JPH0368868A - 蛋白質分析物の酸化的変性 - Google Patents

蛋白質分析物の酸化的変性

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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、免疫検定法で実施されているような蛋白質を
抗体試薬と結合させるための方法に関するものである。
より特に、本発明はジスルフィド−架橋結合されている
蛋白質を変性させて蛋白質と結合するためにそれに向け
られている抗体の能力を強化させる方法に関するもので
ある。
本発明を要約すれば、蛋白質をジスルフィド結合を分裂
させるのに充分な酸化能力を有する例えば過ヨウ素酸塩
の如き酸化剤で処理することによりジスルフィド−架橋
結合されている蛋白質の抗原性を与えるかまたは増加さ
せる方法である。過剰の酸化剤を次に還元剤の添加によ
り不活性化させる。生成した蛋白質は、蛋白質中の線状
ベプチドエピト−グに向けられた選択抗体、特に単分校
系抗体、によるそれの結合能力において増加を示す。
免疫検定法は、抗体試薬による分析対象物質（分析物）
の結合に基ずく該物質の検出または測定方法である。最
近の技術では、広範囲の分析物に対する抗体の開発が可
能になっている。免疫検定法は、臨床的に重要性のある
分析物がしばしば多数の構造的に同様な背景物質の存在
下で低濃度で存在しているような診断薬において特に有
用である。
蛋白質を抗体と接触させる前に変性条件にかけることに
より、ある種の環境下では蛋白質の抗原性、すなわち蛋
白質に対して向けられている抗体により結合される蛋白
質の能力、が臨界的に必要であったりまたは増加させら
れるということを今見いだした。ある種の環境下では、
蛋白質上のエピトープは蛋白質の天然の三次元に折りた
たまれた構造中では立体的に障害を受けているか、内包
されているか、まｔ；は埋め込まれていることがあり得
る。変性によりエピトープ上の立体的拘束が解かれ、そ
れにより抗体結合を利用できるようになりまたはより多
く利用できるようになる。従って、変性は利用可能な抗
体試薬が天然形の蛋白質と結合しないかまたは結合が検
出しようとする蛋白質の濃度に対して弱すぎるような免
疫検定法の開発において意義があり得るものである。
例えば、米国特許番号４，６５８，０２２は蛋白質の変
性により蛋白質中の線状ペプチドエピトープに向けられ
ている抗体の結合が得られたりまたは強化できることを
記載している。これは特に試験試料中に存在している他
の蛋白質に関してそれを同定するエピトープが天然形の
蛋白質中で立体的に障害を受けている蛋白質の場合に適
用される。
−例は、ヘモグロビンＡｌ２ｃとして知られているグリ
ケート（ｇｌｙｃａｔｅｄ）形のヘモグロビンである。
該特許は、抗原性を与えるかまたは強化させる目的の種
々の蛋白質変性手段、例えば加熱、音波処理、高もしく
は低ｐＨにおける処理、並びに例えばグアニジン、尿素
および洗剤の如き化学的変性剤およびチャオドロビー剤
（ｃｈａｏｔｒｏｐｉｃ　ａｇｅｎｔｓ）を用いる処理
、を記している。ジスルフィド結合を減少させる例えば
メルカプトエタノールまたはジチオトレイトールの如き
試薬の含有が変性工程の有効な促進剤であることも報告
されている。
多くの蛋白質の構造が隣接ベグチド鎖間にジスルフィド
結合を含有していることは知られている。
そのような結合は、該蛋白質の天然三次元構造の規定に
おいて重要である。蛋白質構造の研究にはしばしばジス
ルフィド結合の分裂が含まれている。
蛋白質の完全な変性にはそのような分裂が必要であり、
そしてそれは一般的には還元剤（例えばメルカプトエタ
ノールまたはジチオトレイトール）に対する露呈および
その後の被覆剤（例えばアイオド酢酸またはアイオドア
セトアミド）の添加により行われる。
ジスルフィド架橋結合されている蛋白質の抗原性はジス
ルフィド結合の分裂により与えられるかまたは増加させ
