JPH0369280B2 - - Google Patents
Info
- Publication number
- JPH0369280B2 JPH0369280B2 JP62008785A JP878587A JPH0369280B2 JP H0369280 B2 JPH0369280 B2 JP H0369280B2 JP 62008785 A JP62008785 A JP 62008785A JP 878587 A JP878587 A JP 878587A JP H0369280 B2 JPH0369280 B2 JP H0369280B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cells
- antibody
- cervical cancer
- human
- cancer cells
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
〔産業上の利用分野〕
この発明は、抗ひと子宮頸がん抗体、上記抗体
の製法、および上記抗体を用いるがん細胞の検出
方法に関するものである。 〔発明の背景〕 子宮がんは女性のがんの中では高い罹患率を示
している。その中でも、子宮頸がんは最も死亡数
の多いがんであり、死亡例が減少する傾向があり
ながらも依然重要ながんであるといえる。 子宮頸がんは、第１期に発見され手術等の治療
を受けると５年生存率が87.0％と高いが、第２期
では71.4％、第３期では50.1％、第４期では18.2
％と低下する。したがつて、子宮頸がんにおいて
も他のがんと同様に早期発見が重要である。 現在行われている子宮頸がんの診断法は、子宮
頸部から細胞を採取し、その細胞をスライドガラ
スに塗抹・固定し、染色後顕微鏡によりがん細胞
が存在するかどうかを調べる、細胞診と呼ばれる
方法である。この方法では、細胞をパパニコラウ
染色法またはギームサ染色法で染色し、核縁の不
整、核小体の肥大と増加、核と細胞質の不同性、
異常分裂像、多核細胞の有無等に基づいて、クラ
ス（正常）、（異常あるが悪性の疑なし）、
（悪性の疑あり、（悪性の疑濃厚）、（悪性と
断定）に分類する。しかし、この方法はがん細胞
だけを特異的に染色するものではないため、初期
がんの細胞診による診断は進行がんの診断に比較
して難しく、相当の知識と修練を要するといわれ
ている。一方では、子宮がんの集団検診受診者数
が年々増加しているため、多数の臨床標本を検査
しなければならず、細胞診における染色方法をよ
り迅速かつ客観的なものに改善する必要に迫られ
ているのが現状である。 この発明者は、細胞診における染色方法を改善
するために、抗原抗体反応を利用することを考え
た。すなわち、もし子宮頸がん細胞に対して特異
的な抗体が得られるならば、標識抗体法により子
宮頸がん細胞を特異的に染色することができる筈
である。そこで、この発明者は、子宮頸がん細胞
に対する抗体を製造することを企てた。またその
抗体としては、ただ１種の抗原決定基とのみ特異
的に反応するモノクローナル抗体を得ることを試
みた。 従来、モノクローナル抗体の製造法としては、
動物を悪性腫瘍細胞で免疫し、その動物から得た
抗体産生細胞と骨髄腫細胞とを融合させてハイブ
リドーマを得、ハイブリドーマの中から抗体を産
生するものを選択し、選択したハイブリドーマの
培養物中から抗体を得る方法〔ネイチユア
（Nature）256巻495頁、1975年、および特公昭58
−45407号〕が知られている。しかし、子宮頸が
ん細胞がモノクローナル抗体の製造に役立つ抗原
決定基をもつかどうかは知られていない。この発
明者は、研究を重ねた結果、子宮頸がん細胞に対
する数種類のモノクローナル抗体の製造に成功
し、それが認識する抗原決定基の細胞上における
位置を確認し、またその抗体を標識抗体法（蛍光
または酵素抗体法）に用いて子宮頸がん細胞を特
異的に染色することに成功し、それによつて子宮
頸がんの早期診断を容易かつ迅速に行なうことを
可能にしたのである。 〔発明の構成〕 すなわち、この発明は、 (A) ひと子宮頸がん細胞の抗原決定基に対して反
応するが、ひと子宮頸部の正常組織とは反応せ
ず、イムノグロブリンサブクラスG2aまたは
G2bに属するものであるモノクローナル抗体、 (B) 蛋白分解酵素を用いないて培養器から分離し
たひと子宮頸がん細胞により免疫した哺乳類
（ひとを除く）の抗体産生細胞と骨髄腫細胞と
の融合によるハイブリドーマを培養し、培養物
からひと子宮頸がん細胞の抗原決定基に対して
反応するが、ひと子宮頸部の正常組織とは反応
せず、イムノグロブリンサブクラスG2aまたは
G2bに属するものであるモノクローナル抗体を
分離採取することを特徴とする、上記抗体の製
法、および (C) 検査すべき組織の試料を、ひと子宮頸がん細
胞の抗原決定基に対して反応するが、ひと子宮
頸部の正常組織とは反応せず、イムノグロブリ
ンサブグラスG2aまたはG2bに属するものであ
るモノクローナル抗体であつて標識を付したも
のまたは付しないものと接触させ、後者の場合
にはさらに標識を付した第２抗体と接触させ、
標識を検索することを特徴とする、ひと子宮頸
がん細胞の検出方法を提供するものである。ま
たこの発明は、 (D) ひと子宮頸がん細胞で免疫した哺乳類（ひと
を除く）の抗体産生細胞と骨髄腫細胞とを融合
させてなる、ひと子宮頸がん細胞の抗原性部位
に対して反応するモノクローナル抗体を産生す
るハイブリドーマ、および (E) ひと子宮頸がん細胞で免疫した哺乳類（ひと
を除く）の抗体産生細胞と骨髄腫細胞とを融合
させ、融合細胞からひと子宮頸がん細胞の抗原
決定基に対して反応するモノクローナル抗体を
産生するものを選択することを特徴とする、ハ
イブリドーマの取得法の実施を可能にするもの
である。 以下、上記の発明を詳細に説明する。 （抗体の製造） １ 免疫 この発明のモノクローナル抗体を製造するに
は、まずひと子宮頸がん細胞で哺乳類の動物を
免疫する。ひと子宮頸がん細胞としては、初代
培養細胞またはHeLa細胞の様な樹立培養細胞
を用いることができる。免疫は、例えば次のよ
うに行なう。細胞を、牛胎児血清（10％ｖ／
ｖ）、ペニシリン（100U／ml）、ストレプトマ
イシン（100μｇ／ml）を含むダルベツコ−
MEM培地（以下増殖培地と呼ぶ）の様な適当
な培地中で培養し、細胞が培養フラスコに一面
に広がるまで増殖後上清を除去し、カルシウム
及びマグネシウム不含のりん酸緩衝液（PH7.2、
以下PBSと呼ぶ）を加えて洗い、PBSを細胞
面にピペツトで吹きつけることにより細胞を培
養フラスコから剥がし取る。この方法の方がト
リプシンなどの蛋白分解酵素により細胞を剥が
し取るよりも細胞表面の抗原の損失が少ない。 遠心分離等の分離手段により子宮頸がん細胞
を集め、マウス、ラツト等の哺乳類動物に免疫
する。哺乳類動物は、細胞融合する際の相手の
永久増殖性細胞と同系統の動物の方が望まし
い。動物の週齢は、例えばマウスでは５〜10週
齢がよい。性は雄雌どちらでもよい。免疫に用
いるひと子宮頸がん細胞の数は、例えばマウス
の場合１匹あたり５×106〜２×107個が好まし
い。細胞は、例えばPBSに懸濁させるか、ま
たはフロイントコンプリートアジユバントと
１：１の比で混合しエマルジヨンにして動物の
腹腔内、静脈内、皮下等に投与するのが好まし
い。この免疫操作を１〜３週間隔で１〜５回行
なう。最終免疫は、例えば細胞をPBSに懸濁
させ、動物の静脈内あるいは腹腔内に投与して
行なう。このようにして免疫した動物の体液ま
たは抗体産生細胞からは、ポリクローナル抗体
が得られる。 ２ 細胞融合 上記のようにしてひと子宮頸がん細胞で免疫
した動物から抗体産生細胞をとり出す。抗体産
生細胞は、脾臓、リンパ節、末梢血等から得ら
れるが、脾臓が好ましい。例えば、脾臓を最終
免疫の２〜５日後に無菌的に摘出し、ダルベツ
コ−MEM培地中ではさみによつて細切し脾臓
細胞を浮遊させた後、遠心分離することにより
脾臓細胞を集めて用いる。 融合の相手の永久増殖性細胞としては、骨髄
腫細胞を用いる。骨髄腫細胞は抗体産生細胞と
同種の動物由来のものが好ましい。例えばマウ
スの場合、P3X63−Ag8.U1（P3U1）、P3／
