JPH036796B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、宿主菌に導入した場合、宿主菌が
200μｇ／mlの濃度のトリメトプリムに耐性を獲
得することができるプラスミドに関するものであ
り、該プラスミドの製造方法及び該プラスミドを
含む宿主菌からのジヒドロ葉酸還元酵素の簡便精
製法に関しても言及している。

近年、分子生物学及び遺伝子工学の発展を背景
に組替えDNA手法を用いて有用な物質を生み出
す方法が脚光を浴びつつある。

本発明者らは、すでに大腸菌のジヒドロ葉酸還
元酵素（以下DHFRと略す。）を多コピープラス
ミドに組み込み、これを菌体内に導入することに
より、DHFRの菌体内含量が10〜20倍増加する
こと、またトリメトプリムは、DHFRの強力な
阻害剤であり抗細菌剤として知られているが、プ
ラスミド導入によりDHFRの含量が増加するこ
とにより大腸菌がトリメトプリムに対して耐性に
なることなどを明らかにしている。〔特願、56−
143520、および、M.Iwakura et al、J.
Biochemistry vol.91、pp.1205−1212（1982）〕し
かし、大腸菌本来のDHFR含量は少なく、10〜
20倍増加したとしても、菌体内タンパク質の0.5
％以下である。細菌における遺伝子発現、すなわ
ちタンパク質の生産は、主にRNA合成の開始段
階、すなわち転写の段階において調節されてい
る。RNA合成は、プロモータと呼ばれる特別な
DNA配列を持つ部位から開始される。菌体内の
タンパク質含量は、タンパク質の種類によつて
各々異なつているが、これは各タンパク遺伝子の
プロモータ配列が微妙に異なつているためと考え
られている。

DHFR遺伝子は、タンパク質を暗号化してい
るDNA配列中に制限酵素EcoRで切断される配
列を有する。この部位に異種DNAを挿入するこ
とによりDHFRの一部と、異種DNAによつて暗
号化されるタンパク質とが結合したタンパク質を
生産することが可能であり、適切な方法、例え
ば、結合部位にメチオニンを作る暗号を導入する
ことにより異種DNAによつて暗号化されるタン
パク質とDHFRの一部とを、ブロモシアン分解
により分離することが可能である。もし、
DHFR遺伝子を含んだプラスミドを遺伝子工学
的手法を用いて改変し、DHFRを高収率で作る
ように変換できるならば、それは、上記のように
他のタンパク質にも応用できる。

このような背景から、本発明者は、DHFRの
含量を増大させるべく鋭意研究を重ねた結果、す
でに本発明者が開発しているトリメトプリム耐性
の出現を目安としたプロモータ活性を有する
DNA断片の検出方法（特願57−102553）を応用
することにより強力なプロモータを導入すること
を考えるに至つた。プロモータ材料として、大腸
菌の染色体DNAを制限酵素Hincによつて切断
したものを用いた結果、200μｇ／mlの濃度のト
リメトプリムに対しても耐性を付与できるプラス
ミドを製造することができ、またこのプラスミド
を有する菌体は、DHFR含量が全タンパク質の
約10％にも達することを見い出し、この知見に基
づいて本発明を完成するに至つた。

本発明に用いられる宿主菌は大腸菌であるが、
該プラスミドが自立的に複製される宿主、例えば
大腸菌の近縁菌であれば応用可能である。以下は
大腸菌について記載している。

