【発明の詳細な説明】[Detailed description of the invention]
(イ) 産業上の利用分野
この発明は、多孔性ゲル状担体の製造法に関す
る。さらに詳しくは、各種クロマトグラフイーの
カラム充填材や酵素等生体触媒固定化用として好
適な活性の優れた多孔性ゲル状担体の製造法に関
する。
(ロ) 従来技術
最近、酵素等のペプチド含有化合物をガラス担
体に固定化した固定化酵素が診断用や合成用のバ
イオリアクターとして用いられるようになつてき
た。これらの固定化酵素の製造法としては、溶融
法によつて予め得られたSiO2系ガラスの表面を
アルカリ処理して水酸基を生成させ、これに例え
ばアミノアルキル基を導入しそれに酵素を付加し
て固定させる方法が知られており実用化されてい
る。
しかし上記従来の方法においてはガラス表面に
水酸基を生成させる工程が必要であり、それによ
つて生成しうる水酸基の単位面積当りの量は限度
があつて酵素等の固定量を増大し活性の高い固定
化酵素を得ることが困難であつた。
この点に関し、この発明の発明者は先に、アル
コキシシラン等の金属アルコキシドを原料としこ
れを加水分解した際に得られる多孔性のガラス様
ゲル状化合物を担体とすることにより水酸基を導
入する工程を行なうことなく活性の高い固定化酵
素が得られる事実を見出した。これは、上記ガラ
ス様ゲル状化合物は対応する水酸化金属化合物や
その低縮合物からなるためそれ自身非常に多数の
水酸基を有してのりその結果酵素の固定化能が増
加するものと考えられる。
(ハ) 発明の目的
この発明は、上記知見を更に発展させることに
よりなされたものである。すなわちアルコキシシ
ランからのガラス様ゲル状化合物製造の際に、フ
ツ化水素を接触させることにより、水酸化金属化
合物及び／又はその縮合物にフツ素原子が置換導
入された一種のフツ化ガラス様ゲル状化合物が得
られ、その導入割合を少量とした際に得られるフ
ツ化ガラス様ゲル状化合物が、フツ素化していな
いものに比して水酸基の反応性が優れており酵素
等の固定化能がさらに増加する事実を見い出すこ
とによりなされたものである。
(ニ) 発明の構成
かくしてこの発明によれば、加水分解触媒を任
意に有する水性溶液中で少量のフツ化水素酸の存
在下、アルコキシシランの加水分解を行なつてガ
ラス様ゲル状化合物を生成させることを特徴とす
る多孔性ゲル状酵素固定化用担体の製造法が提供
される。
この発明における金属アルコキシドとしては、
ガラス製造分野やセラミツクス製造分野における
原料として知られたアルコキシシランが種々適用
でき、具体的にはSi（OCH3）4、Si（OC2H5）4等の
低級アルコキシシランを用いるのが通常好適であ
る。なお、これら二種以上の混合物を用いてもさ
しつかえはない。
この発明における多孔性ゲル状担体は、上記ア
ルコキシシランを加水分解してゲル状化合物とす
る際に、フツ化水素を反応に関与させることによ
り得られる。より具体的には加水分解触媒を任意
に有する水性溶液中に、金属アルコキシドを混合
して加水分解させつつ少量のフツ化水素酸を添加
混合した後、徐々に溶媒や触媒を除去させること
により得られる。
例えば低級アルコキシシランを用いる場合に
は、水を含む揮発性の親水性溶媒（例えば含水メ
タノールや含水エタノール）中でかつ酸性下（例
えば、加水分解触媒としての塩酸等の無機酸を添
加してPH１〜３程度とするのが好ましい）の緩和
な条件下（例えば室温下）でアルコキシドの加水
分解を開始すると同時に少量のフツ化水素酸を添
加し80℃〜100℃程度に加温しつつ徐々に生成ア
ルコール、溶媒、無機酸及び未反応のフツ化水素
を蒸発しかつ充分に乾燥させることにより得られ
る。なお、場合によつては水分は空気中から供給
されるため水を含ませなくてもよい。従つて、こ
の発明の水性触媒とは親水性触媒自体をも意味す
るものである。一方、水のみで加水分解を行なう
ことも可能であるが、この場合は加水分解が不均
一になる惧れがありさらに、ゲル状物の乾燥上不
利であり好ましくない。
かようなフツ化水素の処理により、ゲル状が促
進されると共にアルコキシシランの加水分解物で
ある水酸化金属化合物及び／又はその縮合物（ガ
ラス様ゲル状化合物）における一部の水酸基（エ
ーテル結合も含む）がフツ素原子で置換され、フ
ツ素原子を化学的に結合した多孔性ゲル状担体が
得られる。この際置換導入するフツ素原子は少量
であることが必要である。この量としては、原料
のアルコキシシラン（１モル）に対するモル比と
して表わせば0.05〜1.0モル程度が適切であり、
0.2モル前後が最も好ましい。0.05モル以下では
フツ素原子導入による効果が不充分で好ましくな
く、1.0モルを越えると水酸化金属化合物及び／
又はその縮合物における水酸基の置換度が過剰と
なり以後の反応に関与しうる水酸基の量が実質的
に減少するため好ましくない。
このようにして得られた多孔性ゲル状担体は、
基本的に多数の水酸基を有するゲル状化合物から
なるため、従来のガラスを担体とするものに比し
て反応性が良好である。さらに、その水酸基やエ
ーテル結合の一部はフツ素原子で置換されている
ため、単なるゲル状化合物に比して活性はより優
れている。なお、フツ素原子の導入による効果
は、アルコキシシランで説明すれば下式（）に
示されるように、
水酸化金属化合物やその縮合物に少量置換導入さ
れたフツ素原子の誘起効果（効果）によつて隣
接するシラノールの水酸基の分極の程度が大きく
なつて水素原子が活性となり、反応性がより上昇
するものと信じられる。さらに、前述のごとくフ
ツ化水素を合成反応に関与させて得たゲル状化合
物の多孔度は、フツ化水素の反応モル比によつて
制御することができるが、いずれにおいても単な
るゲル状化合物のものよりも多孔であることから
それによる表面積の増加による効果も加わつてい
るものと考えられる。
このようにして得られた多孔性ゲル状担体は、
そのまま用いてもよく、所望の粒子状に粉砕して
用いてもよく（例えば、グルコースオキシダーゼ
固定化カラムを作製する100〜200メツシユが適切
である）、液体クロマトグラフイーやその他の各
種のクロマトグラフイーのカラム充填材の基材と
して有用であり、また、酵素、抗原、抗体等の固
定化用担体としても有用である。
なお、この発明の方法によつて得られた上記多
孔性ゲル状担体ことにアルコキシシランを用いた
担体を実用的に供するに当つて、予め300℃前後
の温度で数時間熱処理しておくことが、残留する
未反応物品、不純物等の除去や担体自体の保型強
度の向上の点好ましい。ただし、熱処理の程度が
300℃前後を越える（例えば、500℃程度）とガラ
ス様ゲル状化合物内にシロキサン結合が増加して
高縮合物化し、活性が低下する点好ましくない。
300℃前後の熱処理ではシラノール基はほとんど
