ｂｉｏｐｈｙ、Ａｃｔａ）７５７、ｐ、３３２
〜３４１　（１９８３）において、アオハブ（Ｔｒｉｍ
ｅｒｅｓｕｒｕｓ　　ｇｒａｍｉｎｅｕＳ）の毒液から
得られた血小板凝集抑制性物質の粗製の製剤を報告して
いる。この物質は、イオン交換クロマトグラフィー及び
ゲル濾過によって単離される。アスパラギン酸、グルタ
ミン酸及びシスティンに富む酸性ホスホリパーゼＡとし
て記載された。また、オーヤン氏らは、５ＤＳ−ポリア
クリルアミドゲルＴｉ電気泳動及び円板式電気泳動によ
ってその製剤中に１２．４ｋｄの単一バンドを同定した
。さらに、彼らは１０９個のアミノ酸残基を基にして１
１．６８２の推定最小分子量を報告している。

しかし、オーヤン氏らの因子の有効性にもかかわらず、
この物質のホスホリパーゼＡ活性は、赤血球に対するホ
スホリパーゼＡの溶血作用のために、該物質を臨床的に
使用することを不適当にしている。さらに、純粋でない
物質は原料の毒液に由来する１種以上の汚染性毒素を含
有するかもしれない、ヘビ溝中に見出されるある種の毒
素がナノグラム量でヒトに対して毒性であることが知ら
れている。

魚」ＬのＪ［眉 本発明者は、オーヤン氏らにより主張された１０９個の
アミノ酸からなる蛋白質が実際の血小板凝集抑制因子を
含有する純粋でない混合物にすぎないことを見出した。

本発明者は、アオハブからホスホリパーゼＡ汚染物を含
まない実買上純粋な化学的形態で血小板凝集抑制因子を
得た。この活性な血小板凝集抑制因子（これはトリグラ
ミン（ｔｒｉｇｒａｍｉｎ）と命名された）は、化学的
均一性まで精製された。

実質上純粋な化学的形態のトリグラミンは、次のアミノ
酸配列 ＥＡＧＥＤＣＤＣＧＳＰＡＮＰＣＣＤＡＡＴＣＫＬＩ　
ＰＧＡＱＣＧＥＧＬＣＣＤＱＣ３ＦＩＥＥＧＴＶＣＲＩ
ＡＲＧＤＤＬＤＤＹＣＮＧＲ３ＡＧＣＰＲＮＰＦＨ （ここで、アミノ酸についての記号は、下記のような認
められた生化学的意味を有する。

ｕ　　　　　７二二盈１］ Ｋ　　　　　リジン Ｈヒスチジン Ｒアルギニン Ｄ　　　　　　アスパラギン酸 Ｎ　　　　　アスパラギン Ｔ　　　　　スレオニン Ｓ　　　　　セリン Ｅ　　　　　　グルタミン酸 Ｑ　　　　　グルタミン Ｐ　　　　　　プロリン Ｇ　　　　　グリシン Ａ　　　　　アラニン Ｃハーフシスチン Ｖ　　　　　バリン Ｍ　　　　　メチオニン ■　　　　　インロイシン Ｌ　　　　　ロイシン Ｙ　　　　　チロシン Ｆ　　　　　フェニルアラニン Ｗ　　　　　トリプトファン　） を有する７２個のアミノ酸よりなるポリペプチドである
。

また１本発明は、ヒト血小板のフィブリノーゲンで誘発
された凝集を抑制するための、ホスホリパーゼＡ汚染物
を実質上台まないトリグラミンの製剤に関する。

また１本発明は、ヒト血小板に対するフィブリノーゲン
の結合を抑制しかつヒト血小板のフィブリノーゲンで誘
発される凝集を抑制するための方法に係る。この方法に
よれば、ヒト血小板は実質上純粋な化学的形態でトリグ
ラミンを含有する製剤とインキュベートされる。したが
って、トリグラミンは、ヒトの血流中での血小板凝集の
発生を抑制するためヒトに投与することができる。

、　　″　　　１ トリグラミンは次のように精製される。まず、オーヤン
氏らの方法（前記のＢｉｏｃｈｉｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、
Ａｃｔａ７５７、ｐ、３３２〜３４１（１９８３））に
従ってホスホリパーゼＡ活性を宥するａ調製物を得る０
次いで、逆相高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ
）によってトリグラミンを化学的均一性まで最終精製す
る。

