JPH036794B2 - - Google Patents
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- JPH036794B2 JPH036794B2 JP4942983A JP4942983A JPH036794B2 JP H036794 B2 JPH036794 B2 JP H036794B2 JP 4942983 A JP4942983 A JP 4942983A JP 4942983 A JP4942983 A JP 4942983A JP H036794 B2 JPH036794 B2 JP H036794B2
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- Oxygen, Ozone, And Oxides In General (AREA)
Description
(イ) 産業上の利用分野
この発明は、多孔性ゲル状担体の製造法に関す
る。さらに詳しくは、各種クロマトグラフイーの
カラム充填材や酵素等生体触媒固定化用として好
適な活性の優れた多孔性ゲル状担体の製造法に関
する。 (ロ) 従来技術 最近、酵素等のペプチド含有化合物をガラス担
体に固定化した固定化酵素が診断用や合成用のバ
イオリアクターとして用いられるようになつてき
た。これらの固定化酵素の製造法としては、溶融
法によつて予め得られたSiO2系ガラスの表面を
アルカリ処理して水酸基を生成させ、これに例え
ばアミノアルキル基を導入しそれに酵素を付加し
て固定させる方法が知られており実用化されてい
る。 しかし上記従来の方法においてはガラス表面に
水酸基を生成させる工程が必要であり、それによ
つて生成しうる水酸基の単位面積当りの量は限度
があつて酵素等の固定量を増大し活性の高い固定
化酵素を得ることが困難であつた。 この点に関し、この発明の発明者は先に、アル
コキシシラン等の金属アルコキシドを原料としこ
れを加水分解した際に得られる多孔性のガラス様
ゲル状化合物を担体とすることにより水酸基を導
入する工程を行なうことなく活性の高い固定化酵
素が得られる事実を見出した。これは、上記ガラ
ス様ゲル状化合物は対応する水酸化金属化合物や
その低縮合物からなるためそれ自身非常に多数の
水酸基を有してのりその結果酵素の固定化能が増
加するものと考えられる。 (ハ) 発明の目的 この発明は、上記知見を更に発展させることに
よりなされたものである。すなわちアルコキシシ
ランからのガラス様ゲル状化合物製造の際に、フ
ツ化水素を接触させることにより、水酸化金属化
合物及び／又はその縮合物にフツ素原子が置換導
入された一種のフツ化ガラス様ゲル状化合物が得
られ、その導入割合を少量とした際に得られるフ
ツ化ガラス様ゲル状化合物が、フツ素化していな
いものに比して水酸基の反応性が優れており酵素
等の固定化能がさらに増加する事実を見い出すこ
とによりなされたものである。 (ニ) 発明の構成 かくしてこの発明によれば、加水分解触媒を任
意に有する水性溶液中で少量のフツ化水素酸の存
在下、アルコキシシランの加水分解を行なつてガ
ラス様ゲル状化合物を生成させることを特徴とす
る多孔性ゲル状酵素固定化用担体の製造法が提供
される。 この発明における金属アルコキシドとしては、
ガラス製造分野やセラミツクス製造分野における
原料として知られたアルコキシシランが種々適用
でき、具体的にはSi（OCH3）4、Si（OC2H5）4等の
低級アルコキシシランを用いるのが通常好適であ
る。なお、これら二種以上の混合物を用いてもさ
しつかえはない。 この発明における多孔性ゲル状担体は、上記ア
ルコキシシランを加水分解してゲル状化合物とす
る際に、フツ化水素を反応に関与させることによ
り得られる。より具体的には加水分解触媒を任意
に有する水性溶液中に、金属アルコキシドを混合
して加水分解させつつ少量のフツ化水素酸を添加
混合した後、徐々に溶媒や触媒を除去させること
により得られる。 例えば低級アルコキシシランを用いる場合に
は、水を含む揮発性の親水性溶媒（例えば含水メ
タノールや含水エタノール）中でかつ酸性下（例
えば、加水分解触媒としての塩酸等の無機酸を添
加してPH１〜３程度とするのが好ましい）の緩和
な条件下（例えば室温下）でアルコキシドの加水
分解を開始すると同時に少量のフツ化水素酸を添
加し80℃〜100℃程度に加温しつつ徐々に生成ア
ルコール、溶媒、無機酸及び未反応のフツ化水素
を蒸発しかつ充分に乾燥させることにより得られ
る。なお、場合によつては水分は空気中から供給
されるため水を含ませなくてもよい。従つて、こ
の発明の水性触媒とは親水性触媒自体をも意味す
るものである。一方、水のみで加水分解を行なう
ことも可能であるが、この場合は加水分解が不均
一になる惧れがありさらに、ゲル状物の乾燥上不
利であり好ましくない。 かようなフツ化水素の処理により、ゲル状が促
進されると共にアルコキシシランの加水分解物で
