JPH0361437B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明はＬ−スレオ−β−ヒドロキシアスパラ
ギン酸の製造法に関する。Ｌ−スレオ−β−ヒド
ロキシアスパラギン酸はそれ自体抗菌活性を有す
る。即ちバチルス・ズブチリス（Bacillus
subtilis）、キサントモナス・オリゼ
（Xanthomonas oryzae）、ミコバクテリウム・
フレイ（Mycobacterium phlei）及びボトリテ
イス・シネリ（Botrytis cinerea）等の細菌に有
効であることが知られている（参考文献1.
Ishiyama 等、Journal of Antibiotics、23巻、
821頁、1975年）。 一方、本物質は生体で重要な役割を演ずるアミ
ノ酸の一種であるＬ−アスパラギン酸の類縁体と
見做すことが出来、生体酵素系に関与して重要な
生理活性を有することが知られている。例えばＬ
−アスパルテートβ−デカ−ボキシラーゼ（Ｌ−
Aspartate β−decarboxylase）の阻害剤である
ことが知られている（参考文献2.E.W.Miles and
A.Meister、Biochemistry ６巻、1734頁、1967
年）。また、脳の興奮刺激剤アミノ酸であるＮ−
メチル−Ｄ−アスパラギン酸の大脳皮質での吸収
をＬ−スレオ−β−ヒドロキシアスパラギン酸が
抑制することを報告されている（参考文献3.J.H.
Skerritt andG.A.R.Johnston、Journal of
Neurochemistry、36巻、881頁、1981年）。 以上の如く、Ｌ−スレオ−β−ヒドロキシアス
パラギン酸は抗菌剤並びに生理活性物質としてそ
れ自体有用であるのみならず、一種のアミノ酸と
して安価に供給出来れば医薬やその他工業的に有
用な化合物の合成原料または素材として用いられ
る可能性が高い。 本物質の製造に当つては動植物体から抽出精製
する方法は可能であるが、原料の制限及び含有量
の少ないことから工業的に不利である。合成によ
る方法は可能であり色々な方法が知られている
が、β−ヒドロキシアスパラギン酸には４種の立
体異性体、即ちスレオ型とエリスロ型及びそれら
のＤ及びＬ体の計４種の異性体を生じ、Ｌ−スレ
オ体のみを単離する必要があり、必ずしも工業的
に有利な方法とは云えない。これらの方法に対し
微生物を用いる醗酵法は、立体異性体の特定のも
ののみに限定された化合物のみを効率的に生産出
来るので工業的に極めて有利な製造法であると云
える。 Ｌ−スレオ−β−ヒドロキシアスパラギン酸を
醗酵生産する微生物としてカビの一種であるアー
スリニウム・フエオスパーマム（Arthrinum
phaeospermum）及び放線菌であるストレプトミ
セス属（Streptomyces）の１菌株が知られてい
るに過ぎない（参考文献１）。本発明者らは放線
菌であるダクチロスポランギウム属
（Dactylosporangium）の１菌株がＬ−スレオ−
β−ヒドロキシアスパラギン酸の醗酵生産能を有
し、しかもその培養液中に効率よく高濃度に生産
蓄積することを発見し、本発明を完了するに至つ
た。以下にその方法を説明する。 本発明に用いる微生物菌株の１例として、本発
明者らが京都市内の土壌より分離したダクチロス
ポランギウム属に属するSF−2253株がある。SF
−2253株の菌学的性状は下記に記述する通りであ
る。観察は主としてE.B.ShirlingとD.Gottliebの
方法（International Journal of Systematic
Bacteriology、16巻、313〜340頁、1966年）に
従つて実施した。 形態 基生菌糸はよく分枝して波状に伸長し、直径は
0.5〜0.6ミクロンである。寒天培地及び液体培地
のいずれにおいても基生菌糸の分断は観察されな
い。気菌糸はほとんど見られず、事実上形成しな
いと思われる。SF−2253株は寒天培地の表面に
胞子のうを１個あるいはタフト状に形成する。胞
子のうは、スターチ寒天培地上で比較的多く認め
