JPH0734741B2 - ヒト腎臓がん抗原に対するモノクローナル抗体生産ハイブリドーマ細胞系 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 以下の記載は本件出願についてのATCC寄託情報である。

本発明は、モノクローナル抗体の産生及びそれ等の、ヒ
ト腎臓がん抗原の認識又は特徴検出への使用に関する。

本発明は、腎臓がん診断についてはもとより腎臓がんの
性質に係る研究にあつて有用な診断手段（トウール）を
提供するものである。即ち、当該高度に特異性の抗体に
は、インデキシング方法に要求されるところの通常の手
法で、赤血細胞、免疫蛍光性、放射性又は酵素標識物質
をそれぞれ結合することができる。又、当該高度に特異
性の抗体には、細胞毒性物質も結合し、当該高度に特異
性の抗体の結合している細胞を選択的に破壊する所謂
“マジツクビユーレツト”型の治療剤を生成する。

発明の背景 1975年、ケラー及びマイルステインは、明確にして反復
性の特異性を有する各種抗体のほとんど無制限量の産生
を促す交雑細胞（ハイブリドーマ）を用いてモノクロー
ナル抗体（mAbs）を製造する方法を開発した。動物をが
ん細胞又は他の抗原で免疫して得られる通常の抗血清
は、特異性及び性質の異る無数の異る抗体を含むが、ハ
イブリドーマは均一特性の単一抗体を産生する。ケラー
及びマイルステインの方法は、免疫化動物の脾臓細胞を
不死骨髄細胞系で融合することを行つている。その交雑
細胞（ハイブリドーマ）から、所望の特異性を有する抗
体を産生するクローンを分取する。分取されたクローン
は、それぞれが当該抗体のみを産生する。ハイブリドー
マ細胞は適宜培養できる（又は液体窒素で凍結して保存
もできる）ので、抗体の継続的提供が保証される。

抗体は、抗原として知られている他の分子と結合し又そ
うした分子を認識する機能を有する蛋白である。モノク
ローナル抗体は、それ等が性質について極めて均一であ
り且つ一抗原又は決定因子として知られる抗原部分のみ
を認識するものである点を除いては他の抗体とは異るも
のではない。

細胞の場合、認識される決定因子は、抗体と反応する細
胞についてのか又は就中の抗原である。特定の抗体が特
定種類の細胞を、即ちそれと反応して、認識すること
は、こうした細胞抗原を介して行われる。したがつて、
そうした細胞抗原は、当該細胞が識別されるマーカーた
るものである。

こうした抗原マーカーは、細胞分化の一般的過程を観察
し又所定の細胞系統内の異常性を突きとめるについてて
用いることができる。細胞分化の過程は、細胞表面抗原
表現型に於ける変化を伴い、そして明瞭な分化系列に属
する細胞を識別するか又は同一の分化系列に於けるいく
つかの段階のところで細胞を識別する抗原は、相応の正
確な抗体を使いさえすれば観察できる。分化抗原の最初
の確認は、マウスのＴ−細胞白血病の表面抗原の分析
と、抗原のTL,Thy−１及びLytシリーズの記述を介して
もたらされた（Old,Lloyd J.,Cancer Research,41,361
−375,February 1981）。

これ等のＴ−細胞分化抗原の分析は、マウス及びヒトの
正常Ｔ−細胞及びＢ−細胞が入手可能になつて飛躍的に
簡単になり且つ比較的進歩した〔米国特許第4,361,549
−550;4,364,932−37及び4,363,799号（ヒトＴ−細胞抗
原に対するmAbに対する）参照〕。他の系列に属する正
常にして新形成の細胞上に露呈する分化抗原については
ほとんど知られていない。

このことは、適当な通常細胞タイプの手頃な試料を入手
するのが困難であることと同時にモノクローナル抗体に
係る技術が定常的なものでないことに起因している。交
雑細胞系の調製は、接種物の性質、細胞増殖条件、交雑
条件等の実験的要素によりできたりできなかつたりす
る。したがつて、ある種の細胞についてハイブリドーマ
調製の可能性を予測することは、その細胞が他の細胞と
の間で可能であつたとしても必ずしもできない。

メラニン細胞についての表面抗原を同定することが、最
近開発された正常皮膚のメラニン細胞を培養する技術に
より可能になつた〔Eisinger et al.,Proc.Natl.Acad,S
ci,USA,79 2018（March 1982）〕。この方法は、メラニ
ン細胞分化抗原の分析のための増殖細胞に新たなものを
提供するものである。

本発明者等は最近、マウスのモノクローナル抗体（Ab
s）により同定されたヒト治療抵抗性メラノーマ（黒色
腫）の細胞表面抗原の独自の分析手法を見い出し発表し
た〔Dippold et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77,6114
−6118（1980）〕。そして、本発明は、ヒト腎臓がんの
比較分析方法に関するものである。前記のところについ
ては、ヒト腎臓がん細胞表面抗原に対するモノクローナ
ル抗体とした名称で出願した米国特許出願（co−pendin
g）Serial No.297,814に見られる。