ある水酸化金属化合物及び／又はその縮合物（ガ
ラス様ゲル状化合物）における一部の水酸基（エ
ーテル結合も含む）がフツ素原子で置換され、フ
ツ素原子を化学的に結合した多孔性ゲル状担体が
得られる。この際置換導入するフツ素原子は少量
であることが必要である。この量としては、原料
のアルコキシシラン（１モル）に対するモル比と
して表わせば0.05〜1.0モル程度が適切であり、
0.2モル前後が最も好ましい。0.05モル以下では
フツ素原子導入による効果が不充分で好ましくな
く、1.0モルを越えると水酸化金属化合物及び／
又はその縮合物における水酸基の置換度が過剰と
なり以後の反応に関与しうる水酸基の量が実質的
に減少するため好ましくない。 このようにして得られた多孔性ゲル状担体は、
基本的に多数の水酸基を有するゲル状化合物から
なるため、従来のガラスを担体とするものに比し
て反応性が良好である。さらに、その水酸基やエ
ーテル結合の一部はフツ素原子で置換されている
ため、単なるゲル状化合物に比して活性はより優
れている。なお、フツ素原子の導入による効果
は、アルコキシシランで説明すれば下式（）に
示されるように、 水酸化金属化合物やその縮合物に少量置換導入さ
れたフツ素原子の誘起効果（効果）によつて隣
接するシラノールの水酸基の分極の程度が大きく
なつて水素原子が活性となり、反応性がより上昇
するものと信じられる。さらに、前述のごとくフ
ツ化水素を合成反応に関与させて得たゲル状化合
物の多孔度は、フツ化水素の反応モル比によつて
制御することができるが、いずれにおいても単な
るゲル状化合物のものよりも多孔であることから
それによる表面積の増加による効果も加わつてい
るものと考えられる。 このようにして得られた多孔性ゲル状担体は、
そのまま用いてもよく、所望の粒子状に粉砕して
用いてもよく（例えば、グルコースオキシダーゼ
固定化カラムを作製する100〜200メツシユが適切
である）、液体クロマトグラフイーやその他の各
種のクロマトグラフイーのカラム充填材の基材と
して有用であり、また、酵素、抗原、抗体等の固
定化用担体としても有用である。 なお、この発明の方法によつて得られた上記多
孔性ゲル状担体ことにアルコキシシランを用いた
担体を実用的に供するに当つて、予め300℃前後
の温度で数時間熱処理しておくことが、残留する
未反応物品、不純物等の除去や担体自体の保型強
度の向上の点好ましい。ただし、熱処理の程度が
300℃前後を越える（例えば、500℃程度）とガラ
ス様ゲル状化合物内にシロキサン結合が増加して
高縮合物化し、活性が低下する点好ましくない。
300℃前後の熱処理ではシラノール基はほとんど
シロキサン結合に変化せず活性の低下はほとんど
見られない。 また、ゲル状担体の作製は、前記アルコキシド
溶液をチユーブ、ネツト等の基材にコーテイング
した状態で行なつてもよく、この際、活性の優れ
たゲル状担体薄膜を形成することができる。 この発明の方法によつて得られたゲル状担体に
シランカツプリング剤を反応させ、その反応物に
酵素を固定化することにより固定化酵素を得るこ
とができる。 上記ゲル状担体に反応させるシランカツプリン
グ剤としては、アミノ基、チオール基、エポキシ
基などの官能性基を有する当該分野で公知のシラ
ン誘導体が適用でき、具体的にはγ−アミノプロ
ピルトリエトキシシラン、γ−クロロプロピルト
リメトキシシラン、ビニルトリエトキシシラン、
γ−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン、
Ｎ−β−（アミノエチル）−γ−アミノプロピルト
リメトキシシラン等が使用される。かようなシラ
ンカツプリング剤との反応は、当該分野で公知の
条件下で行なわれる。例えだγ−アミノプロピル
トリエトキシシランを用いた場合、このカツプリ
ング剤を水に溶解して約10％水溶液としかつPHを
３〜５に調整した後、この溶液に充分に乾燥され
た前記ゲル状担体又はその粉砕物を加え加温下混
合して数時間処理した後水洗して未反応のカツプ
リング剤を除去することにより得られる。 上記、シランカツプリング剤を導入したゲル状
担体は、それ自身従来のガラスに導入したものに
比して担体として多くのカツプリング基を有して
おり、酵素等との反応活性が高く固定化酵素用担
体やカラム充填材として有用なものである。 このようにして処理されたゲル状担体に公知の
方法で酵素が固定化される。例えば、カツプリン
グ剤そしてγ−アミノプロピルトリエトキシシラ
ンを用いてアミノアルキル基を水酸基にエステル
結合で多数導入したゲル状担体を用いる場合、上
記アミノアルキル基にグルタルアルデヒドを用い
てアルデヒド基を有するシツフベースを導入し、
これに酵素等を接触させてアルデヒド基と酵素等
のアミノ基間でさらにシーフベースを形成させて
結合することにより固定化を行なうことができ、
これ以外にもアミノアルキル基をジアソ化して芳
香族アミノ基を導入しこれに酵素等を固定化して
もよく、またカルボジイミドを用いてアミノアル
