JPH0370719B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

産業上の利用分野 本発明は、生理的活性を有する新規な核酸系高
分子物質及びその製造方法に関する。 技術的背景 近年、担子菌類やその他の微生物を利用して蛋
白質（ペプチドを含む）、多糖類及び蛋白質含有
多糖類から成る種々の抗腫瘍性物質を製造するこ
とが提案されており、それらのうちには実用化さ
れているものもある。 本発明者は、微生物が生産する種々の物質の生
理的活性について検討している過程で、アクチノ
マジユラ属に属する微生物が生産する核酸系高分
子物質が優れた抗腫瘍活性及び抗菌活性を示すこ
とを見出し、本発明をなすに至つた。 発明の目的 本発明は、アクチノマジユラ属に属する微生物
を利用して、抗腫瘍活性及び抗菌活性のような生
理的活性を有する核酸系高分子物質を提供するこ
とを目的とするものである。 以下本発明を詳しく説明する。 発明の構成 本発明に係る核酸系高分子物質は、その構成成
分としてデオキシリボ核酸（DNA）35乃至45重
量％、リボ核酸（RNA）６乃至12重量％、糖
（全還元糖として）15乃至17重量％及びアミノ酸
2.5重量％以下を含有していて、下記の理化学的
諸性質により特徴づけられる。 分子量：セフアデツクスＧ−150を用いたゲ
ル濾過性により、２モル塩化カリウム−0.05モ
ルトリス塩酸緩衝液（PH７）中で28000〜30000
（蛋白質換算）を示し、0.05モルトリス塩酸緩
衝液中では分子間会合を生じて60000〜64000
（蛋白質換算）に増大する、 溶解性と色調：水に易溶であるが、メタノー
ル、エタノール、ブタノール、プロパノール、
アセトン及びエーテル等の有機溶剤に不溶、中
性水溶液で赤桃色及びアルカリ水溶液中で青紫
色を呈し、酸性水溶液中では沈澱を生ずる、 旋光度：0.5％水溶液の〔α〕²⁰ _D＝＋76゜ 紫外部及び可視部吸収スペクトル：第１図に
示すとおり。 すなわち、中性水溶液中で256〜258nｍ及び
僅かに505と540nｍに吸収を有し、かつ0.1規定
苛性ソーダ水溶液中で256〜258nｍ及び僅かに
560と600nｍに吸収を有する。 赤外部吸収スペクトル：第２図に示すとお
り。すなわち、3400，2950，2350，1980，
1700，1650，1075，930，670及び520の波長
（cm^-1）で吸収を有する（臭化カリウム錠剤法
による）。 呈色反応： ニンヒドリン反応 陽性 ブリツクス反応 陰性 エルソン・モルガン反応 陰性 ホーリーローリー反応 陰性 ジフエニルアミン反応 陽性 オルシノール反応 陽性 アンスロン反応 陽性 フエノール硫酸反応 陽性 過マンガン酸カリウム反応 陽性、 分解点：＞235℃ また、本発明は、アクチノマジユラ属
（Actinomadura）に属する微生物を培養し、
培養物から上記核酸系高分子物質を製造する方
法もその特徴的事項として包含するものであ
る。 問題点を解決するための手段 本発明の核酸系高分子物質（以下SN−07物質
と称する）は上述したような構成成分を含有する
ものであつて、デオキシリボ核酸（DNA）はシ
ユナイダー（Schneider）法に基づくジフエニル
アミン反応により定量したものであり、リボ核酸
（RNA）はシユナイダー法に基づくオルシノール
反応により定量したものである。また、糖はフエ
ノール硫酸法により全還元糖として、及びアミノ
酸はアミノ酸分析計による分析値としてそれぞれ
測定したものである。なお、アミノ酸分析計によ
るアミノ糖は検出されない。 因みに、SN−07物質は、あたかも核酸様高分
