JPS6013675B2 - 固定化細菌を用いる高濃度エタノ−ルの製法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はゲル状担体に固定化したエタノール生成能を有
するザィモモナス属細菌（以下、単に固定化細菌と称す
る。

）を用いる高濃度エタノールの製法に関し、更に詳しく
は固定化細菌を、該ゲル内で増殖するに必要な栄養素と
エタノール生成原料となる発酵性糖とを含有する培地に
接触反応させることよりなる高濃度エタノールの製法で
ある。古来よりエタノールは酵母を用いて発酵法で生産
されている。

しかし、その生産は回分操作で行なわれ、２０〜４畑時
間の発酵で５０〜７０雌′の‘のェタ／ールを含有する
培養液が得られるけれども、高濃度にエタノールを生産
するには１ケ月以上の発酵時間を要する。しかも回分操
作で発酵を終了した後、酵母を回収し再使用するには多
大の労力と費用を要し経済的にも有利な方法ではなかっ
た。近年、固定化微生物を用いる有用な物質を生産する
方法が開発され、例えば酵母をアルギン酸カルシウムゲ
ルに固定化し、園定イ協酵母が持っている複雑な酵素系
を利用してグルコースからエタノールを生産し得ること
も報告されている。（Ｂｉｏにｃｈ．ＢｉＭｎｇへ １
９斑７（’ ７７））しかし、固定イ○酵母が示すエタ
ノールの生成館が低く、長時間の反応で最大５０雌／凧
【程度のエタノールが生産される程度であって、その生
産性は低く、酵母菌体の増殖に必要な栄養素を含まず、
エタノール原料のグルコースとゲル保型のための塩化カ
ルシウムとのみ含有する溶液と接触反応させているため
酵素の活性が反応時間の経過に伴って急速に低下すると
いう難点があった。

先に、本発明者等は、ゲル担体内に微生物菌体層を濃密
に滞留せしめることにより微生物が持っている複雑な酵
素系が有効に利用できる新しい固定化微生物の調製法を
完成した（特顔昭５３−４１４７１号）。本発明者等は
、この固定化微生物の調製法でエタノール生成能を有す
るザィモモナス属細菌を固定化して得られる固定化細菌
は通常の発酵法による場合の約１の苔以上のエタノール
生産性を示すこと（例えば５０の９′の【程度の濃度の
エタノールは約４５分間程度の反応で生産されること）
。

また、該固定化細菌に１００の９／机程度の発酵性糖お
よび菌体の増殖に必要な栄養素を含有する栄養塔地を供
給すると反応の進行に伴って発酵性糖の濃度が低下して
くるが、その濃度が例えば１０雌／泌以下となった時点
で高濃度の発酵性糖を含有する栄養塔地を追加供給する
ようにすれば、固定化細菌はその性能が低下することな
く高濃度エタノールを効率よく生成する能力を発現する
こと、また更に固定化細菌に菌体増殖に必要な栄養素を
含有する新鮮な培地を加え、上記同機に反応を行なうよ
うにすれば固定化細菌の性能を長期間保持し得ること、
従ってこれらの操作を繰返し行なうことにより約２００
の９／叫にも達する高濃度エタノールを安定して生産し
得ることを見出した。即ち、本発明によればゲル状担体
に固定化したエタノール生成能を有するザイモモナス属
細菌を発酵性糖約５０〜１００の９／叫および細菌の増
殖に必要な栄養素を含有する培地と接触反応させ、該反
応液中の発酵性糖濃度が初期濃度の約２０％以下に低下
した段階で、更に約１００の夕／の‘以上の糖を含有す
る新鮮な栄養培地を連続的に又は間けつ的に補給３する
ことにより高濃度にエタノールを製することができる。

本発明において、エタノール生産能を有するザィモモナ
ス属細菌としてはエタノール生成能が強力であるザィモ
モナス属細菌、例えばザィモモナチス・モピリスＩＦ○
１３７５６、ザイモモナス・アンアェロビアＡＴＣＣ２
９５０１等を好適に用いることができる。

上寿記エタノール生成能を有するザィモモナス属細菌の
固定化は通常文献公３印の微生物菌体の固定化法（例え
ばカラギーナンゲル法、ポリアクリルアミドゲル法等）
によって行なうことができるが「とりわけ、侍磯昭５３
一４１４７１号明細書に記載夕 されている固定化微生
物の調製法に従って行なうのが好ましい。

同特許出願の方法による固定化細菌は、あらかじめゲル
１００夕（緑重量）に対して０．０ｉ〜１０白金耳に相
当する細菌生菌体を含み、かつ厚さ２側〜５肌の粒状も
しくは膜状に成形せる０ゲルを公知のゲル包括法によっ
て調製し、ついで該ゲルを該細菌の生育に適した栄養培
地中で２５ｑ０〜４０℃でインキュベートしてゲル内に
濃密な生菌体を滞留せしめることにより調製される。こ
こでゲル基剤としては例えば、寒天、カラギーナン、タ
フアーセレラン、アルギン酸ソーダ、ポリビニルアルコ
ール、セルロースサクシネート、カゼインサクシネート
、２−メチル一５−ピリジン、メチルアクリレート・メ
タクリル酸共重合体などを用いることができる。０ 本
発明の高濃度エタノールの製造は、回分法によってもま
たカラムを用いる連続法によっても実施することができ
る。