17種のモノクローナル抗体を、腎臓がんの識別された９
種の細胞表面抗原系〔Ueda,Ryuzo et al.,Proc.Natl.Ac
ad.Sci.USA,78,3112,（August 1981）〕の株化培養細胞
で免疫したマウスの脾臓細胞の融合細胞から摘出した。
前記系における６種即ちgp160、S25、gp120r、gp120n
r、gp115及びV₁は今迄に発見されていない新規な抗原で
あるが、他の３種はHLA−Ａ、−Ｂ及び−CH鎖及びＡ及
びＢ血液グループ抗原に関係するものである。新たな抗
原の中最も限定的なものはgp160、S25及びgp120rであ
る。これ等の決定因子は、腎臓起源のものであつて正常
にして治療抵抗性である細胞についてのみ見い出され、
ヒト腎臓の分化抗原に代表される。これ等抗原が分子量
の違いから２つに分けられるのに加えて、gp160、S25及
びgp120rは、培養した腎臓がん細胞、正常の腎臓上皮及
び胎児腎臓細胞のパネル上の相違表徴に基いて識別する
ことができる。gp120rを有するグリコプロテインは、腎
臓gp120nrと決定因子を共通する（gp120rとgp120nrを検
出するモノクローナル抗体での続発沈降により示され
る）が、gp120nrは線維芽細胞及び卵巣、膀胱及び結腸
がんの細胞系を含む広範の細胞型に見られる。他の２つ
の新規系即ちgp115及びV₁は、広範に生ずる分化抗原の
特性を有するものであるが、分子量、熱安定性（V₁は熱
−安定決定因子である）、及び各種起源の相違表徴に於
ける相違により相互に又gp120nrからも識別できる。

したがつて、これ等の系は、腎臓がんの性質を特徴づけ
且つ研究するのに使用できる。このようにすると、異つ
た腎臓がん細胞系及び正常腎臓の培養株のS25とgp160の
表現型の比較によりこれ等２つの系を明確に識別でき
る。

Ueda等による腎臓細胞についての研究（メラノーマに関
しての米国出願（co−pending）Serial No.297,814）
〔Dippold et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77,6614−6
118（1980）〕は、ヒト細胞表面抗原の12の新しい系を
認識するマウスAbsのシリーズを産生した。これ等の中
の６種は、グリコプロテイン（gp95、gp150、gp160、gp
120r、gp120nr及びgp115）として認識され、残るものの
中の３種は、ラベル化された細胞抽出物（S25、M19及び
R8）から免疫沈降しない熱−不安定なものであり、最後
の３種は熱−安定の抗原であつて、グリコリピツド
（O₅、R₂₄及びV₁）であると思われるものである。

培養したヒト細胞の標準パネルの使用は、直接的血清試
験及び吸収分析でのこうしたモノクローナル抗体の反応
性比較を容易にするものであつて、該抗原系のそれぞれ
が抗原の定性的及び定量的表徴の双方の意義で、該細胞
パネル上の分布に明瞭なパターンを有する。各種細胞型
についてのそれ等の分布に基き、これ等12種の抗原系は
更に次の３つのグループに分類できる。即ち、（ｉ）限
定された分化の特性を有するもの〔例えば、腎臓−特異
性gp160、S25及びgp120r抗原、及びメラノーーマ及びメ
ラニン形成細胞（melanocytes）のR₂₄抗原〕、（ii）よ
り広範に表現される分化抗原（例えば、gp95、gp150、M
₁₉、gp120nr及びV₁）、そして（iii）通常のヒト細胞型
の試験で表徴される抗原（例えば、O₅種抗原）。

また、１期腎臓がん（腎臓に限られる）から得られる細
胞系はgp160⁺であり、転移腎臓がんから得られる細胞系
はgp160^-であることがわかつた。このことが、転移ポテ
ンシヤルを上げるがん細胞がgp160表徴を失うことを示
すのか、或いはgp160⁺とgp160^-の腎臓がんが別々の細胞
系統からのものであることを示すのか判定できないとこ
ろではあるが、正常腎臓の細胞系はgp160を表徴するこ
とが明らかとなり腎臓がんに見られる他の抗原は、腎臓
がんの細胞起源に関する情報を与えるものである。

本発明により提供されるこうした血清学的試験は、腎臓
−特異性抗原を認識することができ、腎臓の構造及び機
能に関する研究に特に有用である。更に、より広範に反
応する抗原のいくつかは、他の腫瘍の研究−例えばメラ
ノーマから星状細胞腫（astrocytomas）を識別するV₁に
於て有用である。

