JPH0372430A - 細胞間粘着分子の官能性誘導体を用いた抗ウィルス剤 - Google Patents

細胞間粘着分子の官能性誘導体を用いた抗ウィルス剤

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JPH0372430A
JPH0372430A JP2065495A JP6549590A JPH0372430A JP H0372430 A JPH0372430 A JP H0372430A JP 2065495 A JP2065495 A JP 2065495A JP 6549590 A JP6549590 A JP 6549590A JP H0372430 A JPH0372430 A JP H0372430A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 及粟±生胤里公立 本発明は細胞間粘着分子Ｉ　ＣＡＭ−１の官能性ドメイ
ン及びフラグメントに関する。該官能性ドメイン及びフ
ラグメントはウィルス、特にライノウィルス病の治療に
使用し得る。
藍未狡歪 ■、細胞間粘着分子Ｉ　ＣＡＭ−１及び細胞粘着細胞間
粘着分子Ｉ　ＣＡＭ−１はＲｏｔｈｌｅｉｎ、　Ｒ。
等（Ｊ、　Ｉｎ＋ｗｔｖｏ１．１３’７：１２７０−１
２７４（１９８６））により始めて同定され、かつ部分
的に特性が明らかにされた。Ｉ　ＣＡＭ−１、その調製
法、精製法及び特性はアメリカ特許出願０７１０４５．
９６３号（１９８７年５月４日登録）、０７／１１５，
７９８号（１９８７年１１月２日登録）　、０７／１５
５，９４３号（１９８８年２月１６日登録）　、０７／
１８９．８１５号（１９８８年５月３日登録）、及び０
７／２５０，４４６号（１９８８年９月２８日登録）に
提示されている。
Ｉ　ＣＡＭ−１は始め内皮細胞と白血球との間の細胞粘
着過程に関連するものであると考えられていた。細胞粘
着は白血球が循環系から進行中の炎症部位に移動し、バ
クテリアもしくはウィルスなどの外敵に対しホストを適
切に防衛するために内皮細胞などの細胞基質に付着する
過程である。防御システムの優れた見解はＥｉｓｅｎＳ
Ｈ，Ｗ、により″ルエニ些力料！ｕ−１第３　版、ペン
シルバニア州フィラデルフィア、１ａｒｐｅｒ　＆　Ｒ
ｏｗ社刊、（１９８０）、２９０−２９５及び３８１−
４１８”において提示されている。
粘着過程に関与する内皮細胞表面の分子の１つがＩ　Ｃ
ＡＭ−１である。この分子は白血球の細胞表面上に存在
する糖たん白質のＣＤ−１８群の分子に結合することに
より粘着を仲介することが示されている（　Ｓａｎｃｈ
ｅｚ−Ｍａｄｒｉｄ、　Ｆ、等、４Ｍｅｄ、１５８：１
７８５−１８０３　（１９８３）；Ｋｅｉｚｅｒ、　　
Ｇ、　Ｄ、等ｓ　Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、土
工：１１４２−１１４７　（１９８５））。この糖たん
白質群は１つのアルファー鎖と１つのベータ鎖を有する
ヘテロダイマーからなっている。抗原の各々のアルファ
ー鎖は互いに異なるけれども、ベータ鎖は高度に保護さ
れていることが判明している（　Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｍａ
ｄｒｉｄＳＦ、等、Ｊ、　Ｅｘ　ｅｒ、　Ｍｅｄ、　１
５８　：１７８５−１８０３　（１９８３））。糖たん
白質群のベータ鎖（ある場合には“ＣＤ１Ｂ”と称す）
は９５ＫＤの分子量を有することが見い出され、一方ア
ルファー鎖は１５０ＫＤ−１８０ＫＤで変化することが
見い出された（　Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、　Ｔ、、　Ｆｅｄ
。
Ｐｒｏｃ、４４：２６６０−２６６３　（１９８５））
。
膜たん白質のアルファーサブユニットはベータサブユニ
ットの有する広、い相同性を共有していないけれども、
糖たん白質のアルファーサブユニットの近似分析は両者
の間に実質的な類似性があることを示している。ＣＤ−
１８群には、ｐｌ　５０゜９５、ＭＡＣ−１及びＬＦＡ
−１の三つの主要メンバーがある。Ｍａｃ−１はマクロ
ファージ、顆粒球及び大顆粒リンパ球に見い出されヘテ
ロダイマーである。ＬＦＡ−１はほとんどのリンパ球に
見い出されるヘテロダイマーである（　Ｓｐｒｉｎｇｅ
ｒ、Ｔ、　Ａ、、等、Ｉ＋ｕｓｕｎｏ１．　Ｒｅｖ、　
６８　：　１１１−１３５（１９８２））、ｐ１５０．
９５はＭａｃ−１と同様の組織分布をもっており、かつ
細胞粘着に１役を担っている（　Ｋｅｉｚｅｒ、　Ｇ、
等、Ｅｕｒ、　Ｊ、　ｒｍｍｕｎｏｌ。
エエ：１１４２−１１４７　（１９８５））。ＬＦＡ−
１関連糖たん白質のアルファーおよびベータサブユニッ
ト間の類似性の検討はＳａｎｃｈｅｚ−Ｍａｄｒｉｄ　
ｓＦ等によりなされている（Ｌ−陰史辻ユ通０工七浬：
５８６−６０２　　（１９８３）ｉ　ム４狂肛ユハム１
５８：１７８５−１８０３　　（１９８３））。
■、ヒトライノウィルスの細胞レセプターＡｂｒａｈａ
ｍ等（Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、　５１：３４０−３４５（１９
８５））はランダムに選択したヒトライノウィルス（“
ＨＲＶ″）血清型の大部分が同じ細胞レセプターに結合
し得ることを発見した。つづいて主要血清型のＨＲＶＯ
内皮細胞表面への付着を阻止し得るモノクローナル抗体
がＣｏ１ｏｎｎｏ　等（Ｃｏ１ｏｎｎｏ等、Ｊ、　Ｃｅ
１１．　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｓｕ　　１．　１０−蓮肛
１」リー：　２６６　（１９８６）　　：Ｃｏ１ｏｎｎ
ｏ等、Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　　５７：７−１２　（１９
８６）　：Ｃｏ１ｏｎｎ。
等、ヨーロッパ特許出ｌｌ１１６９．１４６号）により
開発された。この抗体により認識される内皮細胞レセプ
ターたん白質が単離され、ならびに９０ＫＤのたん白質
であることが見い出された（　Ｔｏｍａｓｓｉｎｉ等、
Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、５８：２９０−２９５　（１９８６）
。
衾里象立皇 本発明は抗ウイルス治療における細胞間粘着分子（ＩＣ
ＡＭ−１）の官能性誘導体の用途に関する。特に本発明
は本来のＩ　ＣＡＭ−１分子のフラグメントを包含する
官能性誘導体に関する。
詳細には、本発明はそのような治療を必要とする患者に
かかるウィルス感染の治療法を提供し、その方法はウィ
ルス感染を抑制するのに十分な量のＩ　ＣＡＭ−１のフ
ラグメントまたはＩ　ＣＡＭ−１の官能性誘導体のフラ
グメントを患者に与えることを含む。又、これらを含む
抗ウィルス剤を提供する。
本発明はさらにウィルス感染の存在を診断する方法を提
供し、その方法は、 （ａ）　　ウィルスを含む疑いのある生物試料を検出可
能に標識したＩ　ＣＡＭ−１の官能性誘導体とイソキュ
ベートすること、 （ｂ）　　検出可能に標識したＩ　ＣＡＭ−１の官能性
誘導体がウィルスに結合したかどうかを測定すること、 を含む。
本発明はさらにウィルス感染を予防する方法を提供し、
その方法はＩ　ＣＡＭ−１の官能性誘導体に結合するウ
ィルスを含むワクチン組成物を受容者に与えることを含
む。
１、　ＩＣＡＭ−１の特徴 Ｉ　ＣＡＭ−１は繊維芽球上での９７ｋｄ、骨ずい単球
細胞系上での１１４　ｋｄ　、およびＢリンパ芽球細胞
ＪＹ上での９０ｋｄの分子量を有異なる細胞種での分子
量異種抗原性を示す。Ｉ　ＣＡＭ−１生合生は約７３ｋ
ｄの細胞間プレカーサーを含むことが判っている。ツニ
カマイシン処理（グリコジル化を阻害する）から得られ
る非−Ｎ−グリコジル化形は分子量５５ｋｄを有する。
Ｉ　ＣＡＭ−１は“ＣＤ５４”と称されてきた。ホルボ
ールエステル刺激Ｕ９３７細胞からあるいは繊維芽球細
胞から単離したＩ　ＣＡＭ−１は化学説グリコジル化後
分子量６０ｋｄの同一の主要生成物を与える。ＩＣＡＭ
−，１モノクロ一ナル抗体はフィトヘマグルチニン芽球
のＬＦＡ−１欠損細胞系への粘着を干渉する。繊維芽球
のＩ　ＣＡＭ−１に結合し得るモノクローナル抗体によ
る前処理（リンパ球は行わない）はリンパ球−繊維芽球
粘着を抑制する。リンパ球のＬＦＡ−１に対する抗体に
よる前処理（繊維芽球は行わない）もリンパ球−繊維芽
球粘着を抑制することが見い出されている。
従って、Ｉ　ＣＡＭ−１は白血球上のＣＤ１８複合体の
結合性リガンドである。Ｉ　ＣＡＭ−１はＩＬ−１、ガ
ンマ−インターフェロンおよび腫瘍壊死因子のような炎
症メデイエータ−によりインビトロで繊維芽球及び内皮
細胞上にインビボでの炎症領域中へのリンパ球の浸潤と
時間枠的に一致して誘起可能である（　Ｄｕｓｔｉｎ　
−、Ｍ、　Ｌ、等、Ｊ。
Ｉｎ＋ｎ＋ｕｎｏ１．　１３７　：　２４５−２５４、
（１９８６）；Ｐｒｏｂｅｒ、　Ｊ、　Ｓ、等、Ｊ、　
Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１３７　：　　１８９３−１８９６
　（１９８６））。さらにＩ　ＣＡＭ−１は血管内皮細
胞、胸腺上皮細胞、他の上皮細胞および繊維芽球のよう
な非造血細胞上にまた組織マクロファージ、マイトジェ
ン刺激Ｔリンパ芽球、へん桃腺内の胚中心Ｂ細胞及び樹
枝状細胞、リンパ節及びバイエル板のような造血細胞上
にも発現される（　Ｄｕｓｔｉｎ、、　Ｍ、Ｌ、等、Ｊ
、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　　１３７　：２４５−２５４、
（１９８６））。Ｉ　ＣＡＭ−１はアレルギー性湿疹、
扁平苔瑠、発疹、じんま疹及び水庖性疾患のような良性
炎症のケラナノサイト上にも発現される。アレルギー性
である患者の皮ふへのハブテンの通用により誘発させた
アレルギー性成ふ反応もケラナノサイト上に多量のＩＣ
ＡＭ１発現を生じた。これに対して、皮ふ上の有毒バッ
チはケラナノサイト上にＩ　ＣＡＭ−１発現を生じなか
った。
Ｉ　ＣＡＭ−１は種々の皮ふ掌上の不整からの皮ふ傷害
の生検からのケラナノサイト上に存在し、Ｉ　ＣＡＭ−
１発現はアレルギーバッチ試験からの傷害において誘発
される一方、毒性バッチ試験傷害からのケラチンサイト
はＩ　ＣＡＭ−１を発現しない。
Ｉ　ＣＡＭ−１の疎水性分析（Ｋｙｔｅ　、　Ｊ、、等
、Ｊ、　Ｍｏ１ｅｃ、　Ｂｉｏｌ、　　１５７　：　１
０５−１３２　　（１９８２））は２７残基のシグナル
配列の存在を示した。＋ｌグルタミンの指定は３種のＩ
　ＣＡＭ−またん白質調製に関してＮ末端配列を決定し
得なかったことと一致している。すなわちグルタミンは
ピロゲルマチン酸と環状化し、Ｎ末端のブロツクを生じ
る。
１から４５３までの翻訳配列は主に親水性であり、その
後に２４残基の疎水性の推定される膜内ドメインが続い
ている。膜内ドメインの直く後に２７残基の推定される
細胞質内ドメイン内に含まれるいくつかの荷電残基がつ
づいている。
成熟ポリペプチド鎖の推定サイズは５５，２１９ダルト
ンであり、これは脱グリコジル化ＩＣＡＭ−１の測定値
５５０００とよく一致している（　Ｄｕｓｔｉｎ　ＳＭ
、　Ｌ、＋等、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　　１３７　：
２４５−２５４　（１９８６））。８個のＮ−結合グリ
コシル化部位が推定される。これら部位の中の２つのト
リプシンペプチド配列にアスパラギンかないことはそれ
らのグリコジル化およびそれらの細胞外における存在を
確信させる。高マンノースＮ−結合炭水化物当り２５０
０ダルトンを仮定するとＩ　ＣＡＭ−１プレカーサーに
対して７５０００ダルトンの大きさが推定され、これは
６個の７３０００ダルトンという測定値と一致している
（　Ｄｕｓｔｉｎ　ＳＭ、　Ｌ、、等、Ｊ、　Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ、　　１３７　：２４５−２５４　（１９８６）
）。高マンノースの複合体炭水化物への転換後成熟Ｉ　
ＣＡＭ−１糖たん白質は細胞形に応じて７６−１１４　
ｋｄである（　Ｄｕｓｔｘｎ　％　Ｍ−Ｌｏ等、Ｊ、　
Ｉｍ＋ａｕｎｏ１．　１３７　：２４５−２５４　（１
９８６）”）、このようにＩＣＡＭ−１は高度にグリコ
ジル化されているが典型的内在性膜たん白質である。
それゆえＩ　ＣＡＭ−１はリンパ球が付着し得る細胞基
質であり、その結果リンパ球は炎症部分に移動し、そし
て、またはこの炎症に寄因する種々のエフェクター機能
を果すことになる。このような機能には抗体の産生、ウ
ィルス感染標的細胞の溶解などが含まれる。
ＩＩ、ＩＣＡＭ−１の抗ウイルス官能性誘導体。
本発明の１つの特徴はＩ　ＣＡＭ−１が特定のウィルス
の細胞レセプターであり、したがってヒトの細胞にウィ
ルスが付着しかつ感染するのに必要であるという発見に
関する（　Ｇｒｅｖｅｓ　Ｊ、　Ｍ、を等、Ｃｅ１ｌ　
５’６：８３９−８４７　（１９８９）；５ｔａｕｎｔ
ｏｎｓ　Ｄ、　Ｅ、等、Ｃｅ１ｌ　５６　：　８４９−
８５３（１９８９）、両文献は参考として本明細書に引
用する）、特にライノウィルス、特に主要血清型のライ
ノウィルスは細胞表面上に存在するＩＣＡＭ−１分子に
結合し得るそれらの能力を介してその感染を仲介し得る
ことが判っている。
本発明はウィルス感染の治療を目的とするＩＣＡＭ−■
の官能性誘導体の用途に関する。これらの誘導体はウィ
ルス付着に関し内皮細胞のＩ　ＣＡＭ−１と競合し得る
ため、患者への投与はウィルスの吸着を起こし、したが
って感染患者の細胞に付着し、かつ感染するウィルスの
割合を減少させる。