キル基を酵素等との間に直接ペプチド結合を行な
い固定化を行なつてもよく酵素等の種類に応じて
適宜選択すればよい。他のカツプリング剤使用時
にも同様に直接又は適宜変換したカツプリング基
によつて酵素等を固定化することができる。ま
た、ブロモシアン等で活性化することによつても
容易に固定化することができる。 固定化用の酵素そしては具体的にはグルコース
オキシダーゼ、ウリカーゼ、ウレアーゼ、クレア
チニナーゼ、CoA−シンテターゼ、CoA−オキ
シダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、コレス
テロールヒドロラーゼ等が挙げられるが限定され
ることはなく、抗原や抗体その他生体触媒を固定
化することもできる。 このようにして得られた固定化酵素は従来の固
定化酵素と同様に、種々の形態で診断用や合成用
のバイオリアクターとして有用であり、さらに従
来の固定化酵素に比して担体当りの酵素等の固定
量は多くバイオリアクターとしての能力が増大さ
れたものである。 (ホ) 発明の効果 以上述べたように、この発明の方法によれば、
各種クロマトグラフイーのカラム充填材や酵素等
生体触媒固定化用として好適な活性の優れた多孔
性担体を簡便に得ることができる。ことに担体と
しては従来のガラス担体に比して製造コストは1/
１０以下を極めて安価である。 (ヘ) 実施例 以下、この発明を実施例により説明する。 実施例 １ （多孔性ゲル状担体の製造） テトラエトキシシランSi（OC2H5）40.52モル、
エタノール1.72モル、水1.82モル、塩酸0.028モル
及びフツ化水素酸0.058〜0.115モルの混合物（PH
約１）を室温下で均一になるまで数十分混合撹拌
した。 次いで80℃のウオーターバス中で３昼夜加熱し
て加水分解反応で生じたエチルアルコール、水及
び残存する塩酸や未反応の微量のフツ化水素酸を
蒸発させることにより約30ｇの多孔性ゲル状担体
を得た。 （アミノアルキル化） 上記で得られたゲル状担体を粉砕して120/200
メツシユのビーズを得た。 5wt％のγ−アミノプロピルトリエトキシシラ
ン水溶液を5N塩酸でPH3.5に調整し、この溶液45
mlに対し上記ビーズ状ゲル状物を各々５ｇ投入
し、さらにPH3.5になるように調整した。この混
合物を、撹拌機、温度計、ジムロートを付設した
四ツ口フラスコに入れウオーターバスで温度を75
℃に保ち、撹拌させながら３時間反応を行なつ
た。反応終了後、ビーズを吸引メンブランフイル
ターに移し、１の蒸留水で未反応のγ−ガラス
プロピルトリエトキシシランを除去した後、デシ
ケーターで乾燥させてアミノアルキル化ゲル状担
体を得た。このアミノアルキル化ゲル状物はデシ
ケーター内で保存する。 （酵素の固定化） 上記アミノアルキル化ゲル状担体（ビーズ状）
を二官能性のグルタルアルデヒド（2.5wt％）の
リン酸塩緩衝溶液（PH7.0）に浸漬し、アスピレ
ーターで減圧させつつ約30分撹拌下反応させた。
続いてさらに約30分常圧で撹拌下反応させた。反
応温度は30℃であつた。これををPHを7.0のリン
酸塩緩衝液で充分に洗浄し、乾燥させた。この処
理によりゲル状物にアルデヒド基を有するシツフ
ベースが導入される。 得られたゲル状物１ｇを１mg／ml（グルコース
オキシターゼ／PHを7.0リン酸塩緩衝液）10ml中
に浸漬し、25℃下まず30分減圧下で緩やかに撹拌
して反応を行ない、続いて60分常圧下で緩かに撹
拌して固定化反応を行なつた。この処理によりグ
ルコースオキシターゼのアミノ基が反応に関与
し、担体（ゲル状物）のアルデヒド基とさらにシ
ツフベースを形成し固定化される。このようにし
てグルコースオキシターゼ固定化ゲル状物（固定
化酵素）が得られた。 このようにして得られた固定化酵素の活性の経
時変化をポーラログラフイーで測定した結果を第
１図に示す。なお測定条件は以下の通りである。 試験液：β−Ｄ（＋）−グルコース300mg 測定温度：28℃ 保存温度：４℃ なお、測定は固定化酵素１ｇを試験液11mlと共
に５分間撹拌混合し、その10mlをメンブランフイ
ルターで別した後滴下水銀電極によるポーラロ
グラフイーで行なつた。酸素反応で発生した
H2O2の半波電位は0.85（vs）Ａｇ／ＡｇＣ電極
とした。 このように２ケ月半を経過してもその活性に変
化は見られなかつた。 一方、フツ化水素酸を用いない以外同様にして
作製したゲル状担体を用い同様に処理して得た固
定化酵素との比較を行なつた結果を第２図に示す
（は実施例、は比較例）。このように、フツ素
原子を導入しない同様な固定化酵素に比してこの
発明のゲル状担体を用いた固定化酵素は約2.5倍
の活性を有することが判る。 実施例 ２ 実施例１と同様にしてHF／Si（CO2H5）4がモル
比で0.1〜0.5の条件下で反応を行ない多孔性ゲル
状担体をそれぞれ得た。これらの担体について前
記と同様にしてグルコースオキシターゼを固定化
して固定化酵素を得た。これらの固定化酵素の活
