JPS6193121A - 抗腫瘍免疫細胞誘導材 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、白血球を活性化して抗腫瘍免疫細胞を誘導す
る機能を持つ抗腫瘍免疫細胞誘導材に関する。

（従来の技術） 周知のように、生体の悪性腫瘍に対する免疫監視機構を
荷う抗腫瘍免疫細胞としては、キラーＴ細胞、ＮＫ細胞
、活性化マクロファージ、Ｋ１［１胞等が重要な役割を
はたしていることが報告されている〔福沢正洋：医学の
あゆみ、１２６．４２０（’８３））。したがって、悪
性腫瘍に対する免疫学的療法としては、癌患者免疫細胞
（白血球）を活性化して、これらの抗腫瘍免疫細胞を効
率的に誘導活性化することが考えられる。しかしながら
、実際の癌患者体内においては、このような悪性腫瘍に
対する免疫監視機構の存在にもかかわらず腫瘍細胞が増
殖する。

その主要なメカニズムの一つとして、腫瘍細胞による免
疫抑制性細胞（サプレッサーＴ細胞、サプレッサーマク
ロファージ等）の誘導活性化が報告されている。　（Ｓ
、　Ｆｕｊｉｍｏｔｏ　ｅｔａｌ　：　Ｊ、Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ＋１１６、　７９１　　（’７６））。かかる免疫
抑制性細胞は、腫瘍細胞を障害する機能を荷う種々の抗
腫瘍免疫細胞の誘導活性化を抑制し、ために腫ｙＡｔＩ
！ｌ胞の増殖を許し、ますます腫瘍に対する免疫応答能
の低下をまねくと考えられる。また、その他のメカニズ
ムとして、腫瘍細胞による免疫抑制性因子の産生により
、腫瘍細胞に対する免疫応答が抑制されている可能性も
報告されており（Ｊ、Ａ、Ｒｏｔｈｅｔａｌ　：　　Ｊ
、Ｉｍｍｕｎｏｌ、　　１２８．　１９５５　　（’８
２））、かかる免疫抑制状態下にある癌患者体内におい
ては、効率的な抗腫瘍免疫細胞の誘導活性化は困難であ
ると言わなければならない。

したがって、免疫抑制のない抗腫瘍免疫細胞誘導活性化
に最適な条件を体外に設定し、癌患者から取り出した白
血球を刺激活性化して、強力な抗腫瘍免疫細胞を誘導し
、これを元の癌患者にもどすことによって癌を治療しよ
うとする方法は、効果の高い新しい癌免疫療法となる可
能性を有すると考えられる。

（発明が解決しようとする問題点） 体外に取り出した白血球を刺激活性化して抗腫瘍免疫細
胞を誘導活性化し、これを担癌生体に投与して癌を治療
しようとする試みは、現在活発に研究が行なわれている
が、白血球の刺激活性化に担癌生体より抽出した腫瘍細
胞を用いており、非常に操作が煩雑である。

（問題を解決するための手段） 本発明者らは、前記の問題を解決するために鋭意研究し
た結果、驚くべきことに、オリゴ糖を不溶性担体に共有
結合で固定した誘導材で白血球を刺激活性化することに
より、強力な抗腫瘍免疫細胞が誘導されることを見い出
し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、表面にオリゴ糖部分を有すること
を特徴とする抗腫瘍免疫細胞誘導材に係る。

本発明の銹ｍ材表面のオリゴ糖は、Ｎ−アセチルグルコ
サミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、
フコース、マンノース、グルコース、シアル酸の中の三
つ以上から構成される。たとえば、シアル酸、ガラクト
ース、Ｎ−アセチルグルコサミン、フコースから成るオ
リゴ１店、あるいはガラクトース、Ｎ−アセチルグルコ
サミン、フコースから成るオリゴ糖であり、たとえば、
Ｇａｌβ１　＝　４　ＧｌｃＮ　Ａｃ７？　１　＝　３
　Ｇａｌβ１↑ Ｆｕｃα１ の構造を有するオリゴ糖である。誘導材表面のオリゴ糖
の分子量は１万以下のものを使用する。好ましくは５千
以下がよく、さらに好ましくは、分子量２千以下のオリ
ゴ糖がよい。また、たとえば、動物の粘膜より得られる
オリゴ糖等を不溶性担体に結合したものは、強力な誘導
材として用いることができる。本発明の誘導材は、上記
に限定されるものではなく、オリゴ等を不溶性担体表面
に有する誘導材は、強力な誘導材として使用できる。