本発明のＩ　ＣＡＭ−１の“官能性誘導体はウィルスに
より認識され得る能力を有し、かつウィルスと会合（す
なわち、結合、複合体形成なと）し得る能力を有する化
合物である。このような生物的機能に加え、Ｉ　ＣＡＭ
−１の官能性誘導体はＩ　ＣＡＭ−１の“フラグメント
″　“バリアント”“アナログ“化学的誘導体”又は“
ペプチド模倣物”の構造と実質的に同じ構造を有してい
る。
両分子が実質的に同じ構造をもつか、もしくは両分子が
同じ生物学的活性を有する場合それらの分子は互いに“
実質的に同じ”であると言われる。
Ｉ　ＣＡＭ−１のような分子の“フラグメント”は該分
子のポリペプチドサブセントを意味して用いられる。本
発明は特にＩ　ＣＡＭ−１の１つ以上のフラグメントを
含むＩ　ＣＡＭ−１の官能性誘導体に関する（これらの
フラグメントは本来のＩＣＡＭ−１分子中に連続して存
在する場合とそうでない場合がある）、可溶性（すなわ
ち膜に結合していない）官能性誘導体が特に好ましい。
Ｉ　ＣＡＭ−１のような分子の“バリアント”は分子全
体又はそのフラグメントに構造的かつ機能的に実質的に
同じである分子を意味して用いられる。したがって、本
発明で用いているバリアントという語に関し、２つの分
子が構造的に互いに異っているか、あるいはアミノ酸残
基配列が同一でない場合にもそれらが同じ活性を有する
場合両分子は互いにバリアントである。ＩＣＡＭ−１の
変異体分子はＩ　ＣＡＭ−１バリアントの例である。
Ｉ　ＣＡＭ−１のような分子の“アナログ１は分子全体
またはそのフラグメントに機能的に実質的に同じ分子を
意味して用いられる。
本発明において分子が正確にその分子の一部ではない付
加的な化学的特性を含むときその分子は別の分子の“化
学的誘導体であると呼ばれる。そのような特性にはその
分子の可溶性、吸収、生物学的寿命などが含まれる。そ
れらとは別にこのような特性にはその分子の毒性の減少
、又はその分子の好ましくない副作用の除去または緩和
も包含する。これらの効果を仲介し得る特性は“ル□ｄ
Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅｓ　”
　　（１９８０）に提示されている。“抗原誘導”分子
は特殊な“化学的誘導体”を構成している。“アジュバ
ント誘導”分子はアジュバント特性を含む分子（Ｉ　Ｃ
ＡＭ−１の官能性誘導体のような）である。ウィルスに
対するこのような分子の結合は抗原部分をウィルスの近
くにもたらし、それによりウィルスの抗原性を増し抗ウ
イルス治療を可能にする。適当なアジュバント部分を用
いることがあきるが、例えばムラξルジベブチドのよう
なアジュバントを用いることが望ましい（Ａ１１ｉｓｏ
ｎ、、Ａ、　Ｃ，等ｔｌｃＬＡＳｙｍｐ、　Ｍｏ１ｅｃ
、　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、、　Ｎｅｗ　Ｓｅｒ、　　
８４　：４０１　４１０　（１９８Ｂ　）　ｉ　Ｒｉｖ
ｅａｕ、　Ｇ、等ム」已吐ユバＬ土土：　４４８−４５
４　（１９８８））。
このような部分を分子に結合する操作法は当分野でよく
知られている。
Ｉ　ＣＡＭ−１の“ペプチド模倣物”は三次構造がＩ　
ＣＡＭ−１の三次構造と実質的に同じ化合物である。
本発明の抗ウイルス試剤は自然の過程（例えば動物、植
物、菌類、細菌などを誘導してＩＣＡＭ−１のアナログ
を生成させるか、又は動物を誘導してポリクローナル又
はモノクローナル抗ＩＣＡＭ　−１抗イデオタイブ抗体
を生産させることによる）、または合成法（例えばＩ　
ＣＡＭ−１の官能性誘導体のポリペプチドを合成するた
めにメリフィールド法を用いるなど）、または組換え技
術（例えば多様なホスト（すなわちイースト、バクテリ
ア、菌類、培養哺乳細胞など）において、または組換え
プラスミド又はウィルスベクターからＩＣＡＭ−１の抗
ウイルス官能性誘導体を生産するなど）またはたん白質
分解により得られる。どの方法を採用するかは簡便性、
所望される収率などの因子に依存する。特定の抗ウイル
ス試剤を生産するのに上述の方法、工程又は技術の唯１
つを採用する必要はない。特定の抗ウイルス試剤を得る
ために上述の工程、方法及び技術を組合せることも可能
である。
約１００個までの残基を有するＩ　ＣＡＭ−１の官能性
誘導体はインビトロ合成で簡便に合成できる。所望され
る場合このようなフラグメントは精製された、または粗
たん白質の目的アミノ酸残基を選択された側鎖または末
端残基と反応し得る有機誘導試剤と反応させることによ
り修正する。得られた共有結合誘導体は生物学的活性に
重要な残基の同定に使用し得る。
一般にシスティン残基をクロロ酢酸又はクロロアセドア
ミドなとのα−ハロアセテート（および対応するアミン
）と反応させてカルボキシメチルまたはカルボキシアミ
ドメチル誘導体を得る。またシスティン残基はプロモト
リフルオロアセトン、α−ブロモ−β−（５−イミドジ
イル）プロピオン酸、クロロアセチルホスフェート、Ｎ
−アルキルマレイミド、３−ニトロ−２−ピリジルジス
ルフィド、メチル２−ピリジルジスルフィド、ｐ−クロ
ロマーキュリベンゾエート、２−クロロマーキュリ−４
−二トロフェノール、またはクロロ−７−ニトロベンゾ
−２−オキサ−１，３−ジアゾールとの反応により誘導
化される。
ヒスチジン基はジエチルプロカーボネートが比較的ヒス
チジン側鎖に特異的であることからｐＨ５、５−７，０
でのこの試剤との反応により誘導体化される。またバラ
−ブロモフェナシルプロミドも有用である。この反応は
０．　Ｉ　Ｍカコジル酸ナトリウム（ｐＨ６，０）中で
行うのが望ましい。
リジン及びアミノ末端残基はコハク酸または他のカルボ
ン酸無水物と反応させる。これらの試剤による誘導体化
はりジン残基の荷電を反転する効果をもつ。アルファー
アミノ基含有残基の誘導体化に適したその他の試験には
メチルビコリニミデート、ピリドキサルホスフエート、
ビリドキサル、クロロボロハイドライド、トリニトロベ
ンゼンスルホン酸、０−メチル−イスウレア、２，４ペ
ンタンジオン、などのイミドエステル類及びグリオキシ
レートを用いたトランスアミナーゼ触媒反応を含む。
アルギニン残基は１つ又はいくつかの従来試薬を用いた
反応により修正される。それらの試薬にはフェニルグリ
オキサール、２．３−ブタンジオン、１．２−シクロヘ
キサンジオン及びニンヒドリンがある。アルギニン残基
の誘導体化には、そのグアニジン官能基のｐＫａが高い
ためその反応はアルカリ条件で行う必要がある。さらに
これらの試薬はリジンの官能基及びアルギニンのエプシ
ロンーアξノ基と反応し得る。
チロシン残基それ自体の特異的修飾は広く研究されてお
り、芳香族ジアゾニウム化合物またはテトラトロメタン
を用いた反応によりチロシン残基にスペクトルラベルを
導入することが特に興味をもたれている。一般に、０−
アセチルチロシル誘導体および３−ニトロ誘導体を生成
するのに各々Ｎ−アセチルイξジゾール及びテトラニト
ロメタンが用いられる。チロシン残基を！！！またはＩ
ｊｌｌ　ｌを用いてヨウ素化し、クロラミンＴ法が適し
ているラジオイムノアッセイのための標識たん白質を調
製する。
カルボキシル側鎖基（アスパラギン酸またはグルタミン
酸）は１−シクロへキシル−３−１２−モルホリニル−
（４−エチル）カルボジイミドまたは１−エチル−３−
（４−アゾニア−４，４−ジメチルペンチル）カルボジ
イミドのようなカルボジイミド（Ｒ’−Ｎ−Ｃ−Ｎ−Ｒ
’）による反応により選択的に修飾される。さらにアス
パラギン酸及びグルタミン酸残基はアンモニウムイオン
を用いる反応によりアスパラギン及びグルタミン残基に
変換される。三官能試薬を用いる誘導体化はＩ　ＣＡＭ
−１の官能性誘導体融合ポリペプチドを切断し、切断さ
れたポリペプチドを放出かつ回収する方法で使用する非
水溶性サポートマトリクスまたはサポート表面にＩ　Ｃ
ＡＭ−１の官能性誘導体を架橋するのに有用である。一
般に用いられる架橋試剤には例えば１．１−ビス（ジア
ゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒ
ド、例えば４−アジドサリシル酸とのエステルであるＮ
−ヒドロキシスクシニξドエステル、３゜３′−ジチオ
ビス（スクシニ貴ジルプロピオネート〉のようなジスク
シニ逅ジルエステルを含むホモ三官能性イミドエステル
およびビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタンのよう
な二官能性マレイミドを含む。メチル−３−（（ｐ−ア
ジドフェニル）ジチオ〕ブロピオイ主デートのような誘
導体化試剤は光存在下架橋を生威し得る光活、性化中間
体を生ずる。別にシアノゲンブロマイド活性化炭水化物
のような反応性非水溶性マトリクス及び米国特許３．９
６９．２８７号、３，６９１．０１６号、４．１９５．
１２８号、４，２４７，６４２号、４，２２９，５３７
　、及び４，３３０，４４０号に記述されている反応性
基質がたん白質固定化に用いられる。
グルタミン及びアスパラギンはしばしば対応するグルタ
ミン酸及びアスパラギン酸残基に脱アミド化される。別
にこれらの残基は温和な酸性条件で脱アミド化する。こ
れらの残基のいずれの形も本発明の範囲内にある。
他の修飾にはプロリン及びリジンの水酸化、セリンまた
はスレオニル残基の水酸基のリン酸化、リジン、アルギ
ニン及びヒスチジンのアルファ−アミノ基のメチル化（
Ｔ、Ｂ、　Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、　Ｐｒｏｔｅｉｎ：５
ｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ｍｏ１ｅｃｕｒｅ　Ｐｒｏ
　ｅｒｔｉｅｓ、、Ｗ、）１．　　フリーマン社版、サ
ンフランシスコ、ｐｐ７９−８６（１９８３））、Ｎ−
末端アミンのアセチル化およびある場合にはＣ−末端の
カルボキシル基のアミド化が含まれる。
アミノ酸配列を修正したＩ　ＣＡＭ−１の官能性誘導体
もＤＮＡの突然変異により調製し得る。
Ｉ　ＣＡＭ−１遺伝子をコードするヌクレオチド配列を
第１図に示す。これらのバリアントには例えば第１図に
示されているアミノ酸配列内の残基の欠失または挿入ま
たは置換が含まれる。また最終構築物が所望される活性
を有するならば欠失、挿入及び置換のどんな組合せも行
なわれ最終構築物が作られる。明らかにバリアントをコ
ードするＤＮＡに起こされる突然変異がその配列の読み
枠をはずしてはならないし、かつ二次構造を作りうる相
補的Ｍ域を生じないことが望ましい（ＥＰ特許出願公開
番号第７５．４４４号参照）。
遺伝子レベルでこれらの官能性誘導体は通常Ｉ　ＣＡＭ
−１分子をコードするＤＮＡにおけるヌクレオチドの部
位指定突然変異誘発を行ない、それにより官能性誘導体
をコードするＤＮＡを作り、その後組換え細胞培養によ
りＤＮＡを発現させることにより調製する。−船釣に該
官能性誘導体は天然のアナログと定性的に同じ生物学的
活性を示す。しかしそれらは正規に生産されるＩ　ＣＡ
Ｍ−１分子と比べそのような活性が実質的に異なる。
アミノ酸配列変化を導入する部位は予め決めておくが突
然変異それ自体は予め決めておく必要はない。例えば所
定の部位の突然変異の効率を最適化するため標的コドン
または領域におけるランダム突然変異誘発を行ない、発
現したＩ　ＣＡＭ−１の官能性誘導体を至適組合せの所
望される活性についてスクリーニングを行う。既知配列
を有するＤＮＡ中の所定の部位の置換突然変異を行う技
術、例えば部位指定突然変異誘発はよく知られている。
本発明のＩ　ＣＡＭ−１の官能性誘導体分子の調製は該
たん白質の初期官能性誘導体または非バリアント形をコ
ードするＤＮＡの部位指定突然変異誘発によって行なわ
れることが望ましい。部位指定突然変異誘発は所望され
る突然変異のＤＮＡ配列および十分な数の隣接ヌクレオ
チドをコードし欠失ジャンクションの両側に安定な二本
鎖を形成するのに十分な大きさおよび配列のブライマー
配列を与える特異的オリゴヌクレオチド配列の使用を通
してＩ　ＣＡＭ−１の官能性誘導体の生産を可能にする
。−船釣にヌクレオチド長約２０〜２５のブライマーが
望ましい。それらは修正する配列のジャンクションの両
側に約５〜１０残基のヌクレオチドを有する。一般に部
位指定突然変異誘発技術はよく知られており、Ａｄｅｌ
ｍａｎ等、ＤＮＡ。
２：１８３　（１９８３）のような刊行物に提示されて
いる（この文献は参考として本発明で引用した）。
認められているように典型的には部位指定突然変異誘発
技術は一本鎖および二本鎖画形で存在するファージベク
ターを用いる。部位指定突然変異誘発に有用な典型的フ
ァージには例えばＭｅｓｓｉｎｇア版、アムステルダム
（１９８１）により報告されているＭ１３ファージのよ
うなベクターが含まれる（この文献は参考として本発明
で引用した）。
これらのファージは市販されており、その用途は当分野
でよく知られている。別に一本鎖ファージの複製オリジ
ンを含むプラスミドベクター（Ｖｉｅｒａ等、止匹り一
むム漫４工１５３：３　（１９８７））を用いて一本鎖
ＤＮＡを得ることができる。
一般に本発明の部位指定突然変異誘発はまず配列に関連
たん白質をコードするＤＮＡ配列を含む一本鎖ベクター
を得ることにより行う。所望される変異配列をもつオリ
ゴヌクレオチドブライマーを例えばＣｒｅａ等（Ｐｒｏ
ｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。
（［ｌ５Ａ）７５：５７６５　　（１９７８））の方法
により一般的には合成により調製する。それからこのブ
ライマーを一本鎖のたん白質配列含有ベクターとアニー
リングし大腸菌ポリメラーゼエフレノフラグメントのよ