性と前記モル比との関係を第３図に示す。なお活
性の測定も前記に準じた。 このように、酵素活性が担体製造時のフツ化水
素酸の量に影響を受けており、ことにモル比が
0.2近傍で最大活性（ブランクに比して約７倍程
度）が示されていることが判る。また、担体製造
時に塩酸等の無機酸を添加することが好ましいこ
とが判る。 なお、モル比0.1及び0.5の際に得られる多孔性
ゲル状担体のSEM像（20000倍）を第４図及び第
５図に示した。また、第６図はフツ素原子を導入
していない多孔性ゲル状担体のSEM像（20000
倍）である。このように、この発明によつて得ら
れる担体はその表面の多孔度もフツ素原子を導入
していないものに比してより多孔であることが判
る。 実施例 ３ 実施例２で得られた多孔性ゲル状担体（ガラス
ビーズ状）のESCA（Ｘ線光電子スペクトル）に
よる分析チヤートを第７図に示す。（Ａは走査速
度2eV／secであり、Ｂは走査速度1eV／secであ
る）。なお、ESCAの測定条件は以下の通りであ
る。 ターゲツト：Ｍｇ 加速電圧：8kV フイラメント：30ｍＡ Arエツチング条件：加速電圧 2kV ミツシヨン 30ｍＡ 時 間 15分 このように、結合エネルギーが700ev近傍にフ
ツ素原子によるピークが観察されることから、フ
ツ素原子が化学的に結合していることが判る。ま
た、表１は、HF／Si（OC2H5）4Dがモル比で0.1の
ときの担体のESCAのスペクトルのF1SとSi2Sピー
クの強度比をバルクステートとパウダーステート
で比較したもので、両者の強度比の値が近接して
いることから、この発明の多孔性ゲル状担体は、
表面のみならず全体がフツ素化合物になつている
ことが判る。
る。さらに詳しくは、各種クロマトグラフイーの
カラム充填材や酵素等生体触媒固定化用として好
適な活性の優れた多孔性ゲル状担体の製造法に関
する。 (ロ) 従来技術 最近、酵素等のペプチド含有化合物をガラス担
体に固定化した固定化酵素が診断用や合成用のバ
イオリアクターとして用いられるようになつてき
た。これらの固定化酵素の製造法としては、溶融
法によつて予め得られたSiO2系ガラスの表面を
アルカリ処理して水酸基を生成させ、これに例え
ばアミノアルキル基を導入しそれに酵素を付加し
て固定させる方法が知られており実用化されてい
る。 しかし上記従来の方法においてはガラス表面に
水酸基を生成させる工程が必要であり、それによ
つて生成しうる水酸基の単位面積当りの量は限度
があつて酵素等の固定量を増大し活性の高い固定
化酵素を得ることが困難であつた。 この点に関し、この発明の発明者は先に、アル
コキシシラン等の金属アルコキシドを原料としこ
れを加水分解した際に得られる多孔性のガラス様
ゲル状化合物を担体とすることにより水酸基を導
入する工程を行なうことなく活性の高い固定化酵
素が得られる事実を見出した。これは、上記ガラ
ス様ゲル状化合物は対応する水酸化金属化合物や
その低縮合物からなるためそれ自身非常に多数の
水酸基を有してのりその結果酵素の固定化能が増
加するものと考えられる。 (ハ) 発明の目的 この発明は、上記知見を更に発展させることに
よりなされたものである。すなわちアルコキシシ
ランからのガラス様ゲル状化合物製造の際に、フ
ツ化水素を接触させることにより、水酸化金属化
合物及び／又はその縮合物にフツ素原子が置換導
入された一種のフツ化ガラス様ゲル状化合物が得
られ、その導入割合を少量とした際に得られるフ
ツ化ガラス様ゲル状化合物が、フツ素化していな
いものに比して水酸基の反応性が優れており酵素
等の固定化能がさらに増加する事実を見い出すこ
とによりなされたものである。 (ニ) 発明の構成 かくしてこの発明によれば、加水分解触媒を任
意に有する水性溶液中で少量のフツ化水素酸の存
在下、アルコキシシランの加水分解を行なつてガ
ラス様ゲル状化合物を生成させることを特徴とす
る多孔性ゲル状酵素固定化用担体の製造法が提供
される。 この発明における金属アルコキシドとしては、
ガラス製造分野やセラミツクス製造分野における
原料として知られたアルコキシシランが種々適用
でき、具体的にはSi（OCH3）4、Si（OC2H5）4等の
低級アルコキシシランを用いるのが通常好適であ
る。なお、これら二種以上の混合物を用いてもさ
しつかえはない。 この発明における多孔性ゲル状担体は、上記ア
ルコキシシランを加水分解してゲル状化合物とす
る際に、フツ化水素を反応に関与させることによ
り得られる。より具体的には加水分解触媒を任意
に有する水性溶液中に、金属アルコキシドを混合
して加水分解させつつ少量のフツ化水素酸を添加
混合した後、徐々に溶媒や触媒を除去させること
により得られる。 例えば低級アルコキシシランを用いる場合に
は、水を含む揮発性の親水性溶媒（例えば含水メ
タノールや含水エタノール）中でかつ酸性下（例
えば、加水分解触媒としての塩酸等の無機酸を添
加してPH１〜３程度とするのが好ましい）の緩和
