JPH0365190B2 - - Google Patents

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JPH0365190B2
JPH0365190B2 JP61078425A JP7842586A JPH0365190B2 JP H0365190 B2 JPH0365190 B2 JP H0365190B2 JP 61078425 A JP61078425 A JP 61078425A JP 7842586 A JP7842586 A JP 7842586A JP H0365190 B2 JPH0365190 B2 JP H0365190B2
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Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 免疫グロブリン及び循環中の免疫複合体を除く
ための血液の体外処理は、種々の状況において有
用であろう。たとえば、いくらかの癌患者は、患
者自体のIgGと癌に関連する抗原とから成る特定
の免疫複合体を生じさせると思われる。そのよう
な複合体は患者の免疫系の機能を妨げそしてその
免疫系が癌に反応するのを防止すると思われる。
IgGを吸着するためのシステムを使用して、血液
からIgG複合体を取り除き、そして患者の生来の
免疫防御をそれらの本来の機能に取り戻すのを可
能にすることができる。さらに、種々の“自己免
疫”障害が、患者自身の体に対して特異的である
抗体の産生に関与する。重い損傷はそのような誤
つて指示された免疫反応からそして患者に疾病及
び死さえも引き起こす場合がある。抗体の免疫吸
着法は身体を一層の損傷から保護することができ
る。 これらの理由のために、患者の血液から抗体を
取り除くことを促進するシステムを供給すること
が所望される。その装置は、使用するのに、殺菌
するのに、そして処理されるべき血液中への毒性
物質の放出を避けるのに便利であることが特に好
ましい。 〔従来の技術〕 カラムに充填されている、熱及びホルマリン処
理されたスタフイロコーカス アウレウス
（staphylococcus aureus）Cowan Ｉが血液から
IgGの除去のために使用された。たとえば、
Jonesなど、Cancer（1980）46：675〜684；Ray
など、Cancer（1980）45：2633〜2638；及び
Holohanなど、Cancer Res.（1982）42：3663〜
3668を参照のこと。そのようなシステムは多くの
欠点を有する。カラムを通過する血清の流量はお
そく、そしてカラムは詰まりやすい。さらに、多
分、毒性細菌性細胞壁成分が潅流過程の間、血液
中に浸出するであろう。改良されたシステムが
Termanなど、N.Engl．J.Med．（1981）305：
1195〜1200によつて記載されている。プロテイン
Ａが木炭マトリツクス内に取り込まれ、そして血
漿を処理するために使用される。しかしながら、
このシステムは殺菌するのがむずかしく、そして
患者の血液中にプロテインＡの有意な損失がある
ように思える〔Balintなど、Cancer Res．
（1984）44：734〜743〕。抗−Ａ抗体及び抗−Ｂ抗
体の除去のための血液処理システムがBensinger
など、N.Engl.J.Med．（1981）304：160〜162及
びBensingerなど、J.Clin.Apheresis（1982）
１：２〜５によつて記載されている。免疫吸着法
システムはシリカマトリツクスに共有的に結合し
た合成ヒト血液群抗原を使用する。体外免疫吸着
法のためにプロテインＡ−シリカカラムの使用が
Bensingerなど、N.Engl.J.Med．（1982）306：
935によつて手短に報告されている。Pharmacia
Fine Chemicals、Uppsala、Swedenによつて出
版された“マフイニテイ クロマトグラフイー−
原理及び方法”は、Sepharose と結合している
カルボジイミドが約4.5のPHで最つともよく実施
されることを教示する。 〔発明の要約〕 この発明は、免疫吸着剤を調製するための方法
及び該免疫吸着剤を用いて生物学的流体、たとえ
ば血液及び血漿からIgG及びIgG−複合体の体外
除去を行うシステムを提供する。そのような処理
は、種々の自己免疫障害の治療及び血液中に免疫
