JPH0361431B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は固定化増殖微生物を使用して行なわれ
る連続発酵法に関する。さらに詳しくは、少なく
とも２個のリアクタを用いて有用物質を連続発酵
法により生産する際、生産活性の低下した少なく
とも１個のリアクタ中の固定化増殖微生物を再活
性化し、連続生産と再活性化処理を同時に行なう
方法に関する。

固定化増殖微生物を用いてアルコール、有機
酸、アミノ酸、抗生物質、ステロイド、酵素蛋白
質、水素、メタンなどの有用物質を連続発酵法に
より連続生産する方法が研究されている。この方
法は、微生物を天然高分子や合成樹脂などの担体
に固定化した固定化増殖微生物をリアクタに充填
し、これに培地を供給して固定化微生物を増殖さ
せつつ有用物質を連続的に生産させる方法であ
る。この方法によるときは、多量の微生物が固定
できると共に連続的な微生物の増殖と一部の漏洩
による適度の新陳代謝が行なわれるため固定化微
生物数の減少を抑制し高い酵素活性を維持するこ
とができるので、通常の発酵法に比して物質生産
速度が格段に速く、またいわゆるウオツシユアウ
トの惧れもない。したがつて発酵時間を大幅に短
縮することができ、さらにリアクタの小型化、効
率化を図ることができる。

しかし生産が長期間にわたるばあい、培地の栄
養分の不足、生産物による阻害、pHの変化など
によつて固定化微生物の死滅速度が増殖速度を上
廻り、微生物の数が徐々に減少して全体の生産活
性が低下するという現象が生ずる。そのような状
態になつた固定化微生物は、増殖に適した培地で
再度培養すると増殖して生産活性が回復されるこ
とが知られている。

しかし、そうした再活性化処理は連続生産を一
時中断する必要があり生産効率を低下せしめてい
る。

本発明者らは生産を中断することなく再活性化
処理を行なうことのできる方法を開発するべく鋭
意研究を重ねた結果、本発明を完成するに至つ
た。

すなわち本発明は、固定化増殖微生物が充填さ
れている少なくとも２個のリアクタを連結してな
る装置を用いて連続発酵法により有用物質を生産
する際、各リアクタの固定化微生物の生産活性の
低下の度合に応じて、常時少なくとも１個の生産
活性の低下したリアクタの再活性化を行ないなが
ら連続発酵生産を行なうべくリアクタ相互の連結
状態を変更することを特徴とする固定化増殖微生
物による連続発酵法に関する。

このように本発明においては、生産活性の低下
した固定微生物の再活性化処理と連続発酵生産と
が並行して行なわれるので、全体として生産の中
断は生じない。また使用するリアクタの数を増せ
ば、長期間にわたつて定常的に生産物をうること
ができる。

本発明の方法はリアクタを並列に連結した反応
装置にも直列に連結した反応装置にも適用でき
る。またリアクタとしても完全混合槽型、流動層
型、充填搭型など従来のリアクタをそのまま用い
ることができ、培地の流通方法も下降流型、上昇
流型のいずれでもよい。リアクタの個数は通常２
〜10個が適当であるが、リアクタの型や固定化増
殖微生物の種類、供給培地の種類、培地の供給速
度、生産物の種類、反応温度、通気量、撹拌数、
培地のPHなどによつて適正な数にすればよい。

つぎに本発明の方法を多段直列型および多段並
列型の連続発酵装置に適用するばあいの実施態様
を説明するが、本発明はかかる実施態様のみに限
定されるものではない。

多段直列型の連続発酵は、固定化増殖微生物が
充填されている少なくとも２個のリアクタを直列
に連結してなる装置を用い、少なくとも先頭のリ
アクタに生産用培地を連続的に供給して有用物質
を生産する際、所定期間経過後に最終段のリアク
タが先頭のリアクタとなるようにリアクタ相互の
連結状態を順次変更することによつて行なう。

かかる多段直列型の連続発酵法によるときは、
生産活性の低下した最終段のリアクタが所定期間
経過後に順次先頭のリアクタとなるため、死滅化
しつつある固定化微生物を増殖せしめうるだけで
なく、そのリアクタをも連続生産に供することが
できるので、再活性化時のリアクタを遊ばせるこ
となく常時再活性化処理と連続生産を同時に行な
うことができ、有用物質の連続生産を長期間に亘
つて安定かつ効率的に行なうことができる。