１１叛ｉユＩＪ アオハブ（Ｔｒｉｍｅｒｅｓｕｒｕｓ　　ｇｒａｍｆｎ
ｅｕｓ）の毒液を集め、遠心分離し、凍結乾燥し、無水
ＣａＣ１ｚを入れたデシケータ内に一２０℃で貯蔵する
。この毒液をまず次のようにＤＥＡＥセファデックスＡ
−５０カラムクロマトグラフイーによって１２個の両分
に分離する。

ＤＥＡＥ−セフ　デークスＡ−５０カラム　ロマトグラ
フ　−：　ＤＥＡＥ−セファデックスＡ−５０を充填し
たカラム（３，２Ｘ１００ｃｍ）に毒液１ｇを入れる。

混合容器中の０．００５Ｍ酢酸アンモニウム（ｐＨはア
ンモニア水溶液により８．０に調節する）１０００ｍ見
及び受器中の０．２５Ｍ酢酸アンモニウム（ｐＨは氷酢
酸により６．０に調節する）ｌｏｏｏｍＪＬによってＳ
−段階の勾配溶離を行う０次いで、混合容器中の０．２
５Ｍ酢酸アンモニウム（ｐＨ６，０）８００ｍｌ及び受
器中の１Ｍ酢酸アンモニウム（ｐＨ５，２）１０００ｍ
見によって第二段階の勾配溶離を行う、流量を１６〜１
８ｍ交／ｈに調節し、試験管１本当り６　ｍ　ｌの溶出
液を集める。流出物は分光光度計（例えば、ＬＫＢ社製
のｒＬＫＢＵｖｉｃｏｒｄＪ）によって２７８ｎｍ及び
５℃で連続的にモニターする。

毒液は、前記のＤＥＡＥ−セファデックスＡ−５０カラ
ムによって１２個の両分に分離される。

第一段階の勾配溶離では８個の画分が得られ、他の４ｆ
ｌの両分は第二段階の溶離で得られた０次いで画分１２
を次のようにセファデックスＧ−７５カラムで再分別す
る。

セフ　デークスＧ−７５クロマトグラフ　−：このカラ
ムは０．００５Ｍ重炭酸アンモニウム（ｐＨ７，８）中
で調製されたセファデックスよりなる。カラムの大きさ
は毒液の量に従う、セファデックスＧ−７５カラムから
の溶離を０．００５Ｍ重炭酸アンモニウムで行う、流量
は１８ｍ見／ｈに調節する。試験管１本当り３ｍ文の溶
出液を集める。

セフ　−−クスＧ−５０クロマトグラフ　−：セファデ
ックスＧ−７５カラムからの三番目の副次画分であって
、トロンビン（０，ＩＵ／ｍＪＬ）によって誘発される
血小板凝集に対して活性を持っている両分をセファデッ
クスＧ−５０で単一ピークが得られるまで３回再分別す
る。溶離剤として重炭酸アンモニウム（０，００５Ｍ、
ｐＨ７゜８）を使用する。得られた粗製物質を次のよう
にしてさらに精製する。

−−一　　で　トリグラミン 大きい細孔のＣ−１８シリカマトリツクス（例えば、ｒ
Ｖｙｄａｃ　　ＴＰＲＰＪ　、ザセパレーションズ・グ
ループ社、ヘスバリア、Ｃａ）を入れた高性能液体クロ
マトグラフィーカラム（２５０Ｘ４．６ｍｍ）を０．１
％トリプルオル酢酸中で２０℃で平衡化させる０次いで
、上で調製した粗製物質１５０ｐｇを０．１５Ｍ　　Ｎ
ａＣ１２００ｇ１に加えたものを上記カラムに１．０ｍ
ＪＬ／　ｍ　ｔ　ｎの流量で注入する。カラムを３分間
洗浄する。０〜５５％アセトニトリルの勾配を用いて５
０分間にわたり両分を溶離する。３７分間の保持時間の
後に溶出する第一成分は、ホスホリパーゼＡ活性のない
純粋なトリグラミンを含む、精製された物質の均一性は
銀添加物（ｌｐｇ）を用いた５ＤＳ−ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動によって確認される。トリグラミンは、
２０％ゲル上で、約９ｋｄの見かけ分子量の単一バンド
として現れる。

このＨＰＬＣで精製されたトリグラミンのアミノ醸配列
は、この物質をピリジルエチル化してシスティン残基を
Ｓ−ピリジルエチルシスティン（エドマン分解中に安定
なシスティン誘導体）に転化した後に決定される。その
ままのＳ−ピリジルエチルトリグラミンをＮＨ２−末端
配列決定処理に付すが、これは３５個の明瞭な残基を生
じる。さらに、キモトリプシン、トリプシン及びスタフ
ィロコッカス・オウレウス（Ｓ、ａｕｒｅｕｓ）Ｖ８プ
ロテアーゼによるＳ−ピリジルエチルトリグラミンの慎
重な蛋白質加水分解によって配列決定を行い、さらに個
々に分離された解裂断片の配列決定を行う、このように
して、トリグラミンの７２個のアミノ酸残基についての
完全な配列が得られた。