本発明における誘導材表面とは、不溶性担体において白
血球が接触可能な部分である。

本発明で用いられる不溶性担体は、親木性担体、疏水性
担体いずれも使用できるが、疏水性担体を用いる場合に
は、特に担体への血清成分の非特異的吸着が生じるため
、親水性担体の方が好ましい結果を与える。不溶性担体
の形状は、粒子状、繊維状、中空糸状、膜状等いずれの
公知の形状も用いることができる。粒状もしくは球状不
溶性担体としては、粒径１ミクロン〜３０００ミクロン
のものが使用できる。粒径１ミクロン以下では活性化白
血球との分離が困難である。とくに粒径５０ミクロン以
上であれば、容易に活性化白血球との濾過分離が可能で
あり、粒径３０００ミクロン以上では、白血球との担体
華位重量あたりの接触面積が低下するため好ましくない
。粒径８０〜２０００ミクロンのものが本発明において
最も良好である。また、粒状もしくは球状不溶性担体の
比重が１．０７以上であれば、容易に活性化白血球との
遠心もしくは静置による分離が可能である。また、平膜
状あるいは中空糸状多孔性担体を使用する場合、その孔
径が、細胞は通過できないが培地成分は自由に通過でき
６０．０５〜１０ミクロンのものを使用すれば、膜の一
方の面に結合した白血球に膜の他方の面より栄養を補給
でき、高濃度の白血球を刺激活性化することが可能であ
る。さらに好ましくは、０．１〜５ミクロンの孔径の平
膜状あるいは中空糸状の多孔性担体が良好に使用できる
。

不溶性担体の材質としては、リガンドを固定化するため
に、担体が活性化でき、担体の活性化反応、固定化反応
などを含めた全工程を通じて物理的に安定であればよい
。具体的には、無機ベースのものにあっては、活性炭、
ガラス等およびその誘ｍ体であり、天然高分子由来担体
には、セルロース、セファローズ、デキストラン、デン
プン、アルギン酸、キチン等の単純多等頬およびその誘
導体、寒天、ペクチン、コンニャク、アラビゴム等の複
合条等類およびその誘導体、羊毛、聞蛋白等の蛋白質お
よびその誘導体があるが、これらは必要に応し、架橋反
応等の不溶化処理をした後、担体に用いる。

また、合成高分子にあっては、ビニル系高分子には、ス
チレン、酢酸ビニル、メタクリル酸エステル、アクリル
酸エステル、ハロゲン化ビニル、ハロゲン化ビニリデン
、アクリロニトリル、アクリルアミド、メチルビニルケ
トン、ビニルピロリドン、２−ビニルピリジン、エチレ
ン、プロピレン、ブタジェン、イソプレン等およびその
誘導体の重合体および共重合体があり、環状化合物の開
環重合体には、ジメチルシクロプロパン、スピロ−ジー
〇−キシリレン、ノルボルネン、シクロブテン、トリオ
キサン、ラクチド、シクロポリシロキサン、塩化ホスホ
ニトリル、Ｎ−カルボキシ−α−アミノ酸無水物等およ
びその誘導体の重合体および共重合体、ポリホルムアル
デヒド、ポリエチレンオキシド、ポリプロピレングリコ
ール、ボＩＪ−３．３−ビス（クロルメチル）オキサシ
クーロブタン、ポリテトラヒドロフラン、ポリカプロラ
クタム等およびその誘導体がある。

また、重縮合体には、ポリエステル、ポリアミド、ポリ
アンヒドリド、ポリカーボネート、ポリ尿素、ポリスル
ホンアミド、ポリイミド、ポリベンゾイミダゾール等お
よびその’Ｇｇ　導体があげられる。

樹脂その他のものにあっては、アクリル樹脂、メタクリ
ル樹脂、フッ素樹脂、エポキシ樹脂、尿素樹脂、アミノ
樹脂、スチレン樹脂、メラミン樹脂、ポリウレタン、シ
リコン樹脂、アルキド樹脂等およびその誘導体が例示で
きる。