子物質と活性物質が共存しているかのようにみえ
たが、あらゆる分離、精製法を適用したにもかか
わらず、その分画は不可能である。 また、SN−07物質について上記性質のうち、
紫外部吸収スペクトルは中性水溶液中で256〜
258nｍ及び僅かに505と540nｍに吸収を有し、か
つ0.1規定苛性ソーダ水溶液中で256〜258nｍ及び
僅かに560と600nｍに吸収を有する（第１図参
照）。赤外部吸収スペクトルは3400，2950，2350，
1980，1700，1650，1075，930，670及び520の波
長（cm^-1）に吸収を有する（第２図参照）。 なお、SN−07物質は、赤桃色の色調を呈する
無定形粉末であつて、中性水溶液中で赤桃色を呈
し、アルカリ性水溶液中で青紫色を呈し、酸性水
溶液中では沈澱を生ずる。 SN−07 物質の調製： 本発明に係るSN−07物質は、アクチノマジユ
ラ属に属する微生物を培養することにより調製し
得る。 本発明で利用する上記微生物は、神奈川県の土
壌より新たに分離したものであつて、その菌学的
性質を分離株（SN−07と称株する）について説
明すると下記のとおりである。因みに、SN−07
株は工業技術院微生物工業技術研究所に微工研菌
寄第7890号（FERM Ｐ−7890）として寄託され
ている。 (1) 形態上の性質 基中菌糸は、よく分枝して伸張し、通常の条
件下では、分断しない。気菌糸は、オートミー
ル寒天培地（ISP No.３）の培地上で豊富に着
生し、胞子形成も良好である。気菌糸の分枝は
単純分枝であつて、車軸分枝はみられない。胞
子のう、菌核、鞭毛胞子は観察されない。気菌
糸の先端の胞子の連鎖は１〜1.5回転しており、
10〜15ケの胞子が観察される。 電子顕微鏡下での観察では、胞子は円筒型〜
卵型であつて、0.4〜0.6×0.6×1.0ミクロンの
大きさを有し、胞子表面は平滑状である。 (2) 各種培地上の生育状態 各種培地で28〜30℃の温度に14〜21日間培養
した結果、SN−07株は、オートミール寒天培
地、酵母エキス・麦芽エキス寒天培地及びペプ
トン・酵母エキス・鉄寒天培地には生育する
が、他の寒天培地上での生育はきわめて不良で
ある。そこで、培地組成としてオートミール又
は酵母エキスを欠いている培地に対しては酵母
エキスを0.1％になるように添加したものでの
生育状態を観察した。結果は表１に示すとおり
である。

【表】 つて示した。
(3) 生理的性質 () 生育温度：オートミール寒天において20
〜45℃の温度範囲で生育し、25〜41℃におい
て良好に生育し、特に32〜40℃での生育が速
い。 () ゼラチンの液化： 陰性 () デンプンの分解： 陽性 () 脱脂乳のプトン化： 陽性 同上凝固： 陽性 () メラニン様色素の生成： 陰性 () 硝酸塩の還元： 陽性 (4) 炭素源の同化性 シユクロース・硝酸塩寒天培地（Waksman
No.１）からシユクロースを除去して、代わり
に酵母エキス0.1％を添加したものを基礎培地
として用い、それに各種炭素源をそれぞれ0.1
％添加したものについての同化性を観察した。 Ｄ−グルコース 同化する Ｄ−フラクトース 同化する Ｄ−キシロース 同化する Ｌ−アラビノース 同化する Ｉ−イノシトール 同化する サリシン 同化する シユクロース 稍々同化するも不明確 Ｄ−マンニトール 同化せず Ｌ−ラムノース 同化せず ラフイノース 同化せず (5) 細胞壁組成 ベツカー等の方法（Appl.Microbiol.、12，
421〜423、1964）及びルシバリエ等の方法
（Inter.J.of Systematic Bacteriology 20、