NS1／１−Ag4−１（NS−１）、SP2／０−
Ag14（SP2）、P3X63Ag8（X63）、P3X63−
Ag8.653（653）などが用いられる。また、骨髄
腫細胞としては、８−アザグアニン耐性細胞
株、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルト
ランスフエラーゼ欠損細胞株のような、選別の
際のマーカーとなり得る特性を有するものが好
ましい。これらの細胞株は、例えばアメリカン
タイプカルチヤーコレクシヨン（ATCC）ある
いは大日本製薬(株)より入手可能である。融合に
際しては、これらの骨髄腫細胞のいずれかを増
殖培地中で培養し、融合の前に例えばダルベツ
コ−MEM培地で洗浄後遠心分離により集め
る。 融合は、例えば次のように行なう。抗体産生
細胞（例えば脾臓細胞）と骨髄腫細胞を細胞数
比で２〜10：１になるように混合し、37℃に保
ちつつポリエチレングリコール等の融合促進剤
を徐々に加えて細胞融合を起させる。培養液を
加え融合促進剤を希釈して融合を停止させ、遠
心分離により細胞を分離する。次に、例えば細
胞をヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジ
ンを増殖培地に加えたHAT培地中に懸濁さ
せ、96ウエルマイクロテストプレートに
200μ1／ウエルずつ分注し、37℃、CO25％、湿
度95％のCO2インキユベータ中（以下、CO2イ
ンキユベータ中の培養条件は全て下記と同一と
する）で培養する。培養液は２日間隔で半量ず
つ新しいHAT培地と交換する。約１週間培養
後、交換する培地を増殖培地にヒポキサンチン
及びチミジンを添加したHT培地に変える。 ３ ハイブリドーマのスクリーニング及びクロー
ニング 次に、HT培地中で数日間培養し、ハイブリ
ドーマのコロニーがマイクロテストプレートの
ウエルの半分程度まで広がつてきた時点でどの
ウエルのハイブリドーマが子宮頸がん細胞に対
するモノクローナル抗体を産生しているかをス
クリーニングする。スクリーニングは、例えば
次のように行なう。ハイブリドーマが増殖して
来ているウエルの培養上清を一部とり、それが
培養子宮頸がん細胞と反応するかどうかを例え
ば酵素抗体法あるいは蛍光抗体法等の公知の標
識抗体法で調べる。 次に、例えば限界希釈法や軟寒天法等の公知
の技術を用いて、子宮頸がん細胞と反応するモ
ノクローナル抗体を産生しているハイブリドー
マをクローニングして単一のモノクローナル抗
体を産生するハイブリドーマの集団を選択す
る。クローニング及びスクリーニングは２回以
上繰り返すことが望ましい。 ４ モノクローナル抗体の製造 上記のようにして得られたハイブリドーマを
インビトロ（培養器具内または栄養培地中）及
びインビボ（生体内または動物組織中）で培養
することによりモノクローナル抗体を産生させ
る。培養は、例えば次のように行なう。インビ
トロでの培養では、増殖培地の様な適当な培地
を用い、例えばCO2インキユベータ中でハイブ
リドーマを培養する。ハイブリドーマが増殖限
度まで増殖した時点で培養液を採取し、遠心分
離のような固液分離手段でハイブリドーマと培
養上清を分離する。培養上清中のモノクローナ
ル抗体は目的によつては精製せずに用いること
も可能であるが、分離する場合には例えば硫酸
アンモニウムで塩析し、0.02Mりん酸緩衝液
（PH7.2）で透析後、ジエチルアミノエチルセル
ロースカラム等に通して精製する。 培養上清から分離したハイブリドーマは、例
えばジメチルスルホキシド（５〜10％ｖ／ｖ）
及び牛胎児血清（10〜20％ｖ／ｖ）を添加した
ダルベツコ−MEMの様な適当な培地中に１〜
10×106個／mlの細胞密度で懸濁させ、適当な
アンプルに入れて徐々に−80℃以下に凍結させ
ることにより、生きたままの状態で長期保存す
ることが可能である。特に、例えば液体窒素等
の超低温下ではハイブリドーマを半永久的に保
存することができる。 ハイブリドーマをインビボで培養する場合に
は、任意の動物にハイブリドーマを移植する
が、細胞融合に用いた脾臓細胞を採取した動物
と同種のものを使用するのが好ましい。例えば
BALB／ｃマウスの場合には、ハイブリドー
マの移植の１〜３週間前に２，６，10，14−テ
トラメチルペンタデカン0.5mlを腹腔内に注射
しておき、マウス１匹あたり２〜10×106個の
ハイブリドーマを腹腔内に注射する。１〜２週
間後にマウスの腹腔内にモノクローナル抗体を
高濃度に含んだ腹水が貯留し腹部が肥大してく
るので、腹水を採取し培養上清の場合と同様に
精製する。 ５ モノクローナル抗体の特性 上記のようにして得られたモノクローナル抗
体の特性の検討は、例えば以下のようにして行
なう。まず、モノクローナル抗体が培養子宮頸
がん細胞のどの部位と反応するかを調べるため
に、公知の標識抗体法、例えば蛍光抗体法また
は酵素抗体法を行う。 次にモノクローナル抗体の特異性の検討を、
培養ひと正常細胞および培養ひとがん細胞との
反応性並びに既存のがん関連抗原との反応性を
公知の標識免疫測定法（例えば酵素免疫測定
法）によつて行う。 また、モノクローナル抗体のイムノグロブリ
ンクラスおよびサブクラスの決定は、抗イムノ
グロブリンクラス・サブクラス抗体を用いた標
識（例えば酵素）免疫測定法によつて行うこと
が出来る。 この発明のモノクローナル抗体は、イムノグ
ロブリンサブクラスG2aまたはG2bに属するも
のであり、ひと子宮頸がん細胞の抗原決定基に
対して反応するがひと子宮頸部の正常組織とは
反応しない。 （用途） この発明のモノクローナル抗体は、例えば細胞
診におけるひと子宮頸がん細胞の検出方法に用い
られる。この検出方法は、検査すべき組織の試料
を、標識を付したこの発明のモノクローナル抗体
と接触させた後、標識検知手段によつて細胞に付
着した標識を検索するか、または標識を付してい
ないこの発明のモノクローナル抗体と接触させた
後標識を付した第２抗体（この発明のモノクロー
ナル抗体と結合し得る抗体）と接触させ、標識検
知手段によつて細胞に付着した標識を検索するこ
とによつて行なわれる。標識としては、放射能、
酵素、蛍光化合物（例えばフルオレスセインイソ
チオシアネート、テトラメチローダミンイソチオ
シアネート）等が用いられる。第２抗体の製造、
および抗体に対する標識の付着は常法によつて行
なわれる。上記の検出方法には、(a)標識を付しま
たは付していないこの発明の抗体、(b)必要に応じ
て、標識を付した第２抗体、および(c)必要な他の
試薬および器具（例えば組織採取器具、緩衝液、
チヤンバースライド等）を含む、診断用キツトを
作成・使用するのが便利である。この発明のモノ
クローナル抗体はひと子宮頸がん細胞と特異的に
反応するため、子宮頸がんの診断の迅速化および
客観化に大きく寄与するものである。 ［実施例］ 以下、この発明を実施例によりさらに詳細に説
明する。 実施例 １ヒト子宮頸がんに対するモノクローナ
ル抗体の製造 (1) 免疫 ヒト子宮頸がん由来細胞であるHeLa細胞
（大日本製薬(株)から購入）を増殖培地中、
CO2インキユベータ内で培養した。細胞が単
層を形成した段階で培養液を捨て、培養容器
底面に付着している細胞にPBSをピペツト
で吹きつけることにより細胞を剥がしとり、
遠心分離（400×ｇ、５分間）して細胞を集
めた。 このHeLa細胞をPBSに懸濁し、、フロイ
ントコンプリートアジユバントと１：１の割
合で充分混合し、２匹のBALB／ｃマウス
（６週令、雌、日本チヤールズリバー社）に
１匹あたり１×107個（0.4ml）の割で腹腔内
に注射した。２週間後、上記と同様にして集
めたHeLa細胞をPBSに懸濁させ、１匹あた
り１×107個（0.4ml）の割で尾静脈内に投与
した。 (2) 細胞融合 ２回目の免疫の３日後に、免疫された２匹
のマウスから脾臓を無菌的に摘出し、ダルベ
ツコ−MEM培地中に細切した脾臓細胞を浮
遊させ、250×ｇで５分間、室温で遠心分離
して細胞を集めた。ダルベツコ−MEM培地
で２回細胞を洗浄した後、融合まで室温に放
置した。マウスの骨髄腫細胞NS−１（大日本
製薬(株)から購入）は増殖培地中、CO2インキ
ユベータ内で培養しておいた。細胞融合の直