たとえばNo.１〜No.ｎのｎ個のリアクタをNo.１の
リアクタが先頭となりNo.ｎのリアクタが最終段と
なるように直列に連結された装置を用い、先頭の
リアクタに生産用培地を供給し最終段のリアクタ
から生産物を取り出すばあい、最終段のリアクタ
（No.ｎ）中の固定化微生物は高濃度の生産物にさ
らされているため徐々に死滅し、その分有用物質
の生産活性が低下する。一方、先頭のリアクタで
は基質をはじめ培地中の栄養源が豊富でありかつ
生産物濃度も低いので、微生物は充分増殖できる
環境にある。そこで最終段のリアクタ（No.ｎ）中
の固定化微生物が弱つて死滅し始める時期に、培
地の供給をNo.１のリアクタからNo.ｎのリアクタに
切り換えてNo.ｎのリアクタを先頭のリアクタと
し、他のリアクタの連結状態も順次１段ずつずら
す、すなわち２段目をNo.１、３段目をNo.２……最
終段をNo.ｎ−１とする。このリアクタ相互の連結
状態の切り換えにより、死滅しつつあつたNo.ｎの
リアクタ中の固定化微生物が再び増殖して生産活
性を取り戻すことができる。この切り換え操作を
繰り返すことにより、連続生産を中断することな
く長期間安定して有用物質を生産することができ
る。

連結状態の切り換え時期は、段数、用いる微生
物の増殖速度と死滅速度、生産活性、培地中の基
質濃度などによつて異なり、生産時の具体的条件
に即して決定すればよい。たとえば用いる微生
物、段数、培地中の基質濃度が定まると、生産中
の最終段のリアクタ内の固定化微生物の個数およ
び（または）反応終了液中の生産物の濃度を検出
して所定のレベル以下になると切り換え操作を行
なうようにしてもよいし、また別途同一条件で予
備実験を行ない、その結果から切り換え時期を設
定してもよい。切り換えは定期的に行なつてもよ
いし、不定期的に行なつてもよい。

段数、すなわちリアクタの個数は２個以上であ
ればとくに制限されないが、段数が多くなるほど
切り換え操作を頻繁に行なわなければならない
が、切り換え直後の反応終了液中の生産物濃度の
低下は少ない。一方、段数が少ないばあいは切り
換え直後の反応終了液中の生産物濃度の低下が大
きいが、切り換えの間隔を長くすることができ
る。

この多段直列型連続発酵法におけるリアクタと
して充填搭型または流動層型リアクタを用いるば
あい、還流管を付設して培地を循環させると完全
混合槽型に近づき、生産効率を高めることができ
る。

リアクタの反応液流出口の下流に、反応流出液
中に含まれる増殖した微生物を吸着保持するため
に、微生物を吸着保持する担体が充填された塾成
槽を設けてもよい。用いる担体としては、たとえ
ばスポンジ、目の細かい金属ネツト、サランネツ
ト、ガラスビーズ、合成樹脂ビーズなどがあげら
れる。熟成槽を設けるときは、流出液から微生物
を除去できるほか、保持された微生物によつて基
質を生産物へさらに転換することもできる。

リアクタには、ばあいによつて微量の空気（酸
素）を通気して微生物の増殖を促進させることも
できる。

つぎに多段直列型連続発酵法を図面にもとづい
て説明する。第１図は１種類の生産用培地を用い
る多段直列型生産装置の概略ブロツク図であり、
Ａ，Ｂ，Ｃはいずれもリアクタであり、それらの
リアクタに生産用培地供給ライン１０が接続され
ており、先行するリアクタの反応液を順次つぎの
リアクタに供給する連結ライン１１により相互に
連結されている。また各リアクタＡ，Ｂ，Ｃには
反応終了液排出ライン１２がそれぞれ開閉弁１３
ａ，１３ｂ，１３ｃを介して接続されている。生
産用培地供給ライン１０と各リアクタＡ，Ｂ，Ｃ
との間には開閉弁１４ａ，１４ｂ，１４ｃが配設
されており、またリアクタＡとＢとの連結ライン
には開閉弁１５ａが、リアクタＢとＣとの連結ラ
インには開閉弁１５ｂが、リアクタＣとＡとの連
結ラインには開閉弁１５ｃがそれぞれ配設されて
いる。