シロキサン結合に変化せず活性の低下はほとんど
見られない。
また、ゲル状担体の作製は、前記アルコキシド
溶液をチユーブ、ネツト等の基材にコーテイング
した状態で行なつてもよく、この際、活性の優れ
たゲル状担体薄膜を形成することができる。
この発明の方法によつて得られたゲル状担体に
シランカツプリング剤を反応させ、その反応物に
酵素を固定化することにより固定化酵素を得るこ
とができる。
上記ゲル状担体に反応させるシランカツプリン
グ剤としては、アミノ基、チオール基、エポキシ
基などの官能性基を有する当該分野で公知のシラ
ン誘導体が適用でき、具体的にはγ−アミノプロ
ピルトリエトキシシラン、γ−クロロプロピルト
リメトキシシラン、ビニルトリエトキシシラン、
γ−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン、
Ｎ−β−（アミノエチル）−γ−アミノプロピルト
リメトキシシラン等が使用される。かようなシラ
ンカツプリング剤との反応は、当該分野で公知の
条件下で行なわれる。例えだγ−アミノプロピル
トリエトキシシランを用いた場合、このカツプリ
ング剤を水に溶解して約10％水溶液としかつPHを
３〜５に調整した後、この溶液に充分に乾燥され
た前記ゲル状担体又はその粉砕物を加え加温下混
合して数時間処理した後水洗して未反応のカツプ
リング剤を除去することにより得られる。
上記、シランカツプリング剤を導入したゲル状
担体は、それ自身従来のガラスに導入したものに
比して担体として多くのカツプリング基を有して
おり、酵素等との反応活性が高く固定化酵素用担
体やカラム充填材として有用なものである。
このようにして処理されたゲル状担体に公知の
方法で酵素が固定化される。例えば、カツプリン
グ剤そしてγ−アミノプロピルトリエトキシシラ
ンを用いてアミノアルキル基を水酸基にエステル
結合で多数導入したゲル状担体を用いる場合、上
記アミノアルキル基にグルタルアルデヒドを用い
てアルデヒド基を有するシツフベースを導入し、
これに酵素等を接触させてアルデヒド基と酵素等
のアミノ基間でさらにシーフベースを形成させて
結合することにより固定化を行なうことができ、
これ以外にもアミノアルキル基をジアソ化して芳
香族アミノ基を導入しこれに酵素等を固定化して
もよく、またカルボジイミドを用いてアミノアル
キル基を酵素等との間に直接ペプチド結合を行な
い固定化を行なつてもよく酵素等の種類に応じて
適宜選択すればよい。他のカツプリング剤使用時
にも同様に直接又は適宜変換したカツプリング基
によつて酵素等を固定化することができる。ま
た、ブロモシアン等で活性化することによつても
容易に固定化することができる。
固定化用の酵素そしては具体的にはグルコース
オキシダーゼ、ウリカーゼ、ウレアーゼ、クレア
チニナーゼ、CoA−シンテターゼ、CoA−オキ
シダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、コレス
テロールヒドロラーゼ等が挙げられるが限定され
ることはなく、抗原や抗体その他生体触媒を固定
化することもできる。
このようにして得られた固定化酵素は従来の固
定化酵素と同様に、種々の形態で診断用や合成用
のバイオリアクターとして有用であり、さらに従
来の固定化酵素に比して担体当りの酵素等の固定
量は多くバイオリアクターとしての能力が増大さ
れたものである。
(ホ) 発明の効果
以上述べたように、この発明の方法によれば、
各種クロマトグラフイーのカラム充填材や酵素等
生体触媒固定化用として好適な活性の優れた多孔
性担体を簡便に得ることができる。ことに担体と
しては従来のガラス担体に比して製造コストは1/
１０以下を極めて安価である。
(ヘ) 実施例
以下、この発明を実施例により説明する。
実施例 １
（多孔性ゲル状担体の製造）
テトラエトキシシランSi（OC2H5）40.52モル、
エタノール1.72モル、水1.82モル、塩酸0.028モル
及びフツ化水素酸0.058〜0.115モルの混合物（PH
約１）を室温下で均一になるまで数十分混合撹拌
した。
次いで80℃のウオーターバス中で３昼夜加熱し
て加水分解反応で生じたエチルアルコール、水及
び残存する塩酸や未反応の微量のフツ化水素酸を
蒸発させることにより約30ｇの多孔性ゲル状担体
を得た。
（アミノアルキル化）
上記で得られたゲル状担体を粉砕して120/200
メツシユのビーズを得た。
5wt％のγ−アミノプロピルトリエトキシシラ
ン水溶液を5N塩酸でPH3.5に調整し、この溶液45
mlに対し上記ビーズ状ゲル状物を各々５ｇ投入
し、さらにPH3.5になるように調整した。この混
合物を、撹拌機、温度計、ジムロートを付設した
四ツ口フラスコに入れウオーターバスで温度を75
℃に保ち、撹拌させながら３時間反応を行なつ
た。反応終了後、ビーズを吸引メンブランフイル
ターに移し、１の蒸留水で未反応のγ−ガラス
プロピルトリエトキシシランを除去した後、デシ
ケーターで乾燥させてアミノアルキル化ゲル状担
体を得た。このアミノアルキル化ゲル状物はデシ
ケーター内で保存する。
（酵素の固定化）
上記アミノアルキル化ゲル状担体（ビーズ状）
を二官能性のグルタルアルデヒド（2.5wt％）の
リン酸塩緩衝溶液（PH7.0）に浸漬し、アスピレ
ーターで減圧させつつ約30分撹拌下反応させた。
続いてさらに約30分常圧で撹拌下反応させた。反
応温度は30℃であつた。これををPHを7.0のリン
酸塩緩衝液で充分に洗浄し、乾燥させた。この処
理によりゲル状物にアルデヒド基を有するシツフ
ベースが導入される。
得られたゲル状物１ｇを１mg／ml（グルコース
オキシターゼ／PHを7.0リン酸塩緩衝液）10ml中
に浸漬し、25℃下まず30分減圧下で緩やかに撹拌
して反応を行ない、続いて60分常圧下で緩かに撹
拌して固定化反応を行なつた。この処理によりグ
ルコースオキシターゼのアミノ基が反応に関与
し、担体（ゲル状物）のアルデヒド基とさらにシ
ツフベースを形成し固定化される。このようにし
てグルコースオキシターゼ固定化ゲル状物（固定
化酵素）が得られた。
このようにして得られた固定化酵素の活性の経
時変化をポーラログラフイーで測定した結果を第
１図に示す。なお測定条件は以下の通りである。
試験液：β−Ｄ（＋）−グルコース300mg
測定温度：28℃
保存温度：４℃
なお、測定は固定化酵素１ｇを試験液11mlと共
に５分間撹拌混合し、その10mlをメンブランフイ
ルターで別した後滴下水銀電極によるポーラロ
グラフイーで行なつた。酸素反応で発生した
H2O2の半波電位は0.85（vs）Ａｇ／ＡｇＣ電極
とした。
このように２ケ月半を経過してもその活性に変
化は見られなかつた。
一方、フツ化水素酸を用いない以外同様にして
作製したゲル状担体を用い同様に処理して得た固