Absにより認識される抗原についての相当する生化学的
並びに血清学的特性の重要性をgp120r及びgp120nrにつ
いての分析により説明する。このシリーズの５種のAbs
は、SK−RC−７がん細胞のラベル化した抽出物から120,
000−ダルトン成分を免疫沈降させた。これ等Absの１つ
（Abs6）で該抽出物を予備クリアリン（pre−clearin
g）するとAbs23で識別される当該120,000−ダルトン成
分が除かれ、このことは関与する２つのAbsが同一分子
に反応していることを示す。しかしながら、Abs6及びAb
s23により検出される抗原決定因子は、Ｍ−MHA試験及び
吸収分析により識別できる。即ち、Abs23は腎臓−特異
性抗原を検出し、一方Abs6はより広範の細胞型に反応し
た。これ等の結果は、共にAbs6により認識されるエピト
ープ（epitope）を運搬するが、その中の一方のみがAbs
23により認識されるエピトープを運搬する２種のgp120
分子を仮説することにより説明できる。この仮説が正し
い証拠に、Abs23によりクリアリング後の上澄物は、Abs
23で沈降する抗原が残存していないにもかかわらず、依
然Abs6と反応した。Abs23により認識されるエピトープ
は、腎臓起源の細胞についてのみ見られ、そしてこの制
限分布が故にそれがgp120rであるといえる。それ以上広
範に分布するエピトープについては“nr"に指定し、無
制限分布性質を表現するものとした。gp120r及びgp120n
rは、２つの別々の因子の生産物であるか又は、生産物
が腎臓細胞中で変性する単一因子の生産物であるかの何
れかである。同様のことが、各種のモノクローナル抗体
により認識される抗原の細胞分布についてやや的確性を
欠きまた不確定要素があるところではあるが、免疫沈降
するgp95又はgp150分子についても確認されているいく
つかのエピトープに基いて説明されている〔Dippold et
al.,Proc.Natl.Sci・USA 77,6114−6118（1980）〕。

概 要 新規mAb,F23（ATCC HB8231）について記述する。F23
は、腎臓がん細胞及び抗原を検出するに使用する腎臓起
源のモノクローナル抗体のパネルの一部である。このパ
ネルは、重要な診断機能をもたらすものである。ここで
のmAbsは、腎臓腫瘍をサブセツトし且つ正常ネフロン
（nephron）をサブセツトする。そしてこのmAbsは、分
化抗原と思われる正常細胞についての腎臓抗原を認識
し、即ち、腫瘍に存在する腎臓抗原を認識し、したがつ
て正常な腎臓細胞とがん性腎臓細胞とを識別するもので
ある。

F23はまた、腎臓及び膀胱について腫瘍性及び非−腫瘍
性疾病の分析のための免疫吻合探針を提供する腎臓及び
膀胱の双方についてのmAbsのパネルの一部である。

内容説明−技術的手段 組織培養 腎臓細胞系〔Veda et al.,J.Exp.Med.150,564−589（19
79）〕及び腫瘍細胞系〔Carey et al.,Proc−Natl.Aca
d.Sci.USA 73,3278−3282（1976）〕は既に報告されて
いる。また、正常な腎臓上皮の短期培養方法も既に報告
されている〔Veda（前述）〕。これ等の公知手段を介
し、培養細胞を、グルタミン2mM、非必須アミノ酸１
％、ペニシリン100units/ml、ストレプトマイシン1ug/m
l、中胎児血清10％（vol/vol）を補足したEagleの最少
限必須栄養基に保持し、その培養細胞をミコプラズマ
（mycoplasma）、かびそして細菌について定常的にテス
トし、汚染培養細胞を取り除いた。

血清学的方法 マウス混合ヘム吸着アツセイ（hema dsonption ossay）
〔Ｍ−MHA〕を、Fragraeus et al.の方法〔Immunology
9,161−175（1965）〕に基き、これをマウス抗体を検出
するようにして行つた。直接試験及び吸収分析の血清学
的方法は、Dippold等（前出）、Ueda等（前出）及びCar
oy等（前出）の文献に記述されている。

免疫化 （BALB/C×C57BL/6）F₁めすマウスを、株化腎臓がん細
胞系で免疫した。この免疫操作に当つて、最初１×10⁷
腎臓がん細胞を、補助薬を使用することなく前記マウス
の皮下に注射した。その後の免疫操作は、３−４週間の
間隔で、１×10⁷腎臓がん細胞を腹腔内接種して行つ
た。免疫マウスは最終免疫操作の３日後に処置した。