グロブリン複合体の存在が癌に対する患者の免疫
反応を抑制しているらしい場合の癌の治療のため
に有用であろう。さらに、この方法及びシステム
は、種々の状況下で、たとえば輸血の前に望まし
くない免疫グロブリンを取り除くために血漿を処
理するために使用されるであろう。 この発明のシステムは、特定の条件下で固相マ
トリツクスに共有結合した精製されたプロテイン
Ａを含んで成る免疫吸着剤を使用する。固相マト
リツクスは非晶質シリカ又は結晶質シリカのいづ
れかであり、そして共有結合は、免疫吸着材の結
合活性及び容量を最大にすることが見出されてい
る条件下で固相マトリツクスを適切に誘導体化
し、そしてプロテインを連結することによつて達
成される。このようにして形成された免疫吸着剤
は、免疫グロブリンの吸着のためにひじように高
い容量を有し、ひじように安定であり且つ生物学
的流体中に結合タンパク質を放さず、非毒性であ
り、そして次の取扱の間、微粉を発生せしめな
い。さらに、次に、この調製された吸着剤を、自
然乾燥し、生物適合性カートリツジ中に負荷し、
そしてガス殺菌することができる。次に、この装
置を、無菌状態で輸送し、使用する場所で再水和
化し、そして１回の使用で廃棄できる方式で臨床
的処理のために使用することができる。 〔特定の態様の説明〕 IgG及びIgG−複合体を除去するための、生物
学的流体、たとえば血漿の対外処理のために新規
免疫吸着材をその中に有する免疫吸着性カラムを
提供する。連続的に患者の血液を取り出し、それ
らから血液細胞を分離し、免疫吸着性カラム中に
おいてその分離された血漿を処理し、IgG及び
IgG−複合体を取り除き、そしてその処理された
血漿と血液細胞とを混合し、そして直接的に患者
に戻すことによつて前記処理を提供することがで
きる。他方、血液が取り出されそしてその血液細
胞が分離された後、その血液細胞は患者に直接的
に再注入され得る。その分離された血漿は集めら
れ、この発明の免疫吸着性カラムにより処理さ
れ、再び集められ、そして次にできるだけ早く患
者に戻されるであろう。 この発明の新規免疫吸着材は、使用の間、カラ
ムからプロテインＡ及び他の物質の漏れを最小に
しながら、プロテインＡの活性及びカラムの結合
能力を最大にすることが見出される特定の条件下
で、固相シリカマトリツクスに共有的に結合する
プロテインＡを含んで成る。 プロテインＡは、スタフイロコーカス アウレ
ウスの特定の菌株から単離され、そして遊離性
IgG及びIgG−複合体を結合することができる細
胞表面タンパク質である。IgG−複合体は、患者
血清中で循環し、そして免疫系の通常の貧食機能
によつて取り除かれない抗原−IgG複合体であ
る。上に記載したように、そのような循環性IgG
−複合体の除去は、種々の障害、たとえば自己免
疫障害及び癌の治療において有用である。この発
明の免疫吸着材は、少なくともIgG5mg／吸着材
１ｇ、普通７mg／１ｇ又はそれよりも大きな結合
容量を有するであろう。この発明の免疫吸着シス
テムは、血漿を処理することによつて循環性IgG
−複合体約750〜1500mgまで、普通約1000mgの除
去を可能にする。 スタフイロコーカス アウレウス、たとえばS.
アウレウスCowan Ｉ、の培養物から細胞を収得
し、そして適切な溶菌剤、たとえばライソスタフ
インにより溶解することによつて、プロテインＡ
を得ることができる。次に、このプロテインＡを
いずれかの適切な技法、たとえば分子篩クロマト
グラフイーと結合されたイオン交換によつて90〜
99％、普通約95％の最終純度に精製することがで
きる。一方、適切に精製されたプロテインＡを、
多くの商業的供給者、たとえばワシントン州シア
トルのIMRE Corporationから得ることができ
る。 固相シリカマトリツクスは実質的に、非晶質シ
リカ、たとえばコロイド状シリカ、シリカゲル、
沈降シリカ、及びヒユームドシリカ又は熱分解法
シリカ；微晶質シリカ、たとえば珪藻土；及び結
晶質シリカ、たとえば石英を含む任意の形の粒状
シリカを含んで成るであろう。シリカは約45〜
120メツシユの範囲、普通45〜60メツシユの範囲
の粒子サイズを持つべきである。 好ましい態様においては、免疫吸着剤の固相マ
トリツクスは珪藻土凝集体から形成されるであろ
う。普通、使用の間免疫吸着剤の破壊及び分解を
少なくするために珪藻土材料を焼成し、すべての
