JPH0362700B2

JPH0362700B2 -

Info

Publication number: JPH0362700B2
Application number: JP59214326A
Authority: JP
Inventors: Toshiji Kaieda; Kimimasa Yamada; Naokuni Yamawaki
Original assignee: Asahi Chemical Industry Co Ltd
Current assignee: Asahi Chemical Industry Co Ltd
Priority date: 1984-10-15
Filing date: 1984-10-15
Publication date: 1991-09-26
Also published as: JPS6193121A

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は、白血球を活性化して抗腫瘍免疫細胞
を誘導する機能を持つ抗腫瘍免疫細胞誘導材に関
する。（従来の技術）周知のように、生体の悪性腫瘍に対する免疫監
視機構を荷う抗腫瘍免疫細胞としては、キラーＴ
細胞、NK細胞、活性化マクロフアージ、Ｋ細胞
等が重要な役割をはたしていることが報告されて
いる〔福沢正洋：医学のあゆみ，126，420（′
83）〕。したがつて、悪性腫瘍に対する免疫学的療
法としては、癌患者免疫細胞（白血球）を活性化
して、これらの抗腫瘍免疫細胞を効率的に誘導活
性化することが考えられる。しかしながら、実際
の癌患者体内においては、このような悪性腫瘍に
対する免疫監視機構の存在にもかかわらず腫瘍細
胞が増殖する。その主要なメカニズムの一つとして、腫瘍細胞
による免疫抑制性細胞（サプレツサーＴ細胞、サ
プレツサーマクロフアージ等）の誘導活性化が報
告されている。〔S.Fujimoto etal：J.Immunol，
116，791（′76）〕。かかる免疫抑制性細胞は、腫瘍
細胞を障害する機能を荷う種々の抗腫瘍免疫細胞
の誘導活性化を抑制し、ために腫瘍細胞の増殖を
許し、ますます腫瘍に対する免疫応答能の低下を
まねくと考えられる。また、その他のメカニズム
として、腫瘍細胞による免疫抑制性因子の産生に
より、腫瘍細胞に対する免疫応答が抑制されてい
る可能性も報告されており〔J.A.Rothetal：J.
Immunol，128，1955（′82）〕、かかる免疫抑制状
態下にある癌患者体内においては、効率的な抗腫
瘍免疫細胞の誘導活性化は困難であると言わなけ
ればならない。したがつて、免疫抑制のない抗腫瘍免疫細胞誘
導活性化に最適な条件を体外に設定し、癌患者か
ら取り出した白血球を刺激活性化して、強力な抗
腫瘍免疫細胞を誘導し、これを元の癌患者にもど
すことによつて癌を治療しようとする方法は、効
果の高い新しい癌免疫療法となる可能性を有する
と考えられる。（発明が解決しようとする問題点）体外に取り出した白血球を刺激活性化して抗腫
瘍免疫細胞を誘導活性化し、これを担癌生体に投
与して癌を治療しようとする試みは、現在活発に
研究が行なわれているが、白血球の刺激活性化に
担癌生体より抽出した腫瘍細胞を用いており、非
常に操作が煩雑である。（問題を解決するための手段）本発明者らは、前記の問題を解決するために鋭
意研究した結果、驚くべきことに、オリゴ糖を不
溶性担体に共有結合で固定した誘導材で白血球を
刺激活性化することにより、強力な抗腫瘍免疫細
胞が誘導されることを見い出し、本発明を完成す
るに至つた。すなわち、本発明は、表面にオリゴ糖部分を有
することを特徴とする抗腫瘍免疫細胞誘導材に係
る。本発明の誘導材表面のオリゴ糖は、Ｎ−アセチ
ルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、