マウスAbsのデリベーシヨン（derivation） 免疫脾臓細胞の、マウス骨髄腫MOPC−21 NS/1細胞との
融合は、Dippold等（前出）及びkohler＆Milstein〔Nat
ure（London）236,495−497（1975）〕の方法により行
つた。ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを
含む選択培地/ml中の融合細胞（５−８×10⁵）は、組織
培養プレートのウエル（wells）〔Costar No.3524,24 w
ells per plate〕に添加した。ハイブリドーマ培養基
は、少くとも３回、１−３×10⁵マウス腹腔内マクロフ
アージの供給層（feeder layer）の希釈を制限して予備
クローンした。かくして得られた培養上澄物は、２つの
腎臓がん細胞系（免疫細胞を含む）、AJ星状細胞腫、SK
−MEL−33及び−37メラノーマ、Me−180頚管がん、WI−
38胎児細胞、VEROアダルト及び胎児腎臓上皮、そして胎
児脳細胞からなる培養細胞のパネル上で、抗体活性につ
いてモニターした。

抗体のサブクラスは、抗−Ig H鎖特異性試薬を含有する
寒天培地（Bionetics,Kensingtoor,M.D.）中での二重拡
散により固定した。クローンしたハイブリドーマの培養
物は、nu/nuマウス（スイス産）に皮下注射し、又、液
体窒素中に保存した。腫瘍の次第に増大するマウスの血
清を採取し、−70℃で保存し、血清学的及び生化学的特
性試験に用いた。

免疫沈降操作 1ml当り15uCiの〔3H〕グルコサミン（New England Nucl
ear;30−60Ci/mmol;Ci＝3.7×10¹⁰ベツクレル）を含む
完全なEagle培地中で、37℃の温度で48時間〔3H〕グル
コサミンにより新陳代謝的にラベル化し、該ラベル化さ
れた細胞は、トリス緩衝液〔Ogata et al.Proc.Natl.Ac
ad.Sci.USA 78,770−774（1981）〕中で、3MKCl処理を
行うことなくして、0.5％ Nonidet P−40（NP−40）で
抽出した。

免疫沈降は、この細胞抽出物（１×10⁵cpm）の一部を、
トリス緩衝液中でマウス血清2ul及びウサギ抗−マウスI
g血清（Cappel Laboratories,Cochranvills,PA）と混合
することにより行つた。生成する免疫複合体をスタフイ
ロコツカス・マウレリユウス（S.aureus）を用いて分取
し、Dippold等のNaDod SO₄/ポリアクリルアミドゲル電
気泳動法（前出）により分析した。また、同様にして、
〔35S〕メチオニンでラベル化した試料を免疫沈降させ
た。但し、この際は、セフアローズ−ウサギＦ（ab′）
_２抗−マウスIgを複合体を分取するのに使用した。当該
抗原のpIを決定するについて、免疫沈降物をOgata等の
方法（前出）の変形であるＯ−Farrell方法〔Ｏ′Farre
ll,P.H.Biol.chem.250,4007−4021（1975）〕による２
次元−電気泳動で検査した。NS−１骨髄腫の３種の異な
る腎臓がん細胞との５つの融合細胞から、詳細分析（表
Ｉ）のため17の抗体生成クローンを選抜した。これ等抗
体の血清学的特異性は、47の株化細胞〔腎臓がん13、メ
ラニン細胞腫５、神経膠芽細胞腫瘍、上皮がん５、Ｂ−
細胞K562（赤血ルーケミア）、Ｔ−細胞２（MOLT−４、
Ｔ−45）及び猿腎臓細胞（VERO）〕のパネル上で試験し
た。更に、当該抗体は、正常腎臓上皮、線維芽細胞及び
胎児組織（脳、線維芽細胞及び腎臓）の短期培養物に対
して試験した、ヒト、ヒツジ、ラツト及び中の赤血球に
ついても試験した。ほとんどの場合、血清学的分析で
は、直接及び吸収試験の双方を行つた。

免疫化学分析に関係するこうした血清学的研究は、９つ
の明確に区別される抗原系に分けた。その中の３つの系
（gp160、S25及びgp120）は、正常にして治療抵抗性腎
臓細胞に限定し、次の３つの系（gp120nr、gp115及び
V₁）は、より広範に分布しているところのものとし、残
る３つの系は、HLA−Ａ、−Ｂ、−C H鎖（heavy chri
n）とＡ及びＢ血液グループ抗原として区別した。

凍結区分（表II）に、腎臓腫瘍に対するS4,S22及びS6の
特異抗を示した。

説明−抗原系（Antigenic Systems） gp160抗原系 このシリーズに於ける５つのAbs（S₄、S₇、S₁₁、S₂₄及
びM₁）は、ヒト腎臓細胞に対して高度の特異性を示す16
0,000−ダルトン グリコプロテインとして認識される
ものである。gp160は、pI7.5の弱塩基性の成分である。
Ｍ−MHA試験により、gp160は、正常腎臓上皮細胞につい
ては全ての培養物、胎児腎臓については３つの培養物の
中２つ、腎臓がん細胞については13の株化細胞の中７つ
について実験的に明らかにすることができた（表２）。
これ等の結果は、吸収試験で確認された。他の細胞型に
ついては、それが正常であつたにしろ治療抵抗性のもの
であつたにしろ、猿腎臓起源の細胞即ちVEROを含めてgp
160抗原を表徴しないことがわかつた。