残存する有機物質を除き、そして前記凝集体の長
面を硬化せしめるであろう。この珪藻土材料は主
としてシリカ（＝酸化珪素）及びそれより少量の
他の鉱物、たとえば酸化アルミニウム、酸化カル
シウム、酸化マグネシウム、酸化第二鉄、及び同
様のものから成るであろう。普通、珪藻土材料
は、少なくとも80重量％のシリカ、及び５重量％
よりも少ない他の鉱物を含んで成るであろう。他
の不純物は珪藻土中に存在することができるが、
しかしそのような不純物が処理される生物学的流
体に対して非毒性であり且つ非分解性であるよう
に注意すべきである。特に適切な固相シリカ（珪
藻土）マトリツクスを商標Chromosorb として
Johns−Manville Corporationから得ることがで
きる。 プロテインＡは、マトリツクスを誘導体化し
て、活性反応官能基を導入しそしてその誘導体化
されたマトリツクスとカツプリング剤とを反応せ
しめることによつて、又はプロテインＡをマトリ
ツクスに結合せしめる化学的条件下で、固相シリ
カマトリツクスに共有結合せしめる。そのような
結合のための典型的な方法は次のとおりである。 アミノ基を反応官能基としていずれかの適切な
方法によつてシリカマトリツクスに導入すること
ができる。たとえば、まずシリカマトリツクスを
酸により洗浄し、次に水により十分にすすぎ、そ
して乾燥せしめる。次に、酸により洗浄されたシ
リカを、アミノシラン、たとえばγ−アミノプロ
ピルトリエトキシシランの５％〜10％溶液中にお
いて反応せしめ、そしてPHを約3.0に調整する。
約75℃で２時間のインキユベーシヨンの後、その
シリカマトリツクスを再び水により十分に洗浄
し、そして100℃で１晩乾燥せしめる。 すぐ上に記載したようなアミノ誘導材料と無水
コハク酸とを次のようにしてさらに反応せしめる
ことによつてカルボキシル基を反応官能基として
シリカマトリツクスに導入することができる。シ
リカマトリツクスと適切な緩衝液、たとえば
0.5Mのリン酸緩衝液中において無水琥珀酸とを
混合し、そしてPHを約6.0に調整する。室温で12
〜16時間後、シリカマトリツクスを十分に洗浄
し、そして乾燥せしめる。 水酸基を（マトリツクスの本来の構造中に存在
するこれらの水酸基の他に）いずれか適切な方法
によつてシリカマトリツクスに導入することがで
きる。たとえば、まずシリカマトリツクスを酸に
より洗浄し、水により十分にすすぎ、そして乾燥
せしめる。次に、酸により洗浄されたシリカをシ
ラン、たとえばγ−グリシドオキシプロピルトリ
メトキシシランの５〜10％溶液中において反応せ
しめる。75℃で２時間のインキユベーシヨンの後
そのシリカマトリツクスを再び水により十分に洗
浄し、そして100℃で乾燥せしめる。 いつたんシリカマトリツクスがアミノ基及び／
又はカルボキシル基のいづれかにより誘導体化さ
れた後、プロテインＡを、マトリツクスとプロテ
インＡとの間に共有結合を形成するカルボジイミ
ドとの反応により導入する。カルボジイミドは次
の式： R′−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−R″ 〔式中、R′及びR″は同じか又は異なることがで
き、そしてアルキル、置換アルキル、ベンジル、
置換ベンジル、又は水素のいずれかである〕を有
するであろう。アルキル又は置換アルキルは線
状、分枝又は環状であることができ、そしてＲは
普通、16個よりも少ない原子、より一般的には12
個よりも少ない水素以外の原子、及び６個又はそ
れよりも少ないヘテロ原子（すなわち、炭素及び
水素以外の原子）を有するであろう。置換ベンジ
ルの場合、Ｒは普通、３又はそれよりも少ない置
換基を有し、そしてこの置換基は典型的にはハロ
ゲン原子であろう。適切なカルボジイミドは当業
界において良く知られている。好ましいカルボジ
イミドは１−シクロヘキシル−３−（２−モルホ
リノエチル）カルボジイミドメト−ｐ−トルエン
スルホネートである。 アミノ−誘導体化マトリツクスのための結合反
応を次の条件下で実施する。プロテインＡをカル
ボジイミドの存在下において水中で混合する。こ
の溶液のPHを3.5〜4.5の範囲に、普通3.5に調整
し、そしてシリカマトリツクスを導入し、そして
室温で長時間、普通約15〜30時間、より一般的に
は約20〜25時間穏やかに混合する。次に、このマ
トリツクスを水により十分に洗浄し、乾燥せし
め、そして約2.0〜2.5、普通約2.25のPHの酸によ
