JPH0359080B2 - - Google Patents
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- JPH0359080B2 JPH0359080B2 JP57075183A JP7518382A JPH0359080B2 JP H0359080 B2 JPH0359080 B2 JP H0359080B2 JP 57075183 A JP57075183 A JP 57075183A JP 7518382 A JP7518382 A JP 7518382A JP H0359080 B2 JPH0359080 B2 JP H0359080B2
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- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
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Description
本発明は、固定化生理活性物質の製造法に関
し、更に詳しくは、高いリガンド濃度を有し、か
つ、安定である固定化生理活性物質の製造法に関
する。 蛋白質、ペプチド、アミノ酸及び生体アミン等
のアミノ基を有する生理活性物質の固定化には
種々の方法があり、これらは固定化物の利用目的
により適宜選択される。 生理化学工業的に利用価値の高い、特異的吸着
剤、固定化酵素及び特異的過膜等を目的とする
場合には、包理法がよく用いられている。 しかしながらこの包理法には、 (1) 固定化生理活性物質に作用する移動相中の物
質の分子量は低くなければならない、 (2) 固定化される物質が高分子の場合は、特にケ
ージとなる不溶性高分子が機械的に弱い構造と
なり易い、 (3) 大量生産が困難である、 等の欠点がある。 これらの欠点を解消した方法としては、リガン
ドを共有結合により不溶性担体に固定化する方法
があり、特に、高分子基質に作用する酵素、高分
子物質と結合する免疫性蛋白質及びホルモン或は
それらの受容体等の生理活性物質の場合には、優
れた固定化方法といわれている。 この方法に用いる不溶性担体としては、非特異
的に吸着することがなく、結合性の基と活性化さ
れる官能基を有する物理的・化学的に安定な高分
子が好ましい。このうち、バツチ法又はクロマト
グラフイーに用いるアフイーニテイー吸着剤の場
合には、流速が大きく、目づまりがなく、かつ、
吸着容量を大きくできるものがよく、固定化酵素
として用いる場合には、基質との接触面積を大き
くし、触媒効率を高めるために、多孔質のゲル状
物質の粒子が好ましい。このようなものとして
は、球状に成型されたアガロースゲル、セルロー
スゲル、ポリアクリルアミドゲル、ポリビニルゲ
ル等が実用化されている。 共有結合による固定化方法としては、臭化シア
ンを用いる方法（以下、「CNBr」という）すな
わち、担体上の水酸基をシアン酸エステル又はイ
ミドカルボネートに変換（活性化）し、これにア
ミド基を有するリガンドやスペーサー（リガンド
を担体から離してリガンドによる吸着を容易にす
るための腕）をイソウレア架橋により結合させて
固定化する方法がある。この方法は、比較的容易
に固定化を行うことができるのでよく用いられる
が、非特異的に吸着が起こる場合が多く、また、
一度固定化されたリガンドの結合が不安定なため
に、リガンドガ漏出することが多いという欠点が
ある。すなわち、この方法の架橋部に形成される
イミド基は、そのpKaが10.4で中性附近では陽性
に荷電しており、一方、通常の蛋白質は中性附近
では陰性に荷電しているため、静電気相互作用に
より非特異的に吸着が起こる。また、架橋部を形
成しているイソウレア結合は分解され易く、特
に、アルカリ性では著しい。 これらの欠点を解消するために考案された方法
のうち、特に有効な方法の一つとして、エポキシ
活性化担体から出発する方法（以下、「エポキシ
活性化法」という。）［有機合成化学、第38巻、
128〜138頁（1980年）］がある。このエポキシ活
性化法は次のような利点を有する。 (1) CNBr法にみられるような静電気的非特異的
吸着がない。 (2) 自動的にスペーサーが入る。 (3) アミノ基又は水酸基を有するリガンドとの結
合であるアルキルアミノ結合又はエーテル結合
が安定であり、CNBr法にみられるような漏出
が少ない。 (4) 担体高分子間に若干の架橋が起こり、担体が
強化される。 (5) 活性化の程度をチオ硫酸ナトリウム法により
測定することができる。 しかしながら、このエポキシ活性化法には、リ
ガンドを結合させる際に、高温のアルカリ性条件
下において長時間反応させなくてはならないとい
う欠点がある。 アミノ基を有する生理活性物質の固定化方法と
して、多糖類の構成糖残基のジオール構造を過ヨ
ウ素酸により酸化し、生ずるアルデヒド基に、水
素化ホウ素ナトリウムの存在下において、アミノ
基を有する生理活性物質を固定化する方法
［Immunology、第20巻、1061〜1065頁（1971
年）］が知られている。 しかしながら、この方法には、 (1) スペーサーが入らない、 (2) 担体の構造が弱くなる、 (3) リガンド濃度が低い、 等の欠点がある。 本発明者は、先に、エポキシ活性化担体をアン
モニアでアミノ誘導体とした後、無水コハク酸で
処理し、スクシニルアミノ誘導体とし、これに、
カルボジイミドとアミノ基を有するリガンドとを
作用させてリガンドの固定化を行う方法［有機合
成化学、第38巻、128〜138頁（1980年）；J.