トリグラミンは、Ｇ　Ｐ　ＩＩ　ｂ　−Ｇ　Ｐ　ｍ　ａ
複合体と会合した血小板上のフィブリノーゲン受容体（
この受容体はＡＤＰによって露出する）に対するフィブ
リノーゲンの結合を特異的にかつ競争的に抑制すること
によって血小板の凝集を抑制する。

さらに、トリグラミンは、フィブリノーゲンと一緒にな
って血小板を凝集させ又は表面に粘着させるホンウィル
ブランド因子（ｙｏｎ　　Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ　　ｆ
ａｃｔｏｒ）の結合を抑制する。

本発明者の実験は、トリグラミンがＧＰＩＩｂ−ＧＰ［
ｎａ複合体に特異的に結合すること並びにトリグラミン
が該複合体と会合した受容体に対するフィブリノーゲン
及びホンウィルブランド因子の結合を競争的に妨げるこ
とを立証するものである。

下記の実験は、トリグラミンが血小板に対するフィブリ
ノーゲンの結合を抑制できることを例示する。マスター
ド（Ｍｕｓｔａｒｄ）氏らの方法（プリティシュ、ジャ
ーナル、オブ、ヘマトロジ−（Ｂｒｔｔ　、Ｊ、Ｈａｅ
ｍａｔ　、　　２２．ｐ。

１９３〜２０４（１９７２））に従って、洗浄されたヒ
ト血小板懸濁液を調製し、これを３．５ｍｇ／ｍｌのウ
シ血清アルブミン（シグマ、フラクションＶ）を含有す
るチロイドのフルブミン溶液（ｐＨ７，３５）に懸濁さ
せた。この血小板懸濁液（約５Ｘ１０雲個の血小板７ｍ
文）の４２０終愛に１ｊゞニーフイブリノーゲンｉｏ＃
ｕを添加した。この懸濁液にある一定量のトリグラミン
を添加し、次いで３分後にＡＤＰＩＯｐｉを添加した（
最終濃度１０ＩＬモル）、ＡＤＰを添加した後。

血小板懸濁液をさらに約１０分間ゆっくりと振盪し、イ
ンキニーベートした０次いで、この血小板懸濁液の４０
０ｋｌをエッペンドルフ遠心機において１５，０ＯＯＧ
でシリコーンオイルを通して遠心分離した。血小板球に
結合した１２５Ｉ−フィブリノーゲンの量を測定した。

フィブリノーゲンの非特異的結合を６ｍＭ　　ＥＤＴＡ
の存在下で測定した。これによりフィブリノーゲンの結
合のＩＣ，。

、即ち５０％抑制率を決定した。

第１図は、トリグラミンの不存在下（○−Ｏ）又は存在
下（０，５１Ｌｇ／ｍＪｌ、ローロ；１．Ｏｇｇ／ｍｌ
、ムーム）での、ｌＯルモルＡＤＰにより刺激されたヒ
ト血小板に対するｕ９ｘ−フィブリノーゲンの結合の二
重逆数プロットである。

第１図に示すように、トリグラミンは、ＡＤＰ（１０終
モル）で刺激された血小板に対する＋２に■−２イブリ
ノーゲンの結合を濃度に依存する形で２．８〜５．６Ｘ
１０１ＭのＩＣｆｆ６でもって抑制した。このデータは
、２　Ｘ　１０””　Ｍの抑制定数Ｋｉでもってトリグ
ラミンの競争的抑制機構と一致する。

また、トリグラミンは、α−キモトリプシンで処理した
血小板に対する＋ｚｊ；ｘ−フィブリノーゲンの結合を
ｌ　、　Ｉ　Ｘ　１０−”　ＭのＩＣ，。でもって抑制
することが認められ、したがって露出したフィブリノー
ゲン受容体に対する直接的効果を示している（データは
示さない）、減少した量（２Ｘ１０−６Ｍ）のトリグラ
ミンはＡＤＰで刺激された血小板に対する′２ゝＩ−フ
ィブリノーゲンの結合を抑制しなかった（データは示さ
ない）。