S25抗原系 Abs25で検出された抗原も、ヒト腎臓起源のヒト細胞に
限定される（表２）。S25決定因子は、熱−不安定のも
のであり、このことはそれがプロテイン又はグルコプロ
テイン上に存在することを示唆するものであるが、Abs2
5は、〔³⁵S〕メチオニンでラベル化するか又は〔3H〕グ
ルコサミンでラベル化したSK−RC−７細胞から如何なる
検出できる成分も沈降しなかつた。異つた腎臓細胞のS2
5及びgp160表現型と正常腎臓細胞の培養物の比較は、こ
れ等２つの系を明確に識別した。例えば、SK−RC−６及
びＡ−498はgp160⁺/S25^-であり、SK−RC−８はgp160^-/S
25⁺であり、一方これ等の培養物の中５つのものはS25表
徴を欠除した。

gp120r及びgp120nr抗原系 ５つのAbs（S₂₃、S₂₆、S₂₇、S₆およびS₁）は、SK−RC−
７細胞の〔³⁵S〕メチオニン又は〔³H〕グルコサミンで
ラベルされた溶解質から120,000−ダルトンのグリコプ
ロテインを免疫沈降した。還元および非還元条件下での
分析はいずれも同じ結果であつた。プロトタイプ（prot
otype）Abs6およびAbs23によつて同定されたgp120のpIs
は一致していた（4.9−5.2）。これら２つのAbsのグル
ープにより認識されるgp120成分の関連性については、
ひきつづく免疫沈降反応を行うことにより明らかにし
た。SK−RC−７の〔³H〕グルコサミンでラベルされた溶
解質をAbs6によつて予備処理することによりAbs23と反
応性を有するすべての抗原を取り除いた。一方、Ｍ−MH
A試験および吸収分析（表２）は、これらのgp120抗体
が、２種類のgp120分子に識別される２種の血清学的に
明瞭なgp120エピトープを認識することを示している。
すなわちgp120r（限定）およびgp120nr（非限定）の２
種である。

Abs23によつて認識されたgp120rは、高度に限定された
分布、すなわち正常腎臓上皮およびある種の腎臓がんに
限られた表徴を有するものであつた。他方のgp120エピ
トープすなわちgp120nrはAbs6によつて認識されたもの
であり、胎児および成人の線維芽細胞と卵巣、膀胱およ
び肺がんからの細胞系を含む培養細胞中に広範に見い出
された。gp120rとgp120nrの決定因子は腎臓がん細胞系
上のそれらの表徴について相違している。即ち、すべて
の細胞がgp120nrエピトープを伴うものであるのに対
し、SK−RC−２、−21、−29およびCaki−１はgp120r決
定因子を欠除している。腎臓起源の細胞に対するAbs23
の特異性は、Abs25そしてとりわけgp160系を認識する抗
体の反応性と類似している。しかしながら、gp160およ
びgp120抗原における分子量の差異に加えて、これらの
腎臓−特異性を有する３種の抗原系は、選択された正常
又は治療抵抗性腎臓細胞を用いた吸収分析をもとにして
区別することができる。たとえば、SK−RC−６及びＡ−
498を用いるとgp160⁺/S25^-/gp120r⁺であり、胎児腎臓細
胞を用いればgp160⁺or^-/S25⁺/gp120r^-である。

gp115抗原系 Abs22は還元及び非還元の両条件下のもとにSK−RC−７
細胞の〔³H〕グルコサミン又は〔³⁵S〕メチオニンでラ
ベルされた溶解質から115,000−ダルトンのグリコプロ
テインを免疫沈降した。直接的Ｍ−MHA試験により、あ
る種の腎臓がんおよび正常な腎臓上皮に対して高い反応
性を示した（力価、１〜10,000×10^-3）。しかしなが
ら、吸収分析の結果は、gp115抗原は種々の細胞型によ
つて表徴されることを示した。

V₁抗原系 AbV₁は、SK−RC−７細胞の〔³H〕グルコサミン又は〔³⁵
S）メチオニンでラベルされた溶解質からいかなるラベ
ルされた成分も免疫沈降しなかつた。吸収試験で、該抗
原が熱安定性（100℃で５分間）であることが明らかに
なり、このことは該抗原がグリコリピツドであることを
示唆している。このV₁（表２）系の２つの特徴点は特に
関係している。すなわち（ａ）該抗原は膀胱の１つのサ
ブセツトを認識するが、乳がんはV₁を表徴しないこと、
および（ｂ）V₁は星状細胞腫上に見い出されないが、一
方メラノーマは強度にV₁を表徴することの２つである。
それらの胚子退行誘導が近い関係にある星状細胞腫とメ
ラノーマ（黒色腫）の間の明瞭な識別は、その他のAbs
によつてはこれまでに見い出されていなかつた。