Biochem.、第87巻、535〜540頁（1980年）］を発
明し、一応の成果を得たが、水溶性カルボジイミ
ドによるカツプリング反応ではチヤツプマン転位
等の副作用の起こる可能性があり、また、最適酸
度であるPH4.5においても、さらに高い水素イオ
ン濃度の条件下ではなおさら、リガンドが重合す
る副反応が起こり易く、固定化物の収率は満足な
ものとはいえなかつた。また、反応させている
間、PHを調整する必要があり、しかも、反応時間
がかなり長く、通常12時間を要する。 本発明は、前述した従来の固定化方法の欠点を
解消し、穏和な条件で固定化することができ、高
いリガンド濃度を有する新規な固定化生理活性物
質の製造法を提供することを目的とする。 本発明者は、鋭意研究を重ねた結果、アミノア
ルキル基を有する多糖類、アミノ化されたエポキ
シ活性化多糖類又はアミノ化されたエポキシ活性
化ポリビニルアルコール樹脂と、ジアルデヒド化
合物とを反応させて得たアルデヒド活性化不溶性
高分子を水素化シアノホウ素ナトリウムの存在下
において、アミノ基を有する生理活性物質と反応
させることにより、穏和な条件による固定化によ
つて、高いリガンド濃度を有し、かつ、安定であ
る固定化生理活性物質が得られることを見出し、
本発明を完成するに至つた。 すなわち、本発明の第１は、アミノアルキル基
を有する水不溶性多糖類を、水素化シアノホウ素
ナトリウムの存在下において、次式（）： OHC−（CH2−）o-2CHO （） （式中、ｎは、２〜10の整数を表す） で示される直鎖状ジアルデヒド化合物と反応させ
て、次式（）： OHC−（CH2−）o-1NH−M1 （） （式中、M1−NH−は、アミノアルキル基を有
する水不溶性多糖類残基を表し、ｎは２〜10の整
数を表す） で示されるアルデヒド活性化不溶性高分子を得、
次いでこれを水素化シアノホウ素ナトリウムの存
在下において、アミノ基を有する生理活性物質と
反応させることを特徴とする次式（）： Ｘ−NH−（CH2−）oNH−M1 （） （式中、Ｘ−NH−は、アミノ基を有する生理活
性物質残基を表し、M1−NH−及びｎは、前記
と同じ）で示される固定化生理活性物質の製造法
である。 さらにまた、本発明の第２は、水酸基を有する
水不溶性多糖類又はポリビニルアルコール系樹脂
をエピハロヒドロリン又はビスオキシランと反応
させた後、アンモニアで処理して得た次式
（）： M2−NH2 （） （式中、M2は、
し、更に詳しくは、高いリガンド濃度を有し、か
つ、安定である固定化生理活性物質の製造法に関
する。 蛋白質、ペプチド、アミノ酸及び生体アミン等
のアミノ基を有する生理活性物質の固定化には
種々の方法があり、これらは固定化物の利用目的
により適宜選択される。 生理化学工業的に利用価値の高い、特異的吸着
剤、固定化酵素及び特異的過膜等を目的とする
場合には、包理法がよく用いられている。 しかしながらこの包理法には、 (1) 固定化生理活性物質に作用する移動相中の物
質の分子量は低くなければならない、 (2) 固定化される物質が高分子の場合は、特にケ
ージとなる不溶性高分子が機械的に弱い構造と
なり易い、 (3) 大量生産が困難である、 等の欠点がある。 これらの欠点を解消した方法としては、リガン
ドを共有結合により不溶性担体に固定化する方法
があり、特に、高分子基質に作用する酵素、高分
子物質と結合する免疫性蛋白質及びホルモン或は
それらの受容体等の生理活性物質の場合には、優
れた固定化方法といわれている。 この方法に用いる不溶性担体としては、非特異
的に吸着することがなく、結合性の基と活性化さ
れる官能基を有する物理的・化学的に安定な高分
子が好ましい。このうち、バツチ法又はクロマト
グラフイーに用いるアフイーニテイー吸着剤の場
合には、流速が大きく、目づまりがなく、かつ、
吸着容量を大きくできるものがよく、固定化酵素
として用いる場合には、基質との接触面積を大き
くし、触媒効率を高めるために、多孔質のゲル状
物質の粒子が好ましい。このようなものとして
は、球状に成型されたアガロースゲル、セルロー
スゲル、ポリアクリルアミドゲル、ポリビニルゲ
ル等が実用化されている。 共有結合による固定化方法としては、臭化シア
ンを用いる方法（以下、「CNBr」という）すな
わち、担体上の水酸基をシアン酸エステル又はイ
ミドカルボネートに変換（活性化）し、これにア
ミド基を有するリガンドやスペーサー（リガンド
を担体から離してリガンドによる吸着を容易にす
るための腕）をイソウレア架橋により結合させて
固定化する方法がある。この方法は、比較的容易
に固定化を行うことができるのでよく用いられる
が、非特異的に吸着が起こる場合が多く、また、
一度固定化されたリガンドの結合が不安定なため
に、リガンドガ漏出することが多いという欠点が
ある。すなわち、この方法の架橋部に形成される
イミド基は、そのpKaが10.4で中性附近では陽性
に荷電しており、一方、通常の蛋白質は中性附近
では陰性に荷電しているため、静電気相互作用に
より非特異的に吸着が起こる。また、架橋部を形
成しているイソウレア結合は分解され易く、特
に、アルカリ性では著しい。 これらの欠点を解消するために考案された方法
のうち、特に有効な方法の一つとして、エポキシ
活性化担体から出発する方法（以下、「エポキシ
活性化法」という。）［有機合成化学、第38巻、
128〜138頁（1980年）］がある。このエポキシ活
性化法は次のような利点を有する。 (1) CNBr法にみられるような静電気的非特異的
吸着がない。 (2) 自動的にスペーサーが入る。 (3) アミノ基又は水酸基を有するリガンドとの結
合であるアルキルアミノ結合又はエーテル結合
が安定であり、CNBr法にみられるような漏出
が少ない。 (4) 担体高分子間に若干の架橋が起こり、担体が
強化される。 (5) 活性化の程度をチオ硫酸ナトリウム法により
測定することができる。 しかしながら、このエポキシ活性化法には、リ
ガンドを結合させる際に、高温のアルカリ性条件
下において長時間反応させなくてはならないとい
う欠点がある。 アミノ基を有する生理活性物質の固定化方法と
して、多糖類の構成糖残基のジオール構造を過ヨ
ウ素酸により酸化し、生ずるアルデヒド基に、水
素化ホウ素ナトリウムの存在下において、アミノ
基を有する生理活性物質を固定化する方法
［Immunology、第20巻、1061〜1065頁（1971
年）］が知られている。 しかしながら、この方法には、 (1) スペーサーが入らない、 (2) 担体の構造が弱くなる、 (3) リガンド濃度が低い、 等の欠点がある。 本発明者は、先に、エポキシ活性化担体をアン
モニアでアミノ誘導体とした後、無水コハク酸で
処理し、スクシニルアミノ誘導体とし、これに、
カルボジイミドとアミノ基を有するリガンドとを
作用させてリガンドの固定化を行う方法［有機合
成化学、第38巻、128〜138頁（1980年）；J.