られること並びにそのような分裂は蛋白質を適当な酸化
能力を有する酸化剤で処理しそしてその後に残存してい
る酸化剤を適当な還元剤の添加により不活性化させるこ
とにより行えることを今見いだした。この酸化的変性が
ジスルフィド架橋結合されている蛋白質中のエピトープ
、特に線状ベブチドエピトーブ、を露呈させしかもその
露呈を増加させるということが見いだされた。
酸化的方法は、両者とも抗体結合に対して有害である高
濃度のチャオドロビー剤の使用またはスルフヒドリル被
覆試薬の使用を必要としない。酸化剤およびその後の還
元剤を用いる処理により、蛋白質中の露呈されたエピト
ープと結合する抗体と相容性である変性された蛋白質混
合物を生皮する。
さらに、この変性は急速でありしかも変性試薬は一般的
に安価である。
蛋白質中のジスルフィド結合が３個の共有結合、すなわ
ち２個の炭素：硫黄結合間の１個の硫黄：硫黄結合、か
らなっていることは理解されよう。
本発明の目的のためには、結合を分裂させるにはこれら
３個の個々の結合が破壊されることが重要であるとは考
えられていない。該結合のどれかの分裂が希望する変性
効果を与えるであろう。
ジスルフィド結合の分裂目的用には種々の酸化剤および
条件が適していることは明らかである。
特定の酸化剤および酸化条件の選択は、包含される特定
蛋白質の条件および耐性並びに蛋白質と結合させようと
する抗−蛋白質抗体の結合性質に従い行われる。一般的
に、酸化剤の酸化能力は意義ある分裂を生じるのに充分
なほどの高さであることが必要である。今までの実験で
は、約１．３ボルト以上の酸化能力を有する酸化剤が有
効であると証明されている。分裂剤の酸化能力を相当高
めると、望ましくない副反応や蛋白質の化学的改変を引
き起こすことがある。これらを考慮に入れ、通常の熟練
作業員が与えられた情況に対して適している酸化条件を
設定まｔ；は決定することができる。
本発明で使用できる酸化剤の代表例は、過ヨウ素酸塩（
Ｉ　Ｏ４−）、過オキソニ硫酸塩（ｓｚｏａ−）、次亜
塩素酸塩（ＯＣＦ）、クロム酸塩（ＣｒＯ４）、および
過塩素酸塩（ＣＱＯ、−）であるが、それらに限定され
るものではない。過ヨウ素酸塩が特に約０．００１〜約
０．２モル（Ｍ）の間のそして好適には約０．０１〜０
．０５Ｍの間の変性混合物中濃度で存在している時に、
特に有用な変性効果を示した。上記の酸化剤中の対カチ
オンは一般的に厳密なものではなく、通常はカリウム、
ナトリウム、リチウム、カルシウム、マグネシウム、バ
リウム、およびアンモニウムから選択できる。金属イオ
ンの添加、例えば適当なイオン形のコバルト、バナジウ
ム、鉄、マンガン、銅、クロム、錫、ルテニウム、鉛、
セリウム、ニッケル、およびネプツニウムの添加、によ
り酸化を促進させることができ、および／または温度条
件を低下させることができる。
変性効果（ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ　ｅｆｆｅｃｔ）
は一般的に、例えば温度、ｐＨｓ培養時間などの如き他
の要素にも依存している。通常は、酸化反応は室温〜約
７０℃の間の温度において簡便に実施される。通常は室
温における変性が好適であるが、ある種の条件下ではわ
ずかに高められた温度、例えば約３５℃〜約７０℃の間
、で酸化することが望ましかったりまたは必要であった
りする。
含まれる酸化剤によるが、変性媒体のｐＨが酸化能力に
影響を与え、従って酸化反応の効果にも影響を与えるこ
とがある。より一般的に言えば、ｐ　Ｈは蛋白質分子の
化学的改変を起こさないような通常の注意を払えば広い
範囲にわたり変えることができる。従って、変性反応の
ｐＨは約３〜約１１の間であることができ、より一般的
にはｐＨは約４〜約７の間に調節される。
酸化反応の他の要素は培養時間を最短にするように一般
的に調節され、反応が数秒間〜数時間まで、例えば０１
分間にわたり、進行できるように見込まれている。分析
場面では、約３０秒間〜約ＩＯ分間の培養時間になるよ
うに一般的に条件が最適にされる。