うなりＮＡ合戒酵素で処理し突然変異含有鎖の合成を完
了させる。したがって変異配列および第２鎖は所望され
る突然変異を有している。それからこのヘテロ二本鎖を
用いて、ＪＭＩ　Ｏ１細胞のような適当な細胞をトラン
スホームし、ついで変異配列を有する組換えベクターを
含むクローンを選択する。
このようなりローンの選択後変異たん白質領域を取り出
し、たん白質産生に適当なベクター　−般には適当なホ
ストのトランスホーメーションに使用されるタイプの発
現ベクター中に挿入する。
一般にアミノ酸配列欠失の範囲は約１〜３０残基、より
好ましくは１〜１０残基であり、かつ典型的には連続的
である。
アミノ酸配列挿入には１残基から基本的には無制限の長
さのポリペプチドのアミノ、および、またはカルボキシ
末端への融合および単一または多数のアミノ酸の配列内
挿入が含まれる。配列内挿入（すなわち完全なＩＣＡＭ
−１分子配列内の挿入）の範囲は一般に約１−ｉｏ残基
、より好ましくは１〜５残基である。末端挿入の例には
組換えホストからのＩ　ＣＡＭ−１の官能性誘導体の分
泌を可能にするホスト細胞と異質または同質の単一の配
列の該分子のＮ末端への融合が含まれる。
官能性誘導体の第３のグループは、ＩＣＡＭ１分子中少
分子中心１個のアミノ酸、好ましくは唯一のアミノ酸が
除かれかつその位置に別の残基が挿入したものである。
Ｉ　ＣＡＭ−１分子の特性をうまく調節したい場合はそ
のような置換は以下の表に従って行うことが望ましい。
第１表 １」Ｌ ｇｌｙ　；　ｓｅｒ ｙｓ ｇｌｎ　；　ｈｉｓ ｇｌｕ ｅｔ Ｓｎ ｓｐ ｌａ Ｓｎ ｌｅｕ １ｅ ８１ｇ ｌｅｕ ｅｔ ｈｒ ｅｔ ｐｒ。
ｇｉｎ ａｌ ａ１ ｇｉｎ　　：　　ｇｌｕ ｔｙｒ　　；　　１ｌｅ ｌｅｕ　　；　　ｔｙｒ 一連」■パ（髭− ｌａ ８１ｇ ｓｎ ｓｐ ｙｓ ｌｎ ｇｌｕ ｌｙ ｉｓ １ｅ ｌｅｕ ｙｓ ｅｔ ｈｅ ｅｔ ｈｒ Ｔ　ｒｐ　　　　　　　　　　　ｔｙｒＴｙｒ　　　　
　　　　　　　ｔｒｐ　　；　　ｐｈｅＶａｌ　　　　
　　　　　　　　ｉｌｅ　　；　　ｌｅｕ機能的または
免疫学的性質の実質的変化は表に示したものよりも保存
性の少ない置換を選択すること、すなわち、（ａ）例え
ばシートまたはへリックス構造のような置換範囲内のポ
リペプチドバソクボーンの構造、（ｂ）標的部位におけ
る分子の荷電または疎水性または（Ｑ）側鎖の大きさ、
の維持に関する効果が大きく異なる残基を選択すること
により行なわれる。一般に（ａ）グリシンそして、また
はプロリンが他のアミノ酸に置換されるか、または欠失
するか、または挿入される、（ｂ）親水性残基、例えば
セリンまたはスレオニンが疎水性残基、例えばロイシン
、イソロイシン、フェニルアラニン、バリンまたはアラ
ニンに置換する、（Ｃｌシスティン残基がその他のアミ
ノ酸残基に置換する、（ｄ）正電荷側鎖を有する残基、
例えばリジン、アルギニン、またはヒスチジンが負電荷
側鎖を有する残基、例えばグルタミン酸またはアスパラ
ギン酸がそのような側鎖を有さない残基、例えばグリシ
ンに置換する、場合が予想される。
はとんどの欠失及び挿入および特に置換はＩＣＡＭ−１
分子の特性を大きく変化させることは期待できない、し
かしこれらを行った後の置換、欠失または挿入の正確な
効果を予測できない時、当業者はその効果がルーチンな
スクリーニング検定により評価されることを認めるであ
ろう０例えば−船釣に官能性誘導体は本来のＩ　ＣＡＭ
−１分子をコードする核酸の部位指定突然変異誘発、組
換え細胞培養におけるバリアント核酸の発現、および場
合によっては例えば抗−Ｉ　ＣＡＭ−１分子抗体カラム
による免疫アフィニティー吸着による（少なくとも１個
の残存する免疫エピトープに結合させることにより官能
性誘導体を吸着する）細胞培養物からの精製によって得
られる。
それから細胞溶解物または精製Ｉ　ＣＡＭ−１分子の官
能性誘導体の活性は所望される特性に関して適当なスク
リーニング検定法でスクリーニングする。例えば所定の
抗体に対するアフィニティーのような官能性誘導体の免
疫学的特性の変化は競合的タイプ免疫検定により測定す
る。免疫調節活性の変化は適当な検定法により測定する
。酸化還元または熱的安定性、生物学的寿命、疎水性、
たん白質分解的分解感受性またはキャリヤーへの、また
はマルチマーへの凝集性のようなたん白質の性質の修正
は当業者によく知られている方法により検定する。
Ｉ［［、ＩＣＡＭ−１の官能性ドメイン地図Ｉ　ＣＡＭ
−１の研究は該分子が７個のドメインを有することを明
らかにした。これらのドメインの中の５個は細胞外ドメ
イン（ドメイン５は細胞表面に一番近く、ドメイン１は
細胞表面から最も遠い）であり、１つのドメインは膜内
ドメインであり、もう１つのドメインは細胞質内にある
（すなわち細胞内にある）、どのドメインがＩＣＡＭ＝
１のウィルス結合能に関係するかを測定するため、エビ
トーブマソビング実験を採用する。この実験を行うため
種々の欠失変異体を調製し、それらのウィルス結合能を
測定した。Ｉ　ＣＡＭ−１に結合し得るウィルスならど
れでも本実験に採用でききるが主要血清型のヒトライノ
ウィルス（ＨＲＶ−１４）を用いることが望ましい。別
に本実験はＩＣＡＭ−１のウィルスまたはＬＦＡ−１結
合能を抑制することが知られている抗−ＩＣ’ＡＭ−１
抗体を用いて行うことができる。このような適当な抗体
の例にはＲＲ１／　１　（Ｒｏｔｈｌｅｉｎ　、　Ｒ，
等Ｊ。
Ｉｍｍｕｎｏｌ、　　１３７　：　１２７０−１２７４
　　（１９８６））Ｒ６，５（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、　Ｔ
、　Ａ、等、米国特許出願０７／２５０，４４６号）　
、ＬＢ　−２（Ｃ１ａｒｋ、ε、Ａ。
等、”Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ　Ｔｙｐｉｎｇ　Ｉ　（Ａ、
　Ｂｅｒｎａｒｄ等編〉、スブリンガーーバーラグ版、
ｐｐ３３９−３４６（１９８４））、またはＣＬ　２０
３　　（Ｓｔａｕｎｔｏｎ。
Ｄ、　Ｅ、　等、Ｃｅ１ｌ　　５６　：　８４９−８５
３　（１９８９））が含まれる。また別に本実験はＬＦ
Ａ−１に欠失変異体が結合し得るかどうかを測定するこ
とによっても行なわれる。本実験を容易に行い得る方法
はヨーロッパ特許出願刊行番号１６９，１４６号、米国
特許出願０７１０４５，９６３号及びＲｏｔｈｌｅｉｎ
。
（１９８６））（これらすべての文献は参考として本発
明に引用されている）に公開されている。
Ｉ　ＣＡＭ−１の欠失変異体は種々の方法で作り得る。
しかし部位指定突然変異誘発、またはその他の組換え法
（特定のたん白質領域をコードする配列が欠失している
遺伝子配列を発現するＩＣＡＭ　−■を構築することな
ど）により該変異体を得ることが望ましい、このような
変異体を作るのに採用する操作法は当分野ではよく知ら
れている。このような操作を用い、３種のＩ　ＣＡＭ−
１の欠失変異体を調製した。第１の変異体はアミノ酸残
基Ｒ１８５からＲ２８４までを欠いている（すなわちド
メイン３の欠失）。第２の変異株はアミノ酸残基Ｒ２８
４からＲ４５１までを欠いている（すなわちドメイン４
および５の欠失〉。第３の変異株はア果）酸残基Ｙ４７
６以降を欠いている（すなわち細胞質内ドメインの欠失
）。この実験の結果は主にドメイン１．２、及び３がＩ
　ＣＡＭ−１の抗Ｉ　ＣＡＭ−１抗体、ＬＦＡ−１およ
びウィルスとの相互作用に関係することを示している。
■、ウィルス結合に関するＩ　ＣＡＭ−１中の突然変異
の影響 Ｉ　ＣＡＭ−１はウィルスと相互作用し、かつこれに結
合する能力を有しており、特にピコルナウィルス属、Ａ
型コックスサキーウィルス（Ｃｏｌｏｎｎｏ　％Ｒ，Ｊ
、等、Ｊ、Ｖｆｒｏｌ、　５７：　７−１２　（１９８
６））及びメンゴウィルス（Ｒｏｓｓｍａｎｎ、　Ｍ、
　Ｇ、等、Ｖｆｒｏｌ、１６４：３７３　３８２　　（
１９８８））のうちの主要血清型のライノウィルスに対
する能力を有する。この相互作用はＩ　ＣＡＭ−１分子
のドメイン１に存在するＩ　ＣＡＭ−１のアミノ酸残基
により仲介される（第１図及び第２図）。しかしこの相
互作用はＩ　ＣＡＭ−１のドメイン２および３に存在す
るアミノ酸からの寄与に助けられる。
したがって本発明の好ましい官能性誘導体はＩＣＡＭ−
ｌのドメインｌ、２および３をを含むＩ　ＣＡＭ−１分
子の可溶性フラグメントである。ＩＣＡＭ−１のドメイ
ン１および２を含むＩ　ＣＡＭ−１分子の可溶性フラグ
メントの方がより好ましい。さらにＩ　ＣＡＭ−１のド
メイン１を含むＩＣＡＭ−１分子の可溶性フラグメント
が最も好ましい。第１のＩ　ＣＡＭ−１ドメイン内のい
くつかのアミノ酸がＩ　ＣＡＭ−１と、例えば主要血清
型のライノウィルスとの相互作用に関係する。これらの
ア壽ノ酸の別のアミノ酸への置換は該ライノウィルスの
Ｉ　ＣＡＭ−１の結合能力を変化させる。天然のアミノ
酸残基および生成する変異体Ｉ　ＣＡＭ−１分子のＬＦ
Ａ−１、またはライノウィルス、または抗−Ｉ　ＣＡＭ
−１モノクロ一ナル抗体への結合能に関するアミノ酸残
基置換効果を第３表に示した。第３表において、残基は
アミノ酸の１文字コードで表されており、Ｉ　ＣＡＭ−
１分子内の残基の位置が付記されている。したがって例
えば“Ｒ９０”はＩ　ＣＡＭ−１の９０番のグルタミン
酸残基を意味する。同様に“Ｒ９０Ｖ”は９０番のグル
タミン酸残基および９１番のバリン残基からなるジペプ
チドを意味している。置換配列はスラッシュ（“／”）
の右に示されている。たとえばＩＣＡＭ−１のＱ１Ｔ、
Ｒ１３、Ｃ２７、Ｋ３９ＫＥ、、Ｇ４６ＮＮ、Ｒ４９Ｋ
Ｖ、Ｃ５８、Ｄ７１、に７７Ｔ、およびＲ１６６ＰＱ残
基はウィルス結合に関している（第３表）。
ウィルス結合に関するＩ　ＣＡＭ−１のアミノ酸におい
て突然変異を含むＩ　ＣＡＭ−１の官能性誘導体が本発
明で特に興味深い。例えばｖ４のＧによる置換はライノ
ウィルスまたはＬＦＡ−１のいずれにも結合能が小さい
変異体Ｉ　ＣＡＭ−１分子を生威する（第３表）。Ｉ　
ＣＡＭ−１のＲ１３残基の已による置換はＬＦＡ−１ま
たはライノウィルスのいずれにも実質的結合能が小さい
変異体分子を生成させる（第３表）。Ｉ　ＣＡＭ−１の
Ｑ５８のＨによる置換はＬＦＡ−１への結合能は実質的
に正常だがライノウィルスへの結合能は実質的に変化し
ている変異体分子を生威する（第３表）。
Ｉ　ＣＡＭ−１のＤ６０ＳのＫＬによる置換はＬＦＡ−
１への結合能は小さく、かつライノウィルスへの結合能
も小さい変異体分子を生成する（第３表）。
ＬＦＡ−１への結合能は小さいがウィルスへの結合能は
正常なＩ　ＣＡＭ−１の官能性誘導体は特に好ましい。
Ｑ２７のＬによる置換はこのような変異体Ｉ　ＣＡＭ−
１分子を生成する。このＩＣＡＭ　−１の官能性誘導体
はＬＦＡ−１へは実質的に小さい結合能を有するがライ
ノウィルスには正常な結合能を有する（第３表）。第３
表に示されているように、Ｉ　ＣＡＭ−１のいくつかの
官能性誘導体はこの好ましい性質を示すことが判ってい
る。指示されている部位に以下のアミノ酸；Ａ３ＧＬ。
Ｌ２７、Ａ３４、Ｎ７３およびＴ７３を有するＩ　ＣＡ
Ｍ−１の官能性誘導体はこのような好ましい誘導体の例
である。したがってこのような変異体分子の受容者への
投与は天然のＩ　ＣＡＭ−１−ＬＦＡ−１相互作用を変
えることなしにウィルス感染を治療し得る。このような
投与はウィルス感染を治療するが患者の免疫抑制および
炎症応答の抑制は起こさない。
また第１および第２ドメインのグリコジル化部位はウィ
ルス結合に関する（第３表）。Ｎ４８のＨによる、また
はＮ１７５のＡによる置換はウィルスまたはＬＦＡ−１
のいずれにも結合能の小さい変異体Ｉ　ＣＡＭ−１分子
を生成する。Ｎ１１８のＱによる、またはＮ１５６のＥ
による置換はＬＦＡ−１との結合能が小さい変異体Ｉ　
ＣＡＭ−１分子を生威する。一方Ｎ１０３のＫまたはＮ
１７５ＴＳＡのＱＴＬＧによる置換はウィルスまたはＬ
ＦＡ−１のいずれにも実質的に結合しない変異体Ｉ　Ｃ
ＡＭ−１分子を生成する。
■０本発明の抗ウイルス試剤 上述のＩ　ＣＡＭ−１の官能性誘導体に加え、ウィルス
感染の治療に本発明に従がって使用する他の試剤にはＩ
　ＣＡＭ−１に対する抗体、抗−ＩＣＡＭ−１抗体に対
する抗イデイオタイプ抗体およびレセプター分子（ＬＦ
Ａ−１、ｐ１５０．９５、Ｍａｃ−１など）またはＩＣ
ＡＭ−１を結合し得る該分子のフラグメントが含まれる
。
使用し得るＩＣＡＭ−１（またはＩ　ＣＡＭ−１の官能
性誘導体）に対する抗体はポリクローナルまたはモノク
ローナル抗体である。
本発明の興味ある抗イデイオタイプ抗体はＩＣＡＭ−１
と競合（もしくはこれを排除して’）ＨＲＶに結合し得
る。このような抗体は例えば抗ＩＣＡＭ−１抗体に対す
る抗体を生威し、ついで該抗体をＨＲＶまたはＬＦＡ−
１のようなＣＤｌ８群ノｌ真に結合能についてスクリー
ニングすることにより得られる。
ＣＤ−１８群の分子はＩ　ＣＡＭ−１と結合し得るので
、このような分子（例えばアルファおよびベータサブユ
ニットの両方を有するヘテロダイマー、またはアルファ
またはベータサブユニットのいずれか１つを含む分子、
またはいずれかまたは両方のサブユニットのフラグメン
ト、を有する分子など）の投与は、内皮細胞上に存在す
るＩＣＡＭ　−１への結合に関してＨＲＶと競合（また
は排除）し得る。
■０本発明の治療的使用 本発明の治療効果は患者に治療活性のあるＩＣＡＭ−１
の官能性誘導体、Ｉ　ＣＡＭ−１に結合し得るＣＤ１８
群の１員、抗−ＩＣＡＭ−抗体に対する抗体イディオタ
イプ抗体、またはＩ　ＣＡＭ−１に対する抗体を投与す
ることにより得られる。該官能性誘導体の治療効果はキ
ャリヤーへの結合を促進させ、またはＩ　ＣＡＭ−１の
官能性誘導体の抗ウィルス活性を増加するため添加した