Biochem.、第87巻、535〜540頁（1980年）］を発
明し、一応の成果を得たが、水溶性カルボジイミ
ドによるカツプリング反応ではチヤツプマン転位
等の副作用の起こる可能性があり、また、最適酸
度であるPH4.5においても、さらに高い水素イオ
ン濃度の条件下ではなおさら、リガンドが重合す
る副反応が起こり易く、固定化物の収率は満足な
ものとはいえなかつた。また、反応させている
間、PHを調整する必要があり、しかも、反応時間
がかなり長く、通常12時間を要する。 本発明は、前述した従来の固定化方法の欠点を
解消し、穏和な条件で固定化することができ、高
いリガンド濃度を有する新規な固定化生理活性物
質の製造法を提供することを目的とする。 本発明者は、鋭意研究を重ねた結果、アミノア
ルキル基を有する多糖類、アミノ化されたエポキ
シ活性化多糖類又はアミノ化されたエポキシ活性
化ポリビニルアルコール樹脂と、ジアルデヒド化
合物とを反応させて得たアルデヒド活性化不溶性
高分子を水素化シアノホウ素ナトリウムの存在下
において、アミノ基を有する生理活性物質と反応
させることにより、穏和な条件による固定化によ
つて、高いリガンド濃度を有し、かつ、安定であ
る固定化生理活性物質が得られることを見出し、
本発明を完成するに至つた。 すなわち、本発明の第１は、アミノアルキル基
を有する水不溶性多糖類を、水素化シアノホウ素
ナトリウムの存在下において、次式（）： OHC−（CH2−）o-2CHO （） （式中、ｎは、２〜10の整数を表す） で示される直鎖状ジアルデヒド化合物と反応させ
て、次式（）： OHC−（CH2−）o-1NH−M1 （） （式中、M1−NH−は、アミノアルキル基を有
する水不溶性多糖類残基を表し、ｎは２〜10の整
数を表す） で示されるアルデヒド活性化不溶性高分子を得、
次いでこれを水素化シアノホウ素ナトリウムの存
在下において、アミノ基を有する生理活性物質と
反応させることを特徴とする次式（）： Ｘ−NH−（CH2−）oNH−M1 （） （式中、Ｘ−NH−は、アミノ基を有する生理活
性物質残基を表し、M1−NH−及びｎは、前記
と同じ）で示される固定化生理活性物質の製造法
である。 さらにまた、本発明の第２は、水酸基を有する
水不溶性多糖類又はポリビニルアルコール系樹脂
をエピハロヒドロリン又はビスオキシランと反応
させた後、アンモニアで処理して得た次式
（）： M2−NH2 （） （式中、M2は、
【式】又は
を表し、ｍは、水酸基を有する水不溶性多糖類残
基又はポリビニルアルコール系樹脂残基を表し、
Ｐは、２〜８の整数を表す）で示されるアミノ化
不溶性高分子に、水素化シアノホウ素ナトリウム
の存在下において、次式（）： OHC−（CH2−）o-2CHO （） （式中、ｎは、２〜10の整数を表す） で示される直鎖状ジアルデヒド化合物を反応させ
て、次式（）： OHC−（CH2−）o-1NH−M2 （） （式中、M2−NH−は、前記アミノ化不溶性高
分子残基を表し、ｎは前記と同じ） で示されるアルデヒド活性化不溶性高分子を得、
次いでこれを水素化シアノホウ素ナトリウムの存
在下において、アミノ基を有する生理活性物質と
反応させることを特徴とする次式（）： Ｘ−NH−（CH2−）oNH−M2 （） （式中、Ｘ−NH−はアミノ基を有する生理活性
物質残基を表し、M2−NH−及びｎは、前記と
同じ） で示される固定化生理活性物質の製造法である。 以下、本発明を詳細に説明する。 本発明に用いるアミノ基を有する生理活性物質
としては、コンカナバリンＡ（以下、「ConA」と
いう。）、ウシ血清アルブミン（以下、「BSA」と
いう。）、γ−グロブリン（抗体）、酵素、植物性
血球凝集素（PHA）、フイブロネクチン、プロテ
インＡ等の蛋白質；キニン、副腎皮質刺激ホルモ
ン放出因子（CRF）、カルシトニン、グルカゴン
等のペプチド；種々のアミノ酸；ヒスタミン、ド
パミン、グルコサミン、トリプタミン等の生体ア
ミン；等が挙げられるが、この中には、種々のホ
ルモンとその受容体も含まれる。 アミノアルキル基を有する水不溶性多糖類とし
ては、アミノエチルアガロース、アミノヘキシル
アガロース等のアミノアルキルアガロース；並び
にアミノエチルセルロース等が挙げられる。 水酸基を有する水不溶性多糖類としては、アガ
ロース、セルロース、キチン、マンナン等が挙げ
られ、ポリビニルアルコール系樹脂としては、ト
ヨパール（東ソー(株)の商品名）等が挙げられる。 これらの不溶性高分子は、目的に応じて種々の
形態で用いられる。例えば、アフイニテイー吸着
剤又は固定化酵素に用いる場合には、吸着容量を
高めたり、接触面積を大きくするため、多孔質の
粒状のものが好ましく、希薄な生理活性物質溶液
の処理に用いる場合には、多孔質の膜状のものが
好ましい。 本発明に係る固定化生理活性物質は、次のよう
にして製造することができる。 担体として製造することができる。 担体として、アミノアルキル基を有する水不溶
性多糖類を用いる場合には、先ず、これを水素化
シアノホウ素ナトリウムの存在下において、直鎖
状ジアルデヒド化合物（）と反応させてアルデ
ヒド活性化不溶性高分子（）とする。このと
き、溶媒としては水が用いられ、その量は不溶性
多糖類１ｇ当たり10〜100mlの範囲内であること
が好ましい。用いる水素化シアノホウ素ナトリウ
ムの量は、不溶性多糖類１ｇ当たり100mg以上で
あればよいが、特に200〜1000mgの範囲内である
ことが好ましい。 直鎖状ジアルデヒド化合物（）としては、一
般には、炭素数２〜10のもの、例えば、グリオキ
