JPH0572918B2 - - Google Patents

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JPH0572918B2
JPH0572918B2 JP61186636A JP18663686A JPH0572918B2 JP H0572918 B2 JPH0572918 B2 JP H0572918B2 JP 61186636 A JP61186636 A JP 61186636A JP 18663686 A JP18663686 A JP 18663686A JP H0572918 B2 JPH0572918 B2 JP H0572918B2
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Japan
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positive
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JP61186636A
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JPS6341496A (ja
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Jun Saeki
Eitaro Kumazawa
Mitsuru Niwano
Nobuhiro Yajima
Nobuo Myata
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Snow Brand Milk Products Co Ltd
Original Assignee
Snow Brand Milk Products Co Ltd
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  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野 本発明は、生理的活性、特に抗腫瘍活性を有す
る新規な核酸系高分子抗生物質に関する。 発明の技術的背景 本発明者は、さきにアクチノマジユラ属に属す
る微生物が生産する抗腫瘍活性及び抗菌活性など
の生理的活性を示す核酸系高分子抗生物質(SN
−07物質と称せられる)を開発したが(特願昭59
−263889号、特開昭61−141895号)、その後さら
に検討した結果、同様にアクチノマジユラ属に属
する微生物により生産され、かつ上記SN−07物
質よりも分子量の著しく大きい高分子物質も同様
に優れた生理的活性特に抗腫瘍活性を示すことを
見出し、本発明をなすに至つた。 発明が解決しようとする課題 したがつて、本発明は、アクチノマジユラ属に
属する微生物を利用して、特に優れた抗腫瘍活性
を有する、分子量の著しく大きな核酸系高分子抗
生物質を提供することを課題とする。 以下本発明を詳しく説明する。 発明の構成 本発明に係る核酸系高分子抗生物質は、デオキ
シリボ核酸(DNA)35乃至45重量%、リボ核酸
(RAN)6乃至12重量%、糖(全還元糖)15乃至
17重量%及びアミノ酸2.5重量%以下を構成成分
として含有し、特に下記点で特徴付けられる。 分子量がセフアロースCL−4Bを用いたゲル
濾過法により、0.05モルトリス塩酸緩衝液中で
分子間会合を生じて約10万〜約100万(蛋白質
換算)を示す。 紫外線吸収スペクトルにおける光学密度
(O.D.、吸光度)の260nm/505nmが平均11.0
(10〜12)(100μg/ml水溶液中で)である。 因に、さきに示したSN−07物質の上記による
分子量は、60000〜64000であり、光学密度の
260nm/505nmは15〜20であることから、本発明
に係る物質(以下本物質と称する)は上記SN−
07物質とは別異な物質であるということができ
る。 また、本物質は、ハイドロキシアパタイトクロ
マトグラフイー分析ではSN−07物質より遅れて
溶出することからみても、SN−07物質とはその
構造の点でも相違しているものと言える。 課題を解決するための手段 本物質の構成成分であるデオキシリボ核酸
(DNA)は、シユナイダ(Schneider)法に基づ
くジフエニルアミン反応により定量したものであ
り、リボ核酸(RNA)はシユナイダ法に基づく
オルシノール反応により定量したものである。ま
た、糖はフエノール硫酸法により全還元糖とし
て、及びアミノ酸はアミノ酸分析計による分析値
としてそれぞれ測定したものである。 なお、アミノ酸分析計によつて本物質にはアミ
ノ糖は検出されない。 本物質の中性水溶液中での紫外部吸収スペクト
ルは第1図に示すとおりであつて、256−258nm
及び505,540nmに吸収を有する。 A260/A505=平均11.0(10〜12) また、本物質の赤外部吸収スペクトルは第2図
に示すとおりであつて、3400,2950,2350,
1980,1700,1650,1075,930,670及び520cm-1
に吸収を有する。 次に、本物質の調製について説明する。 本物質はアクチノマジユラ属
(Actinomadura)に属する微生物を培養するこ