希望する変性の完了後に残っている酸化剤を捕獲するた
めに使用される還元剤は、酸化剤と同様に広範囲の物質
から選択できる。その選択は、酸化剤の酸化力を効果的
に変性させるために必要な還元能力並びに妨害的副反応
および蛋白質の改変を避ける必要性に依存する。この目
的のための代表的還元剤は、チオ硫酸塩（Ｓ２０３−）
、ジチオン酸塩（ｓ　２０４−）、ジチオトレイトール
（ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）、ジチオエリトリト
ール（ｃｌ＋ｔｈｉｏｅｒｙｔｈｒｉｔｏ１）、および
メルカプトエタノールであるが、それらに限定されるも
のではない。
ここで使用されている抗体まＩ；は抗体試薬という語は
、抗体結合位置を含んでいる得られた全ての物質を包括
するものである。従って、この語の意図する意味に含ま
れるものは完全抗体並びにそれらの適当な断片または多
官能化された形である。
完全抗体の形状の時は、それは公知の免疫グロブリン類
、例えばＩｇＧ、ＩｇＭなど、のいずれかの種類および
副種類に属することができる。抗体結合位置を保有して
いる該免疫グロブリンの断片、例えばＦａｂ、Ｆａｂ’
およびＦ（ａｂ’）２として従来から知られているＩｇ
Ｇの断片、も使用できる。さらに、免疫グロブリンの集
合体、重合体、誘導体、兵役物、およびハイブリッドま
たはそれらの断片も適宜使用できる。
抗体試薬の免疫グロブリン原料は、例えば一般的な抗血
清製造または単分枝技術のような利用可能な技術により
誘導することができる。抗体世代中の適当な時点におい
て、寄主の免疫系による希望する抗体の生成に刺激を与
えるために寄主動物にある種の物質（従来はイミュノゲ
ンと称されている）で免疫を与える。当技術の専門家は
希望する抗体の結合性質に適しているイミュノゲンを選
択するであろう。本発明は抗体試薬が向けられている蛋
白質上のエピトープが天然蛋白質中で利用できないかま
たは限定的にしか利用できない情況に関するものである
から、イミュノゲンは通常は非−天然層中のエピトープ
を示す構造を有している。このことは、エピトープが線
状エピトープである場合すなわち抗体が線状順番のアミ
ノ酸残基からなっている蛋白質上の区域に向けられてい
る場合に特に適用される。
例えば、イミュ／ゲンは変性された形状の完全蛋白質ま
たはそれらの消化もしくは合成された断片であることが
できる（後者の場合には、断片は従来のイミュノゲン性
担体物質と化学的に結合できる）。さらに、イミュノゲ
ンは合成ベブチドイミュノゲンすなわち例えば非定形の
イミュノゲン性担体（例えば牛血清アルブミン、キーホ
ールリンペットヘモシアニンなど）と化学的に結合され
た少なくとも約４個のアミノ酸残基からなる合成的に製
造されたペプチドの共役物であってもよい。
合成ペプチドイミュノゲンの使用は線状ベブチドエビト
ーブに対して免疫応答を向けさせるためである。天然の
ジスルフィド−架橋結合されている蛋白質中のそのよう
な線状エピトープが刺激された抗体に対して受容不能で
あるかまたは限定されて受容されることが知られている
場合に、本発明は変性によりエピトープを露呈させるか
またはその露呈を増加させるための手段を提供するもの
である。
本発明は１個以上のジスルフィド架橋を含有している本
質的に全ての蛋白質に適用可能であると思われる。本発
明の酸化的変性は蛋白質に向けられている各抗体に関し
て全てのジスルフィド−架橋結合されている蛋白質の抗
原性を成功裡に与えるかまたは増加させるものでないこ
とは明らかであり、その理由はそのようなことは蛋白質
の特定構造および折りたたみ並びに蛋白質の三次元天然
構造内のエピトープの位置に依存しているからである。
しかしながら、高技術の専門家は抗体がジスルフィド−
架橋結合されている蛋白質中で立体障害を受けているま
たは隠されているエピトープに対して向上されやすい場
合における本発明の方法の有用性を全く容易に決めるこ
とができるであろう。