この装置を用い、生産用培地供給ライン１０の
開閉弁１４ａを開け開閉弁１４ｂと１４ｃを閉
じ、連結ライン１１の開閉弁１５ａと１５ｂを開
け開閉弁１５ｃを閉じ、反応終了液排出ライン１
２の開閉弁１３ａと１３ｂを閉じ開閉弁１３ｃを
開けると、生産用培地がリアクタＡに供給されリ
アクタＢを通つてリアクタＣから反応終了液がえ
られる。

このようにリアクタを直列に連結すると、１段
目のリアクタＡでは培地中の栄養源が豊富であつ
て基質濃度も低いため、固定化微生物の増殖が充
分に行なわれる環境にある。一方、最終段のリア
クタＣ中の固定化微生物は高濃度の生産物にさら
されているため微生物の増殖が阻害され、その結
果死滅速度が増殖速度を上廻つて固定化微生物の
数が減少し、生産活性の低下が生ずる。

生産活性が所定のレベルを下廻ると、開閉弁１
３ｃ，１４ａ，１５ｂを閉じ、開閉弁１３ｂ，１
４ｃ，１５ｃを開ければよい。この切り換えによ
りリアクタＣが先頭となり、リアクタＢが最終段
となる。前記のごとく先頭のリアクタ中の固定化
微生物は増殖に適した環境にあり、再活性化され
る。こうした最終段のリアクタを先頭のリアクタ
とする切り換えを順次行なうことにより、固定化
微生物の再活性化を連続生産と同時に行なうこと
ができる。このように多段直列型連続発酵法で
は、とくに再活性化用と増殖用培地を必要とせ
ず、また再活性化状態にある固定化微生物は同時
に生産にも関与しているので、きわめて生産効率
が高くなる。

前記の生産物阻害だけでなく基質阻害も同時に
みられるような発酵では、１段目に低基質濃度の
培地を供給してより一層増殖が促進されるような
環境にし、基質が消費されたのち高基質濃度の培
地を適量ずつ供給する多点培地供給方式を採用す
ればよい。かかる方式に本発明の方法を適用する
ばあいの一実施態様を第２図に基づいて説明す
る。なお、第２図中第１図と同じ符号の部分は第
１図と同じものを示す。

低基質濃度の培地は供給ライン１０から供給さ
れ、高基質濃度の培地は供給ライン１６から供給
される。供給ライン１６は各リアクタＡ，Ｂ，Ｃ
とそれぞれ開閉弁１７ａ，１７ｂ，１７ｃを介し
て連結されている。

生産開始時に低基質濃度培地をリアクタＡに供
給し、高基質濃度培地をリアクタＢに供給し、反
応終了液をリアクタＣから取り出すように各開閉
弁を開閉する。すなわち開閉弁１３ａ，１３ｂ，
１４ｂ，１４ｃ，１５ｃ，１７ａ，１７ｃを閉
じ、開閉弁１３ｃ，１４ａ，１５ａ，１５ｂ，１
７ｂを開く。

リアクタＣ中の固定化微生物の生産活性が所定
のレベル以下になつたとき、リアクタＣを先頭の
リアクタとするべく開閉弁を切り換える。すなわ
ち開閉弁１３ｃ，１４ａ，１５ｂ，１７ｂを閉
じ、開閉弁１３ｂ，１４ｃ，１５ｃ，１７ａを開
く。このような連結状態の変更、すなわち先頭の
リアクタをＡ→Ｃ→Ｂ→Ａ……、２段目のリアク
タをＢ→Ａ→Ｃ→Ｂ……、最終段のリアクタをＣ
→Ｂ→Ａ→Ｃ……とする切り換えを最終段のリア
クタにおける固定化微生物の生産活性の低下の度
合に応じて行なうときは、生産物阻害と基質阻害
が問題となる微生物の再活性化処理を効率的に行
なうことができる。