HLA H鎖（Heavy Chain） Abs21は、〔³⁵S〕メチオニンでラベルされたSK−RC−７
溶解質から45,000−および12,000−ダルトンの成分を免
疫沈降した。Abs21直接によりおよび吸収試験によつて
検出された決定因子はヒト上皮細胞を除く実際上すべて
のヒト細胞型に表われた。すべてのヒト培養細胞を試験
したところ、直接的MHA試験においAbs21との反応性を有
しないものは、ME−180とSK−MEL−19だけであつた。こ
のSK−MEL−19メラノーマ細胞系はこれまでの研究からH
LA−Ａ、−Ｂおよび−Ｃ抗原に殆んどあるいは全く表徴
しないことが知られている。Abs21により沈降された成
分の分子量およびヒト細胞の血清学的測定の結果から、
Abs21はHLAを検出するが、決定因子がそのＨ鎖上にある
かあるいは₂m鎖上にあるのかは識別しないということが
明らかとなつた。ヒトの₂mがAbs21の反応性を阻害しな
かつたという事実は、HLA H鎖（heary chain）に対する
特異性を示唆するものである。

ＡおよびＢ血液グループ抗原 免疫に用いられた３種の腎臓がん系（表１）のうちの２
つは、それらの表面に血液グループＡおよびＢ抗原に表
徴する。すなわちSK−RC−７はB⁺でありSK−RC−28はA⁺
である。SK−RC−６はＯ型個体からのものであり、Ａ型
およびＢ型反応性は陰性である。血液グループ抗原と反
応するAbsを検出するために、Ａ型、Ｂ型、AB型および
Ｏ型赤血球を用いることによりハイブリドーマ上澄液か
ら血液凝集抗体をスクリーニングした。

Ｂ型（しかしＡ型ではない）凝集活性は462の抗−SK−R
C−７（融合細胞）から得た上澄液のうちの４つに見い
出された。Ａ型（しかしＢ型ではない）凝集活性は225
の抗−SK−RC−28融合細胞から得た上澄液のうちの３つ
に見い出された。Ｏ型赤血球の凝集は抗−SK−７、−28
又は−６融合細胞から得た上澄液のいずれにも見い出さ
れなかつた。血液凝集活性を有する２種のモノクローナ
ル抗体はこれらの融合細胞から得られた。AbM₂（nu/nu
血清）のＡ型およびAB型赤血球に対する血液凝集度数は
10^-4であつた。すなわちＢ型赤血球はAbM₂によつて凝集
しなかつた。Abs8（nu/nu血清）のＡ型およびAB型赤血
球に対する血液凝集度数は４×10^-5であつた。即ちＡ型
赤血球はAbs8によつて凝集しなかつた。表３はＡ型、Ｂ
型、Ｈ型およびルーイス型血液グループ反応活性を有す
るグリコプロテインおよびムチン抽出物を用いたAbs8お
よびAbM₂の阻害試験の概要を表わしている。

ある種の細胞系についてハイブリドーマ調製の可能性を
予測することは、その細胞系が他の細胞系との間で可能
であつたとしても必ずしもできない。モノクローナル抗
体に係る技術が定常的でないが故に、新しい細胞系につ
いて予測することはできない。交雑細胞（hybrid cel
l）系の調整は、接種物の性質、細胞増殖条件、交雑条
件およびその他同様な実験的要素によりできたりできな
かつたりする。

本発明は、新規なモノクローナル抗体、F23、ガンマサ
ブ2A（γ2A）免疫グロブリン（λｇ）について記述する
ものである。これまでの研究において、mAbS₄は上記と
同じ免疫グロブリンの部類に属しており、一方S₂₅、
S₂₂、S₂₃、S₆、S₂₇、V₁およびS₂₁はガンマサブ１
（γ_１）免疫グロブリンに属しており、M₂とS₈は、mu
（ｕ）免疫グロブリンに属しているとされた。F23はヒ
ト腎臓細胞−糖蛋白（gp）140上の新規な抗原系を確認
する。