サール、プロパンジアール、ブタンジアール、グ
ルタルアルデヒド（ペンタンジアール）、デカン
ジアール等が単独で又は二種以上の混合物として
用いられる。以上の条件で、４〜100℃、好まし
くは37〜80℃において１〜100時間、好ましくは
12〜48時間反応させることにより、アルデヒド活
性化不溶性高分子を得ることができる。 次に、このアルデヒド活性化不溶性高分子
（）を、水素化シアノホウ素ナトリウムの存在
下において、前記アミノ基を有する生理活性物質
と反応させることにより、目的とする固定化生理
活性物質（）を得ることができる。 このとき、用いる溶媒としては、リン酸緩衝
液、酢酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸緩衝液等が
挙げられ、そのPHは６〜９の範囲内であることが
好ましく、その量はアルデヒド活性化不溶性高分
子（）１ｇ当たり５〜50mlの範囲内であること
が好ましい。用いる水素化シアノホウ素ナトリウ
ムの量は、アルデヒド活性化不溶性高分子（）
１ｇ当たり100mg以上であればよいが、特に200〜
500mgの範囲内であることが好ましい。生理活性
物質の量は、その種類によつて異なるが、一般に
は、アルデヒド活性化不溶性高分子（）１ｇ当
たり200〜2000mgの範囲内である。以上の条件で、
０〜100℃、好ましくは４〜40℃において１〜72
時間、好ましくは12〜48時間反応させることによ
り、目的とする固定化生理活性物質（）を得る
ことができる。 また、担体として、水酸基を有する水不溶性多
糖類又はポリビニルアルコール樹脂を用いる場合
には、既知の方法［有機合成化学、第38巻、128
〜138頁（1980年）］に従い、エピクロルヒドリ
ン、エピブロムヒドリン等のエピハロヒドリン；
又は、エチレングリコールジグリシジルエーテ
ル、１，３−プロパンジオールジグリシジルエー
テル、１，４−ブタンジオールジグリシジルエー
テル、１，５−ペンタンジオールジグリシジルエ
ーテル、１，６−ヘキサンジオールジグリシジル
エーテル等のビスオキシラン化合物；を用いて、
前記水不溶性多糖類又はポリビニルアルコール樹
脂をエポキシ活性化した後、アンモニアで処理し
て、得られたアミノ化不溶性高分子（）を前述
と同様に処理することにより、目的とする固定化
生理活性物質を得ることができる。 本発明の製造法によれば、穏和な条件下で、か
つ、反応中のPH調整を行うことなく、しかも、従
来法に比し短い反応時間で目的とする固定化生理
活性物質を得ることができる。さらに、得られた
固定化生理活性物質は、従来のものに比し、３〜
200倍のリガンド濃度を有している。 以下、実施例により本発明を更に詳細に説明す
る。 実施例 １ (1) アミノ化アガロースの調製 アガロースとしてフアルマシア社製のセフア
ロース6B及びセフアロース4Bを用いた。グラ
スフイルター上で水でよく洗浄後、吸引過し
たアガロース20ｇをフラスコに入れ、水30ml、
2MNaOH水溶液13ml及びエピクロルヒドリン
３mlを順次加えた。懸濁液を40℃のインキユベ
ーター中で２時間振盪後、グラスフイルター上
で水で充分に洗浄してエポキシ活性化アガロー
スを得た。このエポキシ活性化アガロースに導
入されたエポキシ基の量をNa2S2O3を用いる中
和滴定法により測定したところ、セフアロース
6Bでは、乾燥重量１ｇ当たり約700μmol、セ
フアロース4Bでは、同約500μmolのエポキシ
基が導入されていた。 このエポキシ活性化アガロース１容に濃アン
モニア水1.5容を加え、40℃のインキユベータ
ー中で１時間半振盪した。反応後、グラスフイ
ルター上で水で充分に洗浄してアミノ化アガロ
ースを得た。このアミノ化アガロースを２，
４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸で処理
した後、50％酢酸で可溶化し、340nｍにおけ
るトリニトロフエニルアミンの吸収を測定する
ことにより、導入されたアミノ基の量を算出し
たところ、セフアロース6Bでは、乾燥重量１
ｇ当たり約600μmol、セフアロース4Bでは、
同約400μmolのアミノ基が導入されていた。 (2) 固定化ConAの調製 (1)で得たアミノ化アガロース（セフアロース
4B）１ｇに25％グルタルアルデヒト水溶液１
ml及び水素化シアノホウ素ナトリウム82mgを加
えて、40℃のインキユベーター中で２時間振盪
後、グラスフイルター上で水で充分に洗浄して
アルデヒド活性化アガロースを得た。 このアルデヒド活性化アガロース１ｇに、
ConA100mg及びメチル−α−Ｄ−マンノシド
110mgを溶解した0.2Mリン酸緩衝液（PH7.0）
２mlを加えた後、水素化シアノホウ素ナトリウ
ム24mgを加えて、４℃のインキユベーター中で
２日間振盪した。反応終了後、上清を除き、
0.2Mリン酸緩衝液で充分に洗浄して、ConA結
合アガロースを得た。 (3) リガンド濃度の測定 上清及び洗浄液中の非結合残存ConAの量
を、その28nｍにおける吸収の測定値より算出
することによつて、アガロースに結合した
ConAの量を算出した。尚、対照として、
CNBr法によりアガロースに結合させた酵素
［千畑一郎 外著；“アフイニテイークロマトグ
ラフイー”、40頁、東京、講談社（1976年）］
（対照１）、過ヨウ素酸酸化法により各種多糖に
結合させたBSA［Imuunology第20巻、1061〜
1065頁（1971年）］（対照２）及びヒドラジド誘
導体に結合されたBSA［Bio−chemistry、第８