付加的アミノ酸を有するＩ　ＣＡＭ−１の官能性誘導体
の使用することにより増加させ得る。さらに本発明の範
囲にはウィルス結合能を示すかぎり特定のアミノ酸を欠
くか、または変化したアミノ酸残基を含むＩ　ＣＡＭ−
１の官能性誘導体を含む。
本発明で公開されているＩ　ＣＡＭ−１の官能性誘導体
は、それらを含む調製物が通常かつ天然には見られない
物質を実質的に含まない場合“実質的に天然混入物を含
まないと言われる。
患者に本発明の治療活性分子のいずれかを与える場合投
与試剤の投与量は患者の年令、体重、身長、性別、−船
釣医療状態、医療履歴などの因子に依存して変化させる
。一般に患者には約１ｐｇ／ｋｇから１０■／ｋｇ　（
患者の体重）の範囲の試剤を投与することが望ましいが
それより低量または高量の投与量も投与できる。
本発明の治療薬剤は患者に静注、筋注、皮下、腸内、ま
たは非経口的に投与できる。これらの薬剤を注射により
投与するときは、投与は連続注入によりあるいは１回ま
たは多数回ポーラスにより行い得る。特に鼻孔内投与が
好ましい手段である。
抗ウイルス薬剤は患者に“薬学的に受は入れ可能である
”組成物の一部として供与される。組成物はその投与が
受は入れ患者に許容される場合に１薬学的に受は入れ可
能である”と云える。本発明の抗ウイルス薬剤は“治療
上有効な”量で受は入れ患者に投与される。投与量が生
理学上有意である場合にその量を“治療上有効”である
と云える。薬剤はその存在が受は入れ患者の生理に検知
可能な変化をもたらす場合に生理学上有意である。
例えば受は入れ患者への投与がその患者においてウィル
ス感染または感染性を抑制または緩和し得るとき薬剤量
は“治療上有効”である。
本発明の抗ウイルス薬剤の投与は“予防”または“治療
”曲目的で使用しうる。予防的に用いる場合、抗ウイル
ス薬剤はウィルス感染の徴候にさきがけで投与される（
例えば感染時の前、感染時、またはその直後であるが感
染の徴候の前に）。薬剤の予防的投与はひきつづくウィ
ルス感染を抑制または緩和するか、またはその感染が他
人に伝染する可能性を減少するのに役立つ。
治療的に投与される場合、抗ウイルス薬剤は実際のウィ
ルス感染の徴候（例えば鼻の充血、熱など）の開始時（
またはその直後）に投与される。
本薬剤の治療的投与は現実のウィルス感染を緩和するの
に役立つ。
このように本発明の抗ウイルス薬剤はウィルス感染の開
始前（関与する感染を抑制するため）またはそのような
感染の開始後に投与できる。
本発明の抗ウイルス分子は従来法に従がって成型し薬学
的に有効な組成物を調合し得、それによりこれらの物質
またはその官能性誘導体は混合物として薬学的に受は入
れ可能なキャリヤーと合せられる。適当なビヒクル及び
例えばヒト血清アルブミンなどの他のヒトたん白質を含
めたそれらの成型法は例えばＲｅａ＋ｉｎｇｔｏｒｉ’
ｓ　ＰｈａｒｍａｅｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ　
（第１６ｍ、０ｓｏ１．　Ａｌｉ、マック版イーストン
ＰＡ（１９８０））に提示されている。効果的投与に適
した薬学的に受は入れ可能な組成物を得るためそのよう
な組成物は適当量のキャリヤービヒクルと共に効果量の
薬剤を含む。
別の薬学的方法が作用期間を調節するのに用いられる。
放出調！ｆｆ調合は薬剤との複合体形成またはその吸収
を起こすポリマーの使用により行ないうる。制御された
配給は適当な高分子（例えばポリエステル、ポリアミノ
酸、ポリビニル、ピロリドン、エチレンビニルアセテー
ト、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースま
たは硫酸ブロタ逅ン）、高分子濃度ならびに取り込み方
法を選択することにより放出制御して行なわれる。放出
制御調合による作用期間を制御する別の可能な方法は抗
ウイルス薬剤をポリエステル、ポリアミノ酸、ハイドロ
ゲル、ポリ（乳酸）またはエチレンビニルアセテートコ
ポリマーのようなポリマー物質の粒子に取り込むことで
ある。それとは別にこれらの薬剤をポリマー粒子に取り
込む代りにこれらの物質を例えばコアサーベーシッン法
または表面間型合法（各々例えばヒドロキシメチルセル
ロースまたはゼラチン−マイクロカプセルおよびポリ　
（メチルメタシレート）マイクロカプセル）により調製
されるマイクロカプセル中または例えばリポソーム、ア
ルブミンマイクロスフイア、マイクロエマルジョン、ナ
ノパーティクルおよびナノカプセルなどのコロイド状薬
剤配給系、またはマクロエマルジョン中に封じ込めるこ
とも可能である・このような技法はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ
’ｓ　Ｐｈａｒｍａ−ｃｅｕｔｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃ
ｅｓ　　（１９８０）に述べられている。
■０本発明の診断的および予後的使用 主要血清型のヒトライノウィルスを認識および結合する
Ｉ　ＣＡＭ−１０）能力はヒトのライノウィルス感染の
存在を診断するためのＩ　ＣＡＭ−１の使用の基礎を提
供し得る。現在アメリカにおける全ての病院患者の約２
０％はライノウィルスまたは細菌感染のいずれかにより
引きおこされる徴候の病気に関する。細菌感染は抗生物
質で治療し得るがこれらの薬剤はライノウィルスには効
果がないのでライノウィルスおよび細菌感染を区別する
手段が大いに期待されている。
本発明に従かいヒトの粘液、鼻分泌物または他の体液中
のライノウィルスの存在を同定し得るアソセイが提供さ
れる。ヒトライノウィルスは６０個のＩ　ＣＡＭ−１結
合部位を有しており、従って６０個の種々のＩＣＡＭ−
１分子を同時に結合し得る。各結合部位は抗体が接近す
るには小さすぎる。
１つの実施態様において、本アッセイは患者の粘液、鼻
分泌物などの存在下ある量の検出可能に標識したＩ　Ｃ
ＡＭ−１官能性誘導体をインキユベートシ、そしてウィ
ルスに結合した標識化分子の量を測定することを含む。
好ましい実施態様においては非標識Ｉ　ＣＡＭ−１官能
性誘導体を固体サポート（ガラス、ポリスチレン、ポリ
プロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、
アミラーゼ、天然および修正セルロース、ポリアクリル
アミド、アガロースおよびマグネタイト）に結合させる
。キャリヤーの性質は本発明の目的によりある程度水溶
性でもよいし、または不溶性でもありうる。サポート物
質はその結合した分子がウィルスと結合し得るかぎりど
んな構造をもっていてもよい。したがってサポートの構
造はビーズのような球状や、試験管の内側表面または棒
の表面のような円筒状をとり得る。それとは別にこの表
面はシートまたは試験紙片などのように平坦でもよい。
熟練者はモノクローナル抗体に適した他のキャリヤーに
気づくであろうし、またルーチンな実験材料を用いて同
じことを確認し得るであろう（ガラス、ポリスチレン、
紙、セルロース等〉。
ウィルスを含む疑いのある液体試料を該液体中に存在す
るウィルスがサポートに結合したＩＣＡＭ　−１官能性
誘導体に結合するのに十分な条件下でその結合Ｉ　ＣＡ
Ｍ−１官能性誘導体と接触させる。
その後そのサポートを標識Ｉ　ＣＡＭ−１官能性誘導体
がウィルス上の未結合のＩ　ＣＡＭ−１結合部位に結合
し得る条件下で標識Ｉ　ＣＡＭ−１官能性誘導体と共に
インキュベートする。標識Ｉ　ＣＡＭ−１官能性誘導体
の未結合分子洗浄後、サポートへの標識結合量を測定す
る。サポートに結合した標識Ｉ　ＣＡＭ−１官能性誘導
体分子の存在は液体試料中のウィルスの存在を示してい
る。
容易に認めろれるように、多くの同様の検定が上述の検
定の精神を逸脱することなしに使用し得る０例えば本検
定は固体サポートを使用する代りに液相で行うことがで
きる。別にその他の免疫検定変法も用い得る。結合Ｉ　
ＣＡＭ−１を用いる代りに結合抗ライノウイルス抗体も
用い得る。このような検定は結合抗体の性質及び特異性
に依存して亜血清型（またはウィルス亜種）の同定を可
能にする。
本発明のこの特徴に従って用い偽る標識の例には酵素標
識、放射性同位元素標識、非放射性同位元素標識、螢光
標識および化学発光標識などが含まれるが、これらのみ
に限られるわけではない。
適当な酵素標識の例にはマレートデヒドロゲナーゼ、ス
タフィロコッカスヌクレアーゼ、デルタ−５−ステロイ
ドイソメラーゼ、イースト−アルコールデヒドロゲナー
ゼ、アルファーグリセロールホスフェートデヒドロゲナ
ーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、パーオキ
シダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ
、グルコースオキシダーゼ、ベーターガラクトシダーゼ
、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコ
ース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ゲルコア泉
ラーゼ、アセチルコリンエステラーゼなどが含まれる。
適当な放射性同位元素標識の例には３Ｈ１目ＩＩｎ、”
ＪＳ１３’　１．、”Ｐ−、”Ｓ−、”Ｃ，、”Ｃｒ　
、、”Ｔｏ、”　Ｃｏ　　ｓ　　”　Ｆ　ｅ　　−、丁
’Ｓｅ　　−、””Ｅｌｆ　　％　　”Ｙ％　　”Ｃｕ
　　、”’Ｃ１％　”’Ａｔ　％　　””Ｐｂ　、”Ｓ
Ｃｓ　　”９Ｐｄなどが含まれる。
適当な非放射性同位元素標識の例にはｌｓ？Ｇｄ、”Ｍ
ｒ　％　　、””Ｄｙ　、、”Ｔｒ　ｓ　５６Ｆｅなど
が含まれる。
適当な螢光標識の例には１５”Ｅｕ標識、フルオレセイ
ン標識、イソチオシアネート標識、ローダミン標識、フ
ィコエリスリン標識、フィコシアニン標識、アロフィコ
シアニン標識、Ｏ−フタルアルデヒド標識、フルオレサ
ミン標識などが含まれる。
化学発光標識の例には、ルミナール標識、イソルミナー
ルＳ識、芳香族アクリジニウムエステル標識、イミダゾ
ール標識、アクリジニウム塩標識、オキサレートエステ
ル標識、ルシフェリン標識、ルシフェラーゼ標識、エフ
ロリン標識などが含まれる。
当業者は本発明に従って用い得る他の適当な標識を思い
つくであろう。ＩＣＡＭ−１官能性誘導体へのａ識の結
合は一般に当業者に知られている標準技術を用いて行な
い得る。−船釣技術はＫｅｎｎｅｄｙ　、　Ｊ、　Ｈ９
等（ＣＩｉｎ、　Ｃｈｉｍ、　Ａｃｔａ　７０　：１−
３１　（１’９７６）　）および５ｃｈｕｒｓ　、　Ａ
、　Ｈ。
Ｗ、　Ｍ、等（ＣＩｉｎ、　Ｃｈｉｍ、　Ａｃｔａ　８
１　：　１−４０（１９７７））により提示されている
。後者に述べられている結合技術にはグルタルアルデヒ
ド、過ヨウ素酸法、シマレイミド法、ｍ−マレイミドベ
ンジル−Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミドエステル法が
あり、これら全ての方法は本明細書に参考として引用さ
れている。
上述のインビトロ検定に加え、インビボイメージングに
より感染部位を同定するためヒトに検出可能に標識され
たＩ　ＣＡＭ−１官能性誘導体を投与することも可能で
ある。別の実施態様においては患者組織のサンプルを取
り出し、検出可能に標識したＩ　ＣＡＭ−１官能性誘導
体の存在下でインキュベートすることによりそのままの
状態でウィルス感染を測定し得る。このようなｉｎ　５
ｉｔｕ分析はウィルスの存在を検定する目的で培地中の
細胞または培養培地についても行ない得る。
■８８本発明抗ウィルス剤のワクチンとしての使用 本発明はさらにワクチン調製を通してウィルス感染を防
ぐ手段を提供する０本発明の１つの実施態様に従がい、
１つ以上のライノウィルス亜血清型または亜種（全ての
主要血清型）をそのウィルス感染性を減少させるためＩ
　ＣＡＭ−１の官能性誘導体の存在下でインキュベート
する。その後、結合したＩ　ＣＡＭ−１官能性誘導体を
含むウィルスをそのヒトの免疫応答を刺激するのに十分
な量投与する（注射、経口、鼻孔内投与のいずれか）。
ウィルスのＩ　ＣＡＭ−１結合部位はＩ　ＣＡＭ−１官
能性誘導体によりブロックされるので、このような投与
から病気にはならない。
好ましい実施態様においてウィルス感染性を緩和するの
に用いるＩ　ＣＡＭ−１の官能性誘導体はアジュバント
誘導体化Ｉ　ＣＡＭ−１分子であろう。
このような分子の使用は弱毒化ウィルスの免疫原性を増
すのに役立つ。
ここまで−船釣に本発明について説明してきたので、説
明として提供される以下の例を参照すれば同じことがよ
り容易に理解されるであろうが、以下の例は特別に指定
しないかぎり本発明を制限する意図はない。
例Ｉ Ｉ　ＣＡＭ−１は免疫グロブリンスパージーン群のイン
テグリン結合メンバーである Ｉ　ＣＡＭ−１内部反復の整列化はマイクロジニーブロ
テインアラインメントプログラム（Ｑｕｅｅｎ％Ｃ０等
、Ｎｕｃｌ、　Ａｃｆｄ　Ｒｅｓ、工２：５８１−５９
９（１９８４））によって行ない、これを検閲した。
Ｉ　ｇＭＳＮ−ＣＡＮ、およびＭＡＧに対するＩＣＡＭ
−１の整列化はマイクロジニー及びＡＬＩＧＮプログラ
ム（ＤａｙｈｏｆｆＳＡ、Ｏ，等、Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚ
　ｍｏｌ。
９１：５２４−５４５　（１９８３））によって行った
。ナショナルバイオメディカルリサーチファンデーシゴ
ンに管理されている４個のたん白質データベースはＷｉ
ｌｌｉａｍｓおよびＰｅａｒｓｏｎ　（Ｌｉｐｍａｎ。
Ｄ、　Ｊ、等５ｃｉｅｎｃｅ　２２７　：　１４３５　
１４３９（１９８５））のＦＡＳＴＰプログラムを用い
たん白質配列類似性を検索した。