従って、本発明は例えば５０００ダルトン以下の比較的
低い分子量を有するもの（ここで使用されている蛋白質
という語には他の概念ではそれらの分子量のためにポリ
ペプチド類と称されているものも含まれている）並びに
数十万以上の分子量を有するものを含む希望するいずれ
の蛋白質にも有効に適用することができる。代表的種類
の蛋白質には、プロタミン類、ムコ蛋白質類、グリコ蛋
白質類、グロブリン類、アルブミン類、ホスホ蛋白質類
、ヒストン類、リボ蛋白質類、クロモ蛋白質類、および
ヌクレオ蛋白質類が包含される。
本発明は、特定のジスルフィド−架橋結合されている蛋
白質分析物を特異的に測定するための免疫検定法および
試薬系に適用することができる。
本発明は、新規で有用な線状ベプチドエビトーブを見い
だしそして当該ジスルフィド−架橋結合されている蛋白
質中での該エピトープの利用性を増加させる機会を与貞
るであろう。本発明の方法は、天然蛋白質中で結合して
いる抗体に対する同定用エピト−プが入手できないかま
たは限定的にしか入手できないような場合に蛋白質を成
功裡にまたは改良して特異的に検出できるような抗体試
薬を設定しそして結合条件を制定する手段を与えるもの
である。本発明の他の用途は、蛋白質の通常に露呈され
た部分に対する抗体の生成および結合用に利用できるも
のより特異的でありおよび／またはそれより高い結合親
和力を有するジスルフィド−架橋結合されている蛋白質
中のエピトープを見いだす際の用途である。希望する寄
主動物に適当に変性された形の蛋白質またはそれの断片
を用いて免疫を与えることにより、望ましく増加した特
異性および／または結合性を示す抗体に対して生じる免
疫応答を試験することができる。この用途の応用は、例
えば血液細胞、バクテリアおよびウィルスなどの微生物
、などの如き細胞状分析物の特異的検出である。検出の
特異性を表面蛋白質抗原に結合している抗体により供さ
れるものより改良させようと希望する場合には、表面蛋
白質および／または細胞内蛋白質を変性させて改良され
た抗体応答を観察することにより内部エピトープを試験
することができる。
本発明を用いる蛋白質分析物の免疫検定測定法は本質的
には従来技術に従うことができる。それには、比較的古
い技術、例えば免疫拡散、免疫電気泳動、凝着技術、お
よび補体固着、並びに比較的最近の技術、例えば放射免
疫検定および非放射性アイソトープ方法の如き特異的に
検出可能なラベルの使用など、が包含される。本発明を
使用する蛋白質分析物に対する免疫検定法の工程には、
相当量の蛋白質を効果的に変性させて希望するエピトー
プを露呈させるために含まれている水性試験試料を処理
し、変性した試料を抗体試薬と接触させ、該蛋白質に対
する抗体試薬の結合を測定するという必須段階が包含さ
れる。もちろん測定段階は包含されている基本的な免疫
検定技術に従い変えることができる。この測定を行うｔ
；めの一般的技術は、分析物または抗体試薬と相互作用
しそして分析物および抗体の間の免疫複合体の生成を指
示するかまたは該生成と競合する方法で使用されるラベ
ルの付いた試薬を使用する。
後者の技術は例えばラベルの付いた試薬が抗体試薬との
結合用の蛋白質分析物と競合するようにされている競合
結合型式の如き種々の型式で実施することができる。抗
体試薬と結合されたラベルの付いた試薬またはそのよう
に結合されていないラベルの付いた試薬からなっている
遊離種の量を適当に測定し、そして試料中の蛋白質分析
物の量と機能的に関連させることができる。本発明の抗
体試薬を蛋白質分析物中の線状エピトープに向けさせる
場合には、ラベルの付いた試薬はラベルの付いた形の変
性蛋白質またはそれの変性断片であることができ、或い
は好適には線状エピトープ順序のアミノ酸類からなるラ
ベルの付いた形のペプチド残基であることができる。好
適な試薬である後者は利用可能な台底ペプチド方法およ
び装置によって製造することができ、そして蛋白質分子
自身の単離、精製、および変性を必要としない。
蛋白質分析物を検出するだめの他の有用な免疫検定技術