巻、4074〜4082頁（1969年）］（対照３）を用い
た。結果を第１表に示す。
基又はポリビニルアルコール系樹脂残基を表し、
Ｐは、２〜８の整数を表す）で示されるアミノ化
不溶性高分子に、水素化シアノホウ素ナトリウム
の存在下において、次式（）： OHC−（CH2−）o-2CHO （） （式中、ｎは、２〜10の整数を表す） で示される直鎖状ジアルデヒド化合物を反応させ
て、次式（）： OHC−（CH2−）o-1NH−M2 （） （式中、M2−NH−は、前記アミノ化不溶性高
分子残基を表し、ｎは前記と同じ） で示されるアルデヒド活性化不溶性高分子を得、
次いでこれを水素化シアノホウ素ナトリウムの存
在下において、アミノ基を有する生理活性物質と
反応させることを特徴とする次式（）： Ｘ−NH−（CH2−）oNH−M2 （） （式中、Ｘ−NH−はアミノ基を有する生理活性
物質残基を表し、M2−NH−及びｎは、前記と
同じ） で示される固定化生理活性物質の製造法である。 以下、本発明を詳細に説明する。 本発明に用いるアミノ基を有する生理活性物質
としては、コンカナバリンＡ（以下、「ConA」と
いう。）、ウシ血清アルブミン（以下、「BSA」と
いう。）、γ−グロブリン（抗体）、酵素、植物性
血球凝集素（PHA）、フイブロネクチン、プロテ
インＡ等の蛋白質；キニン、副腎皮質刺激ホルモ
ン放出因子（CRF）、カルシトニン、グルカゴン
等のペプチド；種々のアミノ酸；ヒスタミン、ド
パミン、グルコサミン、トリプタミン等の生体ア
ミン；等が挙げられるが、この中には、種々のホ
ルモンとその受容体も含まれる。 アミノアルキル基を有する水不溶性多糖類とし
ては、アミノエチルアガロース、アミノヘキシル
アガロース等のアミノアルキルアガロース；並び
にアミノエチルセルロース等が挙げられる。 水酸基を有する水不溶性多糖類としては、アガ
ロース、セルロース、キチン、マンナン等が挙げ
られ、ポリビニルアルコール系樹脂としては、ト
ヨパール（東ソー(株)の商品名）等が挙げられる。 これらの不溶性高分子は、目的に応じて種々の
形態で用いられる。例えば、アフイニテイー吸着
剤又は固定化酵素に用いる場合には、吸着容量を
高めたり、接触面積を大きくするため、多孔質の
粒状のものが好ましく、希薄な生理活性物質溶液
の処理に用いる場合には、多孔質の膜状のものが
好ましい。 本発明に係る固定化生理活性物質は、次のよう
にして製造することができる。 担体として製造することができる。 担体として、アミノアルキル基を有する水不溶
性多糖類を用いる場合には、先ず、これを水素化
シアノホウ素ナトリウムの存在下において、直鎖
状ジアルデヒド化合物（）と反応させてアルデ
ヒド活性化不溶性高分子（）とする。このと
き、溶媒としては水が用いられ、その量は不溶性
多糖類１ｇ当たり10〜100mlの範囲内であること
が好ましい。用いる水素化シアノホウ素ナトリウ
ムの量は、不溶性多糖類１ｇ当たり100mg以上で
あればよいが、特に200〜1000mgの範囲内である
ことが好ましい。 直鎖状ジアルデヒド化合物（）としては、一
般には、炭素数２〜10のもの、例えば、グリオキ
サール、プロパンジアール、ブタンジアール、グ
ルタルアルデヒド（ペンタンジアール）、デカン
ジアール等が単独で又は二種以上の混合物として
用いられる。以上の条件で、４〜100℃、好まし
くは37〜80℃において１〜100時間、好ましくは
12〜48時間反応させることにより、アルデヒド活
性化不溶性高分子を得ることができる。 次に、このアルデヒド活性化不溶性高分子
（）を、水素化シアノホウ素ナトリウムの存在
下において、前記アミノ基を有する生理活性物質
と反応させることにより、目的とする固定化生理
活性物質（）を得ることができる。 このとき、用いる溶媒としては、リン酸緩衝
液、酢酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸緩衝液等が
挙げられ、そのPHは６〜９の範囲内であることが
好ましく、その量はアルデヒド活性化不溶性高分
子（）１ｇ当たり５〜50mlの範囲内であること
が好ましい。用いる水素化シアノホウ素ナトリウ
ムの量は、アルデヒド活性化不溶性高分子（）
１ｇ当たり100mg以上であればよいが、特に200〜
500mgの範囲内であることが好ましい。生理活性
物質の量は、その種類によつて異なるが、一般に
は、アルデヒド活性化不溶性高分子（）１ｇ当
たり200〜2000mgの範囲内である。以上の条件で、
０〜100℃、好ましくは４〜40℃において１〜72
時間、好ましくは12〜48時間反応させることによ
り、目的とする固定化生理活性物質（）を得る
ことができる。 また、担体として、水酸基を有する水不溶性多
糖類又はポリビニルアルコール樹脂を用いる場合
には、既知の方法［有機合成化学、第38巻、128
〜138頁（1980年）］に従い、エピクロルヒドリ
ン、エピブロムヒドリン等のエピハロヒドリン；
又は、エチレングリコールジグリシジルエーテ
ル、１，３−プロパンジオールジグリシジルエー
テル、１，４−ブタンジオールジグリシジルエー
テル、１，５−ペンタンジオールジグリシジルエ
ーテル、１，６−ヘキサンジオールジグリシジル
エーテル等のビスオキシラン化合物；を用いて、
前記水不溶性多糖類又はポリビニルアルコール樹
脂をエポキシ活性化した後、アンモニアで処理し
て、得られたアミノ化不溶性高分子（）を前述
と同様に処理することにより、目的とする固定化
生理活性物質を得ることができる。 本発明の製造法によれば、穏和な条件下で、か