435〜443、1970）により分析した。 () 全細胞中の２，６−ジアミノピメリン
酸： メソ型 () 全細胞中の糖：グルコース、マンノース
の他に少量のマジユロースを含み、アラビノ
ース、キシロースを含まない。 上述した性状からみて、SN−07株は形態的に
はストレプトミセス属（Streptomyces）に類似
するが、細胞壁中にメソ型２，６−ジミノピメリ
ン酸を含むことからストレプトミセス属とは明り
ように区別され、また、細胞壁中の糖にアラビノ
ースを含まないことからノカルデイア属
（Nocardia）とも区別される。 したがつて、これらの重要な性質上の特徴か
ら、SN−07株はアクチノマジユラ属
（Actinomadura）に属する菌株であることが判
明した。なお、野々村等のアクチノマジユラ属の
分類「J.Ferment.Technol.、49（11）904〜912
（1971）」によると、５種類の菌株が記載されてい
る。これらのうち、アクチノマジユラ・ロゼオヴ
イオラセア（Actinomadura roseoviolaceae）
がSN−07株と比較的類似しているが、各種培地
での生育状態、炭素源の利用及びデンプン分解性
等の点で若干相違が認められるので、SN−07株
については種の確定には至らず、したがつて、本
菌株をアクチノマジユラ・スピーシーズ
（Actinomadura sp.）SN−07と命名した。 而して、SN−07株は他の放線菌の場合と同様
に、その性質が変化し易く、人工的変異処理で容
易に変異し得るので、いずれの変異株であつても
SN−07物質の生産能を有する菌株はすべて本発
明において利用し得るものである。 上記Actinomadura sp.を利用してSN−07物質
を調製するには、該菌株を、通常の微生物が利用
し得る公知の栄養源を含有する培地中で培養す
る。 培地としては、例えば、グルコース、グリセリ
ン、デンプン、デキストリン、オートミール、マ
ルトース、シユクロース、その他の糖類、及び油
脂類等を炭素源として含み、大豆粉、綿実粕、肉
エキス、酵母エキス、ペプトン、コーンステイー
プリカー、落下生粉、カゼイン、アンモニウム
塩、硝酸、尿素等を窒素源として含み、その他必
要に応じて塩化ナトリウム、塩化カリウム、リン
酸塩等の無機塩類を添加したものを用い得る。 培養方法としては、一般に行なわれる放線菌の
培養方法と同様に好気的条件下での液体深部培養
が適している。また、培養条件としては、25〜37
℃、好ましくは28〜34℃の温度で振とう培養もし
くは通気培養を行なうとよく、２〜４日の培養で
目的とするSN−07物質が最高濃度で産生するに
至る。 因みに、培養物中のSN−07物質の検出には、
大腸菌の薬剤高感受性変異株（Eschericha coli
BE1186）を用いるペーパーデイスク平板法又は
ヒーラ（Hela）細胞による細胞培養法によつて
行なう。 上記培養により得られた培養物からSN−07物
質を採取するに当つては、塩析、溶剤抽出、吸着
剤による処理、イオン交換処理、ゲル濾過法等を
適用して抽出及び精製を行なう。 例えば、培養物を濾過もしくは遠心分離などに
より菌体固形分を分離して得られた濾液に硫酸ア
ンモニウム等の塩析剤を用いて塩析し、得られた
SN−07物質を含む沈澱物を濾取し、これを水又
は緩衝液（例えばリン酸緩衝液、トリス緩衝液
等）に溶解し、ついでこの溶液をセロフアン膜や
限外濾過膜を用いて脱塩した後、ジエチルアミノ
エチル（DEAE）−セルロースあるいはセフアデ
ツクス等の弱塩基性イオン交換樹脂に吸着せし
め、この吸着物を食塩のような中性塩乃至リン酸