また、たとえば活性炭等に、ＰＨＥＭＡ等をコートシた
多層構造の不溶性担体も使用できる。

オリゴ糖を不溶性担体の表面に固定する方法としては、
共有結合、イオン結合、物理吸着等のあらゆる公知の方
法を用いることができるが、オリゴ糖の溶出性から考え
ると、共有結合で固定して用いることが望ましい。その
ためには通常固定化酵素、アフイニテイクロマトグラフ
イで用いられる公知の方法を用いることができる。たと
えば、不溶性担体をエポキシ活性化し、これにオリゴ糖
を結合させる方法等を用いることができる。また必要に
応じて、不溶性担体とオリゴ糖の間に任意の長さの分子
（スペーサー）を導入して使用することもできる。

本発明の誘導材の製造方法は、上記方法に限定されるも
のではなく、たとえばビニルモノマーにオリゴ糖を結合
させ、これを重合させる方法、また、たとえばリガンド
を活性化して担体に結合させる方法等の方法を用いるこ
とができ、本発明は、誘導材の製造方法に規定されるも
のではない。

本発明における白血球とは、血液細胞のうち赤血球およ
び血小板を除いた、いわゆる白血球を指すが、この白血
球より顆粒球あるいはＢ１１１胞を除去した細胞分画も
、本発明における白血球の概念に含まれる。本発明にお
いて活性化を行なう白血球は、公知の連続遠心分離法に
て末梢血より採取した白血球分画を用いてもよく、また
公知のフィコールパーク重層遠心分離法にて分離した単
核細胞分画でもよく、あるいは末梢血単核細胞より公知
のノイラミニダーゼ処理羊赤血球とのロゼツト形成で分
離濃縮したＴ細胞分画を使用しても、強力な腫瘍障害性
細胞の誘導が可能である。

本発明において誘魯活性化する腫瘍障害性細胞は、白血
球の中で顆粒球、単球、マクロファージを除くリンパ球
分画に属し、とりわけＴ細胞の性質を有している。

オリゴ糖結合不溶性担体による末梢血白血球の活性化は
、血清成分含有培地もしくはこれにインターリューキン
２を添加した培地で行なうと強力な腫瘍障害性細胞の誘
導が可能である。すなわち、牛胎児血清、牛血端、馬血
清等の動物血清あるいはヒト血清を２〜２０％含有した
培地を調製する。

好ましくはヒト血清を２〜２０％含有した培地を調製す
る。この場合の培地は、動物細胞培養に一般的に用いら
れる培地、たとえば、ＲＰ　Ｍ　Ｉ　１６４０培地、Ｍ
ＥＭ培地等が使用できる。また、血清成分たとえば、血
゛清アルブミンを添加したＲ　Ｐ　Ｍ　１１６４０培地
でも使用が可能である。

調製した培地中に、種々の方法で採取した末梢血白血球
を０．５〜３×１０ｂ個／ｍｌの細胞濃度で浮遊させ、
これに適当量のオリゴ糖結合不溶性担体を添加し、温度
２５〜４５℃で培養を行なう。温度２５℃以下ではほと
んど有効な白血球の活性化が起こらず、温度４５℃以上
では白血球の生存率が低下する。培養は市販の細胞培養
用のプラスチック製容器を使用し、ＣＯ□インキュヘー
ター中で行なえば簡便である。１日ないし数日培養を行
なった後、活性化白血球を回収する。

このようにして得た活性化白血球は、腫瘍細胞を強力に
殺すことが判明した。

（発明の効果） 本発明のオリゴ糖結合不溶性担体は、以上述べてきたよ
うに、白血球を刺激活性化して、安全かつ操作性よく、
強力な抗腫瘍免疫細胞を誘専するものであり、胃癌、肺
癌、乳癌等の癌治療および検査診断、研究等に用いよう
とするものである。

（実施例） 実施例１ 市販のぶた胃粘膜ムチン（シグマ）２ｇを０．２Ｎ−Ｎ
ａＯＨ，（３７℃、２４時間）あるいはトリプシン（３
７℃、２４時間）で処理して分解し、６０％の濃度とな
るようにエタノールを加え、未分解のムチンを沈澱させ
、上清を濃縮乾固する。５ｍｌの０．２Ｍリン酸バッフ
ァー（ｐＨ８，０）に？容器し、セファデックスＧ−５
０でゲルクロマトグラフィーを行ない、各分画の糖濃度
をフェノール硫酸法で測定し、分子量５００〜２０００
のオリゴ糖分画を集め濃縮する。