り洗浄し、シリカマトリツクスに非共有的に結合
されている不安定タンパク質及び他の物質を取り
除く。次に、最後に、この材料を洗浄し、乾燥せ
しめ、そして発熱物質の存在について調べる。発
熱物質の存在についての適切な試験は、P.O.Box
546、Marmoro、New Jersey 08222のMarine
Biologicals、Inc.からキツトとして商業的に入手
可能なリムルス アムベオサイト ライセート
〔limulus ambeocyte lysate（LAL）〕試験であ
る。 カルボキシル−誘導体化シリカマトリツクスに
ついての結合方法は次のとおりである。カルボジ
イミド（上記のような）を水に溶解し、そしてそ
の溶液を3.5〜4.5の範囲に、普通約3.5のPHに調整
する。シリカマトリツクスを導入した後、その溶
液を室温で長時間、普通約10〜25時間、より一般
的には約12〜20時間穏やかに混合する。次に、こ
のシリカマトリツクスを取り出し、そして水によ
り十分に洗浄する。次に、プロテインＡを水に溶
解し、PHを3.5〜4.5の範囲に、普通約3.5に調整
し、そして前記シリカマトリツクスを添加し、そ
して室温で約15〜30時間、普通約20〜25時間混合
する。次に、シリカマトリツクスを水により十分
に洗浄し、乾燥せしめ、そして酸洗浄後（2.0〜
2.5、普通約2.25のPH）により１度洗浄し、非共
有的に結合するプロテインＡ及び他の物質を取り
除く。次に、最後にこのシリカマトリツクスを洗
浄し、そして発熱物質について調べる。 水酸基−誘導体化シリカマトリツクスについて
の結合方法は次のとおりである。臭化シアンを水
に溶解する。シリカマトリツクスを水に添加し、
そしてPHを11.0に調整する。臭化シアン溶液を前
記シリカマトリツクス溶液に添加し、このシリカ
粒子を懸濁状に保持しながら該混合物を絶えず撹
拌し、そしてPHが安定するまでNaOHの添加に
よつてPHを11.0〜11.5の間に維持する。活性化さ
れたシリカマトリツクスを水により十分に洗浄
し、8.5〜9.0に調整されたPHを有するプロテイン
Ａ溶液と共に混合し、そして25℃で１晩混合す
る。結合した後、このマトリツクスを水により十
分に洗浄し、乾燥せしめ、そしてPH＝2.5の酸洗
浄液により１度洗浄し、非共有的に結合し且つ酸
不安定性プロテインＡ結合体を取り除く。最後
に、このシリカマトリツクスを洗浄し、そして発
熱物質について調べる。 この後実験部に説明されているように、シリカ
マトリツクス上のアミノ及び／又はカルボキシル
官能基へのプロテインＡの結合のためには、3.5
〜4.5のPH範囲が臨界的である。同様に、8.5〜9.0
の範囲のPHで水酸基官能基へのプロテインＡの結
合もまた臨界的である。PHがこれらの狭い範囲以
外に外れる場合、結合の効率及びプロテインＡの
保持された活性度の両者は、減少する。さらに、
約2.0〜2.5の範囲のPHを有する緩衝洗浄液は、シ
リカマトリツクスから非共有的に結合する物質、
特に開裂性不安定プロテインＡ結合体を好都合に
は除去する。従つて、酸処理は、結合されたIgG
及びIgG−複合体をカラム内に保持し、そして処
理される血清中へのプロテインＡの損失を避ける
ことができる安定した免疫吸着材を得るために重
要である。 今、第１図を参照すれば、ちようど上に記載さ
れているような免疫吸着材を含むための適切なカ
ートリツジ１０の構造が例示される。このカート
リツジは、シリンダー１２、一対の保持スクリー
ン１４、及び一対の端のキヤツプ１６を含んで成
る。おのおのの端のキヤツプ１６は、それらの１
つの表面から突起するフランジ要素１８及びそれ
らの他の長面から突起するコネクターニツプル２
０を含む。そのコネクターニツプルは、端のキヤ
ツプ１６を通つて入口／出口を構成する軸方向通
路２２を含む。 シリンダー１２はそれらのおのおのの端に輪形
溝２６を含む。おのおのの端のキヤツプ上のフラ
ンジ要素１８は、それらの内部のシリンダー表面
上に嵌め合いリング２８を含み、そしてこの嵌め
合いリングは、キヤツプがシリンダー１２の端上
に置かれる場合輪形溝２６にかみ合う。おのおの
のスクリーンはその円周の囲りにガスケツト３０
を含み、そしてこのガスケツトは、カートリツジ
１０が組み立てられる場合、端のキヤツプ１６と
シリンダー１２との間の密封部材として働く。カ
ートリツジ１０を組み立てる場合、第一のスクリ