つぎに本発明の方法を多段並列型連続発酵法に
適用するばあいの一実施例を図面に基づいて説明
する。

第３図に多段並列型の連続発酵装置の概略ブロ
ツク図を示す。Ａ，ＢおよびＣはいずれもリアク
タであり、生産用培地供給ライン２１および反応
液排出ライン２２によつて並列に連結されてい
る。各リアクタＡ，Ｂ，Ｃにはさらに増殖用培地
供給ライン２３が接続されており、また増殖用培
地排出ライン２４も接続されている。生産用培地
供給ライン２１と増殖用培地ライン２３はそれぞ
れ開閉弁２５ａ，２５ｂ，２５ｃおよび２６ａ，
２６ｂ，２６ｃが配設されており、それらによ
り、各リアクタへの培地の供給を任意に切り換え
ることができる。

連続発酵は生産用培地をライン２１からリアク
タＡ，Ｂ，Ｃに供給することにより開始される。
各リアクタ中の固定化微生物はある程度の期間生
産活性を一定レベル以上に維持するが、その後
徐々に生産活性が低下してくる。リアクタ全体ま
たはいずれか１個のリアクタ中の固定化微生物の
生産活性が所定のレベルを下廻つたとき、生産活
性のもつとも低下した固定化微生物が充填された
リアクタを再活性化処理に切り換える。ここで、
そのリアクタがリアクタＡであるとすると、開の
状態になつている開閉弁２５ａ，２５ｂ，２５ｃ
のうち開閉弁２５ａを閉じてリアクタＡへの生産
用培地の供給を停止すると共に、閉の状態となつ
ている開閉弁２６ａ，２６ｂ，２６ｃのうち開閉
弁２６ａを開けてリアクタＡに増殖用培地を供給
し、リアクタＡ中の固定化微生物の再活性を行な
う。増殖用培地排液はライン２４から排出され
る。この状態において、リアクタＢ，Ｃはそのま
ま連続生産に用いられている。

リアクタＡ中の固定化微生物の再活性化処理が
終了すると、開閉弁２６ａを閉じ開閉弁２５ａを
開けて生産を再開する。一方、その時点で生産活
性が低下しているリアクタ、たとえばリアクタＢ
の開閉弁２５ｂを閉じ開閉弁２６ｂに開けてリア
クタＢを再活性化処理する。

このように生産用培地供給ライン２１の開閉弁
２５ａ，２５ｂ，２５ｃと増殖用培地供給ライン
２３の開閉弁２６ａ，２６ｂ，２６ｃをリアクタ
中の固定化微生物の生産活性の低下の度合に応じ
て開閉し、常に少なくとも１個のリアクタを順次
再活性化処理し残りのリアクタを連続生産に供す
ることにより、安定でかつ長期間の連続生産が可
能となる。

増殖用培地は用いる固定化微生物によつて異な
り、その微生物の増殖に最適の条件の培地を選定
すればよい。そのような条件としては、たとえば
栄養成分濃度、溶存酸素濃度、PH、温度などがあ
げられる。

連続生産から再活性化処理およびその逆の切り
換えは、固定化微生物の数および（または）生成
物濃度を測定することによつて行なえばよい。生
産活性の度合は用いる固定化微生物の種類、供給
培地の種類、培地の供給速度、生産物の種類、反
応温度、通気量、撹拌数、培地のPHなどによつて
異なり、それぞれ具体的な系において適宜切り換
えの時期を設定すればよい。また予備実験によつ
て最適の切り換え時期を決め、その切り換え間隔
で定期的または不定期的に各リアクタの再活性化
を順次行なつてもよい。

本発明の方法において使用されうる固定化微生
物としては、連続発酵に使用できるものであれば
いずれも採用できる。好ましい固定化増殖微生物
としては、たとえば寒天ゲル、カラギーナンゲ
ル、フアーセレランゲルなどの硫酸根含有多糖類
ゲル、アルギン酸アルカリ土類金属塩ゲル（たと
えばアルギン酸カルシウム）、ポリビニルアルコ
ールゲル、ポリアクリル酸アミドゲル（たとえば
Ｎ、N′−低級アルキレン−ビス（アクリルアミ
ド）、ビス（アクリルアミドメチル）エーテルお
よびアクリルアミドから選ばれる１〜２種のモノ
マーの重合体または共重合体）、セルロースサク
シネートゲル、カゼインゲルなどのゲル担体に包
括された各種微生物があげられ、とりわけカラギ
ーナンゲルまたはアルギン酸カルシウムゲルに包
括されたものが好適である。ゲル内に包括される
微生物の量はとくに制限されないが、一般的には
ゲル100ｇ（湿重量）に対して0.01〜10白金耳相
当量であるのが好ましく、またゲルの形状は厚さ
１mm〜５cmの粒状、立方体状、糸状または膜状に
成形したものが好ましい。