DHFR遺伝子を組み込んだプラスミドとして
は、発明者がすでに作製したプラスミドpTP6−
６（特願昭57−102553に記載）を用いた。pTP6
−６は、約4300塩基対の大きさの組換えプラスミ
ドであり、宿主にアンピシリン耐性を付与する。
また、pTP6−６中には、DHFRを暗号化する配
列が存在するが、DHFR遺伝子のプロモーター
配列の一部が欠失しているために、DHFR遺伝
子の発現がおこらない。このため、pTP6−６は
宿主にトリメトプリム耐性を付与することができ
ない。pTP6−６は大腸菌に安定状態に保たれ、
pTP6−６を含有する大腸菌は微工研にFERMP
−8647として寄託されている。pTP6−６は、大
腸菌FERMP−8647から、普通に行われるプラス
ミドの調製法に従い分離して用いることができ
る。大腸菌からのプラスミドの調製法としては、
実施例において記載した方法以外にも種々の方法
が知られており、本発明に係わる当業者であれば
FERMP−8647株を用いることにより容易に
pTP6−６を調製することができる。

プロモータDNA材料としては、大腸菌の染色
体DNAを制限酵素Hincで切断したものを用い
た。制限酵素Hincは、二本鎖DNA中の 5′−GTPyPuAC−3′ 3′−CAPuPyTG−5′ の配列を認識し（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、Pu、および
Pyは、それぞれアデニン、シチジン、グアニン、
チミン、プリン、およびピリミジン残基を表わし
ている。）ちようど中央の部分を切断し、平滑末
端を作製する。制限酵素Hincで切断された大
腸菌の染色体DNAは、平均約1000塩基対の断片
を作る。その中には、プロモータ配列が無傷で存
在する断片が数多く存在するものと考えられる。
それらのうち、強力なプロモータ配列を含む断片
を利用することができれば、DHFRの含量を高
めることが可能である。逆に、強力なプロモータ
が結合した場合、DHFRの含量が高まり、その
ことによりトリメトプリム耐性が強力になるはず
である。従つて、pTP6−６のDHFR遺伝子のプ
ロモータを少し欠如させ、この部分にT4DNAリ
ガーゼを用いて、大腸菌の染色体DNAの制限酵
素Hinc切断によつて得られる断片を結合する
ことによつて、種々の断片が挿入された種々のプ
ラスミドを作製し、これを宿主菌である大腸菌に
導入し、高濃度のトリメトプリムを含ませた培地
で培養し、生長できるものを選び、これからプラ
スミドを得ることができる。目的のプラスミドを
有する菌体においては、DHFRが菌体タンパク
の約10％程度存在する。本発明者らのこれまでの
知見では、単にDHFR遺伝子を含む多コピープ
ラスミドを有する菌体は、約20μｇ／mlの濃度の
トリメトプリムを含む培地においては生育が困難
であつたが、目的のプラスミドを有する菌体は、
200μｇ／mlの濃度のトリメトプリムを含む培地
中でも生育が可能である。さらに、この菌体を音
波破砕した液より２段階の精製、すなわち硫安分
画、及びDEAE−セフアデエクスカラムクロマト
グラフイーを行うことにより高い収率でDHFR
の精製を行うことができ、均一なタンパク標品を
得ることができる。

次に実施例によつて本発明をさらに詳細に説明
する。なお、実施例における菌体からのプラスミ
ドの分離は、Tanaka及びWeisblumの方法〔T.
Tanaka、B.Weisblum；J.Bacteriology、121、
354（1975）〕に、DNAの宿主への取り込みは、
Norgardらの方法〔M.V.Norgard、K.Keem、J.
J.Monahan；Gene、３、279（1979）〕に、大腸菌
の染色体DNAの分離精製は、Saito及びMiuraの
方法〔H.Saito、K.Miura；Biochim、Biophys、
Acta、72、619（1963）〕に従つた。

