JPS6143036B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、新規抗生物質AF−８およびその製
造法に関するものである。

本発明の抗生物質AF−８物質は、次に示すよ
うな理化学的性質を有する新規な抗生物質であ
る。

(1) 元素分析値：C58.52％、H8.64％、N9.04％ (2) 融点：145〜147℃ (3) 比旋光度：〔α〕^２５ _Ｄ＝＋12.0゜（Ｃ＝１、ク
ロロホルム） (4) 紫外線吸収スペクトル：第１図に示す（メタ
ノール溶媒）。

(5) 赤外線吸収スペクトル：第２図に示す通りで
ある（KBr法）。

(6) 溶剤に対する溶解性：ベンゼン、酢酸エチ
ル、クロロホルム、ブタノールに可溶、メ
タノール、エタノール、エーテルに難溶、
ｎ−ヘキサン、アセトン、水に不溶であ
る。

(7) 呈色反応：ドラーゲンドルフ、ライドン・ス
ミス反応に陽性であり、ニンヒドリン、パ
ラアニシジン反応には陰性である。

(8) 酸性、中性、塩基性の区別：酸性 (9) 物質の色：白色 (10) プロトン核磁気共鳴スペクトル：第３図の通
りである（重クロロホルム中で測定）。

(11) Ｃ−13核磁気共鳴スペクトル：第４図の通り
である（重クロロホルム中で測定）。

(12) Rf値：シリカゲル薄層クロマトグラフイー
（メルク社製キーゼルゲルＧ、厚さ300μ）
を常法にて行なつた時のRf値は次の通り
である。

Rf値 (イ) ｎ−ブタノール：アセトン：水（４：
５：１） 0.40 (ロ) クロロホルム：メタノール：酢酸
（15：１：１） 0.50 (ハ) ｎ−ブタノール：酢酸：水（３：１：
１） 0.72 (13) 酸加水分解：６規定塩酸で16時間加水分解
すると、ロイシン、バリン、グルタミン
酸、アスパラギン酸を、４：１：１：１の
モル比で含む物質である。

抗生物質AF−８の生物学的性質について述べ
ると、次の如くである。

(1) 抗菌性 寒天希釈法による最小生育阻止濃度（MIC）
は、第１表に示す通りである。

第 １ 表 抗生物質AF−８の抗菌スペクトル 被検菌名 最小生育阻止濃 度（mcg/ml） カンジダ・アルビカンス ＞100 サツカロマイセス・セルビシ ＞100 ア キサントモナス・オリーゼ ＞100 エルビニア・アロイデ ＞100 グロメレラ・シグレータ ＞100 アルタネリア・マリ ＞100 フザリウム・オキシスポラム ＞100 クラドスポリウム・ベルニケ ＞100 コクリオボーラス・ミヤベナ ＞ 50 ス ピリクラリア・オリーゼ ＞ 50 ボトリチス・シネレア ＞ 50 アルタネリア・キクチアナ ＞100 スクレロチニア・シネレア ＞ 50 ペリクラリア・ササキ 50 アスペルギルス・ニガー 100 トリコフイートン・インター 25 デイジターレ バチルス・サブチルス ＞100 PCI219 スタフイロコツカス・オーレ ＞100 ウス FDA 209P ミコバクテリウム・スメグマ ＞100 テス ATCC607 エシエリシア・コリー ＞100 NIHJ AF−８物質1000mcg/mlの溶液でペーパーデ
イスク法を用いたときの、各種被検菌に対する
抗菌作用は、第２表に示す通り、ピリクラリ
ア・オリーゼ及びアルタネリア・キクチアナに
対し顕著な効果を示す。

第 ２ 表 被 検 菌 阻止円直径 （m/m） スタフイロコツカス・オーレウス − FDA209P バチルス・サブチルスPCI219 − ミコバクテリウム・スメグマテス − ザルチナ・ルテア・PCI1001 10.8 エシエリシア・コリーNIHJ − キサントモナス・オリーゼ − シユードモナス・エルギノーザ − Ｐ−３ カンジダ・アルビカンス − サツカロマイセス・セルビシア − ピリクラリア・オリーゼ 33.5 アスペルギルス・ニガー − アルタネリア・キクチアナ 25.7 (2) 毒 性 AF−８物質の急性毒性を、マウス腹腔内
（i.p.）投与により調べたところ、100mg/Kg投
与で異常は認められなかつた。