られる。胞子のうは指状で、大きさはおよそ0.7
〜1.0×2.0〜4.0ミクロンである。各胞子のうは中
に１列に通常３〜４個の胞子を持つ。胞子は大部
分が円筒形ないし卵形で表面はなめらか、大きさ
はおよそ0.6〜0.9×0.9〜1.8ミクロンである。胞
子はたとえば土壌抽出液などに懸濁し、15〜30分
放置した後検鏡すると運動性が認められた。 各種培地上の生育状態 SF−2253株の各種培地上の生育状態は次表に
示す通りである。色の記載において〔 〕内に示
す標準はコンテナー・コーポレーシヨン・オブ・
アメリカ社製の「カラー・ハーモニー・マニユア
ル」に記載されたものを用いた。観察は28℃で14
〜28日培養後に行なつた。

【表】

【表】 生理的性質 (1) 生育温度範囲：スターチ寒天において15〜40
℃の温度範囲で生育し、25〜37℃で良好に生育
する。 (2) ゼラチンの液化：陰性 (3) スターチの加水分解：陽性 (4) 硝酸塩の還元：陰性 (5) 脱脂乳の凝固：陰性 脱脂乳のペプトン化：陰性 (6) メラニン様色素の生成：陰性 (7) 耐塩性：1.5％では生育するが、3.0％以上で
は生育しない。 炭素源の利用性

【表】 細胞壁組成 ベツカー等の方法〔Appl.Microbiol.13：236
（1965）参照〕により分析した結果、細胞壁組成
成分中のジアミノピメリン酸は主にヒドロキシ型
であつた。 以上の性状よりSF−2253株は放線菌の中でダ
クチロスポランギウム属に属する菌株であるが、
ダクチロスポランギウム属に属する菌株がＬ−ス
レオ−β−ヒドロキシアスパラギン酸を生産する
ことは知られていない。 従つて、本発明者等はSF−2253株をダクチロ
スポランギウム・エシピー・SF−2253と命名し
た。なお、ダクチロスポランギウム・エスピー・
SF−2253株は工業技術院微生物工業研究所に受
託番号、微工研菌寄第6858号として寄託されてい
る。 上記にその性状が明らかとなつたSF−2253株
を用いＬ−スレオ−β−ヒドロキシアスパラギン
酸を生産するに当り、以下にその概要を説明す
る。 ダクチロスポランギウム・エスピーSF−2253
株は、他の放線菌の場合にみられるように、その
性状が変化しやすく、例えば紫外線、エツクス
線、放射線、薬品等を用いる人工的変異手段で変
異しうるものであり、このような変異株であつて
もＬ−スレオ−β−ヒドロキシアスパラギン酸の
生産能を有するダクチロスポランギウム属の菌は
すべて本発明の方法に使用することができる。 本発明の方法では、SF−2253株を通常微生物
が利用しうる栄養物を含有する培地で培養する。
例えば炭素源としてグルコース、シユクロース、
デキストリン、澱粉、水あめ、糖みつ、大豆油等
を使用しうる。また、窒素源として大豆粉、小麦
胚芽、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーン
ステイープリカー、硝酸ナトリウム、硫酸アンモ
ニウム等を使用しうる。その他必要に応じて炭酸
カルシウム、塩化カリウム、燐酸塩等の無機塩類
を添加するほか菌の発育を助け、Ｌ−スレオ−β
−ヒドロキシアスパラギン酸の生産を促進するよ
うな有機物及び無機物を適当に添加することがで
きる。 培養法としては、一般の微生物の培養方法と同
じく液体培養法、特に深部撹拌培養法が最も適し
ている。培養は好気的条件下で行なわれ、培養に
適した温度は25℃〜40℃であるが、通常30℃付近
で培養し、PHは中性〜弱アルカリ性が望ましい。
液体培養法で通常３〜10日間培養を行なうと、Ｌ
−スレオ−β−ヒドロキシアスパラギン酸が培養
液中に生成蓄積される。 Ｌ−スレオ−β−ヒドロキシアスパラギン酸の
検定方法は本物質が抗菌活性を有するので一般に
抗生物質の検定に用いられるバイオアツセイ法が
適用出来る。即ち検定菌としてバチルス・ズブチ
リスPCI−219（Bacillus subtilis）を用いペプト
ン0.5％と寒天1.5％（殺菌前PH７）から成る検定
シヤーレを作成し、被検液を浸積したペーパーデ