緩衝液等を用いて溶出する。ついでこのようにし
て得られたSN−07物質を含む水性液に当量の80
％フエノールを混和し、よく撹拌して上層の水層
部を分取し、これにエタノールを加えてSN−07
物質を含む沈澱物を得る。この沈澱物を水に溶解
し、必要に応じて水に対して透析し、更に、フエ
ニルセフアロースCL−4Bのような疎水クロマト
グラフイー、または、バイオゲルHTのようなハ
イドロキシアパタイトクロマトグラフイー、ある
いはセフアデツクスＧ−75、Ｇ−100、Ｇ−150等
のようなゲル濾過クロマトグラフイーで処理する
ことにより高純度なSN−07物質を得ることがで
きる。 上述したように、培養物について上記各処理を
組合わせて精製したSN−07物質を凍結乾燥する
と赤桃色無定形粉末として得られる。 因みに、このようにして得られたSN−07物質
が単一物質であることは、セフアデツクスＧ−
150カラムクロマトグラフイーでの対称的な溶出
像、超遠心分析（20℃で50000rpm、30分間）に
よる沈降パターンでの単一ピーク、及びイオン交
換型DEAE−SPWカラムによる高速液体クロマ
トグラフイーでの単一ピークにより立証し得る。 発明の有用性 次に、本発明によるSN−07物質の生理活性に
ついて説明する。 () 抗菌作用 表２に示すとおり、SN−07物質は、グラム
陽性細菌、特に、ミクロコツカス・ルテウスを
強く阻止し、バチルス・ズブチリスではDNA
修復能欠損株（rec^-）に対する作用が大きい。
なお、グラム陰性細菌に対する作用は大きくな
いが、サルモネラ菌のリポポリサツカライド
（LPS）欠損株や大腸菌薬剤高感受性株を強く
阻止する。 なお、ここで用いたSN−07物質の100mc
ｇ／ml水溶液での505nｍにおける吸光度0D₅₀₅
＝0.03である。

【表】

【表】 () 抗腫瘍作用 P388の腫瘍細胞を１×10⁶含む浮遊液0.1mlを
BDF₁マウスの腹腔内に移植した後、SN−07
物質を移植１日目から９日目まで連続して上記
腹腔内に投与した。その結果は表３に示すとお
りである。

【表】 表中の延命率は対照群の平均生存日数に対す
るSN−07物質投与群の平均生存日数の百分率
で示したものである。 叙上のとおり、本発明のSN−07物質は、抗
菌活性においてミクロコツカス・ルテウス及び
エセリシヤ・コリー薬剤高感受性を強く阻止
し、その他のグラム陽性細菌を阻止する。 また、SN−07物質は、抵腫瘍活性において
も微量でP388及びL1210担癌マウス延命効果を
ゆうする。 従来知られている高分子の抗腫瘍剤の全てが
タンパク質（ペプチドを含む）、多糖類乃至こ
れから成る化合物や混合物であるのに対して、
SN−07物質は核酸系物質を構成成分とするこ
とに鑑み、従来の高分子抗腫瘍剤と組成及び性
状を明らかに異にする新規な抗菌性及び抗腫瘍
性を有する物質であると判断される。 以下に実施例を示して本発明のSN−07物質
の調製法を更に具体的に説明する。 実施例 培養： 乾燥オートミール15ｇ、グリセリン15ｇ、乾
燥酵母５ｇ、リン酸−カリウム３ｇ、リン酸水
素二ナトリウム７ｇ、硫酸鉄１ｇ、及び硫酸マ
グネシウム0.5ｇを含有し、PHを7.5に調整した
液体培地１を、50ml容試験管に15ml宛分注
し、常法に従つて滅菌した。 上記各培地に、SN−07株の寒天培地上の胞
子を接種して27℃で４〜７日間振とう培養し、
第一種菌を得た。同様に前記組成の液体培地を
100ml入れた500ml容フラスコで30℃で２〜３日
間振とう培養を行なつて第二種菌を得た。次い
で、30容ジヤーフアーメンタ−に前記組成の
液体培地を20入れて滅菌した後、第二種菌