ーン１４はシリンダー１２の１つの端上に置か
れ、そして端のキヤツプ１６はスクリーン１４上
に嵌められる。次に、シリンダー１２は上記のよ
うな免疫吸着性材料を充填され、そしてカートリ
ツジの組み立ては残るスクリーン１４及び端のキ
ヤツプ１６を適切に配置することによつて完結さ
れる。 カートリツジ１０の寸法は臨界的ではなく、そ
して免疫吸着材の目的の容積に依存するであろ
う。シリンダー１２の容積は典型的には、50〜
500c.c.の範囲であり、そして約４〜８cmの範囲の
直径及び約５〜10cmの範囲の長さを有する。 上記のようにして調製された適切な量の免疫吸
着材を含むカートリツジ１０を含んで成るカラム
１１（第２図）は、典型的にはガス滅菌剤、たと
えば酸化エチレンにより殺菌され、そしてすぐ使
用するか又は密封し、そして後で使用するために
貯蔵され得る。 使用の前、カラム１１は標準的生理的食塩水に
より、次にヘパリン又は他の適切な抗−凝集剤、
たとえば抗−凝集性シトレートデキストロース
（ACD）を含む標準的生理的食塩水によつて洗浄
されるであろう。次に、カラム１１は細胞分離器
４０（第２図）に連結され、それから分離された
血漿を受けることができる。この細胞分離器４０
は連続流れ細胞分離器、たとえばIBMモデル
2997（IBM、Armonk、New Yorkから入手でき
る）であり、又は血漿及び血液タンパク質の通過
を許容するが、但し、血液中の細胞性成分の通過
を妨げる半透膜を含んで成ることができる。半透
膜の場合、血液ポンプ４２が該膜を通して血液を
通過せしめるために必要とされるであろう。適切
な血液ポンプは、チユーブ及びペリスタル−ポン
プを含み、ここで血液は汚染を防ぐためにポンプ
装置から分離される。約２リツターの合計体積の
血液が通過するまで、血液は約10〜20ml／分の範
囲の速度まで細胞分離器４０を通過するであろ
う。この血液は処理用カラム１１から通過する血
漿と混合され、そしてこの再混合された血液は患
者へ戻される。典型的には、ミクロフイルター４
４を、処理用カラム１１の出口に備え付け、カラ
ム１１から失われるかも知れないマクロ粒子の通
過を妨げる。 次の例は制限的でなく例示的に示される。 実 験 １ 免疫吸着材の調製法 酸により洗浄されたシリカマトリツクス
（Chromosorb Ｐ、＃C5889、Johns−
Manville、1.15Kg）を計量し、一定量ずつ４つ
に分け、そして４つのFernback型フラスコに
移した。このマトリツクスを水により再水和化
し、そしておよそ150rpmで回転振盪機
（gyrotary shaker）上で１晩激しく振盪した。
この方法の後、シリカマトリツクスを水により
十分に洗浄し、発生した微粒子を取り除いた。
この方法は、シリカマトリツクス粒子の形をよ
り均一にし、そしてのちの処理方法においてほ
とんど微粉を発生しないマトリツクス粒子をも
たらすように思えた。洗浄の後、このシリカマ
トリツクスを適切なシランのおよそ５〜10％溶
液に添加し、75℃で２時間インキユベートし、
水により十分に洗浄し、そして115℃で乾熱乾
燥せしめた。 このシラン処理された乾燥シリカマトリツク
ス（１Kg）を再水和化し、そして水により十分
に洗浄し、発生した微粉を取り除いた。次に、
このシリカマトリツクスをプロテインA2ｇ及
びカルボジイミド〔１−シクロヘキシル−３−
（２−モルホリノエチル）カルボジイミド メ
ト−ｐ−トルエンスルホネート〕50ｇと共に混
合し、そしてその混合物のPHを3.5に調整した。
本発明者の研究は、3.5〜4.5のPH範囲がより高
いPH範囲（4.5〜5.0）に対してプロテインＡの
より高いパーセントの吸収率を生じた（77.42
％対67.49％の吸収率）を示した。プロテイン
Ａの起りうる酸による加水分解のために長時間
の結合インキユベーシヨンの間、低いPH範囲
（3.5以下）を避けた。 前記混合物を25℃で22時間ローラー装置上で
ゆつくりと回転せしめた。次に、このシリカマ
トリツクスを水により十分に洗浄し、37℃乾燥
せしめ、そしてプロテインＡの吸収率を測定し
た。乾燥後、PH＝2.5の酸性水３を前記シリ
カマトリツクスに添加し、25℃で５分間インキ
ユベートし、そしてこのマトリツクスから放さ
れるプロテインＡの量を測定した。そのマトリ
ツクスを水により十分に洗浄し、乾燥せしめ、
そしてシリカ１ｇ当りプロテインＡの量を測定