定化酵素との比較を行なつた結果を第２図に示す
（は実施例、は比較例）。このように、フツ素
原子を導入しない同様な固定化酵素に比してこの
発明のゲル状担体を用いた固定化酵素は約2.5倍
の活性を有することが判る。
実施例 ２
実施例１と同様にしてHF／Si（CO2H5）4がモル
比で0.1〜0.5の条件下で反応を行ない多孔性ゲル
状担体をそれぞれ得た。これらの担体について前
記と同様にしてグルコースオキシターゼを固定化
して固定化酵素を得た。これらの固定化酵素の活
性と前記モル比との関係を第３図に示す。なお活
性の測定も前記に準じた。
このように、酵素活性が担体製造時のフツ化水
素酸の量に影響を受けており、ことにモル比が
0.2近傍で最大活性（ブランクに比して約７倍程
度）が示されていることが判る。また、担体製造
時に塩酸等の無機酸を添加することが好ましいこ
とが判る。
なお、モル比0.1及び0.5の際に得られる多孔性
ゲル状担体のSEM像（20000倍）を第４図及び第
５図に示した。また、第６図はフツ素原子を導入
していない多孔性ゲル状担体のSEM像（20000
倍）である。このように、この発明によつて得ら
れる担体はその表面の多孔度もフツ素原子を導入
していないものに比してより多孔であることが判
る。
実施例 ３
実施例２で得られた多孔性ゲル状担体（ガラス
ビーズ状）のESCA（Ｘ線光電子スペクトル）に
よる分析チヤートを第７図に示す。（Ａは走査速
度2eV／secであり、Ｂは走査速度1eV／secであ
る）。なお、ESCAの測定条件は以下の通りであ
る。
ターゲツト：Ｍｇ
加速電圧：8kV
フイラメント：30ｍＡ
Arエツチング条件：加速電圧 2kV
ミツシヨン 30ｍＡ
時 間 15分
このように、結合エネルギーが700ev近傍にフ
ツ素原子によるピークが観察されることから、フ
ツ素原子が化学的に結合していることが判る。ま
た、表１は、HF／Si（OC2H5）4Dがモル比で0.1の
ときの担体のESCAのスペクトルのF1SとSi2Sピー
クの強度比をバルクステートとパウダーステート
で比較したもので、両者の強度比の値が近接して
いることから、この発明の多孔性ゲル状担体は、
表面のみならず全体がフツ素化合物になつている
ことが判る。
(a) Industrial Application Field This invention relates to a method for producing a porous gel carrier. More specifically, the present invention relates to a method for producing a porous gel-like carrier with excellent activity and suitable for use as a column filler for various chromatographies or for immobilizing biocatalysts such as enzymes. (B) Prior Art Recently, immobilized enzymes in which peptide-containing compounds such as enzymes are immobilized on glass carriers have come to be used as bioreactors for diagnosis and synthesis. The method for producing these immobilized enzymes involves treating the surface of SiO 2 glass previously obtained by a melting method with alkali to generate hydroxyl groups, introducing aminoalkyl groups into this, and adding enzymes to it. A method of fixing it is known and has been put to practical use. However, the conventional method described above requires a step to generate hydroxyl groups on the glass surface, and there is a limit to the amount of hydroxyl groups that can be generated per unit area. It was difficult to obtain the converting enzyme. In this regard, the inventor of the present invention first developed a process for introducing hydroxyl groups by using a porous glass-like gel-like compound obtained by hydrolyzing a metal alkoxide such as an alkoxysilane as a raw material as a carrier. We have discovered that highly active immobilized enzymes can be obtained without carrying out any steps. This is thought to be because the above-mentioned glass-like gel-like compound is composed of the corresponding metal hydroxide compound or its low condensate, and thus has a very large number of hydroxyl groups, which increases its ability to immobilize enzymes. . (c) Purpose of the invention This invention was made by further developing the above knowledge. In other words, a type of fluorinated glass-like gel in which fluorine atoms are substituted and introduced into a metal hydroxide compound and/or its condensate by