以上のように、本抗生物質は、真菌類に対して
抗菌活性を示すことから、本抗生物質AF−８
は、抗真菌医薬、農薬、動物薬等として使用しう
る物質である。

上記の理化学的性質から、本抗生物質AF−８
は、ペプチド骨格を有する化合物であることが推
測される。ペプチド骨格を有し、真菌類に対し活
性を示す物質としてイチユリンＡ（Tetrahedron
29、3455〜3459、1973）、ミコサブチリン（Eur.
J.Biochem.63、391〜398、1976）、バチロマイシ
ンＬ（Proc.Soc.Exp.Bio.＆Med.63、539〜541、
1948）などが挙げられる。しかしながら、本抗生
物質と、イチユリンＡ、ミコサブチリン、バチロ
マイシンＬの性状を比較すると、アミノ酸組成に
おいて、本物質はチロシンを含まないのに対し、
イチユリンＡ、ミコサブチリン、バチロマイシン
Ｌは、チロシンを含む点で明らかに異なる。した
がつて、本抗生物質の理化学的性状において、既
知の抗生物質のそれと一致する物質が見い出され
ないことから、本抗生物質は新規の抗生物質と判
定される。

本発明の抗生物質AF−８物質は、抗生物質AF
−８を生産するバチルス属に属する微生物を培地
に培養し、培養物より該抗生物質を採取すること
により製造される。

本発明に使用される抗生物質AF−８物質を生
産するバチルス属に属する微生物としては、一例
として本発明者らによつて鳥取県の空中浮遊菌よ
り新たに分離されたバチルス・サブチルス・AF
−８（Bacillus subtilis AF−８）株が挙げられ
る。本菌株の菌学的性状を示すと、次の通りであ
る。

Ａ 形 態 形および大きさ：桿菌 0.8〜1.0×2.0 〜2.5μ 多形性：一連又は二連 運動性とベン毛：有り、周毛性ベン毛 胞子の有無：有り 胞子の形：楕円 胞子の形成部位：中心 グラム染色性：陽性 抗酸性：無し Ｂ 生育状況 肉汁寒天平板培養 生育良好、不定形又は拡散状、表面は培養
日数の経過とともにシワ状となり、内容はバ
ター状不透明で乳白色を呈す。

肉汁寒天斜面培養 生育良好、樹木状に生育、表面はシワ状と
なり内容はバター状不透明で乳白色を呈す。

肉汁液体培養 生育良好、表面に発育し菌膜を形成、培養
日数の経過とともに、わずかに混濁し菌体は
乳白色を呈す。

ばれいしよ切片 生育良好、拡散状に発育し灰白色のコロニ
ー形成。

リトマスミルク すみやかにペプトン化しわずかにリトマス
脱色。

肉汁ゼラチン穿刺 表面に発育し層状に液化する。

Ｃ 生理学的性質 硝酸塩還元：有り 脱窒素反応：無し MRテスト：陰性 VPテスト：陽性 インドールの生成：無し 硫化水素の生成：無し デンプンの加水分解：陽性 クエン酸の利用：有り 硝酸塩の利用：有り 色素の生成：無し ウレアーゼ：無し チトクロームオキシダーゼ：有り カゼインの分解：有り ゼラチンの分解：有り 生育PH：PH５〜９生育可、至適PH７ 生育温度：15〜45℃、至適温度27〜37℃ 酸素に対する態度：好気性、加糖ブイヨン
中で嫌気的に増殖せず 塩化ナトリウム耐性：10％で生育せず。

Ｏ−Ｆテスト：グルコースより発酵的に酸
を生成する。

カタラーゼ：陽性 チロシン分解：無し Ｄ 糖類から酸の生成の有無（※） Ｌ−アラビノース ＋ Ｄ−キシロース ＋ Ｄ−グルコース ＋ Ｄ−マンノース ＋ Ｄ−フラクトース ＋ Ｄ−ガラクトース ＋ マルトース ＋ シヨ糖 ＋ 乳 糖 − トレハロース ＋ Ｄ−ソルビツト ± Ｄ−マンニツト ＋ イノシツト ＋ グリセリン ＋ デンプン − （※）基礎培地組成（NH₄）₂HPO₄1ｇ、塩化カ
リウム0.2ｇ、硫酸マグネシウム0.2ｇ、酵母
エキス0.2ｇ、各種糖５ｇ、寒天15ｇ、ブロ
ムクレゾールパープル0.008ｇ、蒸留水1000
ml、 AF−８株の菌学的性質を、バージーズ・マニ
ユアル・オブ・デイタミネーテイブ・バクテリオ
ロジー（第８版）の記載に照合すると、培養性
状、生理学的性質および糖類から酸の生成の特徴
から、AF−８株はバチルス・サブチルスの種に
属する一菌株と認められる。本菌株は、バチル
ス・サブチルス・AF−８（Bacillus subtilis AF
−８）として工業技術院微生物工業技術研究所に
微生物受託番号微工研菌寄第4850号として寄託さ
れている。

本発明における使用菌としては、上記したバチ
ルス・サブチルス・AF−８およびその変異株だ
けでなく、バチルス属に属し、抗生物質AF−８
を生産する菌であればすべて用いることができ
る。