Ｉ　ＣＡＭ−１はインテグリンのリガンドであるので、
それが免疫グロブリンスパージーン群の一員であること
は予想されなかった。しかしＩＣＡＭ−１配列の検閲は
それが免疫グロブリンスパージーン群の一員として提唱
されている全ての基準を充していることを示している。
これらの基準を順次以下に議論する。
Ｉ　ＣＡＭ−１の全細胞外ドメインは第２Ａ図に整列し
て示されている５個の相同的免疫グロブリン様ドメイン
から構築されている。ドメイン１〜４は各々８８．９７
．９９および９９残基長であり、したがって典型的な１
．ドメインサイズである。ドメイン５は６８残基以内に
切断されている。
ＦＡＳＴＰプログラムを用いたＮＢＲＦデータの検索は
ＩｇＭおよびＩｇＧＣドメイン、Ｔ細胞レセプターαサ
ブユニット可変ドメインおよびアルファ１ベータ糖たん
白質を含む免疫グロブリンスーパージーン群と有意なホ
モロジーを明らかにした（第２Ｂ図〜第２Ｄ図）。
上述の情報を用いＩ　ＣＡＭ−１のアミノ酸配列を免疫
グロブリンスーパージーン群の他のメンバーのアミノ酸
配列と比較した。
Ｉｇスス−−ファミリードメインは３つのタイプＶＳＣ
１およびＣ２に分類されている。■およびＣの両ドメイ
ンはドメイン間ジスルフィド結合により結合している２
つのβ−シートから構築されている。■ドメインは９個
の逆平行β鎖を含み、一方Ｃドメインは７個の逆平行β
鎖を有する。不変ドメインは第２Ａ図に示されている特
徴的残基に基づきＣ１及び０２セントに分けられている
。
Ｃ１セットは抗原認識に関するたん白質を含む。
０２セツトはいくつかのＦｃレセプターおよびＣＤ２、
ＬＦＡ−３、ＭＡＧおよびＮＣＡＭを含む細胞粘着に関
するたん白質を含んでいる。　ＩＣＡＭ＝１ドメインは
Ｃ２セットのドメインと最も強いホモロジーがあること
が分りＩ　ＣＡＭ−１を０２セントに分類さている。こ
のことは第２図のβ鎖Ｂ−Ｆに対して示されているよう
にＣＩドメインよりもＣ２中の保存的残基に対しより強
い類似性を反映している。また、Ｉ　ＣＡＭ−１ドメイ
ンはＶおよびＣ１ドメイン中のβ鎖とよりもＣ２ドメイ
ンのβ鎖ＡおよびＧとうまく整列しており、このことが
全Ｃ２ドメインに対する良い整列性を許している。ＮＧ
ＡＭ、ＭＡＧおよびアルファ１−β糖たん白質のＣ２ド
メインの整列化を第２Ｂ図および第２Ｃ図に示す、同一
性は２８〜３３％の範囲である。Ｔ細胞レセプター■の
（同一性２７％）及びＩ　ｇＭＣドメイン３（同一性３
４％）との整列化も示した（第２Ｂ図、第２Ｄ図）。
免疫グロブリンドメインの最も重要な特徴の１つはβシ
ートサンドインチを安定化するＢ及びＦβ鎖を橋かけす
るジスルフィド結合化システィン残基である。ＩＣＡＭ
−１においてシスティンはサンドインチ内に向き合い、
かつ他のＶおよび０２セツトドメインについて提唱され
ている接触を安定化しているロイシンが存在するドメイ
ン４のｆ鎖中以外の全ての場合に保存されている。シス
ティン間の距離（残基４３．５０．５２および３７）は
Ｃ２セントについて述べられているとおりである。
Ｉ　ＣＡＭ−１中の核内ジスルフィド結合の存在をテス
トするため還元および非還元条件下内皮細胞Ｉ　ＣＡＭ
−１を５ＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。
内皮細胞Ｉ　ＣＡＭ−１はＪＹまたは毛状細胞肺臓Ｉ　
ＣＡＭ−１よりもグリコジル化の差異が小さく、かつＭ
ｒの変化に対し敏感であるため使用した。
それゆえＩ　ＣＡＭ−１は１６時間ＬＰＳ　（５μｇ／
■ｌ）活性化ヘソ静脈内皮細胞培養物から上述の免疫ア
フィニティクロマトグラフィーにより精製した。アセト
ン沈殿化ＩＣＡＭ−１を０．２５％２−メルカプトエタ
ノールまたは２５ｍＭヨードアセトアミドを含むサンプ
ルバッファ（Ｌｅａｍｍｌｉ。
Ｕ、に、Ｎａｔｕｒｅ　　２２７　：６８０−６８５（
１９７０））に９濁し、１００℃に５分間加熱した。こ
のサンプルを５ＤＳ−ＰＡＧＥ　（４６７０）で分画し
銀染色（４６１３）した。内皮細胞ＩＣＡＭ−ｌは還元
条件下で１００ｋｄならびに非還元条件で９５ｋｄの見
かけ上の分子量を有し、このことは天然のＩＣＡＭ−１
中の膜内ジスルフィド結合を強く示唆している。
二次構造を予測するための一次配列の使用は（Ｃｈｏｕ
　Ｓｐ、　ｙ、等Ｂｉｏｃｈｅｍ、　　１３　：　２１
１−２４５（１９７４））、免疫グロブリンドメインに
対する予想を正しく充たしかつ免疫グロブリン中のＡ−
Ｈ鎖の位置に対応する（第２Ａ図下〉第２Ａ図上にａ−
ｇと印された各ＩＣＡＭ−１ドメイン中に予測される７
個のβ鎖を示した。ドメイン５はＡおよびＣ鎖を欠いて
いるがこれらはシートのエツジを形成しているのでこの
シートはいくつかの他の０２ドメインに対して提唱され
ているようにおそらくＣ鎮の代りにＤ＃Ｊを用いて形成
されており、従って特徴的なり鎮およびＦ制量のジスル
フィド結合は影響を受けていないであろう。このように
ドメインサイズ、配列ホモロジー、推定されるドメイン
内ジスルフィド結合を形成する保存的システィン、ジス
ルフィド結合の存在および予想されるβシート構造に対
する基準は全て免疫グロブリンスーパージーン群へのＩ
ＣＡＭ−１の包含を示している。
ＩＣＡＭ−１は０２セツトのＮＣＡＭおよびＭＡＧ糖た
ん白質と最も強いホモロジーを有することが分った。こ
のことはＮＧＡＭおよびＭ　Ａ　Ｇの両方が細胞−細胞
粘着を仲介することから特に興味深い。ＮＣＡＭはニュ
ーロン−ニューロンおよび神経筋相互作用に重要であり
（Ｃｕｎｎ　ｉｎｇｈａｍ、Ｂ、＾０等、５ｃｉｅｎｃ
ｅ　　２３６　：７９９−８０６（１９８７））、一方
ＭＡＧはミニリン形成におけるニューロン−オリゴデン
ドロサイトおよびオリゴデンドロサイト−オリゴデンド
ロサイト相互作用に重要である（　Ｐｏ１ｔｏｖａｋ、
　　ｌｊ、等Ｊ、　Ｃｅ１ｌ肛吐、１０５８１８９３−
１８９９　　（１９Ｂ？））。
ＮＣＡＭおよびＭＡＧの細胞表面における発現は炎症部
のＩ　ＣＡＭ−１の調節的誘導と類似して各々神経系形
成およびミニリン形成の際に分化的に調節されている（
　ＳｐｒｉｎｇｅｒＳＴ、　Ａ、等Ａｎｎ、　Ｒｅｖ。
Ｉｍｍｕｎｏｌ、５：２２３−２５２　（１９８７））
。
ＮＧＡＭにおいてはいくつかの付加的非Ｉｇ様配列が最
後の０２ドメインおよび膜内ドメインの間に存在するけ
れどもＩ　ＣＡＭ−１、ＮＣＡＭ（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａ
＊、、Ｂ、Ａ、等、５ｃｉｅｎｃｅ　２３６　：　７９
９−８０６　（１９８７））およびＭＡＧ　（５ａｌｚ
ｅｒ、Ｊ、Ｌ、等Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、　１０４
　：　９５７−９６５（１９８７））の各々はＮ−末端
細胞外領域を形成する５個の０２ドメインから構築され
ている組込み膜糖たん白質であることから全体の構造が
類似していると同時に相同的である。Ｉ　ＣＡＭ−１は
膜内および細胞質内ドメインを含む全長にわたりＭＡＧ
と２１％の同一性で整列する。同じ率の同一性がＩ　Ｃ
ＡＭ−１の５個のドメインおよびＮＧＡＭ−１の比較で
見い出された。ＩＣＡＭ−１のｃＤＮＡ配列を第１図に
示す、ドメイン間の比較はＩ　ＣＡＭ−１およびＮＣＡ
Ｍ分子内のドメイン間のホモロジーレベル（ｘ＋ｓＳｄ
、各々２１±２．８％および１８．６±３．８％）はＩ
　ＣＡＭ−１ドメインとＮＧＡＭならびにＭＡＧドメイ
ンとの比較によるホモロジーレベル（各々２０．４±３
．７ならびに２１．９±２．７）と同じである。ＮＣＡ
ＭおよびＭＡＧのＣ末端領域内の別のスプライシングに
対する証拠があるにもかかわらず（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａ
ａｉ。
Ｂ、　Ａ、等、５ｃｉｅｎｃｅ　２３６　：　７９９−
８０６（１９Ｂ　？）　：　Ｂａｒｔｈｅｌｓ　、　Ｄ
、等ＥＭＢＯＪ、　６　：９０７−９１４　（１９８７
）（ＮＣＡＭ）およびＬａｉ％Ｃ，等、Ｐｒｏｅ、　Ｎ
ａｔｌ、　Ａｅａｄ、　Ｓｅｔ、　（ＵＳＡ）　８４　
：４３７７−４３４１　　（１９８７）（ＭＡＧ））、
内皮またはＨＬ−６０ＩＣＡＭ−１クローンの配列決定
または種々の細胞型におけるＩ　ＣＡＭ主要たん白質お
よび前駆体に関する研究ではこの証拠は見い出されなか
った（　Ｄｕｓｔｉｎ、　Ｍ、　Ｌ−等、Ｊ。
Ｉｍｍｕｎｏｌ、　　　１３７　　：　　２４５−２５
４　　　（１９８６））。
例２ Ｉ　ＣＡＭ−１の切断誘導体の遺伝子的構築および発現 天然のＩ　ＣＡＭ−１は５個の免疫グロブリン様ドメイ
ン、膜内ドメインおよび細胞質内ドメインを含む細胞膜
結合たん白質である。可溶性分泌型Ｉ　ＣＡＭを生じう
る膜内ドメインそして、または細胞質内ドメインを欠＜
ＩＣＡＭ−１の官能性誘導体を構築することが望まれた
。これらの官能性誘導体はＩ　ＣＡＭ−１遺伝子のオリ
ゴヌクレオチド指定突然変異誘発およびそれにつづく該
変異遺伝子のトランスフェクション後のサル細胞におけ
る発現により構築した。
アミノ酸置換そして、または切断誘導体を生ずるＩ　Ｃ
ＡＭ−１遺伝子の突然変異はＫｕｎｋｅｌＳＴ。
法（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　
（Ｕ、Ｓ、Ａ、）　８２　：４８８−４９２　（１９８
５））を用いて生成した。
上述のように調製したＩ　ＣＡＭ−１ｃＤＮＡを制限エ
ンドヌクレアーゼ５ａｉｌおよびＫｐｎｌで消化し、生
成した１、８ｋｄのＤＮＡフラグメントをプラスミドベ
クター〇〇Ｍ８にサブクローン化した（　５ｅｅｄ、　
Ｂ、等、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ
、（ＵＳＡ）８４：３３６５−３３６９　（１９８７）
）、その後このｐｃＤｌ、８ｃと命名した構築物で大腸
菌（ＢＷ３１３／Ｐ３）のｄｕｔ−、！Ｌ！ＬＬＬ株を
トランスホームした。−氷膜ウラシル含有テンプレート
をヘルパーファージＲ４０Ｂ　（ストラタジーン社）に
よる感染により該トランスホーマントから取り出した。
その後変異体Ｉ　ＣＡＭ−１ｃＤＮＡは、ミスマンチ塩
基を所有するオリゴヌクレオチドを用いて第２Ｍの合成
を開始し、ついで該ヘテロニ量体でｕｎｇ”宿主（ＭＣ
１０６１／Ｐ３）をトランスホームすることにより得た
。変異体は変異オリゴヌクレオチドにより新たに導入さ
れたエンドヌクレアーゼ制限部位によるスクリーニング
で単離した。この変異Ｉ　ＣＡＭ−またん白質は標準Ｄ
ＥＡＥ−デキストラン操作を用い真核性発現ベクターＣ
ＤＭＢ内の変異体ＤＮＡでＣｏ５−７細胞をトランスフ
ェクトすることにより発現させた（　５ｅｌｄｅｎＳＲ
，Ｆ、等、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　（Ａｕ５ｕｂｅ
ｌ、　Ｆ、　Ｍ、等ｔｌｉｉ）、ｐｐ、　　９．　２．
　１−９．　２．　６　　（１９８７）　　）　　。
膜内および細胞質内ドメインを欠くが５個全ての免疫グ
ロブリン様ドメインを有する細胞外領域を含むＩ　ＣＡ
Ｍ−１の切断化官能性誘導体を調製した。３Ｑｂ９の変
異オリゴヌクレオチド（ＣＴＣＴＣＣＣＣＣＣＧＧ　Ｔ
ＴＣＴＡＧ　ＡＴＴ　ＧＴＣＡＴＣＡＴＣ〉を部位４５
２および４５３のアミノ酸チロシン（Ｙ）およびグルタ
ミン酸（Ｅ）を各々フェニルアラニン（Ｆ）および翻訳
終止コドン（ＴＡＧ）に転換するのに用いた。変異体は
それ独自のＸｂａｌ制限部位により単離し、Ｙ４ｓ”　
Ｅ／Ｆ、ＴＡＧと命名シた。
変異体たん白質を発現するためＣＯ８細胞を３種の変異
体サブクローン（＃２、＃７および＃８）でトランスフ
ェクトした。３種の変異体サブクローンによるトランス
フェクションから３日後、培養物上清および細胞溶解物
を抗Ｉ　ＣＡＭ−１モノクロ一ナル抗体ＲＲＩ／１を用
いた免疫沈殿化および５ＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した
。変異体サブクローン化２および＃８でトランスフェク
トした細胞の培養上清からはＩ　ＣＡＭ−１が沈殿化し
たが、これらの細胞の界面活性剤溶解物からは沈殿化し
なかった。培養上滑中に存在するＩ　ＣＡＭ−１の分子
量は膜型ＩＣＡＭ−１と比較しておよそ６　ｋｄ減少し
ており、これは変異体ＤＮＡからの予想サイズと一致し
ていた。したがってこのＩ　ＣＡＭ−１の官能性誘導体
は可溶性たん白質として排出される。一方天然のＩ　Ｃ
ＡＭ−１でトランスフェクトした細胞のコントロール培
養上清からはＩ　ＣＡＭ−１は免疫沈殿を生じなかった
。このことは膜型のＩ　ＣＡＭ−１はＣｏｓ細胞から放
出されないことを示している。さらにネガティブコント
ロールとしての偽のトランスフェクト化細胞由来の培養
上清または細胞溶解物からはＩ　ＣＡＭ−１は免疫沈殿
を生じなかった。
トランスフェクトした細胞から分泌された切断化Ｉ　Ｃ
ＡＭ−１をＩ　ＣＡＭ−１特異的抗体（Ｒ６−５−Ｄ６
）を用いた免疫アフィニティークロマドグラフイーで精
製し、細胞結合検定において官能性をテストした。界面
活性剤のオクチルグルコシドの存在下での精製後、天然
のＩ　ＣＡＭ−１または切断化分泌型Ｉ　ＣＡＭ−１を
含む調製物を最終濃度の０．２５％オクチルグルコシド
（この界面活性剤の限界ミセル濃度以下の濃度）となる
よう希釈した。これらのＩ　ＣＡＭ−１調製物をプラス
チック製の９６穴プレート（ナンク製）の表面に結合さ
せ固相に結合させたＩ　ＣＡＭ−１を生成した。未結合
物質を洗浄後その表面にＬＦＡ−１を有するＳＫＷ細胞
のおよそ７５−８０％および８３−８８％が各々Ｉ　Ｃ
ＡＭ−１の天然型および切断化型に特異的に結合した。
これらのデータは分泌された切断化可溶性Ｉ　ＣＡＭ−