これら固定化増殖微生物の調製法としては、従
来公知の方法を採用することができ、たとえ硫酸
根含有多糖類ゲルおよびアルギン酸塩固定化微生
物は特公昭56−29516〜７号および特公昭57−
18867号公報に記載されている方法により、ポリ
ビニルアルコールゲルはPaper at 5thInt.
Ferment.Symp.Berlin（1976）に記載されている
方法により、アクリルアミドゲル固定化微生物は
たとえば特公昭53−1831号公報、Appl.
Microbiol.27、878（1974）などに記載されている
方法により、またセルロースサクシネートゲルま
たはカゼインゲル固定化微生物はJ.Solid−Phase
Biochem.２、225（1977）に記載されている方に
よつて好適に調製することができる。本発明にお
いて用いる生産用培地および（または）増殖用培
地としては、微生物の生育に必要な栄養源と基質
とを含むものであればとくに制限はなく、それ自
体公知の炭素源、窒素源、無機質、ビタミンを使
用する微生物の種類に応じ適宜組合せて用いれば
よい。

つぎに本発明の方法を実施例をあげて説明する
が、本発明はかかる実施例のみに限定されるもの
ではない。

なお、各実施例において用いるリアクタを特定
するため、便宜的に最初の連結状態における先頭
のリアクタをNo.１とし、以下No.２、No.３……No.ｎ
と番号を付してある。

実施例 １ 70ml容の充填搭型リアクタ（直径４cm、高さ
5.5cmの円筒形）を２個直列（連結状態は第１図
参照）に連結した多段直列型エタノール生産装置
を用いてエタノールを連続生産した。

固定化微生物としては、協会７号酵母の一白金
耳を37℃にて５％カラギーナン水溶液100mlに加
えて混合し、この混合液を２％塩化カリウム水溶
液500ml中にノズルから滴下して直径４mmの球状
ゲルとしたものを用いた。

この球状ゲル20mlを２個のリアクタにそれぞれ
充填し、10％の還元糖を含む糖蜜水溶液（PH5.0）
を30℃にて40ml／hrの流速で48時間供給して予備
増殖を行なつた。その間空気を４／hrの流速で
通気した。

予備増殖後２個のリアクタを直列に連結し、先
頭のリアクタ（No.１）の20％の還元糖を含む糖蜜
水溶液（PH5.0）を30℃、13ml／hrの流速で供給
し、No.２のリアクタから反応終了液をえた。生産
開始５日後にリアクタの連結状態を切り換え、No.
２のリアクタに糖蜜水溶液を供給し、No.１のリア
クタから反応終了液をえた。この切り換えを５日
毎に繰り返したところ、80〜85mg／mlのエタノー
ル濃度の反応終了液が３カ月以上安定してえられ
た。

なお、各カラムは300ml／hrの流速で反応液を
還流させた。

切り換え時期は、予備実験の結果から約１週間
で80mg／ml以下になることがわかつたので、余裕
をみて５日を基準として決定した。

実施例 ２ 70ml容の流動層型リアクタ（下底3.2cm、上底
4.8cm、高さ5.5cmの逆円錐形）を４個直列に連結
した装置（連結状態は第２図参照）を用いエタノ
ールを連続生産した。固定化微生物は実施例１と
同じものを用い、各リアクタに20mlずつ充填して
実施例１と同様に予備増殖したのち４個にリアク
タを直列に連結した。

培地の供給は、先頭のリアクタに10％還元糖を
含む糖蜜水溶液（PH5.0）を20ml／hrの流速で供
給し、２段目のリアクタに40％の還元糖を含む糖
蜜水溶液（PH5.0）を５ml／hrの流速で供給し、
４段目のリアクタから反応終了液をうるという多
点培地供給方式を採用した。なお、先頭のリアク
タと２段目のリアクタは300ml／hrの流速で反応
液を還流させた。