contacting with hydrogen fluoride during production of a glass-like gel-like compound from an alkoxysilane. A fluorinated glass-like gel-like compound obtained when a small amount of the compound is introduced has superior reactivity of hydroxyl groups compared to non-fluorinated compounds, and has the ability to immobilize enzymes, etc. This was done by discovering the fact that the (d) Structure of the Invention Thus, according to the present invention, a glass-like gel-like compound is produced by hydrolyzing an alkoxysilane in the presence of a small amount of hydrofluoric acid in an aqueous solution optionally containing a hydrolysis catalyst. Provided is a method for producing a porous gel-like carrier for enzyme immobilization, which is characterized by: The metal alkoxide in this invention includes:
Various alkoxysilanes known as raw materials in the glass manufacturing field and ceramic manufacturing field can be used, and specifically, it is usually preferable to use lower alkoxysilanes such as Si(OCH 3 ) 4 and Si(OC 2 H 5 ) 4 It is. Note that a mixture of two or more of these may also be used. The porous gel-like carrier in this invention can be obtained by involving hydrogen fluoride in the reaction when hydrolyzing the alkoxysilane to form a gel-like compound. More specifically, a metal alkoxide is mixed into an aqueous solution optionally containing a hydrolysis catalyst, and a small amount of hydrofluoric acid is added and mixed while the metal alkoxide is hydrolyzed, and then the solvent and catalyst are gradually removed. It will be done. For example, when using a lower alkoxysilane, it is necessary to reduce the pH by adding an inorganic acid such as hydrochloric acid as a hydrolysis catalyst in a volatile hydrophilic solvent containing water (e.g., aqueous methanol or aqueous ethanol) and under acidic conditions (e.g., adding an inorganic acid such as hydrochloric acid as a hydrolysis catalyst). At the same time, a small amount of hydrofluoric acid is added under mild conditions (for example, at room temperature) under mild conditions (preferably approximately It is obtained by evaporating the produced alcohol, solvent, inorganic acid and unreacted hydrogen fluoride and thoroughly drying it. Note that in some cases, water may not be included because the water is supplied from the air. Therefore, the aqueous catalyst of this invention also means the hydrophilic catalyst itself. On the other hand, it is also possible to carry out hydrolysis using only water, but in this case there is a risk that the hydrolysis will be uneven, and furthermore, it is disadvantageous in terms of drying of the gel-like material, which is not preferable. Such treatment with hydrogen fluoride promotes the gel-like state and also improves the formation of some hydroxyl groups (ether bonds) in the metal hydroxide compound and/or its condensate (glass-like gel compound), which is a hydrolyzate of alkoxysilane. ) are substituted with fluorine atoms to obtain a porous gel-like carrier in which the fluorine atoms are chemically bonded. At this time, it is necessary that the amount of fluorine atoms introduced by substitution be small. Appropriately, this amount is about 0.05 to 1.0 mol, expressed as a molar ratio to the raw material alkoxysilane (1 mol).