前にNS−１細胞を遠心管に移し、200×ｇで
５分間、室温で遠心分離して細胞を集めた。
細胞をさらに２回ダルベツコ−MEM培地で
洗浄し、融合まで室温に放置した。 脾臓細胞1.5×108個とNS−１細胞３×107
個を遠心管に移して混合し、400×ｇで５分
間、室温で遠心した。上清を除去し、細胞を
しつかりしたペレツトにした。遠心管を37℃
に保ちつつ、これにダルベツコ−MEM中37
℃に温めた50％ポリエチレングリコール
（PEG4000、メルク）１mlを１分間かけて
徐々に加え、細胞と混合した。さらに１分
間、ピペツトの先で細胞ペレツトをかき混ぜ
続けた。次に37℃に温めた10mlのダルベツコ
−MEM培地を５分間かけて混ぜながら加
え、室温、400×ｇで５分間遠心し、上清を
除去した。牛胎児血清（10％ｖ／ｖ）、ペニ
シリン（100U／ml）、ストレプトマイシン
（100μｇ／ml）、ヒポキサンチン（１×
10-4M）、アミノプテリン（４×10-7M）、チ
ミジン（1.6×10-5M）を含むダルベツコ−
MEM培地（以下、HAT培地と呼ぶ）を60
ml加えて細胞浮遊液を作り、96ウエルマイク
ロテストプレート（フアルコン3072）３枚に
200μ1／ウエルずつ分注し、CO2インキユベ
ータ内で培養した。 培養液は２日間隔で半量ずつ新しいHAT
培地と交換した。培養開始後７日目に、ハイ
ブリドーマのコロニーが肉眼で観察出来るよ
うになつたが、培地をHAT培地からアミノ
プテリンだけを含まないHT培地に変え培養
を続けた。 (3) ハイブリドーマのスクリーニング及びクロ
ーニング 培養開始後11日目に、ハイブリドーマのコ
ロニーが96ウエルマイクロテストプレートの
ほとんどのウエルでウエルの底面積の半分程
度まで増殖して来たので、子宮頸がん細胞に
対する抗体を産生しているかどうかをスクリ
ーニングした。 96ウエルマイクロテストプレートにHeLa
細胞を単層を形成するまで培養しておき、培
養上清を除去後PBS中１％ｗ／ｖ牛血清ア
ルブミン溶液（以下、１％BSAと呼ぶ）で
ウエルを満たし、室温で１時間放置した。
0.05％ｖ／ｖツイーン20添加りん酸緩衝液
（以下、ツイーン−PBSと呼ぶ）でウエルを
３回洗浄後、ハイブリドーマ培養上清を
50μ1／ウエルずつ分注し、室温で２時間放
置した。ツイーン−PBSでウエルを４回洗
浄後、ペルオキシダーゼ標識抗マウスIgG＋
IgMうさぎ抗体（ザイメツドボラトリーズ）
の1000分の１希釈液を100μ1／ウエルずつ分
注し、室温で２時間放置した。ツイーン−
PBSでウエルを４回洗浄後、100μｇ／mlの
２，2′−アジノビス（３−エチルベンゾチア
ゾリン−６−スルホン酸）（以下、ABTSと
呼ぶ）と0.03％過酸化水素を含む0.1Mクエ
ン酸緩衝液（PH4.2）を100μ1／ウエルずつ加
え室温で30分間反応させた。２ｍＭのアジ化
ナトリウム溶液を100μ1／ウエルずつ分注し
て反応を停止させ、ウエルの青緑色の発生を
観察し、発色したウエル中に子宮頸がんに対
する抗体が存在すると判定した。 同様の操作を、正常人血清をPBSで10分
の１に希釈した溶液を100μ1／ウエル加え、
４℃で１晩放置してコーテイングした96ウエ
ルマイクロプレートについても行つた。 HeLa細胞と反応するモノクローナル抗体
を産生するハイブリドーマを含むウエルは、
288ウエル中７ウエルであり、正常人血清と
反応するものは288ウエル中０ウエルであつ
た。 次にこの７ウエル中のハイブリドーマを限
界希釈法でクローニングした。マウス
（BALB／ｃ、３週令）の胸腺を無菌的に摘
出し、ハサミで細切して胸腺細胞を増殖培地
に懸濁し、５×106個／mlの細胞浮遊液を作
り、そこにハイブリドーマを５個／mlになる
ように希釈した液を200μ1／ウエルずつ96ウ
エルマイクロテストプレートに分注し、CO2
インキユベータ内で培養した。培養開始後12
日目に、ハイブリドーマのコロニーが１ウエ
ルに１個だけ存在するウエルの培養上清につ
いて、上記の抗子宮頸がん細胞モノクローナ
ル抗体産生ハイブリドーマのスクリーニング
を行つた。このクローニングおよびスクリー
ニングの操作を２回くり返し、２種類のハイ
ブリドーマ、1C2、2G12を樹立した。 (4) モノクローナル抗体の製造 樹立したハイブリドーマをそれぞれ増殖培
地中に初期細胞密度３×104個／mlで浮遊さ
せ、CO2インキユベータ内で培養し、４日後
培養液を遠心分離（400×ｇ、10分間）し、
モノクローナル抗体を含む培養上清を採取し
た。 インビボでのハイブリドーマの培養では、
ハイブリドーマを移植する２週間前に
BALB／ｃマウス（８週令）の腹腔内に１
匹あたり0.5mlの２，６，10，14−テトラメ
チルペンタデカンを注射しておいた。これら
のマウスに２種類のハイブリドーマを１×
107個／mlの細胞密度でダルベツコ−MEM
培地に懸濁させた細胞浮遊液を１匹あたり
0.5mlずつ腹腔内に注射した。15日後マウス
の腹腔内に貯留した腹水（５〜８ml）を注射
器で吸引採取し、遠心分離（400×ｇ、10分
間）後、モノクローナル抗体を含む腹水上清
を採取した。 このようにして２種類のハイブリドーマ、
1C2、2G12を培養し、それぞれのハイブリド
ーマが産生したモノクローナル抗体を次のよ
うにして分離した。 モノクローナル抗体を含む培養上清もしく
は腹水上清に４℃で等量の飽和硫酸アンモニ
ウムを徐々に加え塩析し、0.02Mりん酸緩衝
液（PH7.2）で24時間透析した。この透析画
分を0.02Mりん酸緩衝液（PH7.8）で平衡化
したジエチルアミノエチルセルロースカラム
（ワツトマン）に通し、溶離液を限外濾過し
た後、280nｍにおける吸光度測定による蛋
白濃度が約10mg／mlになるまで減圧濃縮し、
モノクローナル抗体を含む濃縮液約３mlを得
た。 得られたモノクローナル抗体をそれぞれＭ
−１、Ｍ−２と名付けた。これらは何れも、
電気泳動法による分子量が約15万であつた。 実施例 ２ モノクローナル抗体の特性 (1) 蛍光抗体法 HeLa細胞を、ラブテツクテイツシユカルチ
ヤーチヤンバー／スライド（4804、マイルスラ
ボラトリーズ）内で、増殖培地中、初期細胞密
度１×104個／mlで３日間培養後、培養上清を
除去し、１％BSAで満たした。室温で１時間
放置後、ツイーン−PBSで３回洗浄し、モノ
クローナル抗体を含む培養上清を200μ1ずつ加
え、室温で２時間反応させた。次に上清を除去
し、ツイーン−PBSで４回洗浄後FITC標識抗
マウスIgG＋IgMやぎ抗体溶液（PBSで10分の
１希釈、ケーピーエル）を100μ1ずつ加え、37
℃で30分間反応させた。上清を除去し、PBS
で４回洗浄後、蛍光顕微鏡（ニコン・ダイアフ
オトTMD−EF）で検鏡した。 ２種類のモノクローナル抗体のうちＭ−１で
はHeLa細胞の細胞表面に強い蛍光が観察さ
れ、Ｍ−２ではHeLa細胞の細胞間質に強い蛍
光が観察された。こうして、それぞれのモノク
ローナル抗体の認識する抗原決定基の細胞上の
位置が確認された。 (2) モノクローナル抗体のクラス・サブクラスの
決定 HeLa細胞を、96ウエルマイクロテストプレ
ート中で培養し、単層を形成した時点で培養上
清を除去し、１％BSAを加えて室温で１時間
放置した。次に上清を除去し、ツイーン−
PBSで４回洗浄後、モノクローナル抗体を含
む培養上清を100μ1／ウエルずつ分注し、室温
で２時間放置した。ツイーン−PBSで４回洗
浄後、MonoAb−ID EIA KIT（ザイメツドラ
ボラトリーズ）を用いて２種類のモノクローナ
ル抗体のクラス・サブクラスを決定した（第１
表）。
の製法、および上記抗体を用いるがん細胞の検出
方法に関するものである。 〔発明の背景〕 子宮がんは女性のがんの中では高い罹患率を示
している。その中でも、子宮頸がんは最も死亡数
の多いがんであり、死亡例が減少する傾向があり
ながらも依然重要ながんであるといえる。 子宮頸がんは、第１期に発見され手術等の治療
を受けると５年生存率が87.0％と高いが、第２期
では71.4％、第３期では50.1％、第４期では18.2
％と低下する。したがつて、子宮頸がんにおいて
も他のがんと同様に早期発見が重要である。 現在行われている子宮頸がんの診断法は、子宮