つ、反応中のPH調整を行うことなく、しかも、従
来法に比し短い反応時間で目的とする固定化生理
活性物質を得ることができる。さらに、得られた
固定化生理活性物質は、従来のものに比し、３〜
200倍のリガンド濃度を有している。 以下、実施例により本発明を更に詳細に説明す
る。 実施例 １ (1) アミノ化アガロースの調製 アガロースとしてフアルマシア社製のセフア
ロース6B及びセフアロース4Bを用いた。グラ
スフイルター上で水でよく洗浄後、吸引過し
たアガロース20ｇをフラスコに入れ、水30ml、
2MNaOH水溶液13ml及びエピクロルヒドリン
３mlを順次加えた。懸濁液を40℃のインキユベ
ーター中で２時間振盪後、グラスフイルター上
で水で充分に洗浄してエポキシ活性化アガロー
スを得た。このエポキシ活性化アガロースに導
入されたエポキシ基の量をNa2S2O3を用いる中
和滴定法により測定したところ、セフアロース
6Bでは、乾燥重量１ｇ当たり約700μmol、セ
フアロース4Bでは、同約500μmolのエポキシ
基が導入されていた。 このエポキシ活性化アガロース１容に濃アン
モニア水1.5容を加え、40℃のインキユベータ
ー中で１時間半振盪した。反応後、グラスフイ
ルター上で水で充分に洗浄してアミノ化アガロ
ースを得た。このアミノ化アガロースを２，
４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸で処理
した後、50％酢酸で可溶化し、340nｍにおけ
るトリニトロフエニルアミンの吸収を測定する
ことにより、導入されたアミノ基の量を算出し
たところ、セフアロース6Bでは、乾燥重量１
ｇ当たり約600μmol、セフアロース4Bでは、
同約400μmolのアミノ基が導入されていた。 (2) 固定化ConAの調製 (1)で得たアミノ化アガロース（セフアロース
4B）１ｇに25％グルタルアルデヒト水溶液１
ml及び水素化シアノホウ素ナトリウム82mgを加
えて、40℃のインキユベーター中で２時間振盪
後、グラスフイルター上で水で充分に洗浄して
アルデヒド活性化アガロースを得た。 このアルデヒド活性化アガロース１ｇに、
ConA100mg及びメチル−α−Ｄ−マンノシド
110mgを溶解した0.2Mリン酸緩衝液（PH7.0）
２mlを加えた後、水素化シアノホウ素ナトリウ
ム24mgを加えて、４℃のインキユベーター中で
２日間振盪した。反応終了後、上清を除き、
0.2Mリン酸緩衝液で充分に洗浄して、ConA結
合アガロースを得た。 (3) リガンド濃度の測定 上清及び洗浄液中の非結合残存ConAの量
を、その28nｍにおける吸収の測定値より算出
することによつて、アガロースに結合した
ConAの量を算出した。尚、対照として、
CNBr法によりアガロースに結合させた酵素
［千畑一郎 外著；“アフイニテイークロマトグ
ラフイー”、40頁、東京、講談社（1976年）］
（対照１）、過ヨウ素酸酸化法により各種多糖に
結合させたBSA［Imuunology第20巻、1061〜
1065頁（1971年）］（対照２）及びヒドラジド誘
導体に結合されたBSA［Bio−chemistry、第８
巻、4074〜4082頁（1969年）］（対照３）を用い
た。結果を第１表に示す。
【表】
表から、本発明の固定化生理活性物質は従来
のものに比し高いリガンド濃度を有することが
わかる。 実施例 ２ (1) 固定化BSAの調製 実施例１(1)と同様に処理することにより得た
アミノ化アガロース（セフアロース4B）１ｇ
（湿重量）に25％グルタルアルデヒド水溶液１
ml及び水素化シアノホウ素ナトリウム82mgを加
えて、40℃のインキユベーター中で２時間振盪
後、グラスフイルター上で水で充分に洗浄して
アルデヒド活性化アガロースを得た。 このアルデヒド活性化アガロース0.5ｇに、
BSA50mgを溶解した0.2Mリン酸緩衝液（PH
7.0）１mlを加えた後、水素化シアノホウ素ナ
トリウム12mgを加えて、37℃のインキユベータ
ー中で一夜振盪した。反応終了後、上清を除
き、0.2Mリン酸緩衝液で充分に洗浄してBSA
結合アガロースを得た。 (2) リガンド濃度の測定 上清及び洗浄液中の非結合残存BSAの量を、
その280nｍにおける吸収の測定値より算出す
ることによつて、アガロースに結合したBSA
の量を算出した。尚、対照としては、実施例１
(3)と同様の対照１〜３を用いた。結果を第２表
に示す。
のものに比し高いリガンド濃度を有することが
わかる。 実施例 ２ (1) 固定化BSAの調製 実施例１(1)と同様に処理することにより得た
アミノ化アガロース（セフアロース4B）１ｇ
（湿重量）に25％グルタルアルデヒド水溶液１
ml及び水素化シアノホウ素ナトリウム82mgを加
えて、40℃のインキユベーター中で２時間振盪
後、グラスフイルター上で水で充分に洗浄して
アルデヒド活性化アガロースを得た。 このアルデヒド活性化アガロース0.5ｇに、
BSA50mgを溶解した0.2Mリン酸緩衝液（PH
7.0）１mlを加えた後、水素化シアノホウ素ナ
トリウム12mgを加えて、37℃のインキユベータ
ー中で一夜振盪した。反応終了後、上清を除
き、0.2Mリン酸緩衝液で充分に洗浄してBSA
結合アガロースを得た。 (2) リガンド濃度の測定 上清及び洗浄液中の非結合残存BSAの量を、
その280nｍにおける吸収の測定値より算出す
ることによつて、アガロースに結合したBSA
の量を算出した。尚、対照としては、実施例１
(3)と同様の対照１〜３を用いた。結果を第２表
に示す。
【表】
表から、本発明の固定化生理活性物質は従来