The most preferred amount is around 0.2 mol. If it is less than 0.05 mol, the effect of introducing fluorine atoms will be insufficient and undesirable, and if it exceeds 1.0 mol, metal hydroxide compounds and/or
Otherwise, the degree of substitution of hydroxyl groups in the condensate becomes excessive, and the amount of hydroxyl groups that can participate in subsequent reactions is substantially reduced, which is not preferable. The porous gel carrier thus obtained is
Since it basically consists of a gel-like compound having a large number of hydroxyl groups, it has better reactivity than conventional glass carriers. Furthermore, since some of its hydroxyl groups and ether bonds are substituted with fluorine atoms, its activity is superior to that of simple gel-like compounds. Furthermore, the effect of introducing fluorine atoms can be explained using alkoxysilane as shown in the following formula (). Due to the inducing effect (effect) of a small amount of fluorine atoms substituted into metal hydroxide compounds and their condensates, the degree of polarization of the hydroxyl groups of adjacent silanol increases, making hydrogen atoms active and further increasing reactivity. I believe that you will. Furthermore, as mentioned above, the porosity of the gel-like compound obtained by involving hydrogen fluoride in the synthesis reaction can be controlled by the reaction molar ratio of hydrogen fluoride; Since it is more porous than other materials, it is thought that the resulting increase in surface area has an additional effect. The porous gel carrier thus obtained is
It can be used as it is, or it can be crushed into the desired particle form (for example, 100 to 200 mesh is suitable for producing a glucose oxidase immobilized column), and can be used for liquid chromatography and other various chromatographs. It is useful as a base material for a column packing material for E., and also as a carrier for immobilizing enzymes, antigens, antibodies, etc. In addition, in order to practically use the porous gel-like carrier obtained by the method of the present invention and the carrier using alkoxysilane, it is necessary to heat-treat it in advance at a temperature of about 300°C for several hours. This is preferable because it removes residual unreacted products, impurities, etc., and improves the shape retention strength of the carrier itself. However, the degree of heat treatment
If the temperature exceeds about 300°C (for example, about 500°C), the number of siloxane bonds increases in the glass-like gel compound, resulting in a highly condensed product, which is undesirable because the activity decreases.