頸部から細胞を採取し、その細胞をスライドガラ
スに塗抹・固定し、染色後顕微鏡によりがん細胞
が存在するかどうかを調べる、細胞診と呼ばれる
方法である。この方法では、細胞をパパニコラウ
染色法またはギームサ染色法で染色し、核縁の不
整、核小体の肥大と増加、核と細胞質の不同性、
異常分裂像、多核細胞の有無等に基づいて、クラ
ス（正常）、（異常あるが悪性の疑なし）、
（悪性の疑あり、（悪性の疑濃厚）、（悪性と
断定）に分類する。しかし、この方法はがん細胞
だけを特異的に染色するものではないため、初期
がんの細胞診による診断は進行がんの診断に比較
して難しく、相当の知識と修練を要するといわれ
ている。一方では、子宮がんの集団検診受診者数
が年々増加しているため、多数の臨床標本を検査
しなければならず、細胞診における染色方法をよ
り迅速かつ客観的なものに改善する必要に迫られ
ているのが現状である。 この発明者は、細胞診における染色方法を改善
するために、抗原抗体反応を利用することを考え
た。すなわち、もし子宮頸がん細胞に対して特異
的な抗体が得られるならば、標識抗体法により子
宮頸がん細胞を特異的に染色することができる筈
である。そこで、この発明者は、子宮頸がん細胞
に対する抗体を製造することを企てた。またその
抗体としては、ただ１種の抗原決定基とのみ特異
的に反応するモノクローナル抗体を得ることを試
みた。 従来、モノクローナル抗体の製造法としては、
動物を悪性腫瘍細胞で免疫し、その動物から得た
抗体産生細胞と骨髄腫細胞とを融合させてハイブ
リドーマを得、ハイブリドーマの中から抗体を産
生するものを選択し、選択したハイブリドーマの
培養物中から抗体を得る方法〔ネイチユア
（Nature）256巻495頁、1975年、および特公昭58
−45407号〕が知られている。しかし、子宮頸が
ん細胞がモノクローナル抗体の製造に役立つ抗原
決定基をもつかどうかは知られていない。この発
明者は、研究を重ねた結果、子宮頸がん細胞に対
する数種類のモノクローナル抗体の製造に成功
し、それが認識する抗原決定基の細胞上における
位置を確認し、またその抗体を標識抗体法（蛍光
または酵素抗体法）に用いて子宮頸がん細胞を特
異的に染色することに成功し、それによつて子宮
頸がんの早期診断を容易かつ迅速に行なうことを
可能にしたのである。 〔発明の構成〕 すなわち、この発明は、 (A) ひと子宮頸がん細胞の抗原決定基に対して反
応するが、ひと子宮頸部の正常組織とは反応せ
ず、イムノグロブリンサブクラスG2aまたは
G2bに属するものであるモノクローナル抗体、 (B) 蛋白分解酵素を用いないて培養器から分離し
たひと子宮頸がん細胞により免疫した哺乳類
（ひとを除く）の抗体産生細胞と骨髄腫細胞と
の融合によるハイブリドーマを培養し、培養物
からひと子宮頸がん細胞の抗原決定基に対して
反応するが、ひと子宮頸部の正常組織とは反応
せず、イムノグロブリンサブクラスG2aまたは
G2bに属するものであるモノクローナル抗体を
分離採取することを特徴とする、上記抗体の製
法、および (C) 検査すべき組織の試料を、ひと子宮頸がん細
胞の抗原決定基に対して反応するが、ひと子宮
頸部の正常組織とは反応せず、イムノグロブリ
ンサブグラスG2aまたはG2bに属するものであ
るモノクローナル抗体であつて標識を付したも
のまたは付しないものと接触させ、後者の場合
にはさらに標識を付した第２抗体と接触させ、
標識を検索することを特徴とする、ひと子宮頸
がん細胞の検出方法を提供するものである。ま
たこの発明は、 (D) ひと子宮頸がん細胞で免疫した哺乳類（ひと
を除く）の抗体産生細胞と骨髄腫細胞とを融合
させてなる、ひと子宮頸がん細胞の抗原性部位
に対して反応するモノクローナル抗体を産生す
るハイブリドーマ、および (E) ひと子宮頸がん細胞で免疫した哺乳類（ひと
を除く）の抗体産生細胞と骨髄腫細胞とを融合
させ、融合細胞からひと子宮頸がん細胞の抗原
決定基に対して反応するモノクローナル抗体を
産生するものを選択することを特徴とする、ハ
イブリドーマの取得法の実施を可能にするもの
である。 以下、上記の発明を詳細に説明する。 （抗体の製造） １ 免疫 この発明のモノクローナル抗体を製造するに
は、まずひと子宮頸がん細胞で哺乳類の動物を
免疫する。ひと子宮頸がん細胞としては、初代
培養細胞またはHeLa細胞の様な樹立培養細胞
を用いることができる。免疫は、例えば次のよ
うに行なう。細胞を、牛胎児血清（10％ｖ／
ｖ）、ペニシリン（100U／ml）、ストレプトマ
イシン（100μｇ／ml）を含むダルベツコ−
MEM培地（以下増殖培地と呼ぶ）の様な適当
な培地中で培養し、細胞が培養フラスコに一面
に広がるまで増殖後上清を除去し、カルシウム
及びマグネシウム不含のりん酸緩衝液（PH7.2、
以下PBSと呼ぶ）を加えて洗い、PBSを細胞
面にピペツトで吹きつけることにより細胞を培
養フラスコから剥がし取る。この方法の方がト
リプシンなどの蛋白分解酵素により細胞を剥が
し取るよりも細胞表面の抗原の損失が少ない。 遠心分離等の分離手段により子宮頸がん細胞
を集め、マウス、ラツト等の哺乳類動物に免疫
する。哺乳類動物は、細胞融合する際の相手の
永久増殖性細胞と同系統の動物の方が望まし
い。動物の週齢は、例えばマウスでは５〜10週
齢がよい。性は雄雌どちらでもよい。免疫に用
いるひと子宮頸がん細胞の数は、例えばマウス
の場合１匹あたり５×106〜２×107個が好まし
い。細胞は、例えばPBSに懸濁させるか、ま
たはフロイントコンプリートアジユバントと
１：１の比で混合しエマルジヨンにして動物の
腹腔内、静脈内、皮下等に投与するのが好まし
い。この免疫操作を１〜３週間隔で１〜５回行
なう。最終免疫は、例えば細胞をPBSに懸濁
させ、動物の静脈内あるいは腹腔内に投与して
行なう。このようにして免疫した動物の体液ま
たは抗体産生細胞からは、ポリクローナル抗体
が得られる。 ２ 細胞融合 上記のようにしてひと子宮頸がん細胞で免疫
した動物から抗体産生細胞をとり出す。抗体産
生細胞は、脾臓、リンパ節、末梢血等から得ら
れるが、脾臓が好ましい。例えば、脾臓を最終
免疫の２〜５日後に無菌的に摘出し、ダルベツ
コ−MEM培地中ではさみによつて細切し脾臓
細胞を浮遊させた後、遠心分離することにより
脾臓細胞を集めて用いる。 融合の相手の永久増殖性細胞としては、骨髄
腫細胞を用いる。骨髄腫細胞は抗体産生細胞と
同種の動物由来のものが好ましい。例えばマウ
スの場合、P3X63−Ag8.U1（P3U1）、P3／
NS1／１−Ag4−１（NS−１）、SP2／０−
Ag14（SP2）、P3X63Ag8（X63）、P3X63−
Ag8.653（653）などが用いられる。また、骨髄
腫細胞としては、８−アザグアニン耐性細胞
株、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルト
ランスフエラーゼ欠損細胞株のような、選別の
際のマーカーとなり得る特性を有するものが好
ましい。これらの細胞株は、例えばアメリカン
タイプカルチヤーコレクシヨン（ATCC）ある
いは大日本製薬(株)より入手可能である。融合に
際しては、これらの骨髄腫細胞のいずれかを増
殖培地中で培養し、融合の前に例えばダルベツ
コ−MEM培地で洗浄後遠心分離により集め
る。 融合は、例えば次のように行なう。抗体産生
細胞（例えば脾臓細胞）と骨髄腫細胞を細胞数
比で２〜10：１になるように混合し、37℃に保
ちつつポリエチレングリコール等の融合促進剤
を徐々に加えて細胞融合を起させる。培養液を
加え融合促進剤を希釈して融合を停止させ、遠
心分離により細胞を分離する。次に、例えば細
胞をヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジ
ンを増殖培地に加えたHAT培地中に懸濁さ
せ、96ウエルマイクロテストプレートに
200μ1／ウエルずつ分注し、37℃、CO25％、湿
度95％のCO2インキユベータ中（以下、CO2イ
ンキユベータ中の培養条件は全て下記と同一と
する）で培養する。培養液は２日間隔で半量ず
つ新しいHAT培地と交換する。約１週間培養
後、交換する培地を増殖培地にヒポキサンチン