１官能性誘導体は免疫学的反応性および天然のＩ　ＣＡ
Ｍ−１に特徴的なＩ　ＣＡＭ−１依存粘着を仲介する能
力を保持することを示している。
細胞質内ドメインのみを欠＜ＩＣＡＭ−１の官能性誘導
体を同様の方法で調製した。ア逅ノ酸４７６（Ｙ）をＴ
ＡＧ翻訳停止コドンに変えるのに２５ｂｐのオリゴヌク
レオチド（ＴＣＡＧＣＡＣＧＴＡＣＣＴＣＴＡＧ　ＡＡ
ＣＣＧＣＣＡ　）を用いた。この変異体をＹ””　／Ｔ
ＡＧと命名した。この変異体でトランスフェクトしたＣ
ｏｓ細胞の免疫沈殿分析および５ＤＳ−ＰＡＧＥは天然
のＩ　ＣＡＭ−１よりもおよそ３　ｋｄ小さい分子量の
膜結合型Ｉ　ＣＡＭ−１を検出した。変異体トランスフ
ェクト化Ｃｏｓ細胞の間接免疫螢光法はＬＰＳ活性化ヒ
ト内皮細胞上に発現される天然のＩ　ＣＡＭ−１と同じ
斑点染色パターンを示した。結局変異体ＤＮＡでトラン
スフェクトした細胞は天然のＩＣＡＭ−Ｉ　　ＤＮＡで
トランスフェクトしたＣｏｓ細胞と同じ様にプラスチッ
ク表面上の精製ＬＦＡ−ｌに特異的に結合した。
第２表 Ｉ　ＣＡＭ−１を発現する細胞またはＩＣＡＭ−１官能
性誘導体のＬＦＡ−１結合能 トランスフェクシ３ン　ＬＦＡ−１を結合するＩＣＡＭ
−１を発現する細胞の割合（Ｘ） 偽サンプル　　　　　　　ＯＯ 天然のＩＣＡＭ−１２００ Ｙ”’／ＴＡＧ　　　　　　　　２０　　　　　０例３ 生物学的に長寿命のアフィニティーおよびクリアランス
能を有する多重型Ｉ　ＣＡＭ−１１ＣＡＭ−１のドメイ
ン１およびドメイン２が免疫グロブリン重鎮のつがい領
域に結合するキメラ分子を構築した。好ましい構築物は
つがい領域の丁度Ｎ末端のところでＩ　ＣＡＭ−１ドメ
イン２と免疫グロブリン重鎮遺伝子のセグメントが結合
しており、つがい領域によりセグメント間に柔軟性を与
えている。したがってＩ　ＣＡＭ−１ドメイン１および
２は抗体のＦａｂフラグメントと入れ替る。１ｇ０群の
重鎮への結合および動物細胞の生産はキメラ分子を産出
する。ＩｇＡまたはＩｇＭ由来の重鎮を含む分子の生産
は２〜１２個のＩＣＡＭ−１分子を含む高マルチマー分
子を産生ずる。
ＩＣＡＭ重鎖キメラ分子を産生ずる動物細胞におけるＪ
鎖遺伝子の共発現はＩｇＡおよびＩｇＭマルチマーの適
正な集合を可能にし主に４〜６個のＩ　ＣＡＭ−１分子
を含むＩｇＡ分子を生じ、またＩｇＭの場合は１０個の
Ｉ　ＣＡＭ−１分子を含む分子を生じる。これらのキメ
ラ分子はいくつかの利点を有している。第１に１ｇ分子
は循還層系において永く持続するように設計され、この
ことにより生物学的寿命を改善し得る。
さらにこれら製造分子のマルチマー性は治療状況に応じ
ライノウィルス並びに細胞表面ＬＦＡ−ｌと高活性での
相互作用を可能にし、従って効果的投与量を与える必要
のある組換えたん白質の量を大きく減少させ得る。Ｉｇ
ＡおよびＩｇＭは粘膜部位および鼻の分泌物中に通常存
在する高度にグリコジル化された分子である。それらの
高度な親木性はそれらが粘膜から解離させる細菌および
ウィルスが細胞に付着するのを防ぎ、かつ内皮細胸膜バ
リヤーを閉鎖するのを防ぐのに役立つ。このようにそれ
らは治療効果を増進させる。ＩｇＭおよび特にＩｇＡは
粘膜環境下で安定であり、それらはＩ　ＣＡＭ−１構築
物の安定化を増加させる。
もしこのようなＩ　ＣＡＭ−１官能性誘導体を血液流の
中に投与すればそれは生物学的寿命も増加する。ＩｇＡ
は補体を固定化しないのでこのことが有害となる用途に
は理想的である。もしＩｇＧＨ鎖キメラが所望される場
合は補体との結合並びにＦｃレセプターとの相互作用に
関する領域を変異させることが可能である。
Ｉ　ＣＡＭ−１のドメイン１．１−２．１−３．１−４
または１−５がつがい領域及びＩｇＡのＣＨ２およびＣ
Ｈ３ドメインに結合するキメラ分子は鼻におけるウィル
スインヒビターとして用いるのに特に適している。３個
のＩｇＡＨ鎖配列が提示されている（参考として本発明
に引用しているＴｓｕｚｕｋｉｄａ等、Ｐｒｏｃ、　Ｎ
ａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　　（ＵＳＡ）７６３
１１０４−１１０８　（１９７９）に概説されている）
、Ｉ　ＣＡＭ−１ｃＤＮＡ　（上述の領域の３′側切断
物）のＩ　ｇＡＨ鎖へのライゲージタンには標準法を用
い得る。ＩｇＡＨ鎖は残基２２１〜２４１　（Ｔｓｕｚ
ｕｋｉｄａ等（上述〉の番号付けによる）間で結合され
、その結果としてこの領域から始まりＩｇＨのＣ末端ま
でのＩ　ｇＡＨの領域が該キメラのＣ末端領域に結合す
ることになる。　ＩＣＡＭ−１はＦＡＢフラグメントに
類似している。すなわちＩｇＡのＶＨおよびＣＨＩは該
構築物中に存在しないのでＬ鎖は必要ない。
ＩｇＡは粘膜環境に特殊化されており（Ｕｎｄｅｒｄｏ
ｗｎ等、Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｌｓｍｕｎｏｌ、　４　
：　３８９−４１７（１９８６））かつＩ　ＣＡＭ−１
キメラの安定性を増進し得る。さらにこれら分子のムコ
多糖への結合能は鼻孔内のライノウィルスの除去または
維持管理を増強する。
さらにＩｇＡＣ９１域を重合する。ＩｇＡモノマーは２
ＨおよびＬｌ［を含む、すなわちＩ　ＣＡＭ−１１ｇＡ
Ｈ鎖キメラモノマーはｒｇＡつがい領域中のジスルフィ
ド並びにＣＨ２およびＣＨ３の間の非共有的相互作用に
より安定化する。さらにこれらのモノマーユニットはモ
ノマーを互いにまたはＪ鎖に結合し得るＩｇＡアミノ酸
部位４７１にあるシスティン残基により二量体および二
量体に集合し得る。このような構築物はＪ鎖構築物との
コトランスフェクシッンなしに使用され付加的性質の賦
与および安定性の改善を可能にする。二量体および二量
体を得るのにＪ鎖は必要ない。
キメラはアフィニティーを増加し、それにより中和に必
要なＩ　ＣＡＭ−１濃度を１０−”Ｍ−１０伺寞Ｍに低
下させる、ライノウィルスとの多点相互作用をもつマル
チマーＩ　ＣＡＭ−１の利点を有する。
ＩｇＡのつがい領域はライノウィルスへの結合に適した
配向を可能にし、かつ〇−結合グリコシル化によりプロ
テアーゼ耐性である。ＩｇＡｌおよびＩ　ｇＡ２および
１ｇＡ２、Ａ２ｍ　（１）およびＡ２ｍ　（２）の対立
遺伝子バリアントはつがい領域およびＣＨドメインと配
列かつプロテアーゼに対する感受性が異なる（Ｆｌａｎ
ａｇａｎ％Ｊ、　Ｇ、等Ｃｅ１ｌ主立：６８１−６８８
　（１９８４）、本文献は参考として本明細書に引用し
ている）。
例４ Ｉ　ＣＡＭの構造およびＬＦＡ−１並びにライノウィル
ス結合部位：細胞粘着レセプターのウィルス模倣 Ｉ　ＣＡＭ−１および第２ＬＦＡ−１力ウンタ−レセプ
ターＩＣＡＭ−２は免疫グロブリン（Ｉｇ　）スーパー
ファミリーのサブファミリーを構成している（　５ｔａ
ｕｎｔｏｎ、、Ｄ、　Ｅ、等、蝕旦５２１２５−９３３
　（１９８Ｂ）該文献は参考として本明細書で引用して
いる）、ＩＣＡＭ−１はＩｇ様Ｃドメインを５個有し、
一方ＩＣＡＭ−２は２個有するため、Ｉ　ＣＡＭ−２は
Ｉ　ＣＡＭのア逅ノ末端ドメインと非常にホモロジーが
高い０種々の細胞型で発現したＩ　ＣＡＭ−１およびＩ
ＣＡＭ−２は免疫応答における誘導およびエフェクター
ａ能を含む種々の白血球粘着依存機能をサポートする。
Ｉ　ＣＡＭ−１発現はサイトカインにより非常に誘導可
能となり、従ってＬＦＡ−１／Ｉ　ＣＡＭ−１粘着系は
炎症の際の白血球移動および局在化を誘導し得る（　Ｒ
ｏｔｈｌｅｉｎＳＲ，等Ｊ、　ｌ５ｓｕｎｏ１．１３７
：１２７０−１２７４　　（１９８６）　　；Ｍａｒｌ
ｉｎＳ　Ｓ、０゜等助力、旦：８１３−８１９　（１９
Ｂ？）；Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏ、　Ｔ、に、等Ａｄｖ、　
Ｉｍｍｕｎｏｉ、　４６　：　１４９１８２　（１９８
９）　　；　Ｄｕｓｔｆ、　Ｍ、　Ｌ、等、Ｉｓｍｕｎ
ｏｌ、　Ｔｏｄａ　　９　：　２１３−２１５　　（１
９８８）、全ての文献は参考のため本ＦｉＡａｉ書に引
用した）。
ＬＦＡ　−１（ＣＤ　１１　ａ／ＣＤ　１８）は２つの
白血球インテグリンＭａｃ　−１（ＣＲ３；　ＣＤ　１
　ｌｂ／ＣＤ１８）およびｐ　１５０／９５　（ＣＤＩ
　１　ｃ／ＣＤ１Ｂ）に非常に密接に関係するインテグ
リン群の一員である（　Ｈｙｎｅｓ、　Ｒ，０，、Ｃｅ
旦Ｕ：５４９−５５４　（１９８７））、好中球粘着の
サポートに加えＭａｃ−１は１Ｃ３ｂ、レイシェマニア
（ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ　）　　ｇｐ　６３およびフィ
ブリノーゲンを含むいくつかのリガンドを結合すること
が示された（　ＲｕｏｓｌａｈｔｉＳＥ、等聾旦土土：
５１７−５１８　（１９８６）　　；　　ＨｙｎｅｓＳ
Ｒ，Ｏ，、Ｃｅ１ｌ　４８：５４９−５５４　（１９８
７））、これらのりガントへの結合はＲＧＤまたはＲＸ
ＸＤＳ配列のいずれかを含むペプチドと競合し得る（Ｍ
ａｒｌｉｒ＋、　ｓ、ｏ。
等、≦旦二：８１３−８１９　（１９８７）。
ＩＣＡＭはＲＧＤおよびＲｘＸＤＳ配列（７）イずれも
有していない。それゆえＩＣＡＭ−１およびＬＦＡ−１
の間の相互作用はＲＧＤレセプターと競合しないことと
一致している。このようにＩＣＡＭ−１のＬＦＡ−１と
の接触部位は他の多くのインテグリンーリガンド相互作
用と同じく明らかではない。
最近ＩＣＡＭ−ｌがライノウィルスの主要グループによ
りレセプターとして破壊されることが示された（　Ｇｒ
ｅｖｅ、％Ｊ１Ｍ、　　等、Ｃｅ１ｌ　　５６　：　８
３９−８４７　（１９８９）　　；５ｔａｕｎｔｏｎ、
　Ｄ、Ｅ、等、Ｃｅ１１５８　：８４９−８５３　　（
１９８９）　、Ｔｏｍａｓｓｉｎｉ　。
Ｊ、　Ｂ、等、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓ
ｃｉ、　　（Ｕ、Ｓ、Ａ、）８６：４９０７−４９１１
　　（，１９８９）、これら全文献は参考として本明細
書で引用している）。
ＲＮＡ含有たん白質カプシド化ピコルナウィルス群の一
員であるライブウィルスは一般的風邪の４０〜５０％を
引き起こす（Ｒｎｅｃｋｅｒｌ　ＳＲ，Ｒ。
ベン社版、ＮＹ　（１９８５）　ｐＩ）７０５−７３８
；５ｐｅｒｔｅｒ　ＳＳ、Ｊ、等Ａｎｔｉｍｉｃｒ、　
Ａｇｅｎｔｓ　Ｃｈｅｍｏ。
３２：４０９−４１９　（１９８８）、これら全ての文
献は参考として本明細書で引用している。〉。
１００種以上の免疫学的に交叉反応しないライノウィル
スが同定されており、その９０％はＩＣＡＭ−１と結合
する。
Ｘ線結晶学はライノウィルスの直径は３Ｑｎｍであり、
かつ各カプシドたん白質６０個からなる正二十面体構造
をもつため（Ｒｏｓｓｍａｎｎ、　Ｍ、　Ｇ、　　等Ｎ
ａｔｕｒｅ　　３１７：１４５−１５３　（１９８５）
）６０個の潜在的ＩＣＡＭ−１結合部位を有する。
アミノ酸置換変異体および抗ウイルス薬剤の結合により
誘導される構造変化に基づき、その５回回転軸の回りに
走るカプシド内のくぼみまたは峡谷の深い領域が同定さ
れた（ＲｏｓｓｍａｎｎＳＭ、　Ｇ、等Ｎａｔｕｒｅ３
１７　：１４５−１５３　（１９８５）　　；　Ｃｏ１
ｏｎｎｏ。
Ｒ，Ｊ、等、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、Ｓｃｉ
、　　（Ｌｌ、Ｓ、Ａ、）　８５：５４４９−５４５３
　（１９８８）、Ｒｏｓｓａ＋ａｎｎＳＭ。
Ｇ０等＾ｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　　５８
　：　５３３−５７３（１９８９）、これら全ての文献
は参考として本明細書に引用されている）、峡谷の底の
残基はｌ　ＣＡＭ−１結合能と関係している。
１個のＩ　ＣＡＭ−１のＩｇ様トドメイン峡谷の底のＨ
ＲＶ残基と会合するのにほぼ適正な大きさをもつことが
予想される（　５ｔａｕｎｔｏｎ、口、Ｅ０等、Ｃｅ１
ｌ　　５６　：　８４９−８５３　　（１９８９）；Ｌ
かし抗体Ｆａｂフラグメントは排除されると予想される
（　ＲｏｓｓｔａａｎｎＳＭ、　Ｇ、等Ｎａｔｕｒｅ　
３１７　：　１４５−１５３　（１９８５））、　Ｆａ
ｂフラグメントの抗体結合部位は峡谷の底と接触するに
は大きすぎるので、レセプターの特異性は峡谷の底にあ
る比較的に保存されている残基により維持されており一
方峡谷の底の残基の変異は新しい血清型および免疫的監
視からの逃避を可能にする；”峡谷仮説”（Ｒｏｓｓａ
ａｎｎ、　Ｍ、　Ｇ、等Ｎａｔｕｒｅ　３１７　：　１
４５−１５３　（１９８５）　；　Ｃｏ１ｏｎｎｏ、　
Ｒ，Ｊ、等Ｐｒｏｃ。
Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　（Ｕ、Ｓ、Ａ、）
　　８５　：　５４４９−５４５３　（１９８８）　；
　Ｒｏｓｓｍａｎｎ、Ｍ、　Ｇ、等Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、
　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　　５８　：　５３３−５７３（１
９８９）　　。
Ｉ　ＣＡＭ−１の全体的大きさおよび形状はそのＩｇ　
ドメインがどのように配列するかを理解する上で重要で
ある。したがって、１ｇスーパーファミリーの遠ＸＮＩ
Ａ結晶構造はＩｇ　ドメインと対合する免疫グロブリン
およびＨＬＡ抗原に対してのみ使用し得る。しかし単一
ドメインを含むＴｈｙ−１により明らかなように対合し
ないドメインも存在し得る。
ＬＦＡ−１への結合をブロックする３種の非交叉ブロン
キングＩＣＡＭ−ＩＭａｂ　（ＲＲＩ／１、Ｒ６，５、
およびＬＢ−２）はＨＲＶの結合もブロックするが一方
他のもの（ＣＬ２０３）はＬＦＡ−１およびＨＲＶいず