は、サンドインチ技術として知られているものである。
この方法では２種の抗体試薬が使用され、一方はラベル
が付けられておりそして他方は蛋白質分析物と結合され
ている最終的にはラベルが付けられる第一抗体試薬を結
合されていないものと分離するために使用される。ラベ
ルの付いていない第二抗体試薬は典型的には当技術で公
知のように固定形であるかまたは固定不能形である。
放射免疫検定法では、ラベルにより発生する１３号が両
方の種類において性質的に同一であるから、遊離種およ
び結合種が物理的に区別すなわち分離されなければなら
ない。そのような技術は当技術では相分離条件の理由の
ために不均質技術として知られている。時にはエリサ技
術とも称されている酵素−ラベル付き免疫検定法（米国
特許番号３゜６５４．０９０参照）および蛍光免疫検定
法（米国特許番号４，２０１，７６３．４，１３３，６
３９および３，９９２．６３１参照）などの他の不均質
免疫検定技術も知られている。均質技術として知られて
いる免疫検定技術を本発明に応用することもできる。
本発明を下記の実施例により今説明するが、それらに限
定しようとするものではない。
実施例 この実施例では、サンドイッチ免疫検定法によるＣＥＡ
の検出性を天然ＣＥＡ、本発明に従い過ヨウ素酸塩を用
いる酸化により変性されたＣＥＡ。
および先行技術方法（還元およびその後のアルキル化）
により変性されたＣＥＡに関して比較した。
酸化されたＣＥＡ−１ミリグラム／ミリリツトル（ｍｇ
／ｍＬ）のＣＥＡを含有している６マイクロリツトル（
μＬ）の溶液（米国、カリホルニア州、サンドイッチの
スクリップス・ラボラトリイス）を２９４μＬのｐＨ５
の燐酸塩−緩衝食塩水（ＰＢＳＴ−１０ｍＭ燐酸ナトリ
ウム、０．１５Ｍ塩化ナトリウム、０．０５％ツイーン
−２０および０．Ｏ１％チメロサル、水酸化ナトリウム
の添加によりｐＨが調節されている）中０．０２Ｍ過ヨ
ウ素酸ナトリウム（ＮａｌＯｎ）の中に溶解させ、そし
て密封試験管中で７０℃に５分間加熱した。溶液を水浴
中で冷却し、３００μＬのＰＢＳＴ　（［）Ｈ５）中０
．０３Ｍチオ硫酸ナトリウム（Ｎａ２Ｓ２０３）を加え
、そして溶液を撹拌により混合した。［酸化されたＣＥ
Ａ［金物はここでは略字ｒｏ　ＣＥ　ＡＪと称される。
天然ＣＥＡはｒｃＥＡＪ　と称される。１ 還元されそしてアルキル化されたＣＥＡ−プリュー　（
Ｂｒｅｗ）他、ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジイ・
アンド・ケミストリイ（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、
）、２４５　：　４５７、（１９７０）の方法。［還元
されそしてアルキル化されたＣＥＡ調台物はここでは略
字ｒＲＡｃＥＡＪ　と称される。１ サンドイッチ免疫検定法−選択された抗ｙＫ調合物をそ
れぞれＰＢＳＴ　（ｐＨ５）で１＝３に殺菌的に１０回
希釈した。
二抗体微量滴定板サンドイッチ免疫検定法を標準的工程
（バーロー（Ｈａｒｌｏｗ）、　Ｅ　、およびレーン（
Ｌａｎｅ）　、　Ｄ　、、アンチボディーズ（Ａｎｔｉ
ｂｏｄｉｅｓ）　：ラボラトリイ・マニュアル、コール
ド・スプリング・ハーバ−１９８８）に従い行った。微
量滴定板をそれぞれ次の段階との間に板洗浄機の上でＰ
ＢＳＴで５回洗浄した。ハツカネズミ抗−ＣＥＡ単分校
状抗体を捕獲抗体として微量滴定板のウェルに吸着させ
た。過剰の結合位置を牛血清アルブミン（Ｂ　Ｓ　Ａ）
のＰＢＳＴ中１％溶液で遮蔽した。
抗原ｃｔｏｏμＬ／ウェルの適当な希釈物）の添加後に
、兎の多分技状抗−ＣＥＡ抗体を検出抗体として加えた
。兎の抗体の検出を、１％のＢＳＡを含有しているＰＢ
ＳＴ　（ｐＨ８，２）中で希釈された１００μＬ／ウエ
ルの山羊抗−（兎１ｇ）−（セイヨウワサビ過酸化酵素
（ＨＲＰ）共役物の添加により行った。基質（テトラメ
チルベンジジン／過酸化水素）の添加により検定を現像
させ、そして光学的密度を４５０ナノメートル（ｎｍ）