下記の実験は、ＡＤＰで刺激された血小板及びキモトリ
プシンで処理した血小板の血小板凝集の抑制にトリグラ
ミンが有効であることを立証する。血小板懸濁液を前記
のように調製した。α−キモトリプシン（シグマ、等級
Ｉｓ）で処理した血小板は、コルネスキ−（Ｋｏｒｎｅ
ｃｋｉ）氏らにより、ジャーナル・バイオロジカルＱケ
ミスト　リ　−　　（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２５８
　　、　　ｐ　　。

９３４９〜９３５６　（１９８３））に記載のように調
製した。ただし、この場合の血小板とキモトリプシンと
のインキュベーション時間は４５分から２０分に短縮し
た。

種々の薬量のトリグラミン（０，２５〜５．０ｇｇ／ｍ
文）を血小板懸濁液（３ＸＩＯ”個の血小板７ｍ文）４
２０牌見に添加した。１分間後に１０ル見のＡＤＰ（１
０ｇモル）及び１０終文のフィブリノーゲン（２００ｐ
ｇ）を添加して血小板の凝集を開始させた。また、キモ
トリプシンで処理した血小板の凝集を誘発させるためフ
ィブリノーゲンのみ（ＡＤＰは用いない）を用いる上記
と同じ操作を行った。それぞれの系における血小板凝集
の程度をポーン（Ｂ　ｏ　ｒ　ｎ）氏らによりジャーナ
ル・オブ・フィジオロジ−（Ｊ、Ｐｈ７ｓｉｏ１．（Ｌ
ｏｎｄ、））１６８、ｐ、１７８〜１９５　（１９６３
）に記載の濁度測定法によって３７℃で測定した。ＡＤ
Ｐで刺激された血小板の凝集のトリグラミンによる抑制
のＩＣ，。値　は１　、３　Ｘ　１０−’　Ｍであった
。キモトリプシンで処理した血小板のトリグラミンによ
る抑制のＩＣ，。

値は２　、８　Ｘ　ｌ　０１Ｍであった。データを第２
図に示す、第２図は、ＡＤＰで刺激された血小板（Δ−
Δ）又はキモトリプシン（ＣＴ）で処理した血小板（０
−０）のフィブリノーゲンで誘発された血小板凝集に対
するトリグラミンの濃度に依存する抑制効果をプロット
したものである。２００　＃Ｌｇ　／　ｍ　Ｊｌのフィ
ブリノーゲン及び１０ＪＬモルのＡＤＰを使用した、各
データの点は、少なくとも５回の実験の平均を表す。

キモトリプシンで処理した血小板は表面上に露出したフ
ィブリノーゲン受容体を有するのでそれらがフィブリノ
ーゲンと直接相互作用することが知られている。特定の
理論にしばられることを欲しないが、キモトリプシンで
処理した血小板のフィブリノーゲンで誘発された凝集に
対するトリグラミンの抑制効果は、トリグラミンが血小
板膜上のフィブリノーゲン受容体と直接相互作用するこ
とを示している。

また、トリグラミンは、安定なプロスタグランジンエン
ドペルオキシド類似体である９、１１ジデオキシ−９，
１１−メタノエポキシ−ＰＧＦｚ−α（２，５１Ｌモル
）及びトロンビン（０，５ユニー／　）　／　ｍ　ｌ　
）により誘発される血小板凝集を濃度に依存する形で抑
制した。

さらに、血小板に富む血漿中では、トリグラミンは、Ａ
ＤＰ（１０ｕＬモル）、エピネフリン（５０ＩＬモル）
、９．１１−ジデオキシ−９，１１−メタノエポキシ−
ＰＧＦｚ−α（２，５ルモル）及びアラキドン酸ナトリ
ウム（２００−モル）によりそれぞれ誘発される血小板
凝集を２〜４ＸｌＯ−’　ＭのＩＣｉ、値でもって抑制
した。

ヒト血小板に対するｕｒエニートリグラミンの結合と７
２ゝＩ−フィブリノーゲンの結合との間にはいくつかの
類似性が存在する０両リガンドの結合は、ＥＤＴＡによ
り；　ＧＰＩＩ　ｂ−ＧＰｍａ複合体と相１作用するモ
ノクロナール抗体（コラ−（ＣｏｔＩｅｒ）氏、ジャー
ナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション（Ｊ
、Ｃｌ１ｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、）７６、ｐ、１０１−１０
８　（１９８５）及びペンネット（Ｂｅｎｎｅｔｔ）氏
ら、プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカ
デミ−滲オプーサイエンス・才ブ・ザ・ＵＳＡ（Ｐｒｏ
ｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、ｓｃｉ、Ｕ、ｓ。