F23は正常ヒト上皮細胞をその免疫原とする交雑細胞系
から得られる。しかしながら本発明によつて腎臓腫瘍に
対する抗体が作られる。これは予測できない結果であ
る。

表Ｉからわかるように、F23はヒト腎臓細胞系を確認す
る。25個の細胞系を試験したところ、そのうちの19個に
対してF23は陽性である。33種のヒト腎臓細胞系につい
て調査した。F23はまた、いくつかの不完全分化腎臓カ
ルシノーマ（carcinomas）といくつかの不完全分化腎臓
カルシノーマ（carcinomas）と、いくつかの乳頭分化を
有していてよく分化された腎臓カルシノーマ（carcinom
as）と反応するいくつかの腎臓カルシノーマを確認す
る。すなわちF23は腎臓カルシノーマをサブセツトする
ので、腎臓腫瘍の治療抵抗性度を分布するのに用いるこ
とができる。20以上の異なつたヒト標本についての凍結
腎臓がん区分についても同様に試験された。凍結区分と
それと同じ標本から株化された組織培養系とを比較する
と、ほとんどの抗原に関して生体内と生体外とで表徴が
一致していることがわかる。表Ｉと表IIを参照のこと。

いくつかの抗原は組織培養において誘発されるか、ある
いは抑制される。この特徴は、生体内および生体外系間
の結果を推定するに先立つて、各々の抗原について決定
されねばならない。F23mAbはヒト腎臓がんのパネルに加
えられるべきであるから、すなわちいまのところF23を
加えてそのパネルは、F₂₃、M₁、M₂、S₁、S₄、S₆、S₇、S
₈、S₁₁、S₂₁、S₂₂、S₂₃、S₂₄、S₂₅、S₂₆、S₂₇、V₁およ
びV₂を包含するものである。この全部そろつたmAbsの配
列は腎臓がんの診断に用いられる。陽反応のスクリーニ
ング試験においては、標本組織、体の排泄物又は分泌物
又は滲出物は上述のmAbsの各々と別々に接触される。

この腎臓mAbF23は、腎臓のと同様に膀胱のmAbを含む尿
−パネルの一部でもある。この尿−パネルは、膀胱mAbs
であるJ143（uro1）、T16（uro5）、T110（uro6）およ
びT138（ECT）を腎臓mAbsであるF23（uro3）、S4（uro
2）およびS6/S27（uro4）とともに包含している。この
提案されたパネル配列は泌尿系の疾病をスクリーン（sc
reen）するのに用いられる。膀胱mAbsは米国特許出願
（co−peuding）Serial No.567,066の主題である。この
mAbsのパネルは、腎臓、尿管および膀胱と反応する。EC
1は糸球体の内皮細胞内に存在し、血管内皮細胞内その
他にも見い出される。Uro1は糸球体の基質膜と尿路上皮
とに表徴される。Uro2は糸球体の上皮細胞と隣接細管の
上、および髄質中の尿細管をとりまく関係組織内に検出
される。Uro3は隣接細管に限定的に存在する。Uro4の分
布は隣接細管およびヘンレ係蹄の部分から、尿路上皮お
よび前立腺の上皮細胞にまで広がつている。Uro5は皮質
および髄質中の遠心細管、尿細管、および腎盂、尿管お
よび膀胱の移行上皮と結合している。Uro6は腎臓の皮質
および髄質両方の間質に見い出される。正常な胎児およ
び成人組織内での、免疫蛍光および免疫過酸化酵素法に
よれば、Uro2、Uro3およびUro4の分布は泌尿系の上皮細
胞に限定される。パネルの残りのmAbの腎臓の外での反
応性に関しては、それらは特定の細胞個体群（EC1およ
びUro5）および基質構成要素（Uro1およびUro6）を意味
するものである。凍結区分について免疫細胞化学的分析
をすると、EC1が内皮に対するものであることが確認で
きる。Uro5はまた、前立腺および乳房の上皮細胞内に存
在し、そして多層形成上皮（皮膚、食道および頚管）内
に存在する。

F23はまた、正常腎臓上皮の２つの細胞系と陽反応を示
す。しかしながら、F23は吸収試験によれば正常ヒトＡ
型、Ｂ型又はＯ型赤血球とは反応しなかつた。凍結反応
においては、F23は成人と同様に胎児標本において正常
腎臓および隣接細管と反応した。F23は脳および神経単
位内で陽反応を呈した。表II参照。

5/31腫瘍だけが３種の抗原すべてを表徴したのに反し、
正常隣接細管細胞は同一レベルで抗原を表徴する（gp16
0、gp120rおよびgp115）。26の腫瘍はこれらの抗原を表
徴せず、試験された８の腫瘍細胞系がgp140に対して陰
性であつた。さらに正常細胞と悪性細胞を分化すると、
そのgp抗原（160、120rおよびgp115）の１つが腫瘍内に
表徴された時、抗原の表徴レベルは正常の10,000倍程度
の高さに達したということに気がつく。結果は抗原表徴
がこれらの腫瘍の治療困難性度と相互に関係しているこ
とを示すものである。