イスク（直径８mm）を検定シヤーレ上に置き37
℃、17時間培養すると、被検体の濃度に応じた発
育阻止円が見られる。阻止円径とＬ−スレオ−β
−ヒドロキシアスパラギン酸の濃度の対数が一定
の範囲で直線的相関関係にあり、この場合100μ
ｇ／ml〜2000μｇ／mlの濃度範囲で定量出来る。 培養液内に生産、蓄積されたSF−2253物質を
単離精製するには、水溶性酸性物質の精製に通常
用いられる手段を適宜利用することが出来る。即
ち、ダイヤイオンHP−20（三菱化成製）、アンバ
ーライトXAD−２（ロームアンドハース社製）、
炭末等の吸着剤；セフアデツクスＧ−10（フアル
マシア製）、トヨパールHW−40（東洋ソーダ社
製）等のゲル濾過剤；ダウエツクス１×２（ダウ
ケミカル社製）、ダイヤイオンPA−306（三菱化成
製）、DEAE−セフアデツクス（フアルマシア製）
等の陰イオン交換樹脂等によるクロマトグラフイ
ーが使用されるが、以下による精製方法が効率的
である。 SF−2253株の培養液をハイフロスーパーセル
等の濾過助剤を用いて菌体その他の固型物を除去
し、次いで濾過中の有効成分をダウエツクス１×
２（Cl^-）に吸着させ、0.5M NaCl水で溶出させ
る。この溶離液をセルロースカラム、セフアデツ
クスＧ−10等のカラムクロマトグラフイー；メト
ノール、エタノール等の有機溶剤による沈澱等を
適宜組み合わせることにより高純度のSF−2253
物質を得ることができる。 以下に本発明によつて得られたＬ−スレオ−β
−ヒドロキシアスパラギン酸の理化学的性状を示
す。 (1) 外観：白色針状結晶 (2) 融点：200℃付近より徐々に褐変する。 (3) 元素分析値：Ｃ 33.36％、Ｈ 4.69％、Ｎ
9.13％、Ｏ 52.82％ (4) 分子量：149（FD マススペクトルによる） (5) 紫外部吸収スペクトル：220nｍ〜370nｍに
特徴的な吸収極大がない。 (6) 赤外部吸収スペクトル（臭化カリウム法）：
第１図に示す。 1725、1660、1500、1160、1100、1040及び
970cm^-1に特徴的吸収が見られる。 (7) 溶解性 アルカリ性または酸性水及び温水に良く溶
け、水に可溶、メタノール、クロロホルム、酢
酸エチル、ヘキサン、ベンゼン、エーテル等の
有機溶剤に実質的に不溶である。 (8) 安定性 酸性、中性、アルカリ性いずれにおいても安
定である。 (9) シリカゲル薄層クロマトグラフイーのR値
ｎ−プロパノール−ピリジン−酢酸−水（15：
10：３：12） 0.5 エタノール−水（７：３） 0.3 (10) ペーパークロマトグラフイーのR値（上昇
法）ｎ−プロパノール−ピリジン−酢酸−水
（15：10：３：12） 0.22 ｎ−ブタノール−酢酸−水（２：１：１） 0.14 (11) 呈色反応 陽性：ニンヒドリン、レミユー、ヨウ素反応 陰性：硫酸、坂口反応 (12) 高圧濾紙電気泳動（3500V、20分） ギ酸−酢酸−水（PH1.9）（20：80：900、Ｖ／
Ｖ） Rm（Lys）0.19 ピリジン−酢酸−水（PH6.4）（200：８：2890、
Ｖ／Ｖ） Rm（Glu）1.14 (13) 比旋光度 〔α〕₃₆₅＋38.0°（Ｃ 0.5、1N HCl） (14) 重水中で測定した水素核磁気共鳴スペクト
ル（100MPH、TMS 外部標準）では4.07
（1Hd、Ｊ＝２Hz）及び4.55ppm（1Hd、Ｊ＝２
Hz）にシグナルが見られる。 (15) 重水中で測定した炭素核磁気共鳴スペクト
ル（25MHz、dioxane 外部標準）では57.8(d)、
71.5(d)、173.0(s)及び177.2(s)にシグナルが見ら
れる。 以下に本発明の方法につき実施例にもとずき説
明する。 実施例 １ 種培地としてスターチ2.0％、グルコース1.0
％、小麦胚芽0.6％、ペプトン0.5％、イーストエ
クストラクト0.3％、大豆粉0.2％および炭酸カル
シウム0.1％を含む培地を用いた。また、生産培
地として水飴2.0％、大豆油0.15％、大豆粉1.0％、
「サングレイン」（サントリー社製）0.25％、綿実