及びチミジンを添加したHT培地に変える。 ３ ハイブリドーマのスクリーニング及びクロー
ニング 次に、HT培地中で数日間培養し、ハイブリ
ドーマのコロニーがマイクロテストプレートの
ウエルの半分程度まで広がつてきた時点でどの
ウエルのハイブリドーマが子宮頸がん細胞に対
するモノクローナル抗体を産生しているかをス
クリーニングする。スクリーニングは、例えば
次のように行なう。ハイブリドーマが増殖して
来ているウエルの培養上清を一部とり、それが
培養子宮頸がん細胞と反応するかどうかを例え
ば酵素抗体法あるいは蛍光抗体法等の公知の標
識抗体法で調べる。 次に、例えば限界希釈法や軟寒天法等の公知
の技術を用いて、子宮頸がん細胞と反応するモ
ノクローナル抗体を産生しているハイブリドー
マをクローニングして単一のモノクローナル抗
体を産生するハイブリドーマの集団を選択す
る。クローニング及びスクリーニングは２回以
上繰り返すことが望ましい。 ４ モノクローナル抗体の製造 上記のようにして得られたハイブリドーマを
インビトロ（培養器具内または栄養培地中）及
びインビボ（生体内または動物組織中）で培養
することによりモノクローナル抗体を産生させ
る。培養は、例えば次のように行なう。インビ
トロでの培養では、増殖培地の様な適当な培地
を用い、例えばCO2インキユベータ中でハイブ
リドーマを培養する。ハイブリドーマが増殖限
度まで増殖した時点で培養液を採取し、遠心分
離のような固液分離手段でハイブリドーマと培
養上清を分離する。培養上清中のモノクローナ
ル抗体は目的によつては精製せずに用いること
も可能であるが、分離する場合には例えば硫酸
アンモニウムで塩析し、0.02Mりん酸緩衝液
（PH7.2）で透析後、ジエチルアミノエチルセル
ロースカラム等に通して精製する。 培養上清から分離したハイブリドーマは、例
えばジメチルスルホキシド（５〜10％ｖ／ｖ）
及び牛胎児血清（10〜20％ｖ／ｖ）を添加した
ダルベツコ−MEMの様な適当な培地中に１〜
10×106個／mlの細胞密度で懸濁させ、適当な
アンプルに入れて徐々に−80℃以下に凍結させ
ることにより、生きたままの状態で長期保存す
ることが可能である。特に、例えば液体窒素等
の超低温下ではハイブリドーマを半永久的に保
存することができる。 ハイブリドーマをインビボで培養する場合に
は、任意の動物にハイブリドーマを移植する
が、細胞融合に用いた脾臓細胞を採取した動物
と同種のものを使用するのが好ましい。例えば
BALB／ｃマウスの場合には、ハイブリドー
マの移植の１〜３週間前に２，６，10，14−テ
トラメチルペンタデカン0.5mlを腹腔内に注射
しておき、マウス１匹あたり２〜10×106個の
ハイブリドーマを腹腔内に注射する。１〜２週
間後にマウスの腹腔内にモノクローナル抗体を
高濃度に含んだ腹水が貯留し腹部が肥大してく
るので、腹水を採取し培養上清の場合と同様に
精製する。 ５ モノクローナル抗体の特性 上記のようにして得られたモノクローナル抗
体の特性の検討は、例えば以下のようにして行
なう。まず、モノクローナル抗体が培養子宮頸
がん細胞のどの部位と反応するかを調べるため
に、公知の標識抗体法、例えば蛍光抗体法また
は酵素抗体法を行う。 次にモノクローナル抗体の特異性の検討を、
培養ひと正常細胞および培養ひとがん細胞との
反応性並びに既存のがん関連抗原との反応性を
公知の標識免疫測定法（例えば酵素免疫測定
法）によつて行う。 また、モノクローナル抗体のイムノグロブリ
ンクラスおよびサブクラスの決定は、抗イムノ
グロブリンクラス・サブクラス抗体を用いた標
識（例えば酵素）免疫測定法によつて行うこと
が出来る。 この発明のモノクローナル抗体は、イムノグ
ロブリンサブクラスG2aまたはG2bに属するも
のであり、ひと子宮頸がん細胞の抗原決定基に
対して反応するがひと子宮頸部の正常組織とは
反応しない。 （用途） この発明のモノクローナル抗体は、例えば細胞
診におけるひと子宮頸がん細胞の検出方法に用い
られる。この検出方法は、検査すべき組織の試料
を、標識を付したこの発明のモノクローナル抗体
と接触させた後、標識検知手段によつて細胞に付
着した標識を検索するか、または標識を付してい
ないこの発明のモノクローナル抗体と接触させた
後標識を付した第２抗体（この発明のモノクロー
ナル抗体と結合し得る抗体）と接触させ、標識検
知手段によつて細胞に付着した標識を検索するこ
とによつて行なわれる。標識としては、放射能、
酵素、蛍光化合物（例えばフルオレスセインイソ
チオシアネート、テトラメチローダミンイソチオ
シアネート）等が用いられる。第２抗体の製造、
および抗体に対する標識の付着は常法によつて行
なわれる。上記の検出方法には、(a)標識を付しま
たは付していないこの発明の抗体、(b)必要に応じ
て、標識を付した第２抗体、および(c)必要な他の
試薬および器具（例えば組織採取器具、緩衝液、
チヤンバースライド等）を含む、診断用キツトを
作成・使用するのが便利である。この発明のモノ
クローナル抗体はひと子宮頸がん細胞と特異的に
反応するため、子宮頸がんの診断の迅速化および
客観化に大きく寄与するものである。 ［実施例］ 以下、この発明を実施例によりさらに詳細に説
明する。 実施例 １ヒト子宮頸がんに対するモノクローナ
ル抗体の製造 (1) 免疫 ヒト子宮頸がん由来細胞であるHeLa細胞
（大日本製薬(株)から購入）を増殖培地中、
CO2インキユベータ内で培養した。細胞が単
層を形成した段階で培養液を捨て、培養容器
底面に付着している細胞にPBSをピペツト
で吹きつけることにより細胞を剥がしとり、
遠心分離（400×ｇ、５分間）して細胞を集
めた。 このHeLa細胞をPBSに懸濁し、、フロイ
ントコンプリートアジユバントと１：１の割
合で充分混合し、２匹のBALB／ｃマウス
（６週令、雌、日本チヤールズリバー社）に
１匹あたり１×107個（0.4ml）の割で腹腔内
に注射した。２週間後、上記と同様にして集
めたHeLa細胞をPBSに懸濁させ、１匹あた
り１×107個（0.4ml）の割で尾静脈内に投与
した。 (2) 細胞融合 ２回目の免疫の３日後に、免疫された２匹
のマウスから脾臓を無菌的に摘出し、ダルベ
ツコ−MEM培地中に細切した脾臓細胞を浮
遊させ、250×ｇで５分間、室温で遠心分離
して細胞を集めた。ダルベツコ−MEM培地
で２回細胞を洗浄した後、融合まで室温に放
置した。マウスの骨髄腫細胞NS−１（大日本
製薬(株)から購入）は増殖培地中、CO2インキ
ユベータ内で培養しておいた。細胞融合の直
前にNS−１細胞を遠心管に移し、200×ｇで
５分間、室温で遠心分離して細胞を集めた。
細胞をさらに２回ダルベツコ−MEM培地で
洗浄し、融合まで室温に放置した。 脾臓細胞1.5×108個とNS−１細胞３×107
個を遠心管に移して混合し、400×ｇで５分
間、室温で遠心した。上清を除去し、細胞を
しつかりしたペレツトにした。遠心管を37℃
に保ちつつ、これにダルベツコ−MEM中37
℃に温めた50％ポリエチレングリコール
（PEG4000、メルク）１mlを１分間かけて
徐々に加え、細胞と混合した。さらに１分
間、ピペツトの先で細胞ペレツトをかき混ぜ
続けた。次に37℃に温めた10mlのダルベツコ
−MEM培地を５分間かけて混ぜながら加
え、室温、400×ｇで５分間遠心し、上清を
除去した。牛胎児血清（10％ｖ／ｖ）、ペニ
シリン（100U／ml）、ストレプトマイシン
（100μｇ／ml）、ヒポキサンチン（１×
10-4M）、アミノプテリン（４×10-7M）、チ
ミジン（1.6×10-5M）を含むダルベツコ−
MEM培地（以下、HAT培地と呼ぶ）を60
ml加えて細胞浮遊液を作り、96ウエルマイク
ロテストプレート（フアルコン3072）３枚に
200μ1／ウエルずつ分注し、CO2インキユベ
ータ内で培養した。 培養液は２日間隔で半量ずつ新しいHAT
培地と交換した。培養開始後７日目に、ハイ
ブリドーマのコロニーが肉眼で観察出来るよ
うになつたが、培地をHAT培地からアミノ
プテリンだけを含まないHT培地に変え培養
を続けた。 (3) ハイブリドーマのスクリーニング及びクロ
ーニング 培養開始後11日目に、ハイブリドーマのコ
ロニーが96ウエルマイクロテストプレートの