When heat treated at around 300°C, the silanol groups hardly change to siloxane bonds, and there is almost no decrease in activity. Further, the gel-like carrier may be prepared by coating a base material such as a tube or net with the alkoxide solution, and in this case, a gel-like carrier thin film with excellent activity can be formed. An immobilized enzyme can be obtained by reacting a silane coupling agent with the gel-like carrier obtained by the method of the present invention and immobilizing the enzyme on the reaction product. As the silane coupling agent to be reacted with the gel carrier, silane derivatives known in the art having functional groups such as amino groups, thiol groups, and epoxy groups can be used. Specifically, γ-aminopropyltriethoxy Silane, γ-chloropropyltrimethoxysilane, vinyltriethoxysilane,
γ-glycidoxypropyltrimethoxysilane,
N-β-(aminoethyl)-γ-aminopropyltrimethoxysilane and the like are used. Reactions with such silane coupling agents are carried out under conditions known in the art. For example, when γ-aminopropyltriethoxysilane is used, this coupling agent is dissolved in water to make an approximately 10% aqueous solution and the pH is adjusted to 3 to 5. It is obtained by adding the carrier or its pulverized product, mixing under heating, treating for several hours, and then washing with water to remove unreacted coupling agents. The above-mentioned gel-like carrier into which a silane coupling agent is introduced has more coupling groups as a carrier than those introduced into conventional glass, and has a high reaction activity with enzymes etc. It is useful as a carrier and column packing material. Enzymes are immobilized on the gel-like carrier thus treated by a known method. For example, when using a gel-like carrier in which a large number of aminoalkyl groups are introduced into hydroxyl groups through ester bonds using a coupling agent and γ-aminopropyltriethoxysilane, a Schiff base having an aldehyde group is formed by using glutaraldehyde for the aminoalkyl group. introduced,
Immobilization can be carried out by contacting this with an enzyme, etc., and further forming a thief base between the aldehyde group and the amino group of the enzyme, etc., and bonding.
In addition to this, the aminoalkyl group may be diisolated to introduce an aromatic amino group and an enzyme etc. may be immobilized thereon, or the aminoalkyl group may be immobilized by directly forming a peptide bond between the aminoalkyl group and the enzyme etc. using carbodiimide. It may be selected as appropriate depending on the type of enzyme, etc. When using other coupling agents, enzymes and the like can be similarly immobilized directly or by appropriately converted coupling groups. Furthermore, it can be easily immobilized by activation with bromosyanate or the like. Enzymes for immobilization include, but are not limited to, glucose oxidase, uricase, urease, creatininase, CoA-synthetase, CoA-oxidase, cholesterol oxidase, cholesterol hydrolase, etc. Antigens and antibodies Other biocatalysts can also be immobilized. The immobilized enzymes thus obtained are useful in various forms as bioreactors for diagnosis and synthesis, similar to conventional immobilized enzymes, and furthermore, they have a lower cost per carrier than conventional immobilized enzymes. The amount of enzymes etc. immobilized is large and the capacity as a bioreactor is increased. (e) Effects of the invention As stated above, according to the method of this invention,
Porous carriers with excellent activity suitable for use as column packing materials for various chromatography and for immobilizing biocatalysts such as enzymes can be easily obtained. In particular, as a carrier, the manufacturing cost is 1/1 compared to conventional glass carriers.
10 or less is extremely cheap. (F) Examples The present invention will be explained below with reference to Examples. Example 1 (Production of porous gel carrier) Tetraethoxysilane Si (OC 2 H 5 ) 4 0.52 mol,
A mixture (PH
About 1) was mixed and stirred at room temperature for several minutes until it became homogeneous. Approximately 30 g of porous gel-like carrier was then heated in a water bath at 80°C for 3 days and nights to evaporate the ethyl alcohol and water produced by the hydrolysis reaction, as well as residual hydrochloric acid and trace amounts of unreacted hydrofluoric acid. I got it. (Aminoalkylation) Grind the gel-like carrier obtained above to 120/200
Obtained mesh beads. A 5wt% γ-aminopropyltriethoxysilane aqueous solution was adjusted to pH 3.5 with 5N hydrochloric acid, and this solution
5 g of each of the above bead-like gels were added per ml, and the pH was adjusted to 3.5. Place this mixture in a four-necked flask equipped with a stirrer, thermometer, and Dimroth, and bring the temperature to 75°C with a water bath.