Ａ）１副、ｐ、２４１７〜２４２１　　（１９８３））
により；フィブリノーゲン分子上の推定血小板結合個所
を表わす合成ペプチドＡｒｇ−Ｇｌｙ−ＡＳＰ−５ｅｒ
　（ガードナー（Ｇａｒｔｎｅｒ）ら、ジャーナル・オ
ブ・バイオロジカル−ケミ　　ス　ト　　リ　−　　（
Ｊ　　　、Ｂｉ　　　ｏ　　　ｌ　　　、Ｃｈｅｍ、）
　　　２６０、ｐ、１１８９１−１１８９４（１９８５
）及びプロ　（Ｐｌｏｗ）氏ら、同上Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ
　Ｉ　、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ　、Ｕ、Ｓ、Ａ、８２゜ｐ、
８０５７〜８０６１　（１９８５））により；γ−釦の
Ｃ末端部分のチロシルペンタデカペプチド　　　　Ｇｌ
ｙ−Ｇｉｎ−Ｇｉｎ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ　　−Ｌｅｕ−Ｇ
ｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ａ　１　ａ−
Ｇ　ｌ　ｙ−Ａｓ　ｐ−Ｖａ　ｌ　（クロツェヴイアク
（Ｋｌｏｃｚｅｗｉａｋ）氏ら、バイオケ　　ミ　　ス
　　ト　　リ　　−（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）　　
　　２旦、Ｐ、１７６７〜１７７４　（１９８４））に
よりそれぞれ抑制される。トリグラミンもフィブリノー
ゲンもグランラマン氏血小板無力症の患者の血小板に十
分に結合することは認められなかった。これらの患者は
ＧＰＩＩｂ−ＧＰｍａ複合体が不足している。フィブリ
ノーゲンは休眠している血小板に対しては結合せず、し
たがってＡＤＰによるか又は蛋白質加水分解酵素処理に
よる血小板の刺激がフィブリノーゲン結合個所を露出さ
せるための要件である。他方、休眠している血小板。

ＡＤＰで刺激された血小板及びキモトリプシンで処理し
た血小板上のトリグラミン結合個所の数は類似しており
、ＡＤＰによって露出したフィブリノーゲン結合個所の
総数の５０％にもなる。

ＡＤＰで刺激された血小板に対する１１ゝＩ−）リグラ
ミンの結合親和性は、解離定数に基づいて判断すると、
ＡＤＰで刺激された血小板に対するハ９Ｉ−フィブリノ
ーゲンの結合親和性よりもほぼ１５倍大きい、したがっ
て、モノクロナール抗体及び合成ペプチドの双方とも、
血小板に対するフィブリノーゲンの結合をＡＤＰで刺激
された血小板に対するトリグラミンの結合よりも有効に
抑制することが認められた。ＡＤＰで刺激された血小板
に対するトリグラミンの結合親和性はモノクロナール抗
体の結合親和性と類似している。それは血小板に対する
合成ペプチドの結合親和性よりも数倍大きい。

また、本発明者は、１０−”　Ｍの濃度でのトリグラミ
ンがトロンビンで刺激されたヒト血小板に対する高度に
精製されたホンウィルブランド因子の結合を特異的に妨
げることを立証した。第５図は、トロンビン（ｏ、ｓｕ
／ｍ見）で刺激された血小板に対するｌ２ｒＩ−ホンウ
ィルブランド因子の結合に及ぼすトリグラミンの効果を
示す、第５図は、トロンビン（０，５Ｕ／ｍＪＬ）で活
性化された血小板（○−○）及びリストセチン（０，７
５ｍ　ｇ　／　ｍ　ｌ　）で誘発された血小板（ローロ
）に対する１２ゞＩ−ホンウィルブランド因子（ＶＷＦ
）の結合のトリグラミンによる抑制率をプロットしたも
のである。ホンウィルブランド因子の最終濃度は５　ｐ
−ｇ／ｒｎｉであった。ホンウィルブランド因子の全特
異的結合量は対照側試料において３８０±５５　ｎ　ｇ
　／　１０　”血小板であった。これに対して、トリグ
ラミンは、リストセチン（０，７５ｍｇ／ｍ文）で刺激
された血小板に対するホンウィルブランド因子の結合を
妨げない（対照例、７５４ｆ１４０ｎｇ／１０”血小板
）、ホンウィルブランド因子がトロンビンで刺激された
血小板上のＧＰＩｒｂ−ＧＰｍａ複合体及びリストセチ
ンで刺激された血小板上のＧＰＩｂに対して結合するこ
とは周知である。したがって、本発明者は、トリグラミ
ンがＧＰＩｂに対するホンウィルブランド因子の結合を
妨げないものと結論する。