培地に使用される炭素源、窒素源は、使用菌株
の利用可能なものならいずれの種類でもよい。す
なわち、炭素源としては、たとえばグルコース、
グリセロール、フラクトース、マルトース、ガラ
クトース、ラクトース、澱粉またはその加水分解
液等の種々の炭水化物が使用できる。その濃度は
通常培地に対して0.1〜5.0％が好ましい。また、
グルコン酸、ピルビン酸、乳酸、酢酸等の各種有
機酸、グリシン、グルタミン酸、アラニン等の各
種アミノ酸等も使用可能である。

窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウ
ム、燐酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸
アンモニウム等の各種の無機および有機アンモニ
ウム塩、尿素、ペプトン、NZアミン、肉エキ
ス、乾燥酵母、コーンスチープリカー、カゼイン
加水分解物、フイツシユミールあるいはその消化
物、蛹加水分解物等の含窒素有機物質、グリシ
ン、グルタミン酸、アラニン等の各種アミノ酸等
が使用可能である。

無機物としては、各種燐酸塩、硫酸マグネシウ
ム等、さらに微量の重金属塩が使用されるが、天
然物を含む培地では必ずしも添加を必要としな
い。

また、栄養要求を示す変異株を用いる場合に
は、当然、その栄養要求を満足させる物質を培地
に加えなければならない。

培養は静置でもよいが、通常振盪または通気撹
拌培養などの好気的条件下に行なうのがよい。培
養中に消泡を必要とする時は、ニツコールBO−
２（日光ケミカルズ株式会社製）、シリコン樹
脂、大豆油、アデカノール類（旭電化株式会社
製）などの消泡剤を使用することができるが、そ
の中でも消泡剤アデカノールLG−126が最も有効
である。培地のPHは5.0〜9.0、培養温度は15〜45
℃、培養期間は通常２〜７日である。なお、これ
らの培養条件は使用する抗生物質AF−８生産微
生物の特性に応じてそれぞれ最適の条件を選択す
ればよい。

抗生物質AF−８物質は主として培養液中に生
成蓄積される。培養物からの抗生物質AF−８物
質の採取及び精製は、一般の抗生物質の採取およ
び精製の手段に準じて行うことができる。たとえ
ば、培養物から菌体その他を除去した培養液か
ら、活性炭などに本抗生物質を吸着せしめ、含水
アセトン等で溶出し、この溶出液を濃縮した後、
ｎ−ブタノールで抽出することができる。また、
培養液から、ｎ−ブタノール等の有機溶媒を用
いて、本抗生物質を抽出することもできる。この
ようにして得られた抽出液を濃縮した後、シリカ
ゲル・カラム・クロマトグラフイー、セフアデツ
クスLH20カラム・クロマトグラフイー等を用い
て本抗生物質を単離することができる。

次に本発明の新規抗生物質AF−８の製造例を
示すが、この実施例はなんら本発明を限定するも
のではない。

実施例 １ 大豆粉1.0％、グルタミン酸ナトリウム1.0％、
グルコース1.0％を含有する培地（PH7.0）100ml
を、500ml容坂口フラスコに分注し、120℃で20分
間滅菌する。これにバチルス・サブチルス・AF
−８（微工研菌寄第4850号）を接種し、27℃で48
時間、毎分120回転で往復振盪培養を行なう。こ
の培養物を上記と同一組成の培地20を有する30
容ジヤーフアーメンターに１％の割合で移殖
し、温度27℃、撹拌数250rpm条件下で毎分10
の無菌空気を送り44時間通気撹拌培養を行い、抗
生物質AF−８物質を含有する培養物を得た。

この培養物から遠心分離によつて菌体及び培地
残渣を除き、培養液15を得た。この培養液
に活性炭（武田薬品工業社製）220ｇを加え、室
温で約30分間撹拉した。遠心分離によりこの活性
炭を培養液から回収し、活性炭より70％含水ア
セトン２で活性分質を２度溶出した。この溶出
液を減圧下約１になるまで濃縮し、この水溶液
より活性分質を500mlのｎ−ブタノールで２度抽
出した。ｎ−ブタノール抽出液を、500mlの0.1N
塩酸及び500mlの水で順次洗浄後、ｎ−ブタノー
ル層を減圧下濃縮乾固して、黄褐色粉末22ｇを得
た。それをクロロホルムに溶解し、シリカゲル
（メルク社製キーゼルゲル60）800ｇをあらかじめ
クロロホルムで充填したカラムにのせた後、クロ
ロホルム：メタノール（７：１）の混合溶媒で溶
出した。溶出された画分（各約15ml）の抗菌活性
を、アルタナリア・キクチアナを含む寒天平板を
用いて、ペーパーデイスク法による阻止円を測定
して決定した。活性区分（第200画分から第450画
分まで）を合せ（約3700ml）減圧下濃縮乾固して
黄色粉末約４ｇを得た。この黄色粉末１ｇをセフ
アデツクスLH−20のカラム（ベツド容量約600
ml）にのせてエタノールでクロマトグラフイーを
行なうことにより、薄層クロマトグラフイーで単
一スポツトを与える純粋なAF−８物質の白色粉
末80mgを得た。