ガラクトース、フコース、マンノース、グルコー
ス、シアル酸の中の三つ以上から構成される。た
とえば、シアル酸、ガラクトース、Ｎ−アセチル
グルコサミン、フコースから成るオリゴ糖、ある
いはガラクトース、Ｎ−アセチルグルコサミン、
フコースから成るオリゴ糖であり、たとえば、の構造を有するオリゴ糖である。誘導材表面のオ
リゴ糖の分子量は１万以下のものを使用する。好
ましくは５千以下がよく、さらに好ましくは、分
子量２以下のオリゴ糖がよい。また、たとえば、
動物の粘膜より得られるオリゴ糖等を不溶性担体
に結合したものは、強力な誘導材として用いるこ
とができる。本発明の誘導材は、上記に限定され
るものではなく、オリゴ等を不溶性担体表面に有
する誘導材は、強力な誘導材として使用できる。
本発明における誘導材表面とは、不溶性担体にお
いて白血球が接触可能な部分である。本発明で用いられる不溶性担体は、親水性担
体、疏水性担体いずれも使用できるが、疏水性担
体を用いる場合には、特に担体への血清成分の非
特異的吸着が生じるため、親水性担体方が好まし
い結果を与える。不溶性担体の形状は、粒子状、
繊維状、中空糸状、膜状等のいずれの公知の形状
も用いることができる。粒状もしくは球状不溶性
担体としては、粒径１ミクロン〜3000ミクロンの
ものが使用できる。粒径１ミクロン以下では活性
化白血球との分離が困難である。とくに粒径50ミ
クロン以上であれば、容易に活性化白血球との濾
過分離が可能であり、粒径3000ミクロン以上で
は、白血球との担体単位重量あたりの接触面積が
低下するため好ましくない。粒径80〜2000ミクロ
ンのものが本発明において最も良好である。ま
た、粒状もしくは球状不溶性担体の比重が1.07以
上であれば、容易に活性化白血球との遠心もしく
は静置による分離が可能である。また、平膜状あ
るいは中空糸状多孔性担体を使用する場合、その
孔径が、細胞は通過できないが培地成分は自由に
通過できる0.05〜10ミクロンのものを使用すれ
ば、膜の一方の面に結合した白血球に膜の他方の
面より栄養を補給でき、高濃度の白血球を刺激活
性化することが可能である。さらに好ましくは、
0.1〜５ミクロンの孔径の平膜状あるいは中空糸
状の多孔性担体が良好に使用できる。不溶性担体の材質としては、リガンドを固定化
するために、担体が活性化でき、担体の活性化反
応、固定化反応などを含めた全工程を通じて物理
的に安定であればよい。具体的には、無機ベース
のものにあつては、活性炭、ガラス等およびその
誘導体であり、天然高分子由来担体には、セルロ
ース、セフアローズ、デキストラン、デンプン、
アルギン酸、キチン等の単純多等類およびその誘
導体、寒天、ペクチン、コンニヤク、アラビゴム
等の複合多等類およびその誘導体、羊毛、絹蛋白
等の蛋白質およびその誘導体があるが、これらは
必要に応じ、架橋反応等の不溶化処理をした後、
担体に用いる。また、合成高分子にあつては、ビニル系高分子
には、スチレン、酢酸ビニル、メタクリル酸エス
テル、アクリル酸エステル、ハロゲン化ビニル、
ハロゲン化ビニリデン、アクリロニトリル、アク
リルアミド、メチルビニルケトン、ビニルピロリ
ドン、２−ビニルピリジン、エチレン、プロピレ
ン、ブタジエン、イソプレン等およびその誘導体
の重合体およびその共重合体があり、環状化合物
の開環重合体には、ジメチルシクロプロパン、ス
ピロ−ジ−０−キシリレン、ノルボルネン、シク
ロブテン、トリオキサン、ラクチド、シクロポリ
シロキサン、塩化ホスホニトリル、Ｎ−カルボキ
シ−α−アミノ酸無水物等およびその誘導体の重
合体および共重合体、ポリホルムアルデヒド、ポ
リエチレンオキシド、ポリプロピレングリコー
ル、ポリ−３，３−ビス（クロルメチル）オキサ
シクロブタン、ポリテトラヒドロフラン、ポリカ