のものに比し高いリガンド濃度を有することが
わかる。 実施例 ３ (1) アミノ化ポリビニルアルコール樹脂の調製ト
ヨパールHW65F（東ソー(株)製、ポリビニルア
ルコール樹脂）１を水洗後、蒸留水1.5に
懸濁させ、これに2MのNaOH水溶液水溶液
650mlを加えて撹拌し、次いでエピクロルヒド
リンを加えて撹拌しながら37〜40℃で２時間反
応させてエポキシ活性化トヨパールを得た。 次に、エポキシ活性化トヨパールを水洗後、
濃アンモニア水1.5に懸濁させて40℃で１時
間振盪撹拌して反応させた後、反応物を水洗し
てアミノ化トヨパールを得た。 (2) 固定化小麦胚芽レクチン（WGA）の調製 (1)で得たアミノ化トヨパール100ｇに25％グ
ルタルアルデヒド水溶液100ml及び水素化シア
ノホウ素ナトリウム8.2ｇを加えて。40℃で２
時間反応させ、（グルタル）アルデヒドトヨパ
ールを得た。 このアルデヒドトヨパール100mlに、小麦胚
芽レクチン（WGA）10ｇ、0.2Mリン酸緩衝液
及び水素化シアノホウ素ナトリウム2.4ｇを加
えて、30℃で１昼夜振盪撹拌した後、上清を除
き、0.05Mトリス緩衝液で洗浄して、WGA結
合トヨパールを得た。このWGA結合トヨパー
ルは、リン酸緩衝化した生理食塩水（PBS）
に懸濁させて使用することができる。 (3) リガンド濃度の測定 実施例１と同様にして、280nｍにおける吸
収の測定値より算出した結果、トヨパールに結
合したWGAの量は、72mg／mlであつた。 実施例 ４ (1) アミノ化セルロースの調製 市販のセルロース粉末（アダバンテツク社
製、ろ紙粉末100〜200メツシユ）を水洗した
後、脱気して得た湿潤セルロース100ｇに、次
式： で示される１，４−ブタンジオールジグリシジ
ルエーテル100mlを加えて撹拌した。これに水
素化ホウ素ナトリウム0.2ｇ及び2MのNaOH水
溶液水溶液100mlを加え、振盪撹拌して25℃で
８時間反応させてエポキシ活性化セルロースを
得た。次にエポキシ活性化セルロースを濃アン
モニア水150mlに懸濁させて40℃で１時間振盪
撹拌して反応させた後、反応物を水洗してアミ
ノ化セルロースを得た。 (2) 固定化アミラーゼの調製 (1)で得たアミノ化セルロース100ｇに25％グ
ルタルアルデヒド水溶液100ml及び水素化シア
ノホウ素ナトリウム8.2ｇを加えて、40℃で２
時間反応させ、（グルタル）アルデヒドセルロ
ースを得た。 このアルデヒドセルロース10ｇ（湿重量）
に、グルクアミラーゼ（生化学工業(株)製、
Rhizpus nireus Glcoamylase）１ｇ及びマル
トース１ｇを0.2Mリン酸緩衝液（PH7.0）に溶
解した溶液20mlと水素化シアノホウ素ナトリウ
ム0.24ｇとを加え、４℃で２日間振盪撹拌し
た。上清を除き、0.1Mトリス塩酸緩衝液（PH
８）で処理し、さらにリン酸緩衝液で洗浄して
固定化グルクアミラーゼを得た。 (3) リガンド濃度の測定 実施例１と同様にして、280nｍにおける吸
収の測定値より算出した結果、セルロースに結
合したグルクアミラーゼの量は、64mg／mlであ
つた。
のものに比し高いリガンド濃度を有することが
わかる。 実施例 ３ (1) アミノ化ポリビニルアルコール樹脂の調製ト
ヨパールHW65F（東ソー(株)製、ポリビニルア
ルコール樹脂）１を水洗後、蒸留水1.5に
懸濁させ、これに2MのNaOH水溶液水溶液
650mlを加えて撹拌し、次いでエピクロルヒド
リンを加えて撹拌しながら37〜40℃で２時間反
応させてエポキシ活性化トヨパールを得た。 次に、エポキシ活性化トヨパールを水洗後、
濃アンモニア水1.5に懸濁させて40℃で１時
間振盪撹拌して反応させた後、反応物を水洗し
てアミノ化トヨパールを得た。 (2) 固定化小麦胚芽レクチン（WGA）の調製 (1)で得たアミノ化トヨパール100ｇに25％グ
ルタルアルデヒド水溶液100ml及び水素化シア
ノホウ素ナトリウム8.2ｇを加えて。40℃で２
時間反応させ、（グルタル）アルデヒドトヨパ
ールを得た。 このアルデヒドトヨパール100mlに、小麦胚
芽レクチン（WGA）10ｇ、0.2Mリン酸緩衝液
及び水素化シアノホウ素ナトリウム2.4ｇを加
えて、30℃で１昼夜振盪撹拌した後、上清を除
き、0.05Mトリス緩衝液で洗浄して、WGA結
合トヨパールを得た。このWGA結合トヨパー
ルは、リン酸緩衝化した生理食塩水（PBS）
に懸濁させて使用することができる。 (3) リガンド濃度の測定 実施例１と同様にして、280nｍにおける吸
収の測定値より算出した結果、トヨパールに結
合したWGAの量は、72mg／mlであつた。 実施例 ４ (1) アミノ化セルロースの調製 市販のセルロース粉末（アダバンテツク社
製、ろ紙粉末100〜200メツシユ）を水洗した
後、脱気して得た湿潤セルロース100ｇに、次
式： で示される１，４−ブタンジオールジグリシジ
ルエーテル100mlを加えて撹拌した。これに水
素化ホウ素ナトリウム0.2ｇ及び2MのNaOH水
溶液水溶液100mlを加え、振盪撹拌して25℃で
８時間反応させてエポキシ活性化セルロースを
得た。次にエポキシ活性化セルロースを濃アン
モニア水150mlに懸濁させて40℃で１時間振盪
撹拌して反応させた後、反応物を水洗してアミ
ノ化セルロースを得た。 (2) 固定化アミラーゼの調製 (1)で得たアミノ化セルロース100ｇに25％グ
ルタルアルデヒド水溶液100ml及び水素化シア
ノホウ素ナトリウム8.2ｇを加えて、40℃で２
時間反応させ、（グルタル）アルデヒドセルロ