実施例 １ プラスミドpTP6−６と大腸菌染色体DNAを
用いたトリメトプリムに対する耐性が増強したプ
ラスミドpTP6−10の作製。

プラスミドpTP6−６は、宿主にアンピシリン
に対する耐性を付与するプラスミドであり、すで
に本発明者が開発したものである。（特願57−
102553に記載）約5μｇのpTP6−６を400μの反
応液〔６ｍＭ、MgCl₂、0.2ｍＭエチレンジアミ
ンテトラ酢酸（以下、EDTAと略す）、及び150
ｍMNaClを含む８ｍＭ Tris−HCl緩衝液（PH
7.6）〕中で、10ユニツトの制限酵素Salで37℃、
２時間消化した後、8μの1M Tris−HCl緩衝液
（PH8.0）、4μの1M MgCl₂、5μの1M CaCl₂、
8μの5M NaCl及び1μの0.25M EDTAを加
え、25℃に保ち、２ユニツトのエキソヌクレアー
ゼBAL31を20秒作用させた。エキソヌクレアー
ゼの反応は、400μの水飽和フエノールを加え
ることにより停止させ、3000回転／分の遠心分離
により水層とフエノール層とに分け、水層を取
り、これを50ｍＭのNaClを含む50ｍＭ Tris−
HCl緩衝液（PH7.4）に透析した。透析済DNA液
をＡ液と名付けた。

次に、大腸菌の染色体DNA約2μｇを100μの
反応液〔７ｍＭ MgCl₂、１ｍＭジチオトレイト
ール（以下、DDTと略す）、60ｍＭ NaClを含
むTris−HCl緩衝液（PH7.4）〕中で、５ユニツト
の制限酵素Hincと37℃、２時間反応させる。
これに、100μの水飽和フエノールを加え、酵
素反応を停止させ、3000回転／分の遠心分離によ
り水層とフエノール層とに分け、水層を取り、こ
れを50ｍＭ NaClを含むTris−HCl緩衝液（PH
7.4）に透析した。透析済DNA液をＢ液と名付け
た。

Ａ液を100μ、Ｂ液を100μ取り両者を混ぜ、
これに20μの3M CH₃COONaを加え、さらに、
600μのエタノールを加え、−20℃で一晩放置す
ることによりDNAを沈殿させた。12000回転／分
の遠心分離により、沈殿を集め、減圧下にエタノ
ールを除いた後、20μのリガーゼ用反応液（５
ｍＭ MgCl₂、10ｍＭ DTT、0.5ｍＭ ATP、
及び50ｍＭ NaClを含む50ｍMTris−HCl緩衝
液（PH7.4）〕に充分溶かした。これに、５ユニツ
トのT4DNAリガーゼを加え、４℃で８時間反応
させ、DNAを連結させ、混成プラスミドを作製
した。この反応生成物をNorgardらの方法に従つ
て、Escherichia coli K12 C600株に取り込ませ
た。この処理をした菌体を20μｇ／mlアンピシリ
ンナトリウム及び200μｇ／mlトリメトプリムを
含む栄養寒天培地上にまき、生長する菌体を１個
得た。この菌体からプラスミドを分離し、再び
Escherichia coli K12 C600株に導入したとこ
ろ、約10⁵／μｇDNAの頻度で、200μｇ／mlの濃
度のトリメトプリムに対して耐性を示す菌体が得
られた。このプラスミドをpTP6−10と名付け
た。pTP6−10の大きさは、約4300塩基対の大き
さであり、制限酵素EcoR、Pst、Pvu、
Pvuにより各１ケ所切断されたが、制限酵素
BamH、Hind、Salによつては切断されな
かつた。第１図にpTP6−10の制限酵素による切
断地図を示す。