した。結果は次の通りであつた。： 結合したプロテインＡ ……1966mg 放されたプロテインＡ ……440mg プロテインＡ／吸着剤１ｇ ……1.5mg ２ 免疫吸着剤を使用する正常なヒト血清からの
TgG及びIgG複合体の分離 上記のようにして調製された免疫吸着剤を25
℃で５分間正常なヒト血清２mlと共にインキユ
ベートした。インキユベートの後、シリカマト
リツクスをPH7.5のリン酸緩衝溶液（PBS）160
mlにより洗浄した。結合したタンパク質を
PBS12.5mlにより溶出し、そしてPH＝7.5に中
和した。溶出された合計タンパク質は、
Lowryなど、J.Biol.Chem.（1951）193：265〜
272によつて記載されたようにして、およそ10
mgであることが測定された。この溶出されたタ
ンパク質をポリアクリルアミドゲル電気泳重力
にかけ、そして顕著なバンドが50KD及び
25KD（それぞれＨ鎖及びＬ鎖に対応する）に
検出された。IgGの存在をγ−鎖特異的抗−ヒ
トIgGを使用して二重免疫拡散分析によつて確
めた。 免疫吸着剤によるIgG複合体の除去を測定す
るために、正常なヒト血清2.5mlを熱−凝集し
たヒトIgGと共にインキユベートし、この凝集
体に補体を固定した。ンの結合体は免疫複合体
されたIgGとして挙動する。上記のようにして
調製された免疫吸着剤を、25℃で５分間熱−凝
集した血清0.8mlと共にインキユベートした。
2.4mlの合計体積が免疫吸着剤を通り抜けるま
でこれを３度くり返えし、そしてすべての血清
が免疫吸着剤を通り抜けるまで画分を集めた。
潅流前及び潅流後の血清画分中のIgG免疫複合
体をTheofilopoulosなど、J.Exp.Med．（1974）
140：1230〜1244によつて記載されているよう
なRaji細胞結合性IgG免疫複合体検定を使用し
て測定した。この結果を第１表に示す。 【表】 第１表に示されるように、血清の免疫複合体
レベルは免疫吸着剤を通り抜けることによつて
減少した。 ３ Kaposi肉腫を治療するためにカラムの治療
法的使用 進行した散在性Kaposi肉腫及び後先性免疫
不全症群（AIDS）を有する患者を上記のよう
にして調製されたプロテインＡカラムを介して
血漿潅流により処理した。処理の間観察される
免疫的変化及び腫瘍の変化を下に報告する。 患者は、広範なKaposi肉腫及びAIDSの病歴
を有する44才の同性愛の男性であつた。皮膚病
巣が最初に足及び脚並びに鼠経節部上にプロテ
インＡ治療の前26カ月に認められた。この時、
１週１回ビンブラスチンにより静脈内治療を開
始した。投与量は完全な血球算定に従つて調整
された。Kaposi肉腫は安定して存続し、そし
て１年間下肢に局在し、この時、少々の散在す
る病巣がゆつくりと前腕及び両ふくらはぎ上に
現われ始めた。６カ月後、鼠経節及び新しい恥
骨病巣の増大のために、クロラムブシル２mg
（b.i.d）を投与した。２カ月内に、結節は減少
し、そして皮膚病巣は安定し、そしてクロラム
ブシル投与を止めた。疾病の活性化が再びプロ
テインＡ治療の前、４カ月で進行し始め、そし
て新しい病巣が、ビンブラスチン注入を続けた
にもかかわらず、右脛骨上の古い病巣群の他
に、体幹、顔、脚、足、腕、及び手上に形成し
始まつた。呼吸困難及び乾燥性せきが３カ月の
ち現われ始まり、そしてＸ−線フイルムは新し
い両側の基部浸潤を示した。切開かれた肺のバ
イオプシはKaposi肉腫を有する肺の広範な関
与を示した。さらに皮膚病巣がほとんど毎日現
れ、そして患者の様態は悪化し続けた。 体外のプロテインＡ潅流処理について始める
時、患者の白血球細胞数は7500細胞／mm3であ
り、そしてそれは多形核白血球70％、バンド３
％、リンパ球11％、単球14％、及び好酸球２％
から成つた。ヘモグロビンレベル8.3ｇ／dl、
及びへマトクリツトは25.6％であり、そして血
小板数は87000個／mm3であつた。合計タンパク
質レベルは5.3ｇ％であり、アルブミンは2.8ｇ
％であり、そしてIgGレベルは1170mg％であつ
た。固相CIq−結合検定を用いて測定された循
環性免疫複合体（IgG−複合体）は、凝集性ヒ
トγ−グロブリン（AHG）の4.7μｇ当量であ
つた。補体レベルは55mg％（C3）及び６mg％
（C4）であつた。 循環性リンパ球に対するモノクローナル抗体
（Ortho−mune、Raritan、NJ）を有する免疫