ースを得た。 このアルデヒドセルロース10ｇ（湿重量）
に、グルクアミラーゼ（生化学工業(株)製、
Rhizpus nireus Glcoamylase）１ｇ及びマル
トース１ｇを0.2Mリン酸緩衝液（PH7.0）に溶
解した溶液20mlと水素化シアノホウ素ナトリウ
ム0.24ｇとを加え、４℃で２日間振盪撹拌し
た。上清を除き、0.1Mトリス塩酸緩衝液（PH
８）で処理し、さらにリン酸緩衝液で洗浄して
固定化グルクアミラーゼを得た。 (3) リガンド濃度の測定 実施例１と同様にして、280nｍにおける吸
収の測定値より算出した結果、セルロースに結
合したグルクアミラーゼの量は、64mg／mlであ
つた。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ アミノアルキル基を有する水不溶性多糖類
を、水素化シアノホウ素ナトリウムの存在下にお
いて、次式（）： OHC−（CH2−）o-2CHO （） （式中、ｎは、２〜10の整数を表す） で示される直鎖状ジアルデヒド化合物と反応させ
て、次式（）： OHC−（CH2−）o-1NH−M1 （） （式中、M1−NH−は、アミノアルキル基を有
する水不溶性多糖類残基を表し、ｎは２〜10の整
数を表す） で示されるアルデヒド活性化不溶性高分子を得、
次いでこれを水素化シアノホウ素ナトリウムの存
在下において、アミノ基を有する生理活性物質と
反応させることを特徴とする次式（）： Ｘ−NH−（CH2−）oNH−M1 （） （式中、Ｘ−NH−は、アミノ基を有する生理活
性物質残基を表し、M1−NH−及びｎは、前記
と同じ） で示される固定化生理活性物質の製造法。 ２ 水酸基を有する水不溶性多糖類又はポリビニ
ルアルコール系樹脂をエピハロヒドリン又はビス
オキシランと反応させた後、アンモニアで処理し
て得た次式（）： M2−NH2 （） （式中、M2は、【式】又は を表し、ｍは、水酸基を有する水不溶性多糖類残
基又はポリビニルアルコール系樹脂残基を表し、
Ｐは、２〜８の整数を表す） で示されるアミノ化不溶性高分子に、水素化シア
ノホウ素ナトリウムの存在下において、次式
（）： OHC−（CH2−）o-2CHO （） （式中、ｎは、２〜10の整数を表す） で示される直鎖状ジアルデヒド化合物と反応させ
て、次式（）： OHC−（CH2−）o-1NH−M2 （） （式中、M2−NH−は、前記アミノ化不溶性高
分子残基を表し、ｎは前記と同じ） で示されるアルデヒド活性化不溶性高分子を得、
次いでこれを水素化シアノホウ素ナトリウムの存
在下において、アミノ基を有する生理活性物質と
反応させることを特徴とする次式（）： Ｘ−NH−（CH2−）oNH−M2 （） （式中、Ｘ−NH−はアミノ基を有する生理活性
物質残基を表し、M2−NH−及びｎは、前記と
同じ） で示される固定化生理活性物質の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57075183A JPS58192829A (ja) | 1982-05-07 | 1982-05-07 | 固定化生理活性物質の製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57075183A JPS58192829A (ja) | 1982-05-07 | 1982-05-07 | 固定化生理活性物質の製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS58192829A JPS58192829A (ja) | 1983-11-10 |
| JPH0359080B2 true JPH0359080B2 (ja) | 1991-09-09 |
Family
ID=13568829
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP57075183A Granted JPS58192829A (ja) | 1982-05-07 | 1982-05-07 | 固定化生理活性物質の製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS58192829A (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2018030932A (ja) * | 2016-08-23 | 2018-03-01 | 公益財団法人川崎市産業振興財団 | ポリマー、ポリマーの製造方法、及び薬物複合体 |
| JP7004590B2 (ja) * | 2018-02-22 | 2022-02-04 | 公益財団法人川崎市産業振興財団 | ポリマー、ポリマーの製造方法、薬物複合体及びミセル |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5559A (en) * | 1978-06-14 | 1980-01-05 | Nippi:Kk | Preparation of immobilized bio-active substance |
-
1982
- 1982-05-07 JP JP57075183A patent/JPS58192829A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS58192829A (ja) | 1983-11-10 |
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