400mlを接種し、培養温度32℃、通気量20／
分、及び撹拌器回転数300〜500rpmの条件下
で、３日間培養を行なつた。培養により産生し
た物質の活性の検定はエセリシヤ・コリー
BE1186株の寒天平板培養における生育阻止を
もつて判定した。 抽出及び精製： 培養終了後、20培養液を濾過して濾液15
を得、これに3.9Kgの硫酸アンモニウム（培養
液１当り２モル硫酸アンモニウム）を加え、
４℃で16時間静かに撹拌した。生じた沈澱物を
遠心分離によつて除去し、清澄液14を得た。
次いで、上記清澄液に2.7Kgの硫酸アンモニウ
ム（はじめの培養液１当り1.5モル硫酸アン
モニウム）を加え、充分撹拌後、４℃で24時間
静置すると、液表面に不溶物がペレツト状に生
じた。このペレツト状不溶物を濾布でこし取つ
て、５の0.05モルリン酸緩衝液PH6.5に溶解
した。予め同上の緩衝液で平衡化しておいた
400mlサイズのジエチルアミノエチル−セフア
デツクスＡ−25カラムに負荷し、活性画分を吸
着させ、同上の緩衝液で充分洗浄した後、緩衝
液中の塩化カリウム濃度を０モルから徐々に１
モルまで高めることによつて、活性画分の溶出
を行なつた。活性を示す溶出液2.5に対して
80％フエノールを等量加えてよく混和した。上
層の水層部を分取し、これにエタノールを注加
しつつ沈澱物を生じさせた。得られた沈澱物を
集めて0.05モルリン酸緩衝液１に溶解して２
モルの硫酸アンモニウムを含有せしめた同上緩
衝液10に対して４℃で透析を行なつた。次い
で、同上の硫酸アンモニウム含有リン酸緩衝液
で平衡化した100mlサイズのフエニルセフアロ
ースCL−4Bカラムに負荷し、活性画分を吸着
させ、同緩衝液中の硫酸アンモニウムを２モル
濃度から徐々に減少させることによつて、活性
画分の溶出を行なつた。活性を示す溶出液0.5
を、蒸留水５に対して４℃で16時間透析を
行なつた。透析内液を25mlまで濃縮して径2.5
cm、長さ105cmサイズのセフアデツクスＧ−150
カラムに負荷し、0.05モルリン酸緩衝液PH6.5
でゲル濾過を行ない、活性画分として15ml、乾
物として赤桃色粉末46mgの精製されたSN−07
物質を得た。培養液に対するSN−07物質の収
率は2.3％であつた。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明のSN−07物質の水溶液（実
線）及び0.1規定カセイソーダ水溶液（破線）
の紫外部及び可視部吸収スペクトルを示す。第
２図はSN−07物質の臭化カリウム錠剤法で測
定した赤外部吸収スペクトルを示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ デオキシリボ核酸（DNA）35乃至45重量％、
   リボ核酸（RNA）６乃至12重量％、糖（全還元
   糖）15乃至17重量％及びアミノ酸2.5重量％以下
   を構成成分として含有し、下記の性質を示すこと
   を特徴とする核酸系高分子物質； 分子量：セフアデツクスＧ−150を用いたゲ
   ル濾過法により、２モル塩化カリウム−0.05モ
   ルトリス塩酸緩衝液（PH７）中で28000〜30000
   （蛋白質換算）を示し、0.05モルトリス塩酸緩
   衝液中では分子間会合を生じて60000〜64000
   （蛋白質換算）に増大する、 溶解性と色調：水に易溶であるが、メタノー
   ル、エタノール、ブタノール、プロパノール、
   アセトン及びエーテル等の有機溶剤に不溶、中
   性水溶液中で赤桃色及びアルカリ水溶液中で青