上述の実施例は、例示目的のためのみのものであり、本
発明の範囲の限定するものではない。本発明はここに記
述されたと同じ特徴を有するすべてのモノクロナール抗
体を包含するものであることは明らかである。前記実施
例は、特に、本願明細書に記載され、特許請求されてい
るハイブリドーマ、モノクローナル抗体および細胞系と
実質上機能均等である物に関しては、本発明を限定する
ものではない。

細胞抗原の代替は分化の段階およびがんの段階に相応し
てなされる。したがつて本発明の手法は、分化に相応し
た細胞抗原と腎臓およびそれに連なる細管のがんを明ら
かにしているものである。

要するにここに記述された抗体は、腎単位とサブセツト
し、腎臓がんにもサブセツトする。F23を入手するのに
用いた手法は、上述の技術的手段の項で述べたとおりで
ある。

表１の解説 上述の上田らによるモノクローナル抗体およびF23mAb
の、腫瘍細胞ラインおよび正常細胞ラインとの血清学反
応 〇＝吸収およびロゼツト形成のいずれによつても反応な
し ●＝力価10,000以上のロゼツト形成によつて反応 △＝反応なし−吸収試験のみ行つた ▲＝吸収テストについてのみ反応 表IIの解説 免疫蛍光による、上述の上田らのモノクローナル抗体お
よびF3mAbと、凍結正常ヒト組織切片との免疫病理学反
応 ＡとＢについて 〇＝反応なし ●＝組織内の均一陽反応 ＣとＤについて−ヒト腫瘍の凍結切片 −,0＝反応なし ±＝不均一反応 ＋＝陽反応 注:C68＝結腸モノクローナル抗体CLH68（米国特許出願
（co−pending）Serial No.474,415） C26＝結腸モノクローナル抗体HT29/26（上記米国特許出
願） AJ8＝星状細胞腫モノクローナル抗体（Cairncrossら、P
roc.Natl,Acad.Sci.USA,1982） NL−１＝急性リンパ球白血病における細胞抗原を認識す
るモノクローナル抗体（Tanimoto） NL−22＝mAb（Tanimoto） Ｑ−14＝メラノーマ抗体（米国特許出願（Co−pendin
g）Serial No.445,561） P170＝AJ2星状細胞腫（Cairncross,上述） P130＝AJ2星状細胞腫（Cairncross,上述） S₆/S₂₇＝同じ反応をおこすS₆又はS₂₇mAbのいずれかを用
いた試験による

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/08 9161−4Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/574 Ｄ (72)発明者 カルロス・コ−ドン−カルド アメリカ合衆国10021ニユ−・ヨ−ク・ニ ユ−・ヨ−ク・イ−スト67ストリ−ト430 番地 (72)発明者 コニ−・エル・フインスタツド アメリカ合衆国10028ニユ−・ヨ−ク・ニ ユ−・ヨ−ク・イ−スト81ストリ−ト504 番地 (72)発明者 ウイレツト・エフ・ウイツトモア・ジユニ ア アメリカ合衆国10021ニユ−・ヨ−ク・ニ ユ−・ヨ−ク・イ−スト68ストリ−ト345 番地 (72)発明者 マイロン・ア−ル・メラメツド アメリカ合衆国10583ニユ−・ヨ−ク・ス カ−スデ−ル・ビバリ−・ロ−ド251番地 (72)発明者 ハ−バ−ト・エフ・エチゲン アメリカ合衆国06840コネチカツト・ニユ −キヤナン・オ−バ−ルツク・ドライブ48 番地 (72)発明者 ロイド・ジエイ・オ−ルド アメリカ合衆国10024ニユ−・ヨ−ク・ニ ユ−・ヨ−ク・ウエスト・エンド・アヴエ ニユ600番地 (72)発明者 イ−ブ・フラデツト アメリカ合衆国10021ニユ−・ヨ−ク・ニ ユ−・ヨ−ク・イ−スト67ストリ−ト430 番地 (72)発明者 ケネス・オ−・ロイド アメリカ合衆国10471ニユ−・ヨ−ク・ブ ロンクス・ヘンリ−・ハドソン・パ−クウ エイ4525番地 (56)参考文献 ・Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ. Ｓｃｉ． ＵＳＡ，78，5122−5126 （1981) ・Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ，27, 775−781（1981) ・Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈ ｅ 72ｎｄ ａｍｍａｌ ｍｅｅｔｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓ ｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅ ｒＲｅｓｅａｒｃｈ （Ｐｒｏｃｅｅｄｉ ｎｇｓ ｏｆ ＡＣＣＲ ａｎｄ ＡＳＣ Ｏ），22，304（1981)

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】ミエローマからの細胞株とヒト正常腎臓上
   皮細胞で免疫されたBALB/Cマウスからの脾細胞を融合す
   ることによって形成された、ヒト腎臓細胞の140KD糖蛋
   白を認識するモノクローナル抗体F23を生産するハイブ
   リドーマ細胞系。