この操作により、ムチンからオリゴｔＦｉ２０ｍｇを得
た。

このオリゴＦ’１０ｍｇを公知の方法によって市販のエ
ポキシ活性化セファロース（ファルマシア製）２ｍｌに
結合させ、誘導材を作成した。

ヒト白血球は次のようにして得た。すなわち、採血した
ヒト末梢血をハンクス液で２倍希釈し、フィコールパー
ク液（ファルマシア社製）に重層し、２００Ｏｒｐｍで
２０分間遠心分離した後、中間層の白血球層を分離して
、これをハンクス液で洗った後、自己血清を１０％添加
したＲＰＭ１１６４０培地にツスイ）に２　Ｘｌ０６／
ｍｌの細胞濃度で浮遊させる。この細胞浮遊液を１ｍｌ
ずつ、細胞培養用の２ｍｌウェル（ファルコンＮｌ１３
０４７）に分注し、これにオリゴ糖結合不溶性担体を５
０μβずつ添加し、ＣＯ２インキュベーター中で温度３
７℃で培養を行なう。３日間培養を行なった後、ピペッ
ティングを行なって静置すると、担体は容器の底に沈澱
するので、上清細胞液をとり、これをハンクス液で洗っ
た後、自己血清１０％添加ＲＰＭＩ培地に５×１０’　
／ｍｌの細胞濃度で浮遊させる。

この活性化白血球が腫瘍細胞障害性を有するか“どうか
は、次のようなキラー活性測定法を用いて評価した。培
養プレートに付着して増殖する種々のヒトＭ細胞株を標
的細胞として、５Ｘ１０’／ｍｌの細胞濃度でｌθ％牛
脂児血清添加ＲＰ　Ｍ　Ｉ　１６４０培地に浮遊させ、
これを１０μβずつ１０μｌ容テラサキプレートに分注
し、ＣＯｚインキュベ−９−中で温度３７℃で培養する
。２４時間培養を行なうと、癌細胞は培養プレート底面
に強く付着する。これを培養液で洗った後、活性化白血
球浮遊液１０Ｉｔｌを添加し、３７℃で４時間、ＣＯｚ
インキュベーク−中で培養し、プレートに付着している
癌細胞を障害させる。障害を受けた癌細胞は、プレート
底面への付着性を喪失し、ハンクス液で洗うと活性が白
血球ととも、工除去され、。１残し−Ｃ７’、−ト体面
に付着している癌細胞をアセトンで固定し、ギムザ液で
染色した後、顕微鏡で計数する。キラー活性は次式によ
り計算する。

このような方法を用いて、オリゴ糖結合不溶性担体で活
性化した免疫細胞の腫瘍細胞障害活性を測定したところ
、ＭＫＮ−１ヒト胃癌細胞に対して５０％の障害活性を
示した。

実施例２ 実施例１と同様にして作成したオリゴ糖結合担体を、実
施例１と同様にしてＢＡＬＢ／Ｃマウスより採取り、り
肺細胞（５Ｘ　１０ｈ／　ｍｌ、　１０％　Ｆ　ＣＳ含
有ＲＰＭＩ培地に浮遊）に、培地１ｍｌあたり５０μｌ
添加し、４日間の培養を行なった。活性化白血球のＢ　
Ａ　Ｌ　Ｂ／Ｃ由来同系腫瘍ｃｏｌｏｎ２６に対するキ
ラー活性を測定したところ、５８％の障害活性を示した
。

実施例３ Ｇａｌβｌ　−”　４　ＧｌｃＮ　Ａｃβ１−３Ｇａｌ
β１↑ Ｆｕｃα１ なる構造のオリゴ糖を公知の方法によって合成し、実施
例１と同様にして、オリゴ糖１０ｍｇをエポキシ活性化
セファロース２ｍｌに結合させ誘導材を作成し、ヒト白
血球を３日間刺激した。得られた活性−化白血球のＰＣ
−１０ヒト肺癌細胞に対するキラー活性を測定したとこ
ろ、６２％の障害活性を示した。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 表面にオリゴ糖部分を有することを特徴とする抗腫瘍免
   疫細胞誘導材。