蛍光研究は、全Ｔ−細胞（T3）58％、ヘルパ
ー／インデユーサーＴ−細胞（T4）12％、サ
プレツサー／細胞障害性Ｔ−細胞（T8）44％
示し、そしてT4／T8の比率は0.21であつた。 肺機能試験は2.46の強制肺活量（予想の51
％）及び１秒当り1.6の強制呼気量（予想の
45％）を示した。一酸化炭素の拡散力は正常の
57％であつた。室内の空気に基づいての動脈血
のガスは次のとおりであつた：すなわち62mm
HgのPo2、41mmHgのPco2、30.5ｍEq／Ｌの
HCO3及びPH＝7.48であつた。 体外免疫吸着方法を集中医療ユニツトに実施
した。Swan−Ganzカテーテルを肺動脈内に配
置し、血流力学的変化をモニターした。連続流
の血漿細胞分離器（IBM2997、Armonk、
NY）を用いて、抗凝血処理された血液を細胞
成分及び血漿に分離した。細胞成分は処理しな
いで戻した。血漿を、上記のようにして調製さ
れた、シリカに共有結合しているプロテイン
A200mgを含むカラムに通して潅流し、そして
患者に戻した。プロテインＡをスタフイロコー
カス アウレウスCowan Ｉの純粋培養からリ
ソスタフイン消化法を用いて単離した。プロテ
インＡの純度をポリアクリルアミドゲル電気泳
動によつて測定し、そしてIgG結合能力を測定
した。プロテインアＡをシリカに共有結合せし
め、生物適合性カートリツジに充填し、そして
酸化エチレンに暴露することによつて殺菌し
た。無菌性はバシラス サブチリス（Bacillus
subtilis）の胞子により含浸されたストリツ
プ（Raven Biological Laboratory、Omada、
NE）を用いて確められた。さらに使用のすぐ
前で、研究は、無菌で、発熱物質を含まない水
４によるカラムの十分な洗浄が検出可能な発
熱物質（リムルス アメーバ細胞溶解物、
Pyrogent ；Mallinckrodt、Inc.、St.Louis、
MO）の欠乏をもたらすことを示した。おのお
のの処理されたプロテインＡカラムは血漿から
およそ1.5ｇのIgGを結合する能力を有した。血
漿の流量は10〜20ml／分の間であつた。おのお
のの処理の間に３の血漿を潅流した。隔日の
スケジユールに基づいて７日間にわたつて３回
の処理を実施した。プロテインＡカラムを通し
ての血漿の体外潅流により患者を３度処理し
た。最後の手順後３日間で患者は呼吸困難で死
亡し、そして検死を実施した。 結 果 治療方法の間、主な合併症は生じなかつた。 120拍動／分までの洞様血管頻脈の他に収縮期
血圧のゆるやかな降下（10〜20mmHg）が観察さ
れたが、しかしどちらも治療は必要でなかつた。
体温の変化は１℃よりも小さかつた。患者は、最
後の処理の間、右の下肢上に腫瘍病巣による苦痛
を訴えた。その他の点では、病巣による苦痛は示
されなかつた。患者の肺の状態はおのおのの処理
を通して安定したままであり、そして全体とし
て、処理を十分に耐えることができた。 処理の開始の後、皮膚の新しい病巣は現れなか
つた。総体的に、中心壊死の他に皮膚病巣の約20
％が大きさにおいて衰えた。紅斑状のかさがこれ
らの病巣のまわりに現れ、そして２回目の処理後
明白になつた。治癒を大きな、融合性の潰瘍化し
た右脛骨の病巣に開始した。測定できるほどのア
デノパシーの変化は示されなかつた。処理の前、
開放肺のバイオプシーの間の胸郭の内部手術試験
は、胸膜においては、平らな、硬化した、出血性
溶出斑、及び肺胞においては、広範囲にわたる赤
色の結節性病巣を示した。患者の死後16時間後の
検死試験では、これらと同じ胸膜部分が明確な中
心へそ形陥凹を有しているように見えた。肺はよ
り出血し、そして結節は減少した。開放肺のバイ
オプシーからの前処理組織は、組織学的に、結節
性で、出血性の、密集した細胞性浸潤物群、不十
分な束を形成する紡錘状細胞、及び多数の発育不
全の血管腔を伴う特有のKaposi肉腫を示した。
死後のこの肺の顕微鏡的試験は、腫瘍細胞密度の
減少、核の大きさの縮小、及び腫瘍細胞間にコラ
ーゲン沈着物の増加を示した。類似した変化がバ
イオプシーの前処理検体と比較して、相応する皮
膚病巣のいくらかに観察された。 処理の前に採取された皮膚腫瘍病巣からのバイ
オプシーは、冷凍切片に対する直接的な免疫蛍光
検査によつて測定される場合、IgM、IgG、又は
IgAの沈着もまたC3又はC4の沈着も示さなかつ
た。最後の処理後採取された同じ病巣からのバイ