プロラクタン等およびその誘導体がある。また、重縮合体には、ポリエステル、ポリアミ
ド、ポリアンヒドリド、ポリカーボネート、ポリ
尿素、ポリスルホンアミド、ポリイミド、ポリベ
ンゾイミダゾール等およびその誘導体があげられ
る。樹脂その他のものにあつては、アクリル樹脂、
メタクリル樹脂、フツ素樹脂、エポキシ樹脂、尿
素樹脂、アミノ樹脂、スチレン樹脂、メラミン樹
脂、ポリウレタン、シリコン樹脂、アルキド樹脂
等およびその誘導体が例示できる。また、たとえば活性炭等に、PHEMA等をコ
ートした多層構造の不溶性担体も使用できる。オリゴ糖を不溶性担体の表面に固定する方法と
しては、共有結合、イオン結合、物理吸着等のあ
らゆる公知の方法を用いることができるが、オリ
ゴ糖の溶出性から考えると、共有結合で固定して
用いることが望ましい。そのためには通常固定化
酵素、アフイニテイクロマトグラフイで用いられ
る公知の方法を用いることができる。たとえば、
不溶性担体をエポキシ活性化し、これにオリゴ糖
を結合させる方法等を用いることができる。また
必要に応じて、不溶性担体とオリゴ糖の間に任意
の長さの分子（スペーサー）を導入して使用する
こともできる。本発明の誘導材の製造方法は、上記方法に限定
されるものではなく、たとえばビニルモノマーに
オリゴ糖を結合させ、これを重合させる方法、ま
た、たとえばリガンドを活性化して担体に結合さ
せる方法等の方法を用いることができ、本発明
は、誘導材の製造方法に規定されるものではな
い。本発明における白血球とは、血液細胞のうち赤
血球および血小板を除いた、いわゆる白血球を指
すが、この白血球より顆粒球あるいはＢ細胞を除
去した細胞分画も、本発明における白血球の概念
に含まれる。本発明において活性化を行なう白血
球は、公知の連続遠心分離法にて末梢血より採取
した白血球分画を用いてもよく、また公知のフイ
コールパーク重層遠心分離法にて分離した単核細
胞分画でもよく、あるいは末梢血単核細胞より公
知のノイラミニダーゼ処理羊赤血球とのロゼツト
形成で分離濃縮したＴ細胞分画を使用しても、強
力な腫瘍障害細胞の誘導が可能である。本発明において誘導活性化する腫瘍障害性細胞
は、白血球の中で顆粒球、単球、マクロフアージ
を除くリンパ球分画に属し、とりわけＴ細胞の性
質を有している。オリゴ糖結合不溶性担体による末梢血白血球の
活性化は、血清成分含有培地もしくはこれにイン
ターリユーキン２を添加した培地で行なうと強力
な腫瘍障害性細胞の誘導が可能である。すなわ
ち、牛胎児血清、牛血清、馬血清等の動物血清あ
るいはヒト血清を２〜20％含有した培地を調製す
る。好ましくはヒト血清を２〜20％含有した培地
を調製する。この場合の培地は、動物細胞培養に
一般的に用いられる培地、たとえば、RPMI1640
倍地、MEM培地等が使用できる。また、血清成
分たとえば、血清アルブミンを添加した
RPMI1640培地でも使用が可能である。調製した培地中に、種々の方法で採取した末梢
血白血球を0.5〜３×10⁶個／mlの細胞濃度で浮遊
させ、これに適当量のオリゴ糖結合不溶性担体を
添加し、濃度25〜45℃で培養を行なう。温度25℃
以下ではほとんど有効な白血球の活性化が起こら
ず、温度45℃以上では白血球の生存率が低下す
る。培養は市販の細胞培養用のプラスチツク製容
器を使用し、CO₂インキユベーター中で行なえば
簡便である。１日ないし数日培養を行なつた後、
活性化白血球を回収する。このようにして得た活性化白血球は、腫瘍細胞
を強力に殺すことが判明した。（発明の効果）本発明のオリゴ糖結合不溶性担体は、以上述べ
てきたように、白血球を刺激活性化して、安全か
つ操作性よく、強力な抗腫瘍免疫細胞を誘導する
ものであり、胃癌、肺癌、乳癌等の癌治療および
検査診断、研究等に用いようとするものである。（実施例）実施例１市販のぶた胃粘膜ムチン（シグマ）２ｇを