特定の理論にしばられることを欲しないが、トリグラミ
ンはＧＰＩＴｂ−ＧＰｍａ複合体におけるフィブリノー
ゲンの領分と同じ領分に結合し得るか、又はフィブリノ
ーゲン受容体の領分に極めて近接して結合し得る。

また、本発明者は、トリグラミンとＧＰｍａ及びビトロ
ネクチン受容体を含有する黒色腫細胞との間の相互作用
を確認した。トリグラミンは、フィブロネクチンで覆わ
れた基質に対する該細胞の付着を妨げ、細胞の拡がりを
抑制する。この試験では、０．２ｎモルのトリグラミン
の生物活性はペプチドであるグリシン−アルギニン−グ
リシン−アスパラギン酸−セリン（ＧＲＧＤＳ）の１０
０ｎモルに相当した。この確認は、マウスにおける黒色
細胞線の転移をＧＲＧＤＳにより抑止するためのハンフ
リーズ（Ｈｕｍｐｈｒｉｅｓ）氏らの成功した努力（サ
イエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２３３、ｐ、４６７〜４７
０）に鑑みて興味がある。

血小板の凝集を抑制するため慣用されている方法は、血
小板の刺激を抑制することに頼っている。他方、トリグ
ラミンは、血小板の凝集を起させるフィブリノーゲンの
結合の直接的な競争的抑制剤トシテ作用する。ＧＰｒｌ
　ｂ−ＧＰｍａ複合体に対するモノクロナール抗体は可
能性ある血小板凝集抑制剤であるが、モノクロナール抗
体は非常に大きい分子である。これらは一般に１８０ｋ
ｄ又はそれ以上の分子量を有する。このような分子、特
にネズミに由来するモノクロナール抗体はヒトにおける
免疫原であることが知られている。

他方、トリグラミンは分子量が８ｋｄの比較的小さいポ
リペプチドである。したがって、トリグラミンは、モノ
クロナール抗体よりもはるかに免疫原性が少ないことが
期待される。さらに、ＧＰｌｌｂ−ＧＰｍａ複合体に対
するフィブリノーゲンの結合を競争的に抑制させる際の
トリグラミンの作用は非常に特異的である。トリグラミ
ンは、免疫原性を伴なうことなくモノクロナール抗体の
特異的な領分及び高い結合親和性を持っている。

また、トリグラミンは、止血性血小板栓塞の形成の抑制
を望むいかなる状況においても投与することができる。

トリグラミンは循環系から迅速に除去されるものと思わ
れる。トリグラミンは、有効性持続時間が短い強力な血
液凝固防止剤が必要である状況において血小板凝集を抑
制するのに特に有用である。したがって、トリグラミン
は、動脈や臓器の取扱い並びに血小板と人工表面との相
互作用が血小板の凝集及び消耗を生じさせるような末梢
動脈の手術（動脈の接合）及び心臓血管手術において有
用であろう、凝集した血小板は血栓塞栓症を形成させる
恐れがある。トリグラミンはこれらの外科患者に対して
血小板の消耗を防ぐため投与することができる。

体外の血液循環は、血液に酸素を付与するために心臓血
管手術に日常的に使用されている。血小板は体外の循環
回路の表面に粘着する。この粘着は、血小板膜上のＧ　
Ｐ　ＩＩ　ｂ　／　ｍ　ａと循環回路の表面に吸着され
たフィブリノーゲンとの間の相互作用に左右される（グ
ラスツコ（Ｇｌｕｓｚｋｏ）氏ら、アメリカン・ジャー
ナル・オブ・フィジオロジ−（Ａｍｅｒ、Ｊ、Ｐｈｙｓ
ｆｏｌ、）２５ヱ、Ｐ、Ｈ６１５〜６２１．１９８７）
、人工表面から離れた血小板は、そこなわれた止血機構
を示す、トリグラミンはこのような粘着を防止するため
に投与することができる。

また、トリグラミンが、傷害の際の有効な止血に対して
重大である、血小板膜上の糖蛋白ｆｉＩｂとホンウィル
ブランド因子との間の相互作用を妨げないことは有益で
ある。このために、そしてトリグラミンの止血効果が短
時間であるために、トリグラミンは外科患者における正
常な止血の再開を妨げない、正常な出血時間への迅速な
復帰はトリグラミン投与の停ととともに起る。