れの結合もブロックしない（Ｍａｋｇｏｂａ、　Ｍ、　
Ｈ，等、“Ｉｗｗｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ＨＬＡ
第２巻：免疫遺伝学および組織適合性、Ｂ、デュポン編
、ニューヨーク；スプリンガーーバーラグ版、ｐｐ５７
７−５８０　　（１９８９）；　　Ｍａｉｏ、Ｍ、。
Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　　１４３　：１８１　１８８
　　（１９８９）；５ｔａｕｎｔｏｎ、　　Ｄ、　　Ｅ
、　　等　Ｃｅ１ｌ　　　５６　　：　　８４９−８５
３（１９８３）、これら全ての文献は参考として本明細
書で引用している）、これらの知見はＬＦＡ−１および
ＨＲＶはＩ　ＣＡＭ−１上の重複領域に結合することを
示している。
Ｉ　ＣＡＭ−１の他に、細胞粘着分子ＣＤ４及び補体レ
セプターＣＲ２は各々ＨＩＶおよびＥＢＶウィルスによ
りウィルスレセプターとして破壊されることが分った（
　Ｍａｄｄｏｎ、　Ｐ、　Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　４７　：３
３３−３４８　（１９８６）　　；　　Ｆｉｎｇｅｒｏ
ｔｈ、　Ｊ、　Ｄ。
等Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　（
Ｕ、Ｓ、Ａ、）　　８１　：４５１０−４５１４　（１
９８４）これら文献は参考書として本明細書で引用して
いる）、さらにＩ　ＣＡＭ−１に似ているＩｇ　ドメイ
ン構造をもち、かつ細胞粘着で機能する分子はポリオウ
ィルスレセプターである（　Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ、　
ｃ、Ｌ、１等匡旦旦：８５５−８６５　（１９８９））
。細胞粘着およびウィルス粘着は原則的に非常によく似
ているのでこのことは一致以上のものである。それゆえ
ウィルス結合に適する細胞粘着分子の領域は細胞粘着レ
セプターへの結合に適した領域に似ているようである。
ＬＦＡ−１およびＨＲＶに対する結合部位は部位指定突
然変異誘発により測定した。ＩＣＡＭ−１上の領域は部
位指定突然変異誘発によりドメインを欠失させかつアミ
ノ酸置換を起こすことにより決定した。Ｉ　ＣＡＭ−１
上のＬＦＡ−１結合部位の特性はＩｇおよびインテグリ
ンスーパーファ電り−の間の相互作用に関する洞察を提
供する。
例５ Ｉ　ＣＡＭ−１変異体の生成 （オリゴヌクレオチド指定突然変異誘発）１．８ｋｂの
Ｓａｌ　Ｉ　−Ｋｐｎ　１フラグメント中のＩ　ＣＡＭ
−１ｃＤＮＡのコード領域を発現ベクターＣＤＭ８にサ
ブクローン化した（　５ｅｅｄ　ｓ　Ｄ−等Ｐｒｏｃ、
　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　ＳｃＬ、　（Ｕ、Ｓ、Ａ、
　）　　８４　：３３６５−３３６９　（１９８７））
、Ｋｕｎｋｅｌ、？。
の方法（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ
、　（Ｕ、Ｓ、Ａ、）　　８２　：４８８−４９２　（
１９８５））および５ｔａｕｎｔｏｎ　ｓＯｌ等の変法
（５ｔａｕｎｔｏｎｓ−Ｄ、Ｅ、等ユ旦亙１：９２５−
９３３　　（１９８８））に基づき、この構築物（ｐｃ
Ｄｌ、８）をオリゴヌクレオチド指定突然変異誘発に使
用する一氷膜ウラシル含有テンプレートの作成に使用し
た。
簡単に云うと大腸菌Ｘ５１２７株をｐｃＤｌ、８でトラ
ンスホームした。１つのコロニーを１３μｇ／１ａｌｌ
のアンピシリンおよび８μｇ／ｗｉｌｌのテトラサイク
リンを含むＬｕｒｉａ　Ｂｒｏｔｈ　（Ｌ　Ｂ　）培地
（デイフコ製）１−ｉ中で飽和付近まで増殖した。この
培養物１００μｌに感染多重度（Ｍｏｌ）１０でＲ４０
Ｂへルバーファージ（ストラテジーン社）を感染させ、
３７℃、１６時間の培養後にアンピシリンおよびテトラ
サイクリンを含むＬＢ培地１０ｓ＋ｊ！を加えた。１１
００００ｒｐ＋１分間の遠心およびその上清の０．２２
μｍ濾過後該フ１−ジ懸濁液を大腸菌ＢＷ３１３／Ｐ３
の感染に用い、その後その大腸菌をアンピシリンおよび
テトラサイクリンを補ったＬＢ寒天（デイフコ製）プレ
ートにブレーティングした。コロニーを釣り上げ、アン
ピシリンおよびテトラサイクリンを含むＬＢ培地１　ｍ
ｌ中飽和付近まで増殖させた後ＭＯＩＩＯでヘルパーフ
ァージを感染させた。その後培養物容積を２５０ａ＋１
とし、さらに細胞を１晩増殖させた。−氷膜ＤＮＡを標
準的ファージ抽出法で単離した。
変異オリゴヌクレオチドをリン酸化し、第２鎖合戒反応
においてｐｃＤｌ、８テンプレートと共に使用した（　
５ｔａｕｎｔｏｎ、　Ｄ、Ｅ、等Ｃｅ１ｌ　５２　：９
２５−９３３　（１９８８））。
（トランスフ上クシ３ン） ＣＯＳ細胞をｌ０Ｃ１１の組織培養プレートに接種し、
１６〜２４時間かけて５０％集密化となるようにした。
ＣＯ８細胞をＴＢＳで１回洗浄し、１０％Ｎｕ血清（コ
ラボラティブ社〉、５μｇ／ｍｌクロロキン、３μｇ変
異プラスミドおよび２００μｇ／ｍＡＤＥＡＥ−硫酸デ
キストランを含む１０ｍｆＲＰＭＩを用いて４時間イン
キュベートした。それから細胞を１０％ＤＭＳＯ／ＰＢ
Ｓで洗浄し、ついでＰＢＳで洗浄した後培養培地中１６
時間培養した。この培養培地を新鮮な培地と変換し、ト
ランスフェクションから４８時間後、ＣＯ３細胞をトリ
プシン／ＥＤＴＡ　（キブコ製）処理で懸濁し２個の１
０ｃｍプレートおよびＨＲＶ結合用の２４穴組織培養プ
レートに分けた。７２時間後１０ｃｍプレートから５　
ｍＭ　８ＤＴＡ／ＨＢＳＳを用いて細胞を収穫しＬＦＡ
−１コートプラスチツクへの粘着および免疫螢光測定用
に処理した。
（ＬＦＡ−１およびＨＲＶ結合） ＬＦＡ−１をＴＳ２／４ＬＦＡ−１ｍＡｂセファロース
を使用する免疫アフィニティクロマトグラフィーにより
５ＫＷ−３溶解物から精製し、２ｍＭＭｇｃｊ！ｚおよ
び１％オクチルグルコシドの存在下ｐＨ１１，５で溶出
した。ＬＦＡ−１（６ｃｍプレートに対し２００μｌ当
り１０μｇ）を２　ｍＭＭｇＣｊ！　２を含むＰＢＳ　
（！Ｊン酸緩衝液）中オクチルグルコシドを０６１％に
希釈し、４℃で１晩インキユベージ□ンすることにより
細菌用ペトリ皿に結合させた。そのプレートを１％ＢＳ
Ａ　（ウシ血清アルブミン〉でブ０７りし２ｍＭ　Ｍｇ
Ｃｆ２．０．２％ＢＳＡ、０．０２５％アジドおよび５
０μｇ／ｍＡゲンタマイシンを含むＰＢＳ中に保存した
。
５％ＦＣ３（ウシ胎児血清）　、２　ｍＭ　ＭｇＣｊ！
１　ｓＯ，０２５％アジドを含むＰＢＳ　（バッファ）
中の”Ｃｒ１ｌ識ＣＯＳ細胞をＬＦＡ−１コ一ト化マイ
クロプレート中５μｇ／１ｍｌのＲＲＩ／１およびＲ６
，５の有無条件下、２５℃で１時間インキュベートした
。
非粘着細胞をバッファを用い３回洗浄することにより除
去した。ＥＤＴＡを１０−Ｍとなるよう加えて粘着細胞
を溶出しγ線計数を行った。
ＨＲＶ結合実験にはＣＯＳ細胞を２４穴プレートに再接
種した。１日後集密化単層をｌ　１ＩｌｌのＲＰＭＩ　
１６４０／１０　ｍＭ　Ｍｇ（Ｊｔ　／２５　ｍＭヘヘ
ス（ｐＨ７，３）　　（ライノウィルス−１４バソフア
）を用いて２回洗浄した。
トランスフェクトしたＣＯ８細胞を先に報告されている
方法で（５ｔａｕｎｔｏｎ　ＳＤ、Ｅ、等Ｎａｔｕｒｅ
３３９：６１−６４　（１９８９））ＬＦＡ−１コート
化プラスチツクへの結合用に５ＩＣｒで標識した。
Ｉ　ＣＡＭ　−Ｉ　ＭＡｂ　　ＲＲＩ／　１　　（Ｒｏ
ｔｈｌｅｉｎ　　。
Ｒ９等、Ｊ、Ｉｍｍ＋ｕｎｏ１．１３７：１２７０　１
２７４（１９８６）　、Ｒ６，５（Ｒｏｔｈｌｅｉｎ　
ＳＲ，等、Ｊ。
Ｉｍｍｕｎｏｌ、　　１４１　　：　　１６６５−１６
６９　　（１９８８）、Ｌ　Ｂ−１（Ｃ１ａｒｋＳＥ、
Ａ、等、Ｈｕｍ、　Ｉｍ＋１ｕｎｏ１．１６：１００−
１１３　（１９８６））およびＣＬ２０３（Ｍａｉｏ、
Ｍ、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、　　１　４３　　：　　１　
８　１−１８８（１９８９）、これら全ての文献は参考
として本明細書で引用している）を用い免疫沈殿化およ
び免疫螢光測定を行った。１００μ［ＨＲＶ−バッファ
中１５−２５．ＯＯＯｃｐｍ　　（およそ１０７ＰＦＵ
）の（”Ｓ）標識ＨＲＶ　１４　（５ｈｅｒｒｙ、、Ｂ
、等、Ｊ。
Ｖｉｒｏｌ、旦＝２４６−２５７　（１９８６）　、本
文献は参考として本明細書で引用している〉を各ウェル
に添加した。結合は水平回転（１００ｒｐｍ）を伴う５
％ＣＯを雰囲気下、３５℃、１時間のインキュベーシッ
ンで起こった。未結合の（”５）ＨＲＶ１４を吸い取り
、１５０　ｖａｔ　（７）ＨＲＶハ。
ファーを用いてＣＯＳ細胞を緩やかに洗浄した後１％Ｓ
ＤＳを含むＰＢＳに“溶かしてシンチレーシッンカウン
ティングを行った。
ＩＣＡＭ−１変異体に対するＬＦＡ−１およびＨＲＶ−
１４の結合は偽トランスフェクト細胞への結合に対して
補正し、ＣＬ２０３＋ｎＡｂで染色されるＣＯ３細胞の
割合および野生株で得られた結合の割合に関して標準化
した。
ＲＲＩＳＲ６，５およびＬＢ−２ｍＡｂの結合は比線形
螢光強度（ＳＬＦＩ）を用いＣＬ２０３ｍＡｂの結合に
対して標準化した。
ＣＬ２０３％＝　（ｍＡｂ　　５ＬＦＩ）Ｘ１００／Ｃ
Ｌ２０３＋ｎＡｂ　５ＬＦＩ　　ＬＦＡ−１に結合した
野生型ＩＣＡＭ−１発現ＣＯ３細胞の割合は１１〜６３
％の間で変化した（平均値３３％）；偽トランスフェク
トＣＯ８細胞結合率は０〜１％の範囲であった。野生型
ＩＣＡＭ−ｌを発現するＣ○Ｓ細胞に結合した〔３ｓＳ
〕メチオニン８１識ＨＲＶ−１４の割合は６〜４３％の
間で変化した（平均値＝２１％）；偽トランスフェクト
ＣＯ３細胞結合率は０−４％の範囲であった。
ＩＣＡＭ−１コート化プラスチツクに対する（３ｓＳ）
ＨＲＶｌ　４の結合は先に示したようにＨＲＶバッファ
を修正した事以外は５ｔａｕｎｔｏｒ、　Ｄ、　Ｂ。
等（Ｃｅｌｌ　５６　：８４９−８５３　（１９８９）
　、本文献は参考として本明細書で引用している）の方
法で行った。インキュベーション条件は回転しながら５
％ＣＯ２雰囲気下３５℃、１時間であった。
ＲＲ１／１、Ｒ６，５、ＬＢ−２またはＣＬ２０３のよ
うな抗ＩＣＡＭ−１抗体を同定した。もしこれらの抗体
がＩＣＡＭ−１機能を阻害し得るならそれらはＩＣＡＭ
−１機能にも重要なＩＣＡＭ−１分子における特定な部
位へ結合し得なければならない。従って上述のＩＣＡＭ
−１欠失変異体を調製し、ついで該欠失物への抗ＩＣＡ
Ｍ−１抗体の結合度を測定することによりその欠失ドメ
インが機能に対して重要であるかどうかを決定し得る。
例６ （電子顕微鏡によるＩＣＡＭ−１の観察）Ｉ　ＣＡＭ−
１分子を電子顕微鏡を用いて観察した。電子顕微鏡でＩ
　ＣＡＭ−１分子を観察するため、５個全ての細胞外１
．様ドメインを有するＩ　ＣＡＭ−１の可溶性フラグメ
ント（第４図）をＩ　ＣＡＭ−１変異構築物ｐＣＤｓＤ
１−５でトランスフェクトしたＣＯ８細胞の培養培地か
ら精製した。
Ｉ　ＣＡＭ−１は以下の方法でＣＯＳ細胞から調製した
。５０％集密化ＣＯＳ細胞を１０ｃｍプレート当りおよ
そ０（偽）または４■ｇプラスξドを用いたＤＥＡＥ−
デキストラン法によりトランスフェクトした（Ｋｉｎｇ
ｓｔｏｎ、　Ｒ，Ｂ、　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃ
ｏｌｓｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏ　　＋グ
リーン出版社板、ｐｐ９゜０．１−９．９．６．　（１
９８７）　、本文献は参考として本明細書で引用してい
る〉。
分泌されたＩ　ＣＡＭ−１をＭａｒｌｉｎおよびＳｐｒ
ｉｎｇｅｒにより報告されている方法（Ｍａｒｌｉｎ、
　Ｓ、Ｄ、等。
困具立上：８１３−８１９　（１９８７））を僅かに修
正した方法を用いｐＣＤｓＤｌ−５でトランスフェクト
したＣＯ３細胞の上清から精製した。
トランスフェクション（２００ｎｇ／ｍＡ）のｓＩＣＡ
Ｍ−１）後４日から１２日の間に上滑を収穫し、０、２
２　ｐ　ｌの濾過を行った後０．５　ｔａ　ｌ　／ｓｉ
ｎの流速でＲＲ１／１−セファロース（５ｔａｌ、　５
ｍｇ／１ａｌｌ＞に通した。このカラムを各々ｐＨ１０
および１２．５の５０ｍＭ）リエタノールアミンー塩酸
、０．１５Ｍ　　ＮａＣｊ！で溶出し、各フラクション
を直ちに中和した。
可溶性ＩＣＡＭを０．２　Ｍ炭酸水素アンモニウム、３
０％グリセリンに対して透析し、回転シャドウィングに
より電子顕微鏡用に調製した（Ｆｏｗｌｅｒ＋Ｗ、Ｅ、
等Ｊ、　Ｍｏ１ｅｃ、　Ｂｉｏｌ、　１３４　：　２４
１−２４９（１９７９））、それとは別に、可溶性ＩＣ
ＡＭを０．２　Ｍ炭酸水素アンモニウム中の１５〜４０
％グリセリン勾配中を沈降させ、ついでこのｆｃＡＭ画
分を直接回転シャドウィングに用いた。その沈降係数は
別の勾配中の標準たん白質との比較から見積った（１１
．３Ｓのカタラーゼおよび４．６ｓのウシ血清アルブミ
ンから外挿した曲線使用）。
Ｉ　ＣＡＭ−１に対して見積もられた３、５８という値
は±０．５８の誤差範囲内で正確である。長さ測定は２
５０，０００倍の写真から金属シェルの厚さ見積値であ
るｌｎｍを両端から差引くことにより行った（Ｆｏｗｌ
ｅｒ、　Ｗ、Ｅ０等Ｊ、　Ｍｏ１ｅｃ、　Ｂｉｏｌ、　
１３４　：２４１−２４９　（１９７９））。
Ｉ　ＣＡＭ−１分子を０．２　Ｍ炭酸水素アンモニウム
中のグリセリン勾配中を沈降させることにより分析した
。ＩＣＡＭ分子に沈降係数３．５８と見積られる勾配の
上部付近にとどまった。この値は９２ＫＤの分子に対し
ｆ／ｆｍｉｎ値を２．０とし、このことは非常に長い分
子を示している（Ｂｒｉｃｋｓｏｎ＋Ｈ，Ｐ、　Ｂｉｏ