粕0.5％、炭酸カルシウム0.1％、硫酸第一鉄
0.0005％、塩化ニツケル0.00005％および塩化コ
バルト0.00005％を含む培地を用いた。殺菌前の
培地のPHは全て７に調節し実施した。 イーストエキストラクト・マルトエキストラク
ト寒天スラントに十分生育したダクチロスポラン
ギウム・エスピーSF−2253株（微工研菌寄第
6858号）を上記殺菌種培地20mlを含む100ml容三
角フラスコ２本に６〜７白金耳接種し、28℃で６
日間培養し、第１種培養液とした。次いで、殺菌
種培地100mlを含む500ml容の三角フラスコ２本に
前記の第１種培養液４mlずつを接種し、28℃で２
日間振盪培養し、これを第２種培養液とした。次
いで、殺菌種培地１を含む５容の三角フラス
コ２本に前記の第２種培養液50mlずつを接種し、
28℃で２日間振盪培養し、これを第３種培養液と
した。次いで、この第３種培養液を35の殺菌生
産培地を含む50容のジヤーフアーメンター２基
に接種し、28℃で５日間通気、撹拌培養した（回
転数270rpm、通気量35／min）。培養終了後、
ケイソウ土を助剤に用いて濾過し、培養濾液40
を得た。バイオアツセイによるＬ−スレオ−β−
ヒドロキシアスパラギン酸の生産量は1100μｇ／
mlであつた。 実施例 ２ 実施例１で得た培養濾液40をPH２に調整後、
活性炭４を充填した塔に通した。その通過液を
ダウエツクス１×２（Cl^-）（ダウケミカル社製）
４を充填した塔に通し有効成分を吸着させた。
吸着後、この塔を12の水で洗浄し、0.2M塩化
ナトリウム溶液で溶離すると、５分画でフラク
シヨンNo.１及び２に有効成分が溶出された。この
フラクシヨンを約30mlになるまで減圧濃縮した。
このとき析出した塩化ナトリウムの結晶は濾過し
て除き、瀘液をセフアデツクスＧ−10（フアルマ
シア社製）1.2を充填した塔に付し水で展開す
ると、フラクシヨンNo.27〜49（18ml分画）にかけ
て有効物質が溶出された。 活性フラクシヨン360mlを集め、減圧濃縮して
凍結乾燥したところ、淡黄色のＬ−スレオ−β−
ヒドロキシアスパラギン酸ナトリウムの粗粉末が
31.5ｇ得られた。 次いで、この粗粉末を50％含水エタノールで溶
解後、あらかじめ90％エタノール水で洗浄したカ
ラムクロマト用セルロース（ワツトマン社製）１
を充填した塔につけ、90％エタノール水１で
洗浄後、70％エタノール水3.5及び50％エタノ
ール水２で各々展開すると、フラクシヨンNo.
137〜278（18ml分画）にかけて有効物質が溶出さ
れた。この活性フラクシヨン2.5を減圧濃縮し
凍結乾燥することにより淡黄色のＬ−スレオ−β
−ヒドロキシアスパラギン酸ナトリウムの精製粉
末が14.8ｇ得られた。 次に、このうちの3.5ｇを水５mlに溶解させ、
PH２に調整後、エタノール50mlを加えると沈澱が
2.72ｇ生成した。この沈澱を温水20mlに加え塩酸
でPH２に調節し溶解させた。この溶液が少し白く
濁るまでエタノールを加え、５℃で一晩静置する
とＬ−スレオ−β−ヒドロキシアスパラギン酸の
白色結晶が析出し、これを濾別し減圧下に乾燥し
て白色針状結晶2.41ｇを得た。

【図面の簡単な説明】

第１図はＬ−スレオ−β−ヒドロキシアスパラ
ギン酸の臭化カリウム錠剤での赤外部吸収スペク
トルである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ ダクチロスポランギウム属に属し、Ｌ−スレ
   オ−β−ヒドロキシアスパラギン酸生産能を有す
   る菌株を栄養培地中に培養し、培養物よりＬ−ス
   レオ−β−ヒドロキシアスパラギン酸を採取する
   ことを特徴とするＬ−スレオ−β−ヒドロキシア
   スパラギン酸の製造法。 ２ ダクチロスポランギウム属に属し、Ｌ−スレ
   オ−β−ヒドロキシアスパラギン酸生産能を有す
   る菌株がダクチロスポランギウム・エスピ−SF
   −2253株（FERM Ｐ−6858）である特許請求の
   範囲第１項記載の製造法。