実施例 ２ グルコース0.5％、Ｌ−グルタミン酸1.0％、ク
エン酸0.1％、燐酸第一カリウム0.05％、燐酸第
二カリウム0.05％、硫酸マグネシウム７水塩0.02
％、硫酸マンガン４水塩0.001％、硫酸第一鉄７
水塩0.001％を含有する培地（PH6.8）100mlを500
ml容坂口フラスコに分注し、120℃で20分間滅菌
する。これに、バチルス・サブチルス・AF−８
（微工研菌寄第4850号）を接種し、27℃で48時間
毎分120回転で往復振盪培養を行なう。この培養
物を上記と同一組成の培地20を有する30容ジ
ヤーフアーメンターに１％の割合で移殖し、温度
27℃撹拌数250rpm条件下で毎分10の無菌空気
を送り72時間通気撹拌培養を行い、抗生物質AF
−８を含有する培養物を得た。

この培養物から遠心分離によつて菌体を除去
し、培養液15を得た。この培養液から、活
性物質を３のｎ−ブタノールで２度抽出した。
ｎ−ブタノール抽出液を減圧下濃縮し、黄色シロ
ツプ状物質約20ｇを得た。この黄色シロツプ状物
質を、実施例１に記載したと同様にして、シリカ
ゲル・カラム・クロマトグラフイーおよびセフア
デツクスLH−20、カラム・クロマトグラフイー
を行い、抗生物質AF−８物質の白色粉末100mgを
得た。

【図面の簡単な説明】

第１図は抗生物質AF−８のメタノール中での
紫外線吸収スペクトルを、第２図は同物質のKBr
法による赤外線吸収スペクトルを、第３図は同物
質の重クロロホルム中でのプロトン核磁気共鳴ス
ペクトルを、第４図は同物質の重クロロホルム中
でのＣ−13核磁気共鳴スペクトルを示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 下記の理化学的性質を有する新規抗生物質
   AF−８。 (1) 元素分析：C58.52％、H8.64％、N9.04％ (2) 融点：145〜147℃ (3) 比旋光度：〔α〕^２５ _Ｄ＝＋12.0゜（Ｃ＝１、ク
   ロロホルム） (4) 紫外線吸収スペクトル：第１図に示す（メタ
   ノール溶媒）。 (5) 赤外線吸収スペクトル：第２図に示す（KBr
   法）。 (6) 溶剤に対する溶解性：ベンゼン、酢酸エチ
   ル、クロロホルム、ブタノールに可溶、メ
   タノール、エタノール、エーテルに難溶、
   ｎ−ヘキサン、アセトン、水に不溶であ
   る。 (7) 呈色反応：ドラーゲンドルフ、ライドン・ス
   ミス反応に陽性であり、ニンヒドリン、パ
   ラアニシジン反応には陰性である。 (8) 酸性、中性、塩基性の区別：酸性 (9) 物質の色：白色 (10) プロトン核磁気共鳴スペクトル：第３図の通
   りである（重クロロホルム中で測定）。 (11) Ｃ−13核磁気共鳴スペクトル：第４図の通り
   である（重クロロホルム中で測定）。 (12) Rf値：シリカゲル薄層クロマトグラフイー
   （メルク社製キーゼルゲルＧ、厚さ300μ）
   を常法にて行なつた時のRf値は次の通り
   である。 Rf値 (イ) ｎ−ブタノール：アセトン：水（４：
   ５：１） 0.40 (ロ) クロロホルム：メタノール：酢酸
   （15：１：１） 0.50 (ハ) ｎ−ブタノール：酢酸：水（３：１：
   １） 0.72 (13) 酸加水分解：６規定塩酸で16時間加水分解
   すると、ロイシン、バリン、グルタミン
   酸、アスパラギン酸を、４：１：１：１の
   モル比で含む物質である。 ２ バチルス属に属し、新規抗生物質AF−８を
   生産する能力を有する微生物を培地に好気的に培
   養し、新規抗生物質AF−８を生成蓄積せしめ、
   これを採取することを特徴とする新規抗生物質
   AF−８の製造法。 ３ バチルス属に属する微生物が、バチルス・サ
   ブチルス・AF−８である特許請求の範囲第２項
   記載の新規抗生物質AF−８の製造法。