The reaction was carried out for 3 hours while maintaining the temperature at °C and stirring. After the reaction was completed, the beads were transferred to a suction membrane filter, unreacted γ-glasspropyltriethoxysilane was removed with distilled water in Step 1, and then dried in a desiccator to obtain an aminoalkylated gel-like carrier. This aminoalkylated gel is stored in a desiccator. (Immobilization of enzyme) The above aminoalkylated gel-like carrier (bead-like)
was immersed in a phosphate buffer solution (PH7.0) of difunctional glutaraldehyde (2.5 wt%), and reacted with stirring for about 30 minutes while reducing the pressure with an aspirator.
Subsequently, the reaction was continued for about 30 minutes under stirring at normal pressure. The reaction temperature was 30°C. This was thoroughly washed with a phosphate buffer solution with a pH of 7.0 and dried. This treatment introduces Schiff base having an aldehyde group into the gel. 1 g of the obtained gel was immersed in 10 ml of 1 mg/ml (glucose oxidase/PH 7.0 phosphate buffer), and the reaction was carried out by stirring gently under reduced pressure for 30 minutes at 25°C, and then The immobilization reaction was carried out by gentle stirring for 60 minutes under normal pressure. Through this treatment, the amino groups of glucose oxidase participate in the reaction, and are further immobilized by forming a Schiff base with the aldehyde groups of the carrier (gel-like substance). In this way, a glucose oxidase immobilized gel (immobilized enzyme) was obtained. FIG. 1 shows the results of measuring the time-dependent changes in the activity of the immobilized enzyme thus obtained using polarography. The measurement conditions are as follows. Test solution: β-D(+)-glucose 300mg Measurement temperature: 28℃ Storage temperature: 4℃ The measurement was performed by stirring and mixing 1g of immobilized enzyme with 11ml of the test solution for 5 minutes, and then separating the 10ml with a membrane filter. This was done using polarography using a dropping mercury electrode. generated by an oxygen reaction
The half-wave potential of H 2 O 2 was 0.85 (vs) at the Ag/AgC electrode. As described above, no change in the activity was observed even after two and a half months had passed. On the other hand, Fig. 2 shows the results of a comparison with the immobilized enzyme obtained by the same treatment using a gel-like carrier prepared in the same manner except without using hydrofluoric acid. Comparative example). Thus, it can be seen that the immobilized enzyme using the gel carrier of the present invention has about 2.5 times the activity as compared to a similar immobilized enzyme that does not introduce fluorine atoms. Example 2 In the same manner as in Example 1, a reaction was carried out under conditions where the molar ratio of HF/Si(CO 2 H 5 ) 4 was 0.1 to 0.5 to obtain porous gel-like carriers. Glucose oxidase was immobilized on these carriers in the same manner as described above to obtain immobilized enzymes. The relationship between the activity of these immobilized enzymes and the molar ratio is shown in FIG. The activity was also measured in the same manner as described above. In this way, the enzyme activity is affected by the amount of hydrofluoric acid used during carrier production, especially the molar ratio.
It can be seen that the maximum activity (approximately 7 times that of the blank) is shown at around 0.2. Furthermore, it is found that it is preferable to add an inorganic acid such as hydrochloric acid during the production of the carrier. Incidentally, SEM images (20,000 times magnification) of the porous gel-like carrier obtained when the molar ratio is 0.1 and 0.5 are shown in FIGS. 4 and 5. In addition, Figure 6 shows an SEM image (20000
times). Thus, it can be seen that the surface porosity of the carrier obtained according to the present invention is more porous than that of a carrier in which fluorine atoms are not introduced. Example 3 An analysis chart of the porous gel-like carrier (glass beads) obtained in Example 2 by ESCA (X-ray photoelectron spectrum) is shown in FIG. (A is a scan rate of 2 eV/sec, B is a scan rate of 1 eV/sec). The measurement conditions for ESCA are as follows. Target: Mg Accelerating voltage: 8kV Filament: 30mA Ar etching conditions: Accelerating voltage 2kV Mission 30mA Time 15 minutes As shown above, a peak due to fluorine atoms is observed near the binding energy of 700ev, indicating that fluorine atoms are It can be seen that they are connected. In addition, Table 1 compares the intensity ratio of the F 1S and Si 2S peaks of the ESCA spectrum of the support in the bulk state and powder state when the molar ratio of HF/Si(OC 2 H 5 ) 4 D is 0.1. Since the strength ratio values of the two are close to each other, the porous gel-like carrier of the present invention has the following properties:
It can be seen that not only the surface but also the entire surface is made of fluorine compound.