   紫色を呈し、酸性水溶液中では沈澱を生ずる、 旋光度：0.5％水溶液の〔α〕²⁰ _D＝＋76゜ 紫外部及び可視部吸収スペクトル：中性水溶
   液中で256〜258nｍ及び僅かに505と540nｍで
   吸収を有し、かつ0.1規定苛性ソーダ水溶液中
   で256〜258nｍ及び僅かに560と600nｍに吸収
   を有する。 赤外部吸収スペクトル：3400，2950，2350，
   1980，1700，1650，1075，930，670及び520の
   波長（cm^-1）で吸収を有する（臭化カリウム錠
   剤法による）。 呈色反応： ニンヒドリン反応 陽性 ブリツクス反応 陰性 エルソン・モルガン反応 陰性 ホーリーローリー反応 陰性 ジフエニルアミン反応 陽性 オルシノール反応 陽性 アンスロン反応 陽性 フエノール硫酸反応 陽性 過マンガン酸カリウム反応 陽性、 分解点：＞235℃ ２ アクチノマジユラ属（Actinomadura）に属
   する次の性質を示す核酸系高分子物質の生産能を
   有する微生物を培養し、培養物から該核酸系高分
   子物質を採取することを特徴とする核酸系高分子
   物質の製造方法。 デオキシリボ核酸（DNA）35乃至45重量％、
   リボ核酸（RNA）６乃至12重量％、糖（全還元
   糖）15乃至17重量％及びアミノ酸2.5重量％以下
   を構成成分として含有し、下記の性質を示す核酸
   系高分子物質； 分子量：セフアデツクスＧ−150を用いたゲ
   ル濾過法により、２モル塩化カリウム−0.05モ
   ルトリス塩酸緩衝液（PH７）中で28000〜30000
   （蛋白質換算）を示し、0.05モルトリス塩酸緩
   衝液中では分子間会合を生じて60000〜64000
   （蛋白質換算）に増大する、 溶解性と色調：水に易溶であるが、メタノー
   ル、エタノール、ブタノール、プロパノール、
   アセトン及びエーテル等の有機溶剤に不溶、中
   性水溶液中で赤桃色及びアルカリ水溶液中で青
   紫色を呈し、酸性水溶液中では沈澱を生ずる、 旋光度：0.5％水溶液の〔α〕²⁰ _D＝＋76゜ 紫外部及び可視部吸収スペクトル：中性水溶
   液中で256〜258nｍ及び僅かに505と540nｍで
   吸収を有し、かつ0.1規定苛性ソーダ水溶液中
   で256〜258nｍ及び僅かに560と600nｍで吸収
   を有する、 赤外部吸収スペクトル：3400，2950，2350，
   1980，1700，1650，1075，930，670及び520の
   波長（cm^-1）で吸収を有する（臭化カリウム錠
   剤法による）、 呈色反応： ニンヒドリン反応 陽性 ブリツクス反応 陰性 エルソン・モルガン反応 陰性 ホーリーローリー反応 陰性 ジフエニルアミン反応 陽性 オルシノール反応 陽性 アンスロン反応 陽性 フエノール硫酸反応 陽性 過マンガン酸カリウム反応 陽性、 分解点：＞235℃ ３ アクチノマジユラ属に属する微生物が菌株
   Actinomadura sp.SN−07（微工研菌寄第7890号）
   である特許請求の範囲第２項記載の製造方法。 ４ 培養を25〜37℃、好ましくは28〜34℃の温度
   で２〜４日間行なう特許請求の範囲第２項記載の
   製造方法。 ５ 培養物を、塩析、フエノール処理、エタノー
   ル沈澱、イオンクロマトグラフイー、疎水クロマ
   トクラフイー、ハイドロキシアパタイトクロマト
   グラフイー及びゲル濾過クロマトグラフイーから
   成る群から選択される少くとも２種を組合わせて
   精製する特許請求の範囲第２項記載の製造方法。