リアクタの連結状態を２日毎にNo.１（先頭）→
No.２→No.３→No.４、No.４（先頭）→No.１→No.２→
No.３、No.３（先頭）→No.４→No.１→No.２、……の
ように切り換えたところ、反応温度30℃で80〜85
mg／mlのエタノール濃度の反応終了液が４段目の
リアクタから３カ月以上安定してえられた。

なお、切り換え時期は、予備実験の結果から最
後段のリアクタ中の固定化微生物の生菌数が低下
しない限度である２日を基準にして決定した。

なお、この実施例において、切り換えを行なわ
なかつたばあい、エタノール温度は１週間で75
mg／ml、２週間で70mg／ml、１カ月で40mg／mlに
まで低下した。

実施例 ３ 実施例２と同型の流動層型リアクタを４個用い
たほかは実施例１と同様にして固定化微生物の調
製、予備増殖およびリアクタの連結を行なつた。

培地の供給は、先頭のリアクタのみに20％の還
元糖を含む糖蜜水溶液（PH5.0）を30％にて25
ml／hrの流速で供給することにより行ない、４段
目から反応終了液をえた。

リアクタの連結状態の切り換えは、実施例２の
要領で１日毎に行なつた。また先頭のリアクタの
みに250ml／hrで空気を供給した。

その結果、80〜85mg／mlのエタノール濃度の反
応終了液が３カ月以上安定してえられた。

なお、切り換え時期は予備実験の結果から最後
段のリアクタ中の固定化微生物の生菌数が低下し
ない限度である１日を基準として決定した。

実施例 ４ 実施例１と同様にして調製した協会７号酵母が
固定化されたカラギーナンゲル10mlをサランネツ
トのカゴに入れ、これを30ml容の完全混合槽型リ
アクタ（直径３cm、高さ4.2cmの円筒形）８個に
それぞれ充填した。各リアクタに10％の還元糖を
含む糖蜜水溶液（PH5.0）を30℃、20ml／hrの流
速で48時間供給し、マグネテイツクスターラーで
撹拌しつつ予備増殖を行なつた。

予備増殖後８個のリアクタを直列に連結し（連
結状態は第２図参照）、先頭のリアクタに15％の
還元糖を含む糖蜜水溶液（PH5.0）を12ml／hrで、
２段目および３段目に40％の還元糖を含む糖蜜水
溶液（PH5.0）を1.1ml／hrで、さらに４段目およ
び５段目に40％の還元糖を含む糖蜜水溶液（PH
5.0）を2.2ml／hrで供給した。

リアクタ相互の連結状態を１日毎に最終段のリ
アクタが先頭のリアクタになるように切り換えた
ところ、反応温度27℃にて95〜100mg／mlのエタ
ノール濃度の反応終了液が３カ月以上安定してえ
られた。

なお、切り換え時期は予備実験の結果から１〜
２日で95mg／ml以下になることがわかつたので１
日を基準として決定した。

実施例 ５ 協会７号酵母をグルコース２％、ペプトン0.5
％、酵母エキス0.3％、マルトエキスを含みPH5.0
調整された培地２中で30℃にて24時間前培養し
た。えられた前培養液を５％カラギーナン水溶液
20を43〜44℃にて混合し、この混合液を２％塩
化カリウム水溶液100中へノズルから適下して
直径４mmの球状ゲルを調製した。この操作を繰り
返してえられたゲルを200ずつ700容の充填搭
型チアクタ（直径0.7ｍ、高さ1.8ｍの円筒形）２
個にそれぞれ充填し、15％の還元糖を含む糖蜜水
溶液（PH5.0）を27℃、150／hrの流速で48時間
供給すると共に空気を1.5Kl／hrで通気し、反応
液を200／hrで還流させて予備増殖を行なつた。