において読み取ることにより定量化しＩ；。
結果−上記の免疫検定法を一連の希釈系ＣＥＡ。
０ＣＥＡおよびＲＡＣＥＡに対して行った。結果を第１
図のグラフに示す。
酸化剤として過オキソニ硫酸塩を用いて、ＣＥＡの酸化
を繰り返した。
酸化されたＣＥＡ−０，８４ｍｇ／ｍＬのＣＥＡを含有
している２３．８１μＬの溶液を９７６゜２μＬのＰＢ
ＳＴ　（ｐＨ５）中０．０２Ｍ過オキソニ硫酸アンモニ
ウム（ＮＨｉＳ２０．）の中に溶解させた。溶液をそれ
ぞれ２５０μＬの４部分に分け、そして密封試験管中で
それぞれ第２図に示されている温度に５−１Ｏ分間にわ
たり加熱した。
溶液を次に水浴中で冷却し、２５０μＬのＰＢＳＴ　（
ｐＨ５）中０．０３Ｍチオ硫酸ナトリウムの中に溶解さ
せ、そして溶液を撹拌により混合した。
免疫検定法−上記の実施例Ａ中と同− 結果一第２図のグラフ中に示されている。
酸化剤として次亜塩素酸塩を用いて、ＣＥＡの酸化を繰
り返しｔ；。
酸化され？：ＣＥＡ−１ｍｇ／ｍＬのＣＥＡを含有して
いる６１μＬの溶液を２９４μＩ−のＰＢＳＴ　（１）
Ｈ５）中０．０２Ｍ次亜塩素酸ナトリウム（ＮａＯＣｆ
２）の中に溶解させ、そして試験管中で室温（２２℃）
に５分間保った。次に、３００μＬのＰＢＳＴ　（ｐＨ
５）中０．３Ｍチオ硫酸ナトリウムを加え、そして溶液
を撹拌により混合しｔこ　。
免疫検定法−上記の実施例Ａ中と同一 結果〜免疫検定を一連の希釈系ＣＥＡおよび０ＣＥＡに
対して行った。結果は第３図のグラフ中に示されている
。
Ｄ、ｐＨの影響 試験試料の調合−１ｍ　ｇ　／　ｍ　ＬのＣＥＡを含有
している６μＬの溶液を第４図に示されている各ｐＨに
おいて２９４μＬのＰＢＳＴ中０．０２Ｍ過ヨウ素酸ナ
トリウムの中に溶解させた。溶液を密封試験管中で７０
℃に５分間加熱し、次に水浴中で冷却した。次に、３０
０μＬのＰＢＳＴ中０゜０３Ｍチオ硫酸ナトリウムを各
酸化反応と同じｐＨにおいて加え、そして溶液を撹拌に
より混合しｔ；。工程のいずれか段階でも無機物質の沈
澱は無視された。各組の試験試料に対して同−ｐＨにお
いて順次希釈を行った。
免疫検定法−上記の実施例Ａ中と同− 結果一第４図のグラフ中に示されている。
Ｅ、ｐＨの影響 試験試料の調合−０、３ｍ　ｇ　／　ｍ　ＬのＣＥＡを
含有している１、８．７５μＬの溶液を７３１．２μＬ
のＰＢＳＴ中０．０２Ｍ過ヨウ素酸ナトリウムの中に溶
解させた。この溶液をそれぞれ２５０μＬの３部分に分
けた。試験管を密封し、そして第５図に示されている各
温度に５分間加熱した。
次に溶液を水浴中で冷却し、それぞれに３００μＬのＰ
ＢＳＴ中０．０３Ｍチオ硫酸ナトリウムを加え、そして
試験試料を撹拌により混合した。
免疫検定法−上記の実施例Ａ中と同− 結果一第５図のグラフ中に示されている。
Ｆ、試みたグアニジン変性との比較 試験試料の調合−０，６１ｍｇ／ｍＬのＣＥＡを含有し
ている２Ｂ、２μＬの溶液を１５７２μＬのＰＢＳＴ中
３Ｍグアニジン塩酸塩溶液の中に溶解させた。３個のこ
の溶液の５００μＬ試料を別々の試験管中に入れ、そし
て第６図に示されている各温度に５分間加熱した。溶液
を水浴中で冷却した。７０℃試料の１個を免疫検定法で
直接使用した。他の２個はアミコン濃縮器管（３０゜０
００ダルトンの膜除外寸法、５０μＬに濃縮、１ｍＬに
再希釈、および５００ｘｇにおける遠心）を用いてＰＢ
ＳＴに対して透析させた。この工程を３回繰り返した。
免疫検定法−上記の実施例Ａ中と同− 結果一第６図のグラフ中に示されている。未透析試料に
より得られた平らな応答は免疫検定抗体試薬の変性によ
るものと信じられる。
本発明を以上で特別に記載しそして例示してきた。明ら
かに、本発明の精神および範囲から逸脱しない限り本発
明の他の改変を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
図面は上記の実施例で生じたデータのグラフ表示である
。第１−３図は、蛋白質抗原ＣＥＡの抗原性に対する過
ヨウ素酸塩、過オキソニ硫酸塩、および次亜塩素酸塩の