とにより調製し得るものであつて、ここで利用す
る上記微生物の菌株(SN−07株と称する)は工
業技術院微生物技術研究所に微工研菌寄第7890号
(FERM P−7890)として寄託されていて、そ
の菌学的性質は特願昭59−263889号の明細書(特
開昭61−141895号公報)に詳しく記載されてい
る。 なお、上記菌株SN−07はアクチノマジユラ・
ロセオヴイオラセア(Actinomadura
roseoviolacea)に属するが、その性質が変化し
易く、人工的変異処理で容易に変異し得るので、
いずれの変異株であつても本物質の生産能を有す
る菌株はすべて利用し得るものである。 上記菌株SN−07を利用して本物質を調製する
には、該菌株を、通常微生物を利用し得る栄養源
を含有する培地中で培養する。 培地としては、例えば、グリコース、グリセリ
ン、デンプン、デキストリン、オートミール、マ
ルトース、シユクロース、その他の糖類、及び油
脂類等を炭素源として含み、大豆粉、綿実粕、肉
エキス、酵母エキス、ペプトン、コーンステイー
プリカー、落花生粉、カゼイン、アンモニウム
塩、硝酸、尿素等を窒素源として含み、その他必
要に応じて塩化ナトリウム、塩化カリウム、リン
酸塩等の無機塩類を添加したものを用い得る。 培養方法としては、一般に行なわれる放線菌の
培養方法と同様に好気的条件下での液体深部培養
が適している。また、培養条件としては、25〜37
℃、好ましくは28〜34℃の温度で振とう培養もし
くは通気攪拌培養を行うとよく、5〜8日の培養
で目的とする本物質を高濃度で得られる。 因に、培養物中の本物質の検出には、大腸菌の
薬剤高感受性変異株(Eschericha coli BE
1186)を用いるペーパーデイスク平板法又はヒー
ラ(Hela)細胞による細胞培養法によつて行う。 上記培養により得られた培養物から本物質を採
取するに当つては、塩析、溶剤抽出、吸着剤によ
る処理、イオン交換処理、ゲル濾過法等を適用し
て抽出及び精製を行う。 例えば、培養物を濾過もしくは遠心分離などに
より菌体固形分を分離して得られた濾液を1〜
3μのカートリツジフイルターを用いて清澄化し、
この液を分子量分画6000〜10000のUF膜を用いて
透過液電気電導率が3μs/cm以下になるまで透析
を行う(通常12〜24時間を要する)。 次いで得られた透析物を再び1μのカートリツ
ジフイルターに通して不溶物を除去した後、その
清澄液をジエチルアミノエチル(DEAE)−セル
ロースあるいはセフアデツクス等の弱塩基性イオ
ン交換樹脂に吸着せしめ、この吸着物を食塩のよ
うな中性塩乃至リン酸緩衝液等を用いて溶出す
る。 次いで、必要に応じて水に対して透析し、更
に、フエニルセフアロースCL−4Bのような疎水
クロマトグラフイー、または、バイオゲルHTの
ようなハイドロキシアパタイトクロマトグラフイ
ー、あるいはセフアロースCL−4B、CL−2B等
のようなゲル濾過クロマトグラフイーで処理する
ことにより高純度な本物質を得ることができる。 上述したように、培養物について上記各処理を
組合せて精製した本物質を凍結乾燥すると赤桃色
無定形粉末として得られる。 因に、このようにして得られた本物質が単一物
質であることは、セフアロースCL−4Bカラムク
ロマトグラフイーでの対称的な溶出像、超遠心分
析(20℃で50000rpm、30分間)による沈降パタ
ーンでの単一ピーク、及びイオン交換型DEAE−
SPWカラムによる高速液体クロマトグラフイー
での単一ピークにより立証し得る。 本物質を酸(例えば0.5N−HCl)或は酵素
(例えばpl−ヌクレアーゼ)で分解処理後、得ら
れるクロモフオア部分をクロロホルムに転溶させ
ると、上記酸分解物からはCarminomycinoneが、
また、上記酵素分解物からは、本物質の生理的活
性本体と思われるクロモフオアとして
Carminomycinを構成成分として含む抗生物質
を得た。 因に、ここでいうクロモフオアとは
Carminomycin(別名RubeomycinA)及び
Carminomycin(別名RubeomycinA1)に類似
した物質であるが、液体グロマトグラフイー、薄
層クロマトグラフイー並びにNMR分析によると
上記Carminomycin及びとは異なるものであ
る。なお、クロモフオアの構造は未だ確定されて
いない。 次に、本物質の有用性についての生理的活性に
ついて説明する。 発明の有用性 本物質は分子量10万〜100万を有する巨大分子
の高次構造から成つていることから、前述した
SN−07物質に比べて安定性が高く、またクロモ
フオアの含有量(A260/A505=平均11.0)も高
い。したがつて、本物質は表1に示すとおり、重
量当りのA505が増加していて、抗腫瘍活性の生
理活性もSN−07物質に比べて優れている。
【表】 以下に実施例を示して本発明を具体的に説明す
る。 実施例 本例は本発明に係る核酸系高分子物質の調製方
法を示したものである。 培養工程 乾燥オートミール15g、グリセリン15g、乾燥
酵母5g、リン酸一カリウム3g、リン酸二ナト
リウム7g、硫酸鉄1g及び硫酸マグネシウム
0.5gを含有する液体培地(PH7.5に調整)1
を、50ml容の試験管に15ml宛分注し、常法に従つ
て滅菌した。 上記各培地に、SN−07株(FERM P−7890)
の寒天培地上の胞子をそれぞれ接種して27℃で4
〜7日間振とう培養して、第1種菌を得た。次い
で、上記と同様の組成の液体培地100mlを500ml容
フラスコに注入したものをに、上記第1種菌を接
種し、30℃で2〜3日間振とう培養を行つて第2
種菌を得た。 次に、この第2種菌400mlを、30容ジヤーフ
アーメンターに前記組成の液体培地を20入れて
滅菌したものに接種し、温度32℃、通気量20/
分及び攪拌機回転数300〜500rpmの条件下に6日
間培養を行つた。 培養により産出した物質の活性の検定はエシエ
リヒア・コリ(Escherichia coli)BE1186株の
寒天平板培養により生育阻止をもつて判定した。 抽出及び精製工程 上記培養終了後、得られた培養液20を遠心分
離に付して菌体を除去し、その上清液を1μのカ
ートリツジフイルターを用いてさらに清澄化して
清澄液15を得た。次いで、この清澄液を分子量
分画6000膜(旭化成社製、フオローフアイバー)
を用いて脱塩し、透過液の電導率が3μS/cm以下
になるまで操作を行つた。濃縮液2が得られ
た。 この透析濃縮液を再び1μのカートリツジフイ
ルターに通して不溶物を除いて清澄液を得た。 この清澄液を、予め0.05モルリン酸緩衝液(PH
6.5)で平衡化しておいた400mlサイズのジエチル
アミノエチルセフアデツクスA−25カラムに負荷
して活性画分を吸着させ、上記リン酸緩衝液で十
分洗浄した後、緩衝液中の塩化カリウム濃度を0
モルから徐々に1モル高めることにより活性画分
の溶出を行つた。 得られた活性溶出液2.5に対して80%フエノ
ールを等量加えてよく混和し、上層の水相部を分
取し、これにエタノールを注加しながら沈殿物を
生成させた。 この沈殿を集めて0.05モルリン酸緩衝液1に
溶解し、2モルの硫酸アンモニウムを含む上記リ
ン酸緩衝液10に対して4℃で透析を行つた。 次いで、得られた透析物を、上記硫酸アンモニ
ウムを含むリン酸緩衝液で平衡化した100mlサイ
ズのフエニルセフアロースCL−4Bカラムに負荷
して活性画分を吸着させ、画緩衝液中の硫酸アン
モニウムを2モル濃度から徐々に減少させること
により活性画分の溶出を行つた。活性を示す溶出
液0.5を蒸留水5に対して4℃で16時間透析
を行つた。透析内液を25mlまで濃縮して径2.5cm、
長さ105cmサイズのセフアロースCL−4Bカラム
に負荷し、0.05モルリン酸緩衝液(PH6.5)でゲ
ル濾過を行い、2種の活性画分A20mlと活性画分
B15mlを得た。これらの活性画分はいずれも赤桃
色を呈する粉末として回収し、画分Aを65mg及び
画分Bを15mgをそれぞれ得た。 画分Aの分子量は10万〜100万であつて、
A260/A505=11.0を示し、画分Bの分子量は5
〜6万であつて、A260/A505=19.5を示した。 すなわち、画分Aは本発明に係る核酸系高分子
物質であり、画分BはSN−07物質である。なお、
画分Aと画分Bを得るに当つて、上記ゲル濾過に
代えてハイドロキシアパタイトクロマトグラフイ
ーによつても両者を別個に単離することができ
る。
【図面の簡単な説明】
第1図は本発明に係る物質の紫外部吸収スペク
トルを示し、第2図は同じく赤外部吸収スペクト
ルを示す。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 1 デオキシリボ核酸35乃至45重量%、リボ核酸
    6乃至12重量%、糖(全還元糖)15乃至17重量%
    及びアミノ酸2.5重量%以下を構成成分として含
    有し、下記の性質を示すことを特徴とする核酸系
    高分子物質; 分子量:セフアロースCL−4Bを用いたゲル
    濾過法により、0.05モルトリス塩酸緩衝液中
    で分子間会合を生じて約10万乃至約100万
    (蛋白質換算)の分子量を示す。 溶解性と色調:水に易溶であるが、メタノー
    ル、エタノール、ブタノール、プロパノー
    ル、アセトン及びエーテル等の有機溶剤に不
    溶、中性水溶液中で赤桃色及びアルカリ水溶
    液中で青紫色を呈し、酸性水溶液中では沈殿
    を生ずる、 旋光度:0.5%水溶液の〔α〕25 D=+76° 紫外部吸収スペクトル:256−258nm、及び
    505,540nm 紫外部吸収スペクトル比:260nm/505nm=
    平均11.0 赤外部吸収スペクトル:3400,2950,2350,
    1980,1700,1650,1075,930,670及び520
    cm-1 呈色反応: ニンヒドリン反応 陽性 ブリツクス反応 陰性 エルソン・モルガン反応 陰性 ホーリーローリー反応 陰性 ジフエニルアミン反応 陽性 オルシノール反応 陽性 アンスロン反応 陽性 フエノール硫酸反応 陽性 過マンガン酸カリウム反応 陽性 分解点:>235℃。
JP61186636A 1986-08-08 1986-08-08 抗腫瘍性を有する核酸系高分子抗生物質 Granted JPS6341496A (ja)

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