トリグラミンのその他の用途としては、血栓溶解療法を
中止した後の血小板血栓塞栓症の予防並びに冠状動脈及
びその他の動脈の血管形成術後の血小板血栓塞栓症の予
防が含まれよう、多くの臨床センターにおいてこれらの
処置を受けた患者は、トリグラミンと比較して弱い血小
板凝集抑制剤である抗血小板薬剤を既に投与されている
。

また、トリグラミンはある種の腫瘍細胞（例えば黒色腫
）及び転移の拡がりを予防するのに有用であり得る。こ
れは、トリグラミンが黒色腫細胞の付着及び拡がりを抑
止することが認められたためである。

トリグラミンは、これを血流中に相当な量で供給させる
簡便な手段のいずれによっても投与することができる。

好ましい投与経路としては今のところ静脈内投与が考慮
される。トリグラミンは水溶性であり、したがって溶液
状で有効に投与することができる。

トリグラミンは蛋白質加水分解に対して比較的安定であ
り、したがって経口投与も実施可能である。経口投与は
、適当なバインダー材料で賦形させたトリグラミンの錠
剤、カプセルなどの形態をとる。

トリグラミンのインビボでの作用効果を下記のハムスタ
ーでの研究によって立証する。

ハムス　−での 雌の黄色シリアンハムスター（体重９０〜１５０ｇ）を
随意に飼料及び水をとれるように維持した。ただし、ハ
ムスターをこの実験に使用する前は一夜断食させた。麻
酔剤（６５ｍ　ｇ　／　ｋ　ｇのナトリウムベンドパル
ビタール、腹腔内）を投与した後、手術の用意のため毛
をそった。自然呼吸を容易にするため気管にポリエチレ
ン（ＰＥ−１００）チューブを差し込んだ、補足的な麻
酔剤用の並びに各種の制御剤及び実験用薬剤の投与用の
静脈内経路を作るため右の股静服にカニュールの差し込
みを行った。また、動脈血圧を連続的にモニターするた
めカテーテルを右の頚動脈に導入し、直腸温度プローブ
も挿入した。動物体の温度は加熱用パッド及びランプに
よって３７℃に維持シた。

毛をそった下腹部を中央線に沿って切開することにより
開き、小腸の一部を外に出し、ルーサイト製目視台上に
垂れ下げた。露出した組織は、加温した（３７℃）哺乳
動物用リンゲル溶液を連続的に注ぎかけることによって
加温加湿状態に保持した。実験溶液を右の股静脈にバー
バードポンプにより０．１９９ｍ１／ｍ１ｎ１７）流量
で１０分間注入した。小腸壁と腸間膜の接合部にある動
脈管（外径ｌＯＯ〜２００ｇｍ）を、注入を開始してか
ら４分後に切断した。血液は、上記の注ぎかけ系によっ
て流し去り、廃液は目視台を取り囲む凹みから真空によ
って除去した。出血はツアイス社製の解剖用顕微ｆｉ（
２０Ｘ）により観察し、切断時から止血性栓塞の形成に
よる出血の停止までの出血時間を記録した。各動物はそ
れ自身の対照例として使用し、そして出血時間は両者と
も塩水及び選定された実験用薬剤の注入中に決定した０
反復測定がその後の出血時間応答に影響しないことを保
障するため、トリグラミンの代りに第二の塩水注入によ
って６匹の動物を評価した。これらの２回の塩水注入の
平均出血時間の間には差異は見出されなかった。さらに
４匹の動物にトリグラミンを注入するとともに、それが
全身血圧に直接的な効果を及ぼすかどうか決定するため
に動脈自圧を連続的にモニターした。さらに、絶対的対
照例とするために１匹のハムスターにＰＣＩｚ類似体（
２ｎｇ／ｋｇ／ｍ１ｎ）のイロプルロスト（１１ｏｐ［
ｒｏｓｔ）（ペンレックス番うボラトリーズ社、シダー
・クノールズ、ＮＪ）を投与した。この動物では、出血
は、注入を完了してから約９分後までは止まらなかった
。

連続的に注入されたトリグラミンは、３．０２分±０．
４３の対照側出血時間を基準として、薬量に依存する形
でハムスターの腸間膜の出血時間を著しく増大させた。

第３図を参照されたい、第３図は、ハムスターの腸間膜
損傷部からの出血時間に対するトリグラミンの連続注入
のインビボでの効果をプロットしたものである。また、
トリグラミン注入を停止させると出血時間が正常値に迅
速に復帰した。第４図を参照されたい、第４図は、トリ
グラミン（８０４ｇ　／　ｋ　ｇ　／　ｍ　ｉ　ｎ　）
の注入前、注入中及び注入後のハムスターの腸間膜から
の出血時間の棒グラフである。