それぞれの影響に関するものである。第４および５図は
、本発明の酸化工程におけるｐＨおよび温度の影響に関
するものである。第６図は、ジスルフィド分裂なしのグ
アニジン塩酸塩を用いて試みられたＣＥＡの変性からの
結果を示している。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、ジスルフィド架橋結合を含有している蛋白質の抗原
    性を与えるかまたは増加させる方法において、蛋白質を
    蛋白質中のジスルフィド結合を分裂させるのに充分な酸
    化能力を有する酸化剤で処理し、そしてあらかじめ決め
    られた反応時間後に、生成した混合物を残存している酸
    化剤と反応しそして不活性化させるのに充分な量の還元
    剤と接触させることからなる方法。 ２、酸化剤が少なくとも約１．３ボルトの酸化能力を有
    しており且つ過ヨウ素酸塩、過オキソニ硫酸塩、次亜塩
    素酸塩、クロム酸塩、過マンガン酸塩および過塩素酸塩
    から選択され、そして還元剤がチオ硫酸塩、ジチオン酸
    塩、ジチオトレイトール、ジチオエリトリトール、およ
    びメルカプトエタノールから選択される、特許請求の範
    囲第１項記載の方法。 ３、酸化段階を約２０℃〜約７０℃の間の温度において
    実施する、特許請求の範囲第１項又は第２項のいずれか
    の方法。 ４、試験試料中でジスルフィド架橋結合を含有している
    蛋白質を検出するために蛋白質を変性条件にかけそして
    次に抗体試薬により結合させる免疫検定方法において、
    該検定が蛋白質を蛋白質中のジスルフィド結合を分裂さ
    せるのに充分な酸化能力を有する酸化剤との反応により
    変性させ、そして生成した混合物を残存している酸化剤
    と反応しそして不活性化させるのに充分な量の還元剤と
    接触させることからなっていることを特徴とする方法。 ５、酸化剤が少なくとも約１．３ボルトの酸化能力を有
    しており且つ過ヨウ素酸塩、過オキソニ硫酸塩、次亜塩
    素酸塩、クロム酸塩、過マンガン酸塩および過塩素酸塩
    から選択され、そして還元剤がチオ硫酸塩、ジチオン酸
    塩、ジチオトレイトール、ジチオエリトリトール、およ
    びメルカプトエタノールから選択される、特許請求の範
    囲第４項記載の方法。 ６、（１）蛋白質中の線状ペプチドエピトープに対して
    特異性の抗体試薬、 （２）蛋白質中のジスルフィド結合を分裂させるのに充
    分な酸化能力を有する酸化剤、および（３）該酸化剤と
    反応しそして不活性化させることのできる還元剤 を有してなっている、試験試料中でジスルフィド架橋結
    合を含有している蛋白質を免疫検定検出するための試薬
    系。 ７、酸化剤が少なくとも約１．３ボルトの酸化能力を有
    しており且つ過ヨウ素酸塩、過オキソニ硫酸塩、次亜塩
    素酸塩、クロム酸塩、過マンガン酸塩および過塩素酸塩
    から選択され、そして還元剤がチオ硫酸塩、ジチオン酸
    塩、ジチオトレイトール、ジチオエリトリトール、およ
    びメルカプトエタノールから選択される、特許請求の範
    囲第６項記載の試薬系。 ８、抗体試薬が非定形の（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｕｓ）イ
    ミュノゲン担体と結合しているペプチド残基を有してな
    る合成ペプチドイミュノゲンに対して向上させられてい
    る、特許請求の範囲第６項又は第７項のいずれかの試薬
    系。 ９、試験試料が生物学的流体である、特許請求の範囲第
    １〜４項のいずれかの方法。 １０、検出しようとする蛋白質がＣＥＡ族の一員である
    、特許請求の範囲第１〜４項のいずれかの方法。
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