回分法による場合、まず例えば酵母エキス、コーンステ
イープリカー、ベプトソ、イーストエキタスの如き有機
窒素源、ビタミン源、アンモニウム塩、リン酸塩、有機
酸、マグネシウム塩、カルシウム塩、ナトリウム塩、カ
リウム塩等の細菌がゲル内で増殖するに必要な栄養素を
含有する培地を調製し、これに例えばグルコース、糖密
等の発酵０性糖を培地に対して約１０％つまり１００の
９／の‘程度添加し、発酵性糖を含有する栄養培地を調
製する。

この培地に上記固定化細菌を加え、かくはん下に接触反
応させればすみやかに発酵性糖が資化されてエタノール
が生成し同時に反応液中の糖濃度が夕低下してくる。そ
してその糖濃度が例えば初期濃度の約２０％程度以下、
好ましくは約１０の９／私以下となった時点で発酵性糖
を補給すれば、発酵性糖は上記同様に資化されてエタノ
ールが生成し、同時に反応液中の糖濃度は再び低下して
くる。この０ように反応液中の糖濃度が低下した時点で
発酵性糖を補給していくようにすれば、最高２００側／
叫程度の高濃度エタノールを生産することができる。上
記において反応液に追加補給する発酵性糖は、１００の
９′私程度以上の高濃度に発酵性糖を含有する栄養培地
とするのが好ましく、補給のたびごとに補給塔地中の糖
濃度を連続的または間欠的に増加させ、約１００〜４０
０の９／机【程度となるようにしていけばよい。また連
続法による場合、固定化細菌を充填したカラムを用い最
初１００の９／舷程度の発酵性糖を含んだ栄養培地をカ
ラムの一端から連続的に供給し、カラム内で固定化細菌
によるエタノールの生成を行なわせ、カラムの池端から
反応終了液を流出させる。

この場合、流出液中の発酵性糖の濃度が初Ｚ期濃度の約
２０％程度以下、好ましくは約１０犯９′の【以下とな
るように培地の供給速度を調整し、かつ経時的に供給す
る培地中の発酵性糖濃度を増していけば固定化細菌は長
時間効率よくエタノールを生産する能力を発現するので
最大２００のｃ′の‘の高濃Ｚ度にエタノールを長期間
安定して生産することができる。また数段のカラムを直
列につなぐかあるいは長いカラムを用い、カラムの途中
あるいは各カラムの中間において発酵性糖の濃度が前記
初期濃度の２０％以下、好ましくは約１０ｍｏ′の【以
下とな２るように培地の供給速度を調節し、それらの糖
濃度低下個所に前記発酵性糖含有栄養塔地を供給してい
けば、高濃度エタノールの単位時間当りの生産能力を増
大させ得るから高濃度エタノールをより一層効率よく連
続的に生産することができる。２尚、本明細書中、糖濃
度はすべてグルコースに換算した数値で示した。

また、以下の実施例において固定化細菌のエタノール生
成能は、生産されるエタノール量から求めた。実施例
１ ３ザイモモナス・
モビリスＩＦＯ１３７５６の１白金耳を３７００で滅菌
処理したカラギーナン水溶液２０肌に加えて混合した。

この混合液を２％塩化カリウム水溶液２００必中にノズ
ルから滴下して直径４側の球状ゲルにした。
３このゲル固定化細菌を酵母エキス
０．１５％、塩化アンモニウム０．２５％、リン酸水素
２カリウム０．５５％、硫酸マグネシウム、７水和物０
．０２５％、塩化カルシウム０．００１％、クエン酸０
．１％および塩化ナトリウム０．２５％を含み、ｐＨ６
．８に調整した栄養培４地（以下、単に堵地と略す）に
グルコースを濃度１０％となるように加え含有させたも
の５００の‘中、３０００で窒素ガスをゆるやかに供給
しながら９餌時間静瞳しゲル内で細菌菌体を増殖させた
。かくして得られた固定化細菌は７７の９エタノール／
ゲル／ｈｒのエタノール生成館を発現した。次いでこの
固定化細菌２０肌をグルコース１０％含有せしめた培地
２０地中、３『０で静層し、４粉ご後に反応液中のグル
コース残量が２雌／泌となった時点で、グルコースを４
０％含有めしめた塔地１０の‘を補充し同条件で反応を
続けた。

その結果、固定化細菌の性能は低下せず、総反応時間２
．０時間後に１００雌′の‘の高濃度エタノールを３０
の【生産することができた。実施例 ２ 実施例１の如くして調製した固定化細菌の２０の‘をグ
ルコース１０％を含有せしめた培地２０の【中、３０℃
で４０分反応させ反応液中のグルコース濃度を２Ｍ′の
‘とした。