ほとんどのウエルでウエルの底面積の半分程
度まで増殖して来たので、子宮頸がん細胞に
対する抗体を産生しているかどうかをスクリ
ーニングした。 96ウエルマイクロテストプレートにHeLa
細胞を単層を形成するまで培養しておき、培
養上清を除去後PBS中１％ｗ／ｖ牛血清ア
ルブミン溶液（以下、１％BSAと呼ぶ）で
ウエルを満たし、室温で１時間放置した。
0.05％ｖ／ｖツイーン20添加りん酸緩衝液
（以下、ツイーン−PBSと呼ぶ）でウエルを
３回洗浄後、ハイブリドーマ培養上清を
50μ1／ウエルずつ分注し、室温で２時間放
置した。ツイーン−PBSでウエルを４回洗
浄後、ペルオキシダーゼ標識抗マウスIgG＋
IgMうさぎ抗体（ザイメツドボラトリーズ）
の1000分の１希釈液を100μ1／ウエルずつ分
注し、室温で２時間放置した。ツイーン−
PBSでウエルを４回洗浄後、100μｇ／mlの
２，2′−アジノビス（３−エチルベンゾチア
ゾリン−６−スルホン酸）（以下、ABTSと
呼ぶ）と0.03％過酸化水素を含む0.1Mクエ
ン酸緩衝液（PH4.2）を100μ1／ウエルずつ加
え室温で30分間反応させた。２ｍＭのアジ化
ナトリウム溶液を100μ1／ウエルずつ分注し
て反応を停止させ、ウエルの青緑色の発生を
観察し、発色したウエル中に子宮頸がんに対
する抗体が存在すると判定した。 同様の操作を、正常人血清をPBSで10分
の１に希釈した溶液を100μ1／ウエル加え、
４℃で１晩放置してコーテイングした96ウエ
ルマイクロプレートについても行つた。 HeLa細胞と反応するモノクローナル抗体
を産生するハイブリドーマを含むウエルは、
288ウエル中７ウエルであり、正常人血清と
反応するものは288ウエル中０ウエルであつ
た。 次にこの７ウエル中のハイブリドーマを限
界希釈法でクローニングした。マウス
（BALB／ｃ、３週令）の胸腺を無菌的に摘
出し、ハサミで細切して胸腺細胞を増殖培地
に懸濁し、５×106個／mlの細胞浮遊液を作
り、そこにハイブリドーマを５個／mlになる
ように希釈した液を200μ1／ウエルずつ96ウ
エルマイクロテストプレートに分注し、CO2
インキユベータ内で培養した。培養開始後12
日目に、ハイブリドーマのコロニーが１ウエ
ルに１個だけ存在するウエルの培養上清につ
いて、上記の抗子宮頸がん細胞モノクローナ
ル抗体産生ハイブリドーマのスクリーニング
を行つた。このクローニングおよびスクリー
ニングの操作を２回くり返し、２種類のハイ
ブリドーマ、1C2、2G12を樹立した。 (4) モノクローナル抗体の製造 樹立したハイブリドーマをそれぞれ増殖培
地中に初期細胞密度３×104個／mlで浮遊さ
せ、CO2インキユベータ内で培養し、４日後
培養液を遠心分離（400×ｇ、10分間）し、
モノクローナル抗体を含む培養上清を採取し
た。 インビボでのハイブリドーマの培養では、
ハイブリドーマを移植する２週間前に
BALB／ｃマウス（８週令）の腹腔内に１
匹あたり0.5mlの２，６，10，14−テトラメ
チルペンタデカンを注射しておいた。これら
のマウスに２種類のハイブリドーマを１×
107個／mlの細胞密度でダルベツコ−MEM
培地に懸濁させた細胞浮遊液を１匹あたり
0.5mlずつ腹腔内に注射した。15日後マウス
の腹腔内に貯留した腹水（５〜８ml）を注射
器で吸引採取し、遠心分離（400×ｇ、10分
間）後、モノクローナル抗体を含む腹水上清
を採取した。 このようにして２種類のハイブリドーマ、
1C2、2G12を培養し、それぞれのハイブリド
ーマが産生したモノクローナル抗体を次のよ
うにして分離した。 モノクローナル抗体を含む培養上清もしく
は腹水上清に４℃で等量の飽和硫酸アンモニ
ウムを徐々に加え塩析し、0.02Mりん酸緩衝
液（PH7.2）で24時間透析した。この透析画
分を0.02Mりん酸緩衝液（PH7.8）で平衡化
したジエチルアミノエチルセルロースカラム
（ワツトマン）に通し、溶離液を限外濾過し
た後、280nｍにおける吸光度測定による蛋
白濃度が約10mg／mlになるまで減圧濃縮し、
モノクローナル抗体を含む濃縮液約３mlを得
た。 得られたモノクローナル抗体をそれぞれＭ
−１、Ｍ−２と名付けた。これらは何れも、
電気泳動法による分子量が約15万であつた。 実施例 ２ モノクローナル抗体の特性 (1) 蛍光抗体法 HeLa細胞を、ラブテツクテイツシユカルチ
ヤーチヤンバー／スライド（4804、マイルスラ
ボラトリーズ）内で、増殖培地中、初期細胞密
度１×104個／mlで３日間培養後、培養上清を
除去し、１％BSAで満たした。室温で１時間
放置後、ツイーン−PBSで３回洗浄し、モノ
クローナル抗体を含む培養上清を200μ1ずつ加
え、室温で２時間反応させた。次に上清を除去
し、ツイーン−PBSで４回洗浄後FITC標識抗
マウスIgG＋IgMやぎ抗体溶液（PBSで10分の
１希釈、ケーピーエル）を100μ1ずつ加え、37
℃で30分間反応させた。上清を除去し、PBS
で４回洗浄後、蛍光顕微鏡（ニコン・ダイアフ
オトTMD−EF）で検鏡した。 ２種類のモノクローナル抗体のうちＭ−１で
はHeLa細胞の細胞表面に強い蛍光が観察さ
れ、Ｍ−２ではHeLa細胞の細胞間質に強い蛍
光が観察された。こうして、それぞれのモノク
ローナル抗体の認識する抗原決定基の細胞上の
位置が確認された。 (2) モノクローナル抗体のクラス・サブクラスの
決定 HeLa細胞を、96ウエルマイクロテストプレ
ート中で培養し、単層を形成した時点で培養上
清を除去し、１％BSAを加えて室温で１時間
放置した。次に上清を除去し、ツイーン−
PBSで４回洗浄後、モノクローナル抗体を含
む培養上清を100μ1／ウエルずつ分注し、室温
で２時間放置した。ツイーン−PBSで４回洗
浄後、MonoAb−ID EIA KIT（ザイメツドラ
ボラトリーズ）を用いて２種類のモノクローナ
ル抗体のクラス・サブクラスを決定した（第１
表）。
【表】
(3) 既知がん関連抗原に対する抗体との交差性
この発明のモノクローナル抗体が既知のがん
関連抗原と反応するかどうかを、既知がん関連
抗原に対する抗体によるモノクローナル抗体結
合抑制を指標として調べた。既知がん関連抗原
としてCEA、フエリチン、AFP、β2−ミクロ
グロブリンについて検討した。 HeLa細胞を、96ウエルマイクロテストプレ
ートに単層を形成するまで培養し、培養上清を
除去後１％BSAをウエルに満たし、室温で１
時間放置した。ツイーン−PBSで３回洗浄後、
抗CEAうさぎ抗体（ダコー）、抗フエリチンう
さぎ抗体（ダコー）、抗AFPうさぎ抗体（ヘキ
スト）、抗β2−ミクログロブリンうさぎ抗体
（生化学工業）をそれぞれ牛血清アルブミン
（0.1％ｗ／ｖ）、ツイーン20（0.05％ｖ／ｖ）を
含む10ｍＭトリス塩酸緩衝液で50分の１に希釈
し、100μ1／ウエルずつ分注し、室温で３時間
放置した。ツイーン−PBSで４回洗浄後、モ
ノクローナル抗体を含む培養上清を100μ1／ウ
エルずつ分注し、室温で２時間放置した。ツイ
ーン−PBSでウエルを４回洗浄後、ペルオキ
シダーゼ標識抗マウスIgG＋IgMうさぎ抗体
（ザイメツトラボラトリーズ）の1000分の１希
釈液を100μ1／ウエルずつ分注し、室温で２時
間放置した。ツイーン−PBSでウエルを４回
洗浄後、100μｇ／mlのABTSと0.03％過酸化水
素を含む0.1Mくえん酸緩衝液（PH4.2）を
100μ1／ウエルずつ加え、室温で30分間反応さ
せた。２ｍＭのアジ化ナトリウム溶液を
100μ1／ウエルずつ分注して反応を停止させ、
414nｍにおける吸光度を測定した（タイター
テツクマルチスキヤン、フロウラボラトリー
ズ）。 その結果、既知がん関連抗原に対する抗体を
大過剰に反応させているにもかかわらず、モノ
クローナル抗体と抗原であるHeLa細胞との結
合がほとんど抑制されないことから、この発明
のモノクローナル抗体はこれらの既知抗原とは
反応しないと考えられる（第２表）。
関連抗原と反応するかどうかを、既知がん関連
抗原に対する抗体によるモノクローナル抗体結
合抑制を指標として調べた。既知がん関連抗原
としてCEA、フエリチン、AFP、β2−ミクロ
グロブリンについて検討した。 HeLa細胞を、96ウエルマイクロテストプレ