本発明者は、アオハブの毒液からトリグラミンを単離す
るのに成功した。前記した精製法に従ってその他のハブ
属（Ｔｒｆｍｅｒｅｓｕｒｕｓ）から単離し得る蛋白質
であって、前記した分子と同−の又は実質的に同一のア
ミノ酸配列を有する蛋白質は本発明の範囲内に包含され
ることを理解されたい。

未発明に従ってトリグラミンを化学的均一性まで精製す
ることがこの分子のアミノ酸配列決定を可能にした。こ
の分子はまず第一に天然源であるアオハブの毒液から精
製されたが、トリグラミンは当業者に知られた遺伝子工
学技術によって製造できることも意図される。しかして
、本明細書に開示したトリグラミンのアミノ酸配列に基
づいて、このアミノ酸配列に相当する合成遺伝子を有利
に製造し、この遺伝子を適当なりローニング中介物によ
って適当な宿主に導入することができる。また別法とし
て、アオハブの毒液産生細胞から天然遺伝子を取得し１
次いで組換え及びクローニングを行なうことによってト
リグラミンを製造し得ることが意図される。したがって
１本発明の範囲は本明細書に開示したクロマトグラフ操
作に従うことによって単離されたトリグラミンに限られ
ないのみならず、遺伝子工学技術に従って製造し得るト
リグラミンをも包含することが理解される。

本発明は、その精神又は必須の特色から逸脱することな
く、その他の特別の形で具体化でき、したがって本発明
の範囲を示すものとして特許請求の範囲を参照すべきで
ある。

【図面の簡単な説明】

第１図は、トリグラミンの不存在下（０−０）又は存在
下（０、５４ｇ　／　ｍ　ｉ、ロー０．１．０ｈ　ｇ　
／　ｍ　ｉ、ムーム）テの、１０ルモルＡＤＰにより刺
激されたヒト血小板に対する１２９■−フィブリノーゲ
ンの結合の二重逆数プロットである。 第２図は、ＡＤＰで刺激された血小板（Δ−Δ）又はキ
モトリプシン（ＣＴ）で処理した血小板（０−０）のフ
ィブリノーゲンで誘発された血小板凝集に対するトリグ
ラミンの濃度に債存する抑制効果をプロットしたもので
ある。 第３図は、ハムスターの腸間膜損傷部からの出血時間に
対するトリグラミンの連続注入のインビボでの効果をプ
ロットしたものである・第４図は、トリグラミン（８０
ＪＬｇ／ｋｇ／ｍ１ｎ）の注入前、注入中及び注入後の
／Ｘムスターの腸間膜からの出血時間の棒グラフである
。 第５図は、トロンビン（０，５Ｕ／ｍ文）で活性化され
た血小板（０−０）及びリストセチン（０，７５ｍｇ／
ｍ又）で誘発された血小板（ローロ）に対する１２ｇ■
−ホンウィルブランド因子（ＶＷＦ）の結合のトリグラ
ミンによる抑制率をプロットしたものである。 べ Ｆｌ（ｉＵＲＥ　Ｉ ＦＩＧＵＲＥ　２ 〔トリグラミン　コ、νｇ／ｍｌ 出血時間　　（ｍｉｎ）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）次のアミノ酸配列 【遺伝子配列があります】 を有する実質上純粋な化学的形態のポリペプチド。 ２）次式 【遺伝子配列があります】 のポリペプチドからなり、ホスホリパーゼＡ汚染物を含
   まない、ヒト血小板のフィブリノーゲンで誘発される凝
   集を抑制するための製剤。 ３）ポリペプチドが実質上純粋な化学的形態にある請求
   項２記載の製剤。 ４）ヒト血小板を請求項１記載のポリペプチドとインキ
   ュベートすることからなる、ヒト血小板に対するフィブ
   リノーゲンの結合を抑制し又はヒト血小板のフィブリノ
   ーゲンで誘発される凝集を抑制する方法。 ５）ヒト血小板を請求項２記載の製剤とインキュベート
   することからなる、ヒト血小板に対するフィブリノーゲ
   ンの結合を抑制し又はヒト血小板のフィブリノーゲンで
   誘発される凝集を抑制する方法。 ６）ヒト血小板を請求項３記載の製剤とインキュベート
   することからなる、ヒト血小板に対するフィブリノーゲ
   ンの結合を抑制し又はヒト血小板のフィブリノーゲンで
   誘発される凝集を抑制する方法。