次いでこの反応液にグルコース４０％を含有せしめた培
地５の【を補充し以後同条件下４０分毎にこの補充を３
回線返した。その結果、固定化細菌は７７の９エタノー
ル／ゲル舷【／ｈてのエタノール生成館を維持し、総反
応時間３時間２０分後で１２５雌／舷のエタノール溶液
４０の‘を得た。

実施例 ３ 実施例２と同じ操作を行なった後、固定化細菌を回収し
、実施例２と同様にしてエタノールの生産を繰返した。

１０回線返しても固定化細菌のエタノール生成能は低下
せず反応時間３時間２０分毎に１２５のｏ′の【のエタ
ノール溶液４０叫を得た。実施例 ４実施例１と同様に
して得た固定化細菌２０の‘を円柱状カラム（容量３０
凧‘）に入れ、３０００で先ず３０の【′ｈｒの速度で
グルコース１０％を含有せしめた堵地を９畑時間供給処
理した固定化酵母を入れた円柱状カラム３本論製した後
、このカラムを直列に接続し、最下段のカラムから上方
にＮｏ．１、Ｎｏ．２、Ｎｏ．３とする（装置は第１図
参照）。

Ｎｏ．１のカラムの下からグルコース１０％を含有せし
めた培地を３０泌／ｈｒの速度で供聯合し、Ｎｏ．２の
カラムにはＮＯ．１からの流出液をそのまま供給すると
共にグルコース４０％を含有せしめた培地をも７泌′ｈ
ｒの速度で流出液と合せて供給する。Ｎｏ．３のカラム
にはＮＯ．２からの流出液をそのまま供給すると共にグ
ルコース４０％を含有せしめた培地をも７の【／ｈｒの
速度で供給する。かくしてＮｏ．３のカラムからはエタ
ノールを１００の９′の‘の濃度で含む反応液が４４机
‘′ｈｒの速度で連続して得られた。実施例 ５ 実施例２において、グルコースを含有せしめた培地に代
えて２０％の糖蜜水溶液（グルコース換算濃度：１００
の９′の【）を用い、以下実施例２と同様にして糠蜜濃
度を６０％まで傾斜的に上昇させて反応させることによ
り、総反応時間３時間で１２５の９／泌のエタノール溶
液４０の‘を得た。

実施例 ６ 実施例１と同様して得た固定化細菌２５の乙をカラム途
中からカラムの下機に反応液の１部を循環させる還流管
を設けてある円柱状カラム（装置は第２図参照）に入れ
、３０ｑＣでグルコースの代りに２０％の糠蜜水溶液（
グルコース換算濃度：１００の９′泌）をカラムの下端
から４０の‘ノｈｒの速度で９独特間供給して固定化細
菌を遊動させ、上端より同じ速度で反応終了液を流出さ
せた。

次いで５０％糖蜜水溶液（グルコース換算濃度：２５０
の９／の‘）を１５の上／ｈｒの速度で供給すると共に
、カラム内の反応液の一部を１００の【／ｈｒの速度で
循環させた。循環液中のグルコース換算糖蜜濃度は１０
の９／奴以下に低下した。供給培地中の糖蜜はこの循環
操作による希釈されるためカラム内の固定化細菌のエタ
ノール先成能は低下せず、１２５の９／舷のエタノール
含有流出液を連続生産できた。

【図面の簡単な説明】

第１図は円柱状カラムを用いる場合、第２図は還流管を
有する円柱状カラムを用いる場合の各エタノールの製造
装置の略図を示す。 第１〜２図において、１，２および３は固定化細菌を充
填せるカラム、４，５および６は高濃度発酵性糖含有※
養培地の供給口、７は反応終了液の流出口、８は反応液
を循環させる還流管をそれぞれ示す。弟２図器ｉ図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ ゲル状担体に固定化したエタノール生成能を有する
   ザイモモナス属細菌を、発酵性糖約５０〜１００ｍｇ／
   ｍｌおよび細菌の増殖に必要な栄養素を含有する培地と
   接触反応させ、該反応液中の発酵性糖濃度が初期濃度の
   約２０％以下に低下した段階で、更に約１００ｍｇ／ｍ
   ｌ以上の糖を含有する新鮮な栄養培地を連続的に又は間
   けつ的に補給することを特徴とする高濃度エタノールの
   製法。 ２ 補給する培地中の発酵性糖の濃度を連続的に又は間
   けつ的に増加させながら培地を固定化ザイモモナス属細
   菌と接触反応させる特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３ 固定化ザイモモナス属細菌を充填したカラムに培地
   を連続的に供給することによって固定化ザイモモナス属
   細菌と培地とを接触反応させるに際し、反応終了液中の
   発酵性糖濃度が初期濃度の２０％以下の低濃度となるよ
   うに培地の補給速度を調整する特許請求の範囲第１項又
   は第２項記載の製法。