ートに単層を形成するまで培養し、培養上清を
除去後１％BSAをウエルに満たし、室温で１
時間放置した。ツイーン−PBSで３回洗浄後、
抗CEAうさぎ抗体（ダコー）、抗フエリチンう
さぎ抗体（ダコー）、抗AFPうさぎ抗体（ヘキ
スト）、抗β2−ミクログロブリンうさぎ抗体
（生化学工業）をそれぞれ牛血清アルブミン
（0.1％ｗ／ｖ）、ツイーン20（0.05％ｖ／ｖ）を
含む10ｍＭトリス塩酸緩衝液で50分の１に希釈
し、100μ1／ウエルずつ分注し、室温で３時間
放置した。ツイーン−PBSで４回洗浄後、モ
ノクローナル抗体を含む培養上清を100μ1／ウ
エルずつ分注し、室温で２時間放置した。ツイ
ーン−PBSでウエルを４回洗浄後、ペルオキ
シダーゼ標識抗マウスIgG＋IgMうさぎ抗体
（ザイメツトラボラトリーズ）の1000分の１希
釈液を100μ1／ウエルずつ分注し、室温で２時
間放置した。ツイーン−PBSでウエルを４回
洗浄後、100μｇ／mlのABTSと0.03％過酸化水
素を含む0.1Mくえん酸緩衝液（PH4.2）を
100μ1／ウエルずつ加え、室温で30分間反応さ
せた。２ｍＭのアジ化ナトリウム溶液を
100μ1／ウエルずつ分注して反応を停止させ、
414nｍにおける吸光度を測定した（タイター
テツクマルチスキヤン、フロウラボラトリー
ズ）。 その結果、既知がん関連抗原に対する抗体を
大過剰に反応させているにもかかわらず、モノ
クローナル抗体と抗原であるHeLa細胞との結
合がほとんど抑制されないことから、この発明
のモノクローナル抗体はこれらの既知抗原とは
反応しないと考えられる（第２表）。
【表】
〔表中の数値は、（がん関連抗原に対する抗体を
加えたときの吸光度／がん関連抗原に対する抗体を加え
ないときの吸光度を示す。］ (4) 培養ひと正常細胞および培養ひとがん細胞と
の反応性 培養ひと正常細胞としてFlow4000（胎児賢）
培養ひとがん細胞としてC32（メラニン欠乏性
黒色腫）、G402（賢平滑筋芽腫）、MIA PaCa−
２（膵臓がん）、PA−１（卵巣奇形腫）、HT−
1197（膀胱がん）、COLO−201（結腸腺がん）
ZR−75−１（乳がん）、IMR−32（神経芽細胞
腫）MOLT−３（急性リンパ芽球白血病）〔い
ずれも大日本製薬(株)から購入〕を、96ウエルマ
イクロテストプレート上で単層を形成するまで
培養した。培養上清を除去後１％BSAをウエ
ルに満たし、室温で１時間放置した。ツイーン
−PBSで３回洗浄後、モノクローナル抗体を
含む培養上清を100μ1／ウエルずつ分注し、室
温で２時間放置した。ツイーン−PBSでウエ
ルを４回洗浄後、ペルオキシダーゼ標識抗マウ
スIgG＋IgMうさぎ抗体（ザイメツトラボラト
リーズ）の1000分の１希釈液を100μ1／ウエル
ずつ分注し、室温で２時間放置した。ツイーン
−PBSで４回洗浄後、100μｇ／mlのABTSと
0.03％過酸化水素を含む0.1Mくえん酸緩衝液
（PH4.2）を100μ1／ウエルずつ加え室温で30分
間反応させた。２ｍＭのアジ化ナトリウム溶液
を100μ1／ウエルずつ分注して反応を停止さ
せ、414nｍにおける吸光度を測定した（タイ
ターテツクマルチスキヤン、フロウラボラトリ
ーズ）。 モノクローナル抗体をHeLa細胞と反応させ
たときの吸光度と他の培養細胞と反応させたと
きの吸光度を比較すると、Ｍ−１とHT−1197
が強く、MIA PaCa−２及びＣ−32が弱く反
応した以外は、ほとんど反応しないことが認め
られた。この結果から、これらのモノクローナ
ル抗体が子宮頸がん細胞とかなり特異的に反応
することが確認された（第３表）。
加えたときの吸光度／がん関連抗原に対する抗体を加え
ないときの吸光度を示す。］ (4) 培養ひと正常細胞および培養ひとがん細胞と
の反応性 培養ひと正常細胞としてFlow4000（胎児賢）
培養ひとがん細胞としてC32（メラニン欠乏性
黒色腫）、G402（賢平滑筋芽腫）、MIA PaCa−
２（膵臓がん）、PA−１（卵巣奇形腫）、HT−
1197（膀胱がん）、COLO−201（結腸腺がん）
ZR−75−１（乳がん）、IMR−32（神経芽細胞
腫）MOLT−３（急性リンパ芽球白血病）〔い
ずれも大日本製薬(株)から購入〕を、96ウエルマ
イクロテストプレート上で単層を形成するまで
培養した。培養上清を除去後１％BSAをウエ
ルに満たし、室温で１時間放置した。ツイーン
−PBSで３回洗浄後、モノクローナル抗体を
含む培養上清を100μ1／ウエルずつ分注し、室
温で２時間放置した。ツイーン−PBSでウエ
ルを４回洗浄後、ペルオキシダーゼ標識抗マウ
スIgG＋IgMうさぎ抗体（ザイメツトラボラト
リーズ）の1000分の１希釈液を100μ1／ウエル
ずつ分注し、室温で２時間放置した。ツイーン
−PBSで４回洗浄後、100μｇ／mlのABTSと
0.03％過酸化水素を含む0.1Mくえん酸緩衝液
（PH4.2）を100μ1／ウエルずつ加え室温で30分
間反応させた。２ｍＭのアジ化ナトリウム溶液
を100μ1／ウエルずつ分注して反応を停止さ
せ、414nｍにおける吸光度を測定した（タイ
ターテツクマルチスキヤン、フロウラボラトリ
ーズ）。 モノクローナル抗体をHeLa細胞と反応させ
たときの吸光度と他の培養細胞と反応させたと
きの吸光度を比較すると、Ｍ−１とHT−1197
が強く、MIA PaCa−２及びＣ−32が弱く反
応した以外は、ほとんど反応しないことが認め
られた。この結果から、これらのモノクローナ
ル抗体が子宮頸がん細胞とかなり特異的に反応
することが確認された（第３表）。
試験例 １
子宮頸がんの細胞診
綿棒あるいは木製またはプラスチツク製のへら
を用いて子宮膣部を擦過し、さらに子宮頸管内に
回転しながら擦過し、スライドグラスに細胞を均
一に塗抹した。95％エタノール液中で20分間固定
した。PBSで３回洗浄後、0.3％過酸化水素を含
むPBS中に30分間放置し、内因性ペルオキシダ
ーゼ活性を阻止した。PBSで３回洗浄後、２％
馬血清中に30分間放置した。モノクローナル抗体
を含む培養上清１mlをスライドグラスの細胞塗抹
上に滴下し、室温で１時間反応させた。PBSで
３回洗浄後、ペルオキシダーゼ標識抗マウスIgG
うさぎ抗体（ザイメツトラボラトリーズ）の1000
分の１希釈液１mlを細胞塗抹上に滴下し、室温で
30分間反応させた。PBSで３回洗浄後、250μ
ｇ／mlの３，3′−ジアミノベンジジン・４塩酸塩
と0.03％過酸化水素を含むPBS中に室温下７分間
放置した。PBSで３回洗浄後、ヘマトキシリン
により室温で５分間核染色した。流水中で10分間
水洗後、95％エタノール液中で10分間放置し、キ
シロール中で15分間放置した。余分なキシロール
をふきとり、乾燥しないうちに封入し、顕微鏡観
察した。 ２種のモノクローナル抗体とも正常例とは全く
反応せず、子宮頸がん症例とは全例反応が陽性と
なつた（第４表）。
を用いて子宮膣部を擦過し、さらに子宮頸管内に
回転しながら擦過し、スライドグラスに細胞を均
一に塗抹した。95％エタノール液中で20分間固定
した。PBSで３回洗浄後、0.3％過酸化水素を含
むPBS中に30分間放置し、内因性ペルオキシダ
ーゼ活性を阻止した。PBSで３回洗浄後、２％
馬血清中に30分間放置した。モノクローナル抗体
を含む培養上清１mlをスライドグラスの細胞塗抹
上に滴下し、室温で１時間反応させた。PBSで
３回洗浄後、ペルオキシダーゼ標識抗マウスIgG
うさぎ抗体（ザイメツトラボラトリーズ）の1000
分の１希釈液１mlを細胞塗抹上に滴下し、室温で
30分間反応させた。PBSで３回洗浄後、250μ
ｇ／mlの３，3′−ジアミノベンジジン・４塩酸塩
と0.03％過酸化水素を含むPBS中に室温下７分間
放置した。PBSで３回洗浄後、ヘマトキシリン
により室温で５分間核染色した。流水中で10分間
水洗後、95％エタノール液中で10分間放置し、キ
シロール中で15分間放置した。余分なキシロール
をふきとり、乾燥しないうちに封入し、顕微鏡観
察した。 ２種のモノクローナル抗体とも正常例とは全く
反応せず、子宮頸がん症例とは全例反応が陽性と