予備増殖後２個のリアクタを直列（第１図参
照）に連結し、先頭のリアクタに0.1％の
（NH₄）₂SO₄および19％の還元糖を含む糖蜜水溶
液（PH5.0）を27℃、150／hrの流速で供給し
た。また先頭のリアクタには7.5Kl／hr、２段目
のリアクタには1.5Kl／hrで空気を通気し、各リ
アクタにおいて反応液を200／hrで還流させた。
なお反応終了後の流出口の下流に、10cm角のウレ
タンスポンジ200が充填された700容の熟成槽
を設けた。

リアクタ相互の連結状態を１〜３日毎に切り換
えたところ、反応温度27℃で80mg／mlのエタノー
ル濃度の反応終了液が３カ月以上安定してえられ
た。

なお、切り換え時期は予備実験の結果から流出
液中のエタノール濃度および固定化微生物の生菌
数の低下に応じて１〜３日を基準として決定し
た。

実施例 ６ 第３図に示す３個のリアクタを並列に連結した
連続発酵装置を用いてＬ−アルギニンを連続生産
した。リアクタとしては70ml容の気泡搭型リアク
タ（下底3.2cmφ、上底4.8cmφ、高さ5.5cmの逆円
錐形）を用いた。

固定化微生物としては、セラチア・マルセツセ
スAT−531（微工研菌寄第6051号）の一白金耳を
40℃で３％カラギーナン水溶液100mlに加えて混
合し、この混合液を２％塩化カリウム水溶液500
ml中にノズルから滴下して直径４mmの球状ゲルと
したものを用い、球状ゲル20mlを各リアクタに充
填した。

各リアクタ10／hrで酸素ガスを通気しつつ、
予備増殖を３個のリアクタに遮糖３％、フマール
酸アンモニウム１％、尿素0.3％、酵母エキス0.1
％、コーンステイープリカー0.1％、リン酸二カ
リウム0.1％、硫酸マグネシウム0.035％を含む増
殖用培地（PH7.0）を30℃にて15ml／hrの流速で
24時間供給することにより行なつた。

ついで開閉弁を切り換えてリアクタＡにはその
まま増殖用培地を供給し、リアクタＢ，Ｃには遮
糖５％、フマール酸アンモニウム２％、尿素1.5
％、酵母エキス0.1％、コーンステイープリカー
0.1％、リン酸二カリウム0.1％、硫酸マグネシウ
ム0.035％を含む生産用培地（PH7.0）を30℃にて
７ml／hrの流速で24時間供給した。24時間後に開
閉弁を切り換えてリアクタＢに増殖用培地を、リ
アクタＡ，Ｃに生産用培地を供給した。各リアク
タには10／hrで酸素ガスを通気した。以後48時
間毎に開閉弁を切り換え、増殖用培地をＣ→Ａ→
Ｂの順で供給して再活性化処理を行なつた。その
結果、生産用培地を14ml／hrの速度で供給するこ
とによつて10mg／mlのＬ−アルギニンが１カ月間
安定してえられた。

なお、再活性化処理への切り換えの時期は、予
備実験の結果から反応終了液中のＬ−アルギニン
の量が10mg／ml以下になつたときを基準とした。

実施例 ７ 70ml容の充填搭型リアクタ（直径４cm、高さ
5.5cmの円筒形）を５個直列（連結状態は第２図
参照）に連結した多段直列型連続発酵装置を用い
てエタノールを連続生産した。

固定化微生物としては、協会７号酵母の一白金
耳を37℃で２％アルギン酸ナトリウム水溶液100
mlに加えて混合し、この混合液を0.1M塩化カル
シウム水溶液500ml中にノズルから滴下して直径
１〜３mmの球状ゲルとしたものを用いた。

この球状ゲル20mlを５個の充填搭型リアクタに
それぞれ充填し、10％の還元糖を含む糖蜜水溶液
（PH5.0）を30℃にて40ml／hrの流速で48時間供給
して予備増殖を行なつたのちリアクタを直列に連
結した。

ついで先頭のリアクタには10％の還元糖を含む
糖蜜水溶液（PH5.0）を24ml／hrの流速で供給し、
２段目および３段目のリアクタにはそれぞれ40％
の還元糖を含む糖蜜水溶液（PH5.0）を３ml／hr
の流速で供給し、５段目のリアクタから反応終了
液をえた。