実施例 ２ pTP6−10を保有する大腸菌からのDHFRの単
離及び精製。

実施例１において得られた菌体を、20μｇ／ml
のアンピシリンナトリウムを含む３の栄養培地
37℃で一晩培養し、約10ｇの菌体を得た。50ｍＭ
Tris−HCl緩衝液（PH7.4）で洗浄した後、40
mlの同緩衝液に懸濁した。菌体を約10分間音波破
砕することにより、細胞を壊した。この液を
20000回転／分で30分遠心分離することにより、
上清と沈殿とを分離し、上清を約50ml得た。この
上清について、総タンパク量と総DHFR活性を
測定したところ、524.7mgのタンパク及び1996.5
ユニツトのDHFR活性が含まれており、この上
清の比活性は、3.8ユニツト／mgタンパクと計算
された。この音波破砕上清50mlに、60％飽和とな
るように固体硫安（19.5ｇ）を加え、４℃で約30
分撹拌した後、20000回転／分で30分間遠心分離
することにより、上清と沈殿とを分離し、上清を
約60ml得た。これを50ｍＭ KClを含む10ｍＭ
リン酸カリウム緩衝液（PH7.0）に充分透析した。
透析されたタンパク溶液を、50ｍＭ KClを含む
10ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（PH7.0）であら
かじめ平衡化したDEAE−Sephadex A50カラム
（φ5cm×50cm）に吸着させ、同緩衝液で充分洗つ
た後、50ｍＭから0.5Mの直線濃度勾配を作つた
KClでタンパク質を溶出させ、５mlずつフラクシ
ヨンを集め、各々について、DHFR活性及び
280nｍの吸収を測定した。DHFR活性を280nｍ
の吸収度で割つた値を各フラクシヨンごとに求
め、約50となるフラクシヨンをすべて集めた（全
量約40ml）。この液について総タンパク量と総
DHFR活性を測定したところ、17.8mgのタンパク
質及び726ユニツトのDHFR活性が含まれてお
り、この標品の比活性は40.7ユニツト／mgタンパ
クと計算された。この標品に90％飽和となるよう
に固体硫安を加えて、４℃で30分間撹拌し、タン
パクを沈殿させ、20000回転／分で30分間遠心分
離することにより沈殿を集め、沈殿を50ｍＭ
KClを含む10ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（PH
7.0）、約１mlに溶かした。このタンパク溶液を
SDS−ポリアクリルアミドゲル電気流動により分
析したところ、分子量約２万のところにのみタン
パク量のバンドが一本現われただけで他にはタン
パク量のバンドが認められなかつた。このこと
は、以上の操作により得られたDHFRは、均一
なタンパク標品であることを示している。また、
均一なタンパク標品の比活性は、40.7ユニツト／
mgタンパクであり、音波破砕上清の比活性が3.8
ユニツト／mgタンパクであることから、pTP6−
10を保有する菌体においては、DHFRが全可溶
性タンパク質のうち約9.3％も生産されていたこ
とが示された。

【図面の簡単な説明】

第１図は、pTP6−10の制限酵素による切断地
図であり、図中符号は制限酵素を表わし、Ｅは
EcoR、ＰはPst、PlはPvu、P2はPvuを
示す。また、数字の単位はキロ塩基であり、還状
DNA構造を便宜上直線上で表わしているが、本
来は両端が同一部位である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 分子量が約4.3キロ塩基対の大きさであり、
   遺伝標識としてトリメトプリム耐性を付与する遺
   伝子及びアンピシリンに対する耐性を付与する遺
   伝子を有し、トリメトプリム耐性を付与する遺伝
   子がプロモーター活性が強化されたジヒドロ葉酸
   還元酵素遺伝子であり、プロモーター活性が強化
   された該ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子を含有する
   組換えプラスミドを宿主菌に導入することによ
   り、宿主菌体が200μｇ／ml以上のトリメトプリ
   ムに対して耐性を示すように菌体の全可溶性タン
   パク質の約10％に致るまでジヒドロ葉酸還元酵素
   を菌体内に生産するように形成転換させることが
   でき、次に示される制限酵素切断地図を有するこ
   とを特徴とする組換えプラスミドpTP6−10。 （下記の切断地図中の符号は制限酵素を表わし、
   ＥはEcoR、ＰはPst、PlはPvu、P2はPvu
   を示す。また、数字の単位はキロ塩基であり、
   還状DNA構造を便宜上直線上で表わしているが、
   本来は両端が同一部位である。）