な条件下（例えば室温下）でアルコキシドの加水
分解を開始すると同時に少量のフツ化水素酸を添
加し80℃〜100℃程度に加温しつつ徐々に生成ア
ルコール、溶媒、無機酸及び未反応のフツ化水素
を蒸発しかつ充分に乾燥させることにより得られ
る。なお、場合によつては水分は空気中から供給
されるため水を含ませなくてもよい。従つて、こ
の発明の水性触媒とは親水性触媒自体をも意味す
るものである。一方、水のみで加水分解を行なう
ことも可能であるが、この場合は加水分解が不均
一になる惧れがありさらに、ゲル状物の乾燥上不
利であり好ましくない。 かようなフツ化水素の処理により、ゲル状が促
進されると共にアルコキシシランの加水分解物で
ある水酸化金属化合物及び／又はその縮合物（ガ
ラス様ゲル状化合物）における一部の水酸基（エ
ーテル結合も含む）がフツ素原子で置換され、フ
ツ素原子を化学的に結合した多孔性ゲル状担体が
得られる。この際置換導入するフツ素原子は少量
であることが必要である。この量としては、原料
のアルコキシシラン（１モル）に対するモル比と
して表わせば0.05〜1.0モル程度が適切であり、
0.2モル前後が最も好ましい。0.05モル以下では
フツ素原子導入による効果が不充分で好ましくな
く、1.0モルを越えると水酸化金属化合物及び／
又はその縮合物における水酸基の置換度が過剰と
なり以後の反応に関与しうる水酸基の量が実質的
に減少するため好ましくない。 このようにして得られた多孔性ゲル状担体は、
基本的に多数の水酸基を有するゲル状化合物から
なるため、従来のガラスを担体とするものに比し
て反応性が良好である。さらに、その水酸基やエ
ーテル結合の一部はフツ素原子で置換されている
ため、単なるゲル状化合物に比して活性はより優
れている。なお、フツ素原子の導入による効果
は、アルコキシシランで説明すれば下式（）に
示されるように、 水酸化金属化合物やその縮合物に少量置換導入さ
れたフツ素原子の誘起効果（効果）によつて隣
接するシラノールの水酸基の分極の程度が大きく
なつて水素原子が活性となり、反応性がより上昇
するものと信じられる。さらに、前述のごとくフ
ツ化水素を合成反応に関与させて得たゲル状化合
物の多孔度は、フツ化水素の反応モル比によつて
制御することができるが、いずれにおいても単な
るゲル状化合物のものよりも多孔であることから
それによる表面積の増加による効果も加わつてい
るものと考えられる。 このようにして得られた多孔性ゲル状担体は、
そのまま用いてもよく、所望の粒子状に粉砕して
用いてもよく（例えば、グルコースオキシダーゼ
固定化カラムを作製する100〜200メツシユが適切
である）、液体クロマトグラフイーやその他の各
種のクロマトグラフイーのカラム充填材の基材と
して有用であり、また、酵素、抗原、抗体等の固
定化用担体としても有用である。 なお、この発明の方法によつて得られた上記多
孔性ゲル状担体ことにアルコキシシランを用いた
担体を実用的に供するに当つて、予め300℃前後
の温度で数時間熱処理しておくことが、残留する
未反応物品、不純物等の除去や担体自体の保型強
度の向上の点好ましい。ただし、熱処理の程度が
300℃前後を越える（例えば、500℃程度）とガラ
ス様ゲル状化合物内にシロキサン結合が増加して
高縮合物化し、活性が低下する点好ましくない。
300℃前後の熱処理ではシラノール基はほとんど
シロキサン結合に変化せず活性の低下はほとんど
見られない。 また、ゲル状担体の作製は、前記アルコキシド
溶液をチユーブ、ネツト等の基材にコーテイング
した状態で行なつてもよく、この際、活性の優れ
たゲル状担体薄膜を形成することができる。 この発明の方法によつて得られたゲル状担体に
シランカツプリング剤を反応させ、その反応物に
酵素を固定化することにより固定化酵素を得るこ
とができる。 上記ゲル状担体に反応させるシランカツプリン
グ剤としては、アミノ基、チオール基、エポキシ
基などの官能性基を有する当該分野で公知のシラ
ン誘導体が適用でき、具体的にはγ−アミノプロ
ピルトリエトキシシラン、γ−クロロプロピルト
リメトキシシラン、ビニルトリエトキシシラン、
γ−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン、
Ｎ−β−（アミノエチル）−γ−アミノプロピルト
リメトキシシラン等が使用される。かようなシラ
ンカツプリング剤との反応は、当該分野で公知の
条件下で行なわれる。例えだγ−アミノプロピル
トリエトキシシランを用いた場合、このカツプリ
ング剤を水に溶解して約10％水溶液としかつPHを
３〜５に調整した後、この溶液に充分に乾燥され
た前記ゲル状担体又はその粉砕物を加え加温下混
合して数時間処理した後水洗して未反応のカツプ
リング剤を除去することにより得られる。 上記、シランカツプリング剤を導入したゲル状
担体は、それ自身従来のガラスに導入したものに
比して担体として多くのカツプリング基を有して
おり、酵素等との反応活性が高く固定化酵素用担
体やカラム充填材として有用なものである。 このようにして処理されたゲル状担体に公知の
方法で酵素が固定化される。例えば、カツプリン
グ剤そしてγ−アミノプロピルトリエトキシシラ
ンを用いてアミノアルキル基を水酸基にエステル
結合で多数導入したゲル状担体を用いる場合、上
記アミノアルキル基にグルタルアルデヒドを用い
てアルデヒド基を有するシツフベースを導入し、
これに酵素等を接触させてアルデヒド基と酵素等
のアミノ基間でさらにシーフベースを形成させて
結合することにより固定化を行なうことができ、
これ以外にもアミノアルキル基をジアソ化して芳
香族アミノ基を導入しこれに酵素等を固定化して
もよく、またカルボジイミドを用いてアミノアル
キル基を酵素等との間に直接ペプチド結合を行な
い固定化を行なつてもよく酵素等の種類に応じて
適宜選択すればよい。他のカツプリング剤使用時
にも同様に直接又は適宜変換したカツプリング基
によつて酵素等を固定化することができる。ま
た、ブロモシアン等で活性化することによつても
容易に固定化することができる。 固定化用の酵素そしては具体的にはグルコース
オキシダーゼ、ウリカーゼ、ウレアーゼ、クレア
チニナーゼ、CoA−シンテターゼ、CoA−オキ
シダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、コレス
テロールヒドロラーゼ等が挙げられるが限定され
ることはなく、抗原や抗体その他生体触媒を固定
化することもできる。 このようにして得られた固定化酵素は従来の固
定化酵素と同様に、種々の形態で診断用や合成用
のバイオリアクターとして有用であり、さらに従
来の固定化酵素に比して担体当りの酵素等の固定
量は多くバイオリアクターとしての能力が増大さ
れたものである。 (ホ) 発明の効果 以上述べたように、この発明の方法によれば、
各種クロマトグラフイーのカラム充填材や酵素等
生体触媒固定化用として好適な活性の優れた多孔
性担体を簡便に得ることができる。ことに担体と
しては従来のガラス担体に比して製造コストは1/
１０以下を極めて安価である。 (ヘ) 実施例 以下、この発明を実施例により説明する。 実施例 １ （多孔性ゲル状担体の製造） テトラエトキシシランSi（OC2H5）40.52モル、
エタノール1.72モル、水1.82モル、塩酸0.028モル
及びフツ化水素酸0.058〜0.115モルの混合物（PH
約１）を室温下で均一になるまで数十分混合撹拌
した。 次いで80℃のウオーターバス中で３昼夜加熱し
て加水分解反応で生じたエチルアルコール、水及
び残存する塩酸や未反応の微量のフツ化水素酸を
蒸発させることにより約30ｇの多孔性ゲル状担体
を得た。 （アミノアルキル化） 上記で得られたゲル状担体を粉砕して120/200
メツシユのビーズを得た。 5wt％のγ−アミノプロピルトリエトキシシラ
ン水溶液を5N塩酸でPH3.5に調整し、この溶液45
mlに対し上記ビーズ状ゲル状物を各々５ｇ投入
し、さらにPH3.5になるように調整した。この混
合物を、撹拌機、温度計、ジムロートを付設した
四ツ口フラスコに入れウオーターバスで温度を75
℃に保ち、撹拌させながら３時間反応を行なつ
た。反応終了後、ビーズを吸引メンブランフイル
ターに移し、１の蒸留水で未反応のγ−ガラス
プロピルトリエトキシシランを除去した後、デシ
ケーターで乾燥させてアミノアルキル化ゲル状担
体を得た。このアミノアルキル化ゲル状物はデシ
ケーター内で保存する。 （酵素の固定化） 上記アミノアルキル化ゲル状担体（ビーズ状）
を二官能性のグルタルアルデヒド（2.5wt％）の
リン酸塩緩衝溶液（PH7.0）に浸漬し、アスピレ
ーターで減圧させつつ約30分撹拌下反応させた。
続いてさらに約30分常圧で撹拌下反応させた。反
応温度は30℃であつた。これををPHを7.0のリン
酸塩緩衝液で充分に洗浄し、乾燥させた。この処
理によりゲル状物にアルデヒド基を有するシツフ
ベースが導入される。 得られたゲル状物１ｇを１mg／ml（グルコース
オキシターゼ／PHを7.0リン酸塩緩衝液）10ml中
に浸漬し、25℃下まず30分減圧下で緩やかに撹拌
して反応を行ない、続いて60分常圧下で緩かに撹
拌して固定化反応を行なつた。この処理によりグ
ルコースオキシターゼのアミノ基が反応に関与
し、担体（ゲル状物）のアルデヒド基とさらにシ
ツフベースを形成し固定化される。このようにし
てグルコースオキシターゼ固定化ゲル状物（固定
化酵素）が得られた。 このようにして得られた固定化酵素の活性の経
時変化をポーラログラフイーで測定した結果を第
１図に示す。なお測定条件は以下の通りである。 試験液：β−Ｄ（＋）−グルコース300mg 測定温度：28℃ 保存温度：４℃ なお、測定は固定化酵素１ｇを試験液11mlと共
に５分間撹拌混合し、その10mlをメンブランフイ
ルターで別した後滴下水銀電極によるポーラロ
グラフイーで行なつた。酸素反応で発生した
H2O2の半波電位は0.85（vs）Ａｇ／ＡｇＣ電極
とした。 このように２ケ月半を経過してもその活性に変
化は見られなかつた。 一方、フツ化水素酸を用いない以外同様にして
作製したゲル状担体を用い同様に処理して得た固
定化酵素との比較を行なつた結果を第２図に示す
（は実施例、は比較例）。このように、フツ素
原子を導入しない同様な固定化酵素に比してこの
発明のゲル状担体を用いた固定化酵素は約2.5倍
の活性を有することが判る。 実施例 ２ 実施例１と同様にしてHF／Si（CO2H5）4がモル
比で0.1〜0.5の条件下で反応を行ない多孔性ゲル
状担体をそれぞれ得た。これらの担体について前
記と同様にしてグルコースオキシターゼを固定化
して固定化酵素を得た。これらの固定化酵素の活
性と前記モル比との関係を第３図に示す。なお活
性の測定も前記に準じた。 このように、酵素活性が担体製造時のフツ化水
素酸の量に影響を受けており、ことにモル比が
0.2近傍で最大活性（ブランクに比して約７倍程
度）が示されていることが判る。また、担体製造
時に塩酸等の無機酸を添加することが好ましいこ
とが判る。 なお、モル比0.1及び0.5の際に得られる多孔性
ゲル状担体のSEM像（20000倍）を第４図及び第
５図に示した。また、第６図はフツ素原子を導入
していない多孔性ゲル状担体のSEM像（20000
倍）である。このように、この発明によつて得ら
れる担体はその表面の多孔度もフツ素原子を導入
していないものに比してより多孔であることが判
る。 実施例 ３ 実施例２で得られた多孔性ゲル状担体（ガラス
ビーズ状）のESCA（Ｘ線光電子スペクトル）に
よる分析チヤートを第７図に示す。（Ａは走査速
度2eV／secであり、Ｂは走査速度1eV／secであ
る）。なお、ESCAの測定条件は以下の通りであ
る。 ターゲツト：Ｍｇ 加速電圧：8kV フイラメント：30ｍＡ Arエツチング条件：加速電圧 2kV ミツシヨン 30ｍＡ 時 間 15分 このように、結合エネルギーが700ev近傍にフ
ツ素原子によるピークが観察されることから、フ
ツ素原子が化学的に結合していることが判る。ま
た、表１は、HF／Si（OC2H5）4Dがモル比で0.1の
ときの担体のESCAのスペクトルのF1SとSi2Sピー
クの強度比をバルクステートとパウダーステート
で比較したもので、両者の強度比の値が近接して
いることから、この発明の多孔性ゲル状担体は、
表面のみならず全体がフツ素化合物になつている
ことが判る。
【表】
実施例 ４
テトラエトキシシラン１モル、エタノール
3.557モル、水3.759モル、塩酸0.28モルを順次混
合し激しく撹拌して均一なゾルを得、これにフツ
化水素酸0.2モルを混し実施例１と同様にして固
形状のガラス様多孔性ゲル状担体を得た。 この多孔性ゲル状担体について300℃及び500℃
での熱処理の影響を調べた。すなわち120/200メ
ツシユに粉砕した担体500mgをそれぞれ電気炉中
で300℃及び500℃下３時間熱処理した後、実施例
１のようにアミノアルキル化及びグルコースオキ
シターゼの固定化を行なつた、得られた固定化酵
素の固定化率（固定化前の酵素溶液と固定化後の
酵素溶液におけるタンパク量をLowry法で求め、
両者の差を差引いて決定した）を測定した。 この結果を、比較例と共に第１表に示す。
3.557モル、水3.759モル、塩酸0.28モルを順次混
合し激しく撹拌して均一なゾルを得、これにフツ
化水素酸0.2モルを混し実施例１と同様にして固
形状のガラス様多孔性ゲル状担体を得た。 この多孔性ゲル状担体について300℃及び500℃
での熱処理の影響を調べた。すなわち120/200メ
ツシユに粉砕した担体500mgをそれぞれ電気炉中
で300℃及び500℃下３時間熱処理した後、実施例
１のようにアミノアルキル化及びグルコースオキ
シターゼの固定化を行なつた、得られた固定化酵
素の固定化率（固定化前の酵素溶液と固定化後の
酵素溶液におけるタンパク量をLowry法で求め、
両者の差を差引いて決定した）を測定した。 この結果を、比較例と共に第１表に示す。
【表】
一方、アミノアルキル化及び固定化前のそれぞ
れの担体〔フツ化水素未処理担体…(A)、熱未処理
担体…(B)、300℃熱処理担体…(C)〕について熱重
量分析（TG）を行なつた結果を第８図に示し、
微分重量分析（DTG）を行なつた結果を第９図
に示す。 図り示すように、フツ化水素で処理した担体
300℃程度の熱処理ではシラノール基はほとんど
シロキサン結合に変化せず、また吸着水分量も非
常に小さいことが判る。
れの担体〔フツ化水素未処理担体…(A)、熱未処理
担体…(B)、300℃熱処理担体…(C)〕について熱重
量分析（TG）を行なつた結果を第８図に示し、
微分重量分析（DTG）を行なつた結果を第９図
に示す。 図り示すように、フツ化水素で処理した担体
300℃程度の熱処理ではシラノール基はほとんど
シロキサン結合に変化せず、また吸着水分量も非
常に小さいことが判る。
第１図はこの発明で得られた固定化酵素の活性
の経時変化を示すグラフ、第２図は同じくグルコ
ースの濃度に対する活性の変化を比較例と共に示
すグラフ、第３図はこの発明で得られた担体を用
いた固定化酵素におけるフツ素原子導入による影
響を示すグラフ、第４図及び第５図はこの発明で
得られる多孔性ゲル状担体の多孔性表面をそれぞ
れ例示する走査型電子顕微鏡（SEM）による拡
大写真、第６図は比較例のゲル状担体の多孔性表
面を例示するSEMによる拡大写真、第７図はこ
の発明で得られる多孔性ゲル状担体のESCAスペ
クトルを例示するグラフ、第８図及び第９図はこ
の発明で得られる多孔性ゲル状担体の熱処理の影
響をそれぞれ比較例と共に示すTGチヤート図及
びDTGチヤート図である。
の経時変化を示すグラフ、第２図は同じくグルコ
ースの濃度に対する活性の変化を比較例と共に示
すグラフ、第３図はこの発明で得られた担体を用
いた固定化酵素におけるフツ素原子導入による影
響を示すグラフ、第４図及び第５図はこの発明で
得られる多孔性ゲル状担体の多孔性表面をそれぞ
れ例示する走査型電子顕微鏡（SEM）による拡
大写真、第６図は比較例のゲル状担体の多孔性表
面を例示するSEMによる拡大写真、第７図はこ
の発明で得られる多孔性ゲル状担体のESCAスペ
クトルを例示するグラフ、第８図及び第９図はこ
の発明で得られる多孔性ゲル状担体の熱処理の影
響をそれぞれ比較例と共に示すTGチヤート図及
びDTGチヤート図である。
Claims (1)
- １ 加水分解触媒を任意に有する水性溶媒中で少
量のフツ化水素酸の存在下、アルコキシシランの
加水分解を行つてガラス様ゲル状化合物を生成さ
せることを特徴とする多孔性ゲル状酵素固定化用
担体の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4942983A JPS59128205A (ja) | 1983-03-24 | 1983-03-24 | 多孔性ゲル状酵素固定化用担体の製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4942983A JPS59128205A (ja) | 1983-03-24 | 1983-03-24 | 多孔性ゲル状酵素固定化用担体の製造法 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP23015982A Division JPS59125894A (ja) | 1982-07-29 | 1982-12-29 | 活性の優れた多孔性ゲル状酵素固定化用担体 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS59128205A JPS59128205A (ja) | 1984-07-24 |
| JPH036794B2 true JPH036794B2 (ja) | 1991-01-30 |
Family
ID=12830853
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4942983A Granted JPS59128205A (ja) | 1983-03-24 | 1983-03-24 | 多孔性ゲル状酵素固定化用担体の製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS59128205A (ja) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0728718B2 (ja) * | 1984-10-22 | 1995-04-05 | 株式会社島津製作所 | バイオリアクタ−素子 |
| JPS62291541A (ja) * | 1986-06-11 | 1987-12-18 | Shimadzu Corp | 湿度センサおよびその製造法 |
| JPH056805Y2 (ja) * | 1989-07-07 | 1993-02-22 | ||
| JP5650658B2 (ja) * | 2008-12-16 | 2015-01-07 | ゾルファイ フルーオル ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツングＳｏｌｖａｙ Ｆｌｕｏｒ ＧｍｂＨ | 保護被膜を含有する金属部品 |
| JP4712879B2 (ja) | 2009-02-19 | 2011-06-29 | 公立大学法人首都大学東京 | 含水湿潤ゲルの乾燥方法及び含水湿潤ゲルの乾燥装置 |
-
1983
- 1983-03-24 JP JP4942983A patent/JPS59128205A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS59128205A (ja) | 1984-07-24 |
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