オプシーは、C3沈着を示したが、しかし免疫グ
ロブリンの沈着は示さなかつた。 免疫的パラメーターの変化を第２表に示す。注
目すべきことには、IgG−複合体レベルは、第３
処理の前、2.6μｇ当量のAHGから24時間後6.5μ
ｇ当量のAHGに増大した。 【表】 すべての値は前処理検体からである。AHG、
すなわち凝集性ヒトγグロブリンは、Hayなど、
Clin.Exp．Immunol．（1976）24：396〜400によ
つて記載されているようにして測定された。 血液学的値には有意な変化は存在せず、但し処
理期間にわたつて血小板数の46％減少が存在し
た。 前述の発明は明確に理解するために詳細に記載
されているけれども、特許請求の範囲内でいくら
かの変更を行なうことができる。
【図面の簡単な説明】
第１図はこの発明の免疫吸着性カラムの分離さ
れた分解図である。第２図はこの発明に従つて構
成された血液の体外処理のためのシステムの略図
である。 １０：カートリツジ、１１：処理用カラム、１
２：シリンダー、１４：スクリーン、１６：キヤ
ツプ、１８：フランジエレメント、２０：コネク
ターニツプル、２２：軸方向通路、２６：輪形
溝、２８：嵌め合いリング、３０：ガスケツト、
４０：細胞分離器、４２：血液ポンプ、４４：マ
クロフイルター。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １ 生物学的流体からIgG及びIgG−複合体を取
    り除くために有用な免疫吸着材を調製するための
    方法であつて、 シリカマトリツクス上に遊離アミノ基又はカル
    ボキシル基を導入し； 前記マトリツクスと精製されたプロテインＡと
    を3.5〜4.5の範囲のPHで、カルボジイミドの存在
    下において反応せしめ、前記アミノ基又はカルボ
    キシル基を介して該マトリツクスにプロテインＡ
    を共有結合せしめ；そして 2.0〜2.5の範囲のPHで前記マトリツクスを洗浄
    し、該マトリツクスからゆるく結合したプロテイ
    ンＡを取り除くことを含んで成る方法。 ２ アミノ基をシランの反応によつてシリカマト
    リツクス上に導入する特許請求の範囲第１項記載
    の方法。 ３ 前記アミノシランがγ−アミノプロピルトリ
    エトキシシランである特許請求の範囲第２項記載
    の方法。 ４ まずシリカマトリツクスとアミノシランとを
    反応せしめることによつて、アミノ基を導入し、
    それに続いて該シリカマトリツクスと無水コハク
    酸とを反応せしめ、前記アミノ基をカルボキシル
    基と置換することによつてカルボキシル基を導入
    する特許請求の範囲第１項記載の方法。 ５ 前記シリカマトリツクスが非晶質シリカであ
    る特許請求の範囲第１項記載の方法。 ６ 前記非晶質シリカが珪藻土である特許請求の
    範囲第５項記載の方法。 ７ 前記珪藻土を45〜60メツシユの大きさである
    特許請求の範囲第６項記載の方法。 ８ 前記プロテインＡがシリカマトリツクスの少
    なくとも0.05重量％で存在する特許請求の範囲第
    １項記載の方法。 ９ 生物学的流体からIgG及びIgG−複合体を取
    り除くために有用な免疫吸着材を調製するための
    方法であつて、 シリカマトリツクス上に遊離ヒドロキシル基を
    導入し； 11.0〜11.5の範囲のPHで、臭化シアンの存在下
    において前記シリカマトリツクスを活性化し、そ
    して該マトリツクスにプロテインＡを8.5〜9.0の
    範囲のPHで共有結合せしめ；そして 前記シリカマトリツクスを2.0〜2.5の範囲のPH
    で洗浄し、該マトリツクスからゆるく結合したプ
    ロテインＡを取り除くことを含んで成る方法。 １０ 水酸基をシランの反応によつてシリカマト
    リツクス上に導入する特許請求の範囲第９項記載
    の方法。 １１ 前記シランがγ−グリシドオキシプロピル
    トリメトキシシランである特許請求の範囲第１０
    項記載の方法。 １２ 前記シリカマトリツクスが非晶質シリカで
    ある特許請求の範囲第９項記載の方法。 １３ 前記非晶質シリカが珪藻土である特許請求
    の範囲第１２項記載の方法。
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