なつた（第４表）。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ ひと子宮頸がん細胞の抗原決定基に対して反
応するが、ひと子宮頸部の正常組織とは反応せ
ず、イムノグロブリンサブクラスG2aまたはG2b
に属するものであるモノクローナル抗体。 ２ ひと子宮頸がん細胞で免疫した哺乳類（ひと
を除く）の抗体産生細胞と骨髄腫細胞との融合に
よるハイブリドーマが産生するものである、特許
請求の範囲第１項記載の抗体。 ３ 蛋白分解酵素を用いないで培養器から分離し
たひと子宮頸がん細胞により免疫した哺乳類（ひ
とを除く）の抗体産生細胞と骨髄腫細胞との融合
によるハイブリドーマを培養し、培養物からひと
子宮頸がん細胞の抗原決定基に対して反応する
が、ひと子宮頸部の正常組織とは反応せず、イム
ノグロブリンサブクラスG2aまたはG2bに属する
ものであるモノクローナル抗体を分離採取するこ
とを特徴とする、上記抗体の製法。 ４ 培養を栄養培地中で行なう、特許請求の範囲
第３項記載の製法。 ５ 培養を動物組織中で行なう、特許請求の範囲
第３項記載の製法。 ６ 検査すべき組織の試料を、ひと子宮頸がん細
胞の抗原決定基に対して反応するがひと子宮頸部
の正常組織とは反応せず、イムノグロブリンサブ
グラスG2aまたはG2bに属するものであるモノク
ローナル抗体であつて標識を付したものまたは付
しないものと接触させ、後者の場合にはさらに標
識を付した第２抗体と接触させ、標識を検索する
ことを特徴とする、ひと子宮頸がん細胞の検出方
法。 ７ 標識が蛍光化合物、酵素または放射性同位元
素である特許請求の範囲第６項記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62008785A JPS63177798A (ja) | 1987-01-16 | 1987-01-16 | 抗ひと子宮頚がん抗体、その製法および用途 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62008785A JPS63177798A (ja) | 1987-01-16 | 1987-01-16 | 抗ひと子宮頚がん抗体、その製法および用途 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63177798A JPS63177798A (ja) | 1988-07-21 |
| JPH0369280B2 true JPH0369280B2 (ja) | 1991-10-31 |
Family
ID=11702523
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62008785A Granted JPS63177798A (ja) | 1987-01-16 | 1987-01-16 | 抗ひと子宮頚がん抗体、その製法および用途 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS63177798A (ja) |
-
1987
- 1987-01-16 JP JP62008785A patent/JPS63177798A/ja active Granted
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| PAT.CLIN.OST.GIN=1986 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS63177798A (ja) | 1988-07-21 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0119556B1 (en) | Monoclonal antibodies to human colon cancers and method | |
| KR900003923B1 (ko) | 인체 암종양과 관련된 항원에 대한 단일클론성 항체 | |
| Lipinski et al. | Human trophoblast cell-surface antigens defined by monoclonal antibodies. | |
| US4713352A (en) | Monoclonal antibody panel for early diagnosis and therapy of renal carcinoma | |
| JPH09191878A (ja) | ヒト非−小細胞肺癌に関するモノクローナル抗体および抗原 | |
| US4737579A (en) | Monoclonal antibodies for human non-small cell lung carinomas | |
| AU612967B2 (en) | Monoclonal antibodies and antigen for human non-small cell lung carcinoma and certain other human carcinomas | |
| US4643971A (en) | Monoclonal antibodies to human bladder and ureter cancers and method | |
| EP0199141A2 (en) | Monoclonal antibodies to human gastrointestinal cancer | |
| JPS619285A (ja) | 細胞表面及び細胞内抗原に対するヒトモノクローナル抗体 | |
| EP0287030A2 (en) | Immunological methods and materials for detection of tumor associated antigens | |
| WO1983004104A1 (en) | In vitro diagnostic methods using monoclonal antibodies against connective tissue proteins | |
| JP2555028B2 (ja) | ヒト非−小細胞肺癌に関するモノクロ−ナル抗体 | |
| EP0184369B1 (en) | Monoclonal antibody specific for a mammary tumor cell surface antigen | |
| JPH0734741B2 (ja) | ヒト腎臓がん抗原に対するモノクローナル抗体生産ハイブリドーマ細胞系 | |
| US4628032A (en) | Monoclonal antibody specific for a mammary tumor cytoplasmic antigen | |
| JPS59205327A (ja) | ヒト膀胱及び尿管がんに対するモノクロ−ナル抗体及び方法 | |
| EP0157613A2 (en) | Monoclonal antibodies specific for human basal cell and malignant squamous cell protein, hybridomas therefor, malignancy test methods and diagnostic kits | |
| JPH04193900A (ja) | 網膜芽腫遺伝子産物の抗体とその利用 | |
| JPH0369280B2 (ja) | ||
| JPH03112486A (ja) | Ｈｌａ―ｂ３５遺伝子およびｄｎａプローブ並びに形質転換細胞 | |
| JP6793514B2 (ja) | 新規甲状腺癌関連抗原に結合する抗体および甲状腺癌診断剤 | |
| JP2002371099A (ja) | 抗原およびこの抗原を識別するモノクローナル抗体 | |
| JPH03277295A (ja) | 人体液中に存在する分子量７万〜３０万のコリンエステラーゼに反応するモノクローナル抗体 | |
| JPS6287100A (ja) | モノクロ−ナル抗体及び該モノクロ−ナル抗体を用いたヒト子宮頚癌用診断試薬 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |