JPH0370787B2 - - Google Patents

Description

請求の範囲 １ 試験試料中の抗体の検出方法において (a) 前記試料と実効陰電荷形態の赤血球を包含す
る本質的に等張かつ低イオン強度の懸濁液を製
造し、 (b) 前記懸濁液を少なくとも30秒間維持し、 (c) 前記懸濁液を、前記赤血球の凝集に有効な量
の重合体溶液と混合し、 (d) 得られた重合体と赤血球の凝集物を前記懸濁
液の上澄液から分離し、 (e) 前記凝集物を本質的に中性のPHを有する高張
塩溶液中に分散させ、そして (f) 分散凝集物を赤血球の解離について監視する
ことからなるその方法。

２ 試験試料を血液および血清からなる群から選
択する特許請求の範囲第１項の方法。

３ 懸濁液が重量で0.1〜１％赤血球からなる特
許請求の範囲第１項の方法。

４ 重合体が陰電荷重合体である特許請求の範囲
第１項の方法。

５ 重合体が陽電荷重合体である特許請求の範囲
第１項の方法。

６ 重合体が第四アンモニウム塩である特許請求
の範囲第５項の方法。

７ 重合体がヘキサジメトリン ブロミドである
特許請求の範囲第５項の方法。

８ 懸濁液が6.0と6.6との間のPHを有する特許請
求の範囲第１項の方法。

９ 凝集物は分散される時16〜22℃の温度である
特許請求の範囲第１項の方法。

１０ 凝集物は分散される時０〜６℃の温度であ
る特許請求の範囲第１項の方法。

１１ オリゴ−またはポリ−特異性抗グロブリン
試薬を解離赤血球分散物への抗体監視のために添
加する特許請求の範囲第１項の方法。

１２ 懸濁液がPH6.0〜6.6を有し、重量で0.005〜
0.025％のエチレンジアミン テトラアセテート
および1.5〜３％の糖からなる水性溶液を包含す
る特許請求の範囲第１項の方法。

１３ 分散媒質が6.8〜7.5のPHを有し、また重量
で0.1〜0.3モルのクエン酸塩と 1.5〜５％の糖からなる水性溶液を包含する特
許請求の範囲第１項の方法。

発明の背景 無数の抗体検出技術が存在する。これれらはい
ずれかの、又は与えられた、抗体の存在を決定
し、またそれらの種々の流体、最も特定的には血
液、中の濃度を測定する多くの応用面に利用され
ている。これらの技術は特に輸血の際の血液は交
叉試験法に有用である。

最も一般に用いられている従来の技法は抗グロ
ブリン試薬の使用に基づいている。代表的な方法
はクームス（Coombs）等による論文｛ブリツ
ト、ジエー、エキスプ、パス（Brit.J.Exp.Path）
（1945）の26巻、255頁｝に記載されている。これ
らの方法は、しかしながら、弛緩がかかること、
および感受性が不十分であるという欠点をもつ。

もうひとつの方法はピー．ラレザリ（P.
Lalezari）により輸血（Transfusion）、８巻６
号11・12月、1968中の論文に記載されている。そ
の方法はこの発明の方法と同じ手段を用いる。他
の知られている技術と同様に、しかしながら、そ
の方法は実質的な欠点を有する。それは成分と試
薬の割合ならびに複雑な装置に対して細心の注意
を払わねばならないことである。さらに、この方
法も時間がかかる。

これらの文献の発表は参照によつて本分中に含
まれる。これら現今の技術の欠点は、容認し得る
精度の迅速かつ簡単な検出の必要性に対する実質
な障害となつている。改良検出技術の必要性はそ
れゆえ明らかである。

本発明の序論 本発明の方法は知られている抗体検出技術の多
くの欠点を解決する。それは次の工程からなる： (a) 前記の試料と実行陰電荷形態の赤血球を包含
する本質的な等張かつ低イオン強度の懸濁液を
製造し、 (b) 前記懸濁液を少くとも30秒間維持し、 (c) 前記懸濁液を、前記赤血球の凝集に有効な量
の重合体溶液と合併し、 (d) 得られた重合体と赤血球の凝集物を前記懸濁
液の上澄液から分離し、 (e) 前記凝集物を本質的に中性のPHを有する高張
塩溶液中へ分散させ、そして (f) 分散凝集物を赤血球の解離について監視す
る。この方法はほの数分で、しかも簡単な実験
室装置を用いて完了し得る。さらに、それは用
いた成分および反応体の量又は型におけるほと
んどの変形に実質上無関係な正確なる結果を生
ずる。

本発明の記載 本法はいずれの、通常は水性の、試料中の抗体
の検出にも適している。最も一般的には、それは
血清（その誘導体を含む）に適用される。赤血球
を試料に添加せねばならない。赤血球をまず、一
般的には等張食塩水で洗浄する。試料は総容量で
0.1ないし１％、より好ましくは0.3ないし0.8％、
の懸濁赤血球（又は抗原被覆赤血球）を含有する
のが望ましい。これらの赤血球は一般的に試料中
に存在するいかなる抗体の受容も確実にするため
種々の源の供給体から得る。赤血球を血清と同じ
供給体から得てもよいのは自家抗体の存在が認め
られている場合である。

試料懸濁液中では、赤血球は実行陰電荷を示
す。これは赤血球の正常もしくは自然の状態であ
る。この形態において、それらは次の凝集反応に
対して最大の感受性を有する。陰電荷はPHをおよ
そ6.0と6.6との間に保持することにより確実にな
る。

最大凝集反応はまたは本質的に等張で、かつ低
イオン強度の懸濁液中にても行われる。低イオン
高度は抗体の受容に関して赤血球を感作すると思
われる。それゆえ最終の塩濃度はおよそ0.02ない
し0.05、特におよそ0.03、モルであるのが好まし
い。これらの懸濁液状態を達成するには多くの添
加剤が用いられ得るが、糖（たとえばデキストロ
ース）の添加が浸透圧を増加させるのに最も便宜
である。実際上はどのような塩を用いてイオン高
度を増大させてもよく、また単なる希釈はこれら
の状態の両方を減ずる。

好ましい態様では、特殊な塩を懸濁媒質中に用
いる。この塩はニトリウム エチレンジアミン
テトラアセテートである。それは抗体に対する赤
血球の感作を多変容易にするのみならず、加えて
本法の他を工程を容易に、および（もしくは）は
やめる。

被検試料との合併に好ましい媒質はそれゆえ、
0.005ないし0.025モルのエチレンジアミン テト
ラアセセートイオン（最適なのは0.01モル）と４
ないし８、望ましくは５％の糖たとえばデキスト
ロース又は他の単糖類を包含する水性溶液からな
る。

懸濁液を製造したら、次の工程の抗体−赤血球
感作は急速に達せられる（すなわち、もしも抗体
が被検試料中に存在すれば）。この検濁液は重合
体を添加する前にわずか約30秒という短い間、検
出方法の正確性を期すために保持されている必要
がある。

懸濁赤血球の凝集反応は重合体溶液の添加によ
つて行われる。この目的に有効な多くの重合体は
知られているか又はすでに同一と認められている
ものである。これらの重合体は実効陽電荷体たと
えば第四アンモニウム塩又は陰電荷体たとえばカ
ルボキシメチルセルロースを含む。この目的には
ヘキサジメトリン ブロミドが好ましい。

懸濁液に添加される反応性重合体の量は決定的
ではない。しかしながら通常は、すべての赤血球
を少くとも凝集させるに十分な重合体が用いられ
る。実際には過剰に用いるのが、定量検出におけ
る正確性を期すために望ましい。

添加後、重合体は通常はその目的を完全に果た
すのに30秒とかからない。その後、この重合体−
赤血球凝集物の分離すればよい。これは遠心分離
にかけ、次いで清澄な上澄液を傾瀉することによ
つて行うのが最も便宜である。

分離後、凝集物を、好ましくは緩やかに撹拌し
ながら、本質的に中性PHの高張塩溶液中に分散さ
せる。また一方、分散媒質中でのそれらの割合は
決定的ではない（6.8ないし7.5のPHが望ましい
が）。数秒で抗体を有無が判明する。

塩溶液（分散）の成分もまた決定的ではなく、
懸濁媒質に関して前述した如く変化させてもよ
い。しかし好ましい態様では、分散に用いられる
塩はクエン酸塩（たとえばクエン酸ナトリウム、
カリウム、アンモニウム等）である。かかる塩は
抗体が存在しない場合には凝集物解離を容易にす
ることが発見されている。これはまた本法を促進
させ、かつ検出終末点をはつきりさせることによ
つて監視を容易にする。

それゆえ本発明に用いる分散媒質はPHが6.8な
いし7.5でおよそ0.1ないし0.3モルのクエン酸塩イ
オンを含む高張溶液からなるのが望ましい。通常
それはさらに糖、たとえばデキストロース、又は
単糖類をおよそ重量で1.5ないし５、好ましくは
その２％含有する。

抗体が存在しない場合には、凝集物は急速に解
離し、かつ懸濁液又はコロイド状形態を再びとり
始める。反対に、抗体の存在は赤血球上の結合作
用によつて立証される。それゆえ抗体は分散内の
凝集物の存続によつて示されるか検出される。

これらの結果から検出は分散凝集物の簡単な監
視によつて行えることがわかる。たとえば、目で
見ることによる監視（所望ならば顕微鏡の助けを
かりて）でも、もしあれば、凝集物が解離する程
度の観察を迅速に行える。かかる解離は最初の試
験試料中の抗体濃度と逆の関係において起こる。

この関係のため、さらに抗体濃度の明確な定量
測定もできる。本方法における標準化した条件又
は対照試料を用いる繰返しのいずれかの使用によ
り、正確な定量分析が行われる。

本発明の方法は通常環境状態（およそ16ないし
22℃）下で行われる。しかしながらこれらは必ず
しも必要なことではない。冷温度の使用は冷−反
応性抗体の分離検出を可能にするという利点があ
る。これらの知られている抗体は環境温度より低
い温度でのみ凝集状態を維持する。結局、それら
は凝集物をおよそ０ないし６℃に、分散および監
視に先立つて冷却することによつてのみ検出され
得る。従つて、この方法を使つてさらに、環境反
応性に対して冷反応性である抗体の定性検出をす
ることができる。

さらに定性分析をこの発明の方法に従つて行な
うことができる。解離赤血球分散物を凝集によつ
て検出されないある種の抗体のために再試験す
る。これはたとえば免疫グロブリンに共通のすべ
てのIgGサブクラスならびにλおよびＫ鎖と反応
するいずれかのオリゴ−またはポリ−特異性抗グ
ロブリン試薬の添加によつて行われる。用いる試
薬は血液又は血清の共通補体成分に不活性である
のが望ましい。

適切な、代表的抗グロブリン試薬として色々な
程度の特異性を有するものが市販されている。か
から試薬の添加は、そのような抗体が存在する場
合には赤血球凝集を引き起こす。結局、この追加
試験はもしやらなければ検出をのがれたかもしれ
ない抗体を監視することにより、本発明の総合的
な精密度を容易に増大させる。

この発明の方法は次の例によりより完全に記述
され、またより十分に理解されることと思う。

例 1/10ml（２滴）の試験血清試料を12×75mmガラ
ス管中に入れ、次いで赤血球を添加しておよそ
0.5％濃度とする。５％デキストロースと0.01モ
ルニナトリウム エチレンジアミン テトラアセ
トテートからなる低イオン性水性希釈剤１mlを次
に添加する。混合物を室温で低イオン層にて１分
間保持する。

1/10ml（２滴）の0.05％ポリブレン（アルドリ
ツチ（Aldrich）ケミカル カンパニー、ミルウ
オーキー、ウイスコ、によつて製造されたヘキサ
ジメトリン ブロミド）の水性溶液を管へ添加
し、かつ混合する。15秒後、管を1000xgで10秒
間遠心分離し、細胞を含まない上澄液を傾瀉す
る。

ポリブレンによつて引き起こされた凝集状態
は、60mlの0.2モルクエン酸三ナトリウム溶液と
40mlの５％デキストロースからなる溶液0.1ml
（２滴）を、静かに撹拌しながら管に加えること
により逆転する。10秒以内に、ポリブレンによつ
て引き起こされた凝集物は一部分解離する。この
正の反応は肉眼で容易に観察される。それは試験
血清中に抗体が存在することを確証するものであ
る。

例 試験の方法を新規試験試料でくり返す。全工
程を環境温度で行う代わりに、傾瀉後の残存沈澱
物を氷浴上で１分間冷却する。

次に溶液中へ分散させるや凝集物は即座に完全
解離する。これは抗体（冷反応性抗体を含む）が
存在しないことを証明するものである。

例 例の解離赤血球の分散物を、さらに0.01モル
のクエン酸三ナトリウム溶液を含む0.9％塩化ナ
トリウム溶液で二回洗浄する。洗浄した細胞を次
に抗グロブリン試薬（ロツト番号OSG−53、デ
イド（Dade）部門、アメリカン ホスピタル
サプライ コーポレーシヨン）の水性溶液２滴と
合併する。試験管を次に10秒間遠心分離し、赤血
球を凝集試験する。凝集が観察されない場合は、
抗体が存在しないことを示す。

前例では、監視を肉眼で見える凝集物粒子を視
覚検査することにより簡単に行う。それゆえに前
例はマイナス−プラスの検出試験のみからなる。
より正確でしかも定量滴な結果は、赤血球解離の
程度の検出を含む注意深い顕微鏡監視によつて得
られる。同様の結果は、たとえば、凝集物添加後
すぐに分散媒質を測光分析することを含む他の技
術によつても得られる。この場合、コロイド状の
各赤血球を分析することにより解離程度の正確な
測定が出来る。

これらの本発明の定量方法には、対照試料がし
ばしば試験試料と縦並びに使われる。これにより
検出測定の精度が保証される。かかる対照物は抗
体に含んでいなくても、又は一般的な分析技術に
より前もつて決められた量の抗体を含んでいても
どちらでもよい。

前述の種々の試薬成分に加えて、他の成分が存
在してもよい。これらの成分は汚染を避けるため
の殺菌剤、たとえばナトリウム アジド；赤血球
の常態を保証するための栄養と十分な浸透圧を提
供する糖、たとえばデキストロース；および同様
の知られているか又は明らかな目的のためのもの
を包含する。

理解せねばならないことは、これらの変化は上
記の説明に照らして前述の典型態様中でなら行わ
れてもよいことである。追加修正および変法もま
た、次の請求の範囲によつてそれゆえ計測される
であろう本発明の範囲および精神からかけ離れて
いなければなされてもよい。