0.2N−NaOH（37℃、24時間）あるいはトリプシ
ン（37℃、24時間）で処理して分解し、60％の濃
度となるようにエタノールを加え、未分解のムチ
ンを沈澱させ、上清を濃縮乾固する。５mlの
0.2Mリン酸バツフアー（PH8.0）に溶解し、セフ
アデツクスＧ−50でゲルクロマトグラフイーを行
ない、各分画の糖濃度をフエノール硫酸法で測定
し、分子量500〜2000のオリゴ糖分画を集め濃縮
する。この操作により、ムチンからオリゴ糖20mg
を得た。このオリゴ糖10mgを公知の方法によつて
市販のエポキシ活性化セフアロース（フアルマシ
ア製）２mlに結合させ、誘導材を作成した。ヒト白血球は次のようにして得た。すなわち、
採血したヒト末梢血をハンクス液で２倍希釈し、
フイコールパーク液（フアルマシア社製）に重層
し、2000rpmで20分間遠心分離した後、中間層の
白血球層を分離して、これをハンクス液で洗つた
後、自己血清を10％添加したRPMI1640培地（ニ
ツスイ）に２×10⁶／mlの細胞濃度で浮遊させる。
この細胞浮遊液を１mlずつ、細胞培養用の２mlウ
エル（フアルコンNo.3047）に分注し、これにオリ
ゴ糖結合不溶性担体を50μずつ添加し、CO₂イ
ンキユベーター中で温度37℃で培養を行なう。３
日間培養を行なつた後、ピペツテイングを行なつ
て静置すると、担体は容器の底に沈澱するので、
上清細胞液をとり、これをハンクス液で洗つた
後、自己血清10％添加RPMI培地に５×10⁶／ml
の細胞濃度で浮遊させる。この活性化白血球が腫瘍細胞障害性を有するか
どうかは、次のようなキラー活性測定法を用いて
評価した。培養プレートに付着して増殖する種々
のヒト癌細胞株を標的細胞として、５×10⁴／ml
の細胞濃度で10％牛胎児血清添加RPMI1640培地
に浮遊させ、これを10μずつ10μ容テラサキ
プレートに分注し、CO₂インキユベーター中で温
度37℃で培養する。24時間培養を行なうと、癌細
胞は培養プレート底面に強く付着する。これを培
養液で洗つた後、活性化白血球浮遊液10μを添
加し、37℃で４時間、CO₂インキユベーター中で
培養し、プレートに付着している癌細胞を障害さ
せる。障害を受けた癌細胞は、プレート底面への
付着性を喪失し、ハンクス液で洗うと活性化白血
球とともに除去される。生残してプレート体面に
付着している癌細胞をアセトンで固定し、ギムザ
液で染色した後、顕微鏡で計数する。キラー活性
は次式により計算する。キラー活性＝（１−活性化白血球を添加した場合の生
残腫瘍細胞数／活性化白血球を添加しない場合の生残腫
瘍細胞数）×100（％）このような方法を用いて、オリゴ糖結合不溶性
担体で活性化した免疫細胞の腫瘍細胞障害活性を
測定したところ、MKN−１ヒト胃癌細胞に対し
て50％の障害活性を示した。実施例２実施例１と同様にして作成したオリゴ糖結合担
体を、実施例１と同様にしてBALB／Ｃマウス
より採取した脾細胞（５×10⁶／ml，10％FCS含
有RPMI培地に浮遊）に、培地１mlあたり50μ
添加し、４日間の培養を行なつた。活性化白血球
のBALB／Ｃ由来同系腫瘍colon26に対するキラ
ー活性を測定したところ、58％の障害活性を示し
た。実施例３なる構造のオリゴ糖を公知の方法〔A.Kobata
＆ V.Ginsburg，J.Biol.Chem.244，5496
（1969）〕によつて合成し、実施例１と同様にし
て、オリゴ糖10mgをエポキシ活性化セフアロース
２mlに結合させ誘導材を作成し、ヒト白血球を３
日間刺激した。得られた活性化白血球のPC−10
ヒト肺癌細胞に対するキラー活性を測定したとこ
ろ、62％の障害活性を示した。

Claims

【特許請求の範囲】

１表面にオリゴ糖部分を有することを特徴とす
る抗腫瘍免疫細胞誘導材。