【表】
実施例 ４
テトラエトキシシラン１モル、エタノール
3.557モル、水3.759モル、塩酸0.28モルを順次混
合し激しく撹拌して均一なゾルを得、これにフツ
化水素酸0.2モルを混し実施例１と同様にして固
形状のガラス様多孔性ゲル状担体を得た。
この多孔性ゲル状担体について300℃及び500℃
での熱処理の影響を調べた。すなわち120/200メ
ツシユに粉砕した担体500mgをそれぞれ電気炉中
で300℃及び500℃下３時間熱処理した後、実施例
１のようにアミノアルキル化及びグルコースオキ
シターゼの固定化を行なつた、得られた固定化酵
素の固定化率（固定化前の酵素溶液と固定化後の
酵素溶液におけるタンパク量をLowry法で求め、
両者の差を差引いて決定した）を測定した。
この結果を、比較例と共に第１表に示す。[Table] Example 4 1 mol of tetraethoxysilane, ethanol
3.557 mol of water, 3.759 mol of water, and 0.28 mol of hydrochloric acid were sequentially mixed and stirred vigorously to obtain a homogeneous sol. To this was added 0.2 mol of hydrofluoric acid and the same procedure as in Example 1 was made to obtain a solid glass-like porous gel. A carrier was obtained. 300℃ and 500℃ for this porous gel-like carrier
We investigated the effects of heat treatment on That is, 500 mg of the carrier crushed into a 120/200 mesh was heat-treated at 300°C and 500°C for 3 hours in an electric furnace, and then aminoalkylation and immobilization of glucose oxidase were performed as in Example 1. The immobilization rate of the immobilized enzyme (the amount of protein in the enzyme solution before immobilization and the enzyme solution after immobilization was determined by the Lowry method,
) was determined by subtracting the difference between the two. The results are shown in Table 1 along with comparative examples.
【表】
一方、アミノアルキル化及び固定化前のそれぞ
れの担体〔フツ化水素未処理担体…(A)、熱未処理
担体…(B)、300℃熱処理担体…(C)〕について熱重
量分析（TG）を行なつた結果を第８図に示し、
微分重量分析（DTG）を行なつた結果を第９図
に示す。
図り示すように、フツ化水素で処理した担体
300℃程度の熱処理ではシラノール基はほとんど
シロキサン結合に変化せず、また吸着水分量も非
常に小さいことが判る。[Table] On the other hand, thermogravimetric analysis of each carrier before aminoalkylation and immobilization [hydrogen fluoride untreated carrier...(A), heat untreated carrier...(B), 300℃ heat treated carrier...(C)] The results of (TG) are shown in Figure 8.
The results of differential gravimetric analysis (DTG) are shown in FIG. As shown, carrier treated with hydrogen fluoride
It can be seen that during heat treatment at about 300°C, the silanol groups hardly change into siloxane bonds, and the amount of adsorbed water is also very small.
【図面の簡単な説明】[Brief explanation of drawings]
第１図はこの発明で得られた固定化酵素の活性
の経時変化を示すグラフ、第２図は同じくグルコ
ースの濃度に対する活性の変化を比較例と共に示
すグラフ、第３図はこの発明で得られた担体を用
いた固定化酵素におけるフツ素原子導入による影
響を示すグラフ、第４図及び第５図はこの発明で
得られる多孔性ゲル状担体の多孔性表面をそれぞ
れ例示する走査型電子顕微鏡（SEM）による拡
大写真、第６図は比較例のゲル状担体の多孔性表
面を例示するSEMによる拡大写真、第７図はこ
の発明で得られる多孔性ゲル状担体のESCAスペ
クトルを例示するグラフ、第８図及び第９図はこ
の発明で得られる多孔性ゲル状担体の熱処理の影
響をそれぞれ比較例と共に示すTGチヤート図及
びDTGチヤート図である。
FIG. 1 is a graph showing changes over time in the activity of the immobilized enzyme obtained by this invention, FIG. 2 is a graph showing changes in activity with respect to glucose concentration along with comparative examples, and FIG. Graphs showing the effects of fluorine atom introduction on immobilized enzymes using carriers obtained using a scanning electron microscope ( 6 is an enlarged SEM photograph illustrating the porous surface of the gel-like carrier of the comparative example; FIG. 7 is a graph illustrating the ESCA spectrum of the porous gel-like carrier obtained by the present invention; FIGS. 8 and 9 are a TG chart and a DTG chart, respectively, showing the influence of heat treatment on the porous gel-like carrier obtained by the present invention, together with comparative examples.