リアクタの連結状態の切り換えは、24時間毎に
つぎのように行なつた。すなわち５個のリアクタ
番号をNo.１〜No.５とすると、最初の連結はNo.１
（１段目）→No.２→No.３→No.４→No.５であり、つ
いでNo.５（１段目）→No.１→No.２→No.３→No.４、
No.４（１段目）→No.５→No.１→No.２→No.３……と
変更した。

その結果、反応温度30℃で80〜85mg／mlのエタ
ノールが３カ月以上安定してえられた。

なお切り換え時期は、予備実験の結果から、エ
タノール濃度が80mg／ml以下にならないように設
定した。

なお、切り換えを行なわなかつたばあい、エタ
ノール濃度は１週間後に75mg／ml、２週間後に70
mg／mlにまで低下し、１カ月後では40mg／ml以下
になつた。

実施例 ８ 実施例７に用いたリアクタと同型の充填搭型リ
アクタ４個を第１図に示すような連結状態で直列
に連結した直列型連続発酵装置を用い、Ｌ−乳酸
を連続生産した。

固定化微生物としては、ストレプトコツカス・
ラクテイスAHU1192の一白金耳を40℃で５％カ
ラギーナン水溶液100mlに加えて混合し、この混
合液を２％塩化ナトリウム水溶液500ml中にノズ
ルから滴下して直径４mmの球状ゲルとしたものを
用い、各リアクタに20mlずつ充填した。

予備増殖は、乳糖３％、酵母エキス２％、ペプ
トン１％およびリン酸二カリウム0.5％を含む培
地（PH7.0）を37℃にて15ml／hrの流速で72時間
供給することによつて行なつた。

ついで直列に連結した４個のリアクタ（No.１〜
No.４）のうちNo.１（１段目）のリアクタに前記培
地を45℃にて７ml／hrの流速で供給し、No.５（４
段目）リアクタから反応終了液をえた。以後24時
間毎につぎのようにリアクタ相互の連結を切り換
えた。すなわちNo.４（１段目）→No.１→No.２→No.
３、No.３（１段目）→No.４→No.１→No.２、……。

その結果、反応温度45℃で20〜25mg／mlのＬ−
乳酸が１カ月以上安定してえられた。

なお切り換え時期は、予備実験の結果から、反
応流出液の乳酸が20mg／ml以下にならないように
設定した。

【図面の簡単な説明】

第１〜３図はいずれも本発明の方法を実施する
ために用いる連続発酵装置の実施態様の概略ブロ
ツク図である。 （図面の主要符号）、１０，２１：生産用培地
供給ライン、１１：連結ライン、１２，２２：反
応終了液排出ライン、１６：高基質濃度培地供給
ライン、２３：増殖用培地供給ライン、２４：増
殖用培地排出ライン、Ａ，Ｂ，Ｃ：リアクタ。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 固定化増殖微生物を用いる連続発酵法により
   有用物質を２個以上のリアクタを使用して生産す
   る際、各リアクタの固定化微生物の生産活性の低
   下の度合に応じて常時少なくとも１個の生産活性
   の低下したリアクタの再活性を行ないながら連続
   発酵生産を行なうべくリアクタ相互の連結状態を
   変更することを特徴とする固定化増殖微生物によ
   る連続発酵法。 ２ 固定化増殖微生物が充填されている少なくと
   も２個のリアクタを直列に連結し、少なくとも先
   頭のリアクタに生産用培地が連続的に供給される
   ようにしてなる装置を用い、かつ所定期間経過後
   に最終段のリアクタが先頭のリアクタとなるよう
   にリアクタ相互の連結状態を順次変更することを
   特徴とする特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３ 培地を少なくとも２個のリアクタに供給する
   特許請求の範囲第１項記載の方法。 ４ リアクタが充填塔型、流動層型または完全混
   合槽型リアクタである特許請求の範囲第１項記載
   の方法。 ５ リアクタの反応液の流出口の下流に微生物を
   吸着保持可能な担体が充填されている熟成槽が設
   けられてなる特許請求の範囲第１項記載の方法。 ６ 生産活性の低下の度合が固定化増殖微生物の
   死滅速度を基準として決定される特許請求の範囲
   第１項記載の方法。 ７ 生産活性の低下の度合が生成物の濃度を基準
   として決定される特許請求の範囲第１項記載の方
   法。