ｈｓ、　Ｊ、　３７　：　９６ａ　（１９８２）　）　
。
回転シャドウ化ＩＣＡＭ分子は直線または１ケ所で曲っ
ている細い棒のように見える。均一な湾曲または２ケ所
屈折分子も稀れにしか見られず、このことは１つのつが
い点をもつ堅い棒状構造を示唆している。屈折角はいく
ぶん変化しているが、明らかに屈折している分子のほと
んどはその角度が９０°に近い。
直線分子の長さは１６．６±０゜２４ｎｍ　（ａｂ、±
５−ｄａ＋ｎ＝２５）と測定された。屈折分子のロング
アームは１１．８±０．１２ｎｍであり、またショート
アームは６．９±０．１５ｎｍ　（ｎ＝２１）であった
。屈折分子の全長１８．７　ｎｍは直線分子よりいくぶ
ん長かった。直線分子群には屈折分子のショートアーム
が観察者に向って屈折しており全体像を短かく見せてい
るものが含まれている可能性がある。したがって屈折分
子は長さ測定により信頼できる集団を提供する。棒は２
〜３ｎＩ１１のオーダーの均一な直径を有するように見
える。
ＩＣＡＭ分子は４Ｘ２．５Ｘ２ｎｍの大きさを持つ５個
の反復するＩｇＧ様ドメインを有することが分った。Ｉ
　ＣＡＭ分子の全長１８．７ｎｍはＩｇＧ反復当り３．
７ｒｉｍを示し、かつそのドメインが棒の軸に対して小
さな角度をもつ長軸に沿って並んでいることを示してい
る。２または４個のＩｇＧ様ドメインが互いに対合して
いるというモデルには短かすぎる。したがって屈折は棒
の約５分の２の位置にあり、このことはそれかドメイン
２および３、またはドメイン３および４の間で起こりそ
れをショートアームとロングアームに二分していること
を示唆している。
例７ Ｉ　ＣＡＭ−１欠失変異体のＬＦＡ−１およびＨＲＶへ
の結合 Ｉ　ＣＡＭ−１は重要な膜たん白質であり、その細胞外
ドメインは５個のＩｇ＋ＩＣ−ドメインを含むと予想さ
れている。特定のＩＣＡＭ−１１ｇ様ドメインに接触す
るＬＦＡ−１およびＨＲＶの部位の位置を決めるため、
全ドメインをオリゴヌクレオチド指定突然変異誘発によ
り欠失させ、ＣＯＳ細胞における機能的発現をテストし
た（第４図）。
さらに粘着に対する潜在的寄与を測定するため細胞質内
ドメインを欠失させた。
ドメイン１〜５を含む分泌型Ｉ　ＣＡＭ−１を２個のカ
ルボキシル側最末端細胞外残基であるＰ４Ｓ２およびＥ
４５３を各々Ｆおよび翻訳停止コドンに変異させること
により生成した（ｐｃＤｓＤｌ　　５）。
Ｉ　ＣＡＭ−１の全細胞質内ドメインはカルボキシル側
末端膜内残基Ｙ４７６コドンを翻訳停止コドンに転換す
ることにより欠失させた（　Ｄ　ｃｙｔ、−）。
Ｏ３並びにＯ４および５は末端のＩ　ＣＡＭ−１配列に
及ぶ長い（４８ｂｐ）変異オリゴヌクレオチドを用いて
欠失させ、その結果Ｐ１Ｓ５およびＰ２Ｓ５（Ｏ３−）
並びにＰ２Ｓ５およびＲ４５１（Ｏ４−５−）のコドン
が結合する（第４図）。所望される欠失突然変異はＤＮ
Ａシーケンシングにより確認した。
トランスフエフシラン後細胞質内（Ｙ４７６／”または
Ｄｃｙｔ、”’　）　、第３（Ｏ３−）並びに第４およ
び第５　（Ｏ４−５−）　　ドメインの欠失を有するＩ
　ＣＡＭ−１変異体は同様に特徴的な広範囲レベルの発
現をＣＯ８細胞の５０〜６０％で起こした（第５図）、
野生型と比較したＣＯＳ細胞由来のＤｃｕｔ、−、Ｄ’
−並びにＯ４−５−ＩＣＡＭ−１の免疫沈殿および５Ｄ
Ｓ−ＰＡＧＥは各々３．２４、並びに２３ＫＤの減少を
示した。ＣＯ３細胞で発現したときおよそ９２ＫＤの野
生型Ｉ　ＣＡＭ−１は５５ＫＤのコアたん白質を有し、
従って８個各々のグルコシル化部位は平均４ＷＤのオリ
ゴ糖を有している。各ドメインに予想されるグリコシル
化に基づき（第４図）、観測された分子量の減少は各々
に期待される減少値３．１９並びに２７ＫＯとかなり一
致する。
これらの実験における変異Ｉ　ＣＡＭ−１の発現効率を
４種のＩＣＡＭ−Ｉ　　ＭＡｂ群を用いて測定した。こ
れら４種のＲＲＩ／１、Ｒ６，５、ＬＢ−２およびＣＬ
２０３はビオチン化ＭＡｂを用いて示されたように細胞
表面Ｉ　ＣＡＭ−１への結合を互いに阻害せず、このこ
とは先に示された結果（Ｍａｒｌｉｎ、　Ｓ、Ｄ、等Ｃ
ｅ１ｌ　　５上：　８１３−８１９、本文献は参考とし
て本明細書に引用した）を確認した。したがってこれら
は４種の異なるエピトープに結合する。トランスフェク
ション後ＩＣＡＭ欠失変異体はＣＯＳ細胞により特徴的
な広範囲なレベルで発現した（第５図）、全てのＭＡｂ
は野生型と等レベルでＤｃｙｔ変異体に結合した（第６
図）。ＣＬ２０３の結合はＤ３の除去により減少し、ま
たＤ４およびＤ５の除去で阻害された。他の３種のＭＡ
ｂの結合はＤ４５変異体については影響されず、またＤ
３変異体についてはＣＬ２０３程ではないが減少した。
したがってＲＲＩ／１、Ｒ６，５並びにＬＢ−２に対す
るエピトープはＤｌまたは２の中に存在し、またＣＬ２
０３のエピトープはＤ４または５に存在する。Ｄｃｙｔ
およびＤ４５変異体は効率的に発現するが一方Ｄ３変異
体は野生型の約半分のレベルで発現するようである。
３種全ての欠失変異体を発現するＣＯＳ細胞はプラスチ
ック結合ＬＦＡ−１と特異的に粘着する（第７図、黒棒
）、３種全ての欠失変異体は野生型レベルのＬＦＡ−１
に対する粘着を示す、Ｄ４および５の欠失はＬＦＡ−１
結合に関して有意な影響を示さなかったが一方Ｄ３の欠
失はその発現減少と同程度にＬＦＡ−１結合を減少した
。したがってＤｌおよび２はＬＦＡ−１に十分結合する
。
ドメイン１．２および３の中に予想されるβ−ターンに
おけるアミノ酸置換も生成させ、ＣＯ８細胞における発
現後その機能を試験した。Ｒ６，５エピトープはドメイ
ン２中の配列ＥＩＩＩＧＯＡに存在し、またドメイン１
中のＲ３９も含む一方ＲＲＩ／１並びにＬＢ−２の両方
ともドメイン中のＲ１３に依存する（第３表）、さらに
ＲＲＩ／１結合は配列Ｄ７１ＧＱＳにおける突然変異に
より減少する。Ｎ１０３およびＮ１６５にあるＮ−結合
グリコシル化部位を除去する突然変異はＲＲＩ／１、Ｒ
６，５およびＬＢ−２のＬＦＡ−Ｉ　　ＨＲＶ結合を減
少する。これらの突然変異はプロセシングをもたらすら
しくその結果Ｉ　ＣＡＭ−１ダイマーが生成する。
ドメイン２または３における他の突然変異はＬＦＡ−１
結着またはＨＲＶ結合を変化させなかった（第３表）。
さらに残基ｖ４およびＲ９０もＨＲＶ結合に関与してい
る。
従っ７ＬＦＡ−１およびＨＲＶ結合はＩ　ＣＡＭ−１の
ア逅ノ末端Ｉｇ様ドメインの機能であるようだ。第３図
はＩ　ＣＡＭアξノ末端ドメインの整列を示している。
Ｉ　ＣＡＭ−１ドメイン欠失変異体へのＨＲＶ１４の結
合はＤｌおよび２も十分にこの相互作用を起こすことを
示している（第７図、９棒）、ドメイン３および細胞質
内ドメイン欠失変異体も野生型レベルの（”５）ＨＲＶ
−１４結合を示す一方ドメイン４および５の欠失は野生
型のおよそ３０％にまでその結合を減少する（第７図）
、Ｄ３−変異体への結合の減少はＬＦＡ−１結合に対し
て先に述べた理由と同じ理由による。しかしＤ４および
５の欠失はＬＦＡ−１に対しては見られないＨＲＶ１４
への結合を一貫し減少させた。このようにＩＣＡＭ−１
上の結合部位がＤ４および５の欠失時予期される８ｎ−
短かくなることにより細胞グリコカリックス中に埋没す
るため、または別にその柔軟性が少なくなることからそ
れはＨＲＶに接近しにくくなる。
ＤｌおよびＤ２に対するＬＦＡ−１およびＩ（ＲＶ１４
の結合並びに先に報告したｍＡｂエピトープの位置のデ
ータは以前のｍＡｂブロッキングデータと相関関係を有
する。したがってＲＲ１／１、Ｒ６，５並びにＬＢ−２
と相互作用するＩ　ＣＡＭ−１部位はドメインｌおよび
２に存在しＬＦＡ−１およびＨＲＶ結合の両方をプロツ
タするが一方ＣＬ２０３と相互作用するＩ　ＣＡＭ−１
はドメイン４および５に存在する。ＣＬ２０３は細胞粘
着およびウィルス粘着のいずれもブロックしない（Ｍａ
ｉｏ、　Ｍ、等、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　　１４３
　：　１８１１８８　（１９８９）　；　５ｔａｕｎｔ
ｏｎ、　Ｄ、Ｅ、等、困旦５２＋９２５−９３３　　（
１９８８）これらの文献は参考として本明細書に引用し
ている）。
例８ ｒ　ＣＡＭ−１アミノ酸置換変異体 Ｉ　ＣＡＭ−１の仮説的Ｉｇ様ドメインの特性は上述の
欠失実験ばかりでなくアミノ酸置換の導入にも使用され
た。Ｉ　ＣＡＭ−１の３個のアミノ末４Ｉｇ＊ドメイン
は各々７ｂ鎖を有すると予測されている。これらの鎖は
２枚のシート内に整列していると考えられており、その
シートはドメイン間ジスルフィド結合により連結されて
“サンドインチ”を形成している。免疫グロブリン中の
ｂ鎖をつなぐループは抗原結合部位を形威し、またそれ
らは他の１ｇスーパーファミリー内の分子間コンタクト
に利用されていると仮定されている（Ｗｉｌｌｉａｍｓ
、　Ａ、Ｆ、等Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、
　６　：３８１−４０５　（１９８８）本文献は参考と
して本明細書に引用している）。従った戦術はまずドメ
イン１−３内のループ当り２〜４個のアミノ酸置換を導
入することであった。もし効果があればつぎに単一の置
換体を作る。最後に目的とするいくつかの領域内のｂ鎖
に置換を導入した。
Ｉ　ＣＡＭ−１の変異体は以下のようにして生成した。
Ｋｕｎｋｅｌの方法（Ｋｕｎｋｅｌ、　Ｔ、Ａ、　Ｐｒ
ｏｃ、　Ｎａｔｌ。
Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、（１１，ｓ、Ａ、）　８２　：　
４８８−４９２　（１９８５）。
Ｐｅｒｔｅｒｓｏｎ、　Ａ、および５ｅｅｄ　Ｂ、の修
正法（Ｎａｔｕｒｅ３２９　：　８４２−８４６　（１
９８７）、両文献は参考として本明細書に引用している
）に基づくオリゴヌクレオチド指定突然変異誘発をＩ　
ＣＡＭ−１の欠失およびアミノ酸置換の生成に使用した
。
突然変異は先に述べられている発現ベクターＣＤＭ８　
（ｐｃＤｌ、８）にサフ゛クローンしたＩＣＡＭ−Ｉｃ
ＤＮＡの一氷膜ウラシル含有テンプレートを用いて導入
した。独自の制限部位を与える変異Ｉ　ＣＡＭ−１オリ
ゴヌクレオチドを第２鎖合或反応の開始に用いた。大腸
菌へのトランスホーメーション後その独自の制限酵素部
位でスクリーニングすることにより単離した。一般に各
変異体の２個以上の単離物をＣＯ８細胞にトランスフエ
フシラン後結合実験で試験した。
この実験の結果を第３表にまとめた。第３表において突
然変異の記述は野生型配列の１文字コードのあとスラッ
シュおよび対応する変異配列の１文字コードを付記して
ものを使用した。その配列内の最初のアミノ酸の位置を
示しである。野生型残基はスラッシュとそれにつづく変
異体で使用されている残基の前に示しである。ＩＣＡＭ
−１変異体を発現するＣＯＳ細胞をＬＦＡ−１コート化
プラスチツクへの結合性及び３ＳＳ標識ＨＲＶ１４の結
合性についてテストした。ＬＦＡ−１並びにＨＲＶ１４
結合性は変異体Ｉ　ＣＡＭ−１を発現する細胞の割合お
よび野生型発現細胞の割合に対して標準化した。結合は
多くの実験（ｎ）に関する平均値及び標準偏差（ＳＥ）
として表わした。
ＬＦＡ−１、ＨＲＶ並びにｉ＋Ａｂ結合検定において２
倍以上の結合が再現的に見られ、したがって有意と考え
た（太文字と下線）。各変異体に対するＣＬ２０３の圧
線形螢光強度（ＳＬＦＩ）値は先に述べたように野生型
ＣＬ２０３ＳＬＦＩ値（％ＷＴ）に対して標準化した。
ＲＲＩ／１、Ｒ６，５並びにＬＢ−２の５ＬＦＩ値は先
に述べたように変異体のＣＬ２０３ＳＬＦＩ値（％ＣＬ
２０３）に対して標準化した。
＝　＝　ぶ　ご　＝　＝　冗　＝　＝　０　＝　ご１已
　ロ１　：　　：　　ｃ２　＋：　　：　　：　　ま　
０　＝　＝トーの一〇〇〇ＣＩ：ＩのＱ苛ロ ーｃｏΦωロ０ＣＩＪ■ロ　ω０ Ｍ　　　ＣＩＪ　　　Ｃｎ　　１７）　　　＋ＩＱ　　
　ｍ　　Ｏ’ｌ　　　Ｑ　　　ロ　　ＣＩＪＩφ　　Ｎ
　　の　　寸　　の　　Φ　　ト　　の　　ロ　　Ｑ　
　ω　　■突然変異 Ｎ１７５ＴＳ＾／ＱＴＬＧ 」ニジ償 ＬＦＡ−１結合 ６ ７ １０（４） ３（３） （続き） ＨＲＶ結合 Ｅ ４０　　８（３） １２９　　４６（２） ；（２） Ｌ２０３ ＸＷＴ　　　＋５Ｅ ７５　　１６（３） ８０　　　９（２） ８７　　　６（３） ０４ ＬＦ　　Ｉ （χｃＬ２０３） 四 Ａ１８９Ｔ／５ｔ Ｄ２０３ＴＱ／丁ＡＤ Ｄ２１３ＧＬ／ＩＩＧＶ Ｄ２２９Ｑｌｌ／ＨＬＥ Ｎ２４０ＤＳ／ＫＮＡ Ｅ２５４Ｄｌ！／ＫＥＫ Ｎ２６９ＱＳＱＩ／ＩＱＡＥＱ ３（２） ５３　（２） ５２　（３） ３７　（３） ２９　（３） ３３　（２） ９（２） ８（２） １３（２） ＩＨ２） ３２　（２） ２３　（２） ４５　（２） ３８　（２） ２Ｂ　（２） ５９　（２） ６３（２） １５（３） ２８８− ｍＡｂｃＬ２０３のエピトープはＤ４および０５に局在
化し、一方Ｄ１〜Ｄ３はアミノ酸置換を受けていること
から、ＣＬ２０３はトランスフェクトしたＣＯＳ細胞に
おけるＩＣＡＭ−１アミノ酸置換変異体の発現レベルを
測定するのに用いた。
ＬＦＡ−１およびＨＲＶに対するＩＣＡＭ−１変異体の
結合はｍＡｂｃＬ２０３結合および野生型ＩＣＡＭ−ｌ
を用いて得られる結合に関して標準化した。さらにｍＡ
ｂＲＲ１／１、Ｒ６，５並びにＬＢ−２は別のエピトー
プに結合するので、これらエピトープの２個以上のロス
は構造の破壊を示し、したがって対応するＬＦＡ−１お
よびＨＲＶ結合に関する効果を割り引いた。ＣＬ２０３
を用いた測定により発現の特異的減少を示す２つの変異
体Ｑ２７／ＬおよびＥ９０／にもそのより低い発現がこ
れらの変異が起こるＤｌの折りたたみ効率の減少を反映
していることから同様に割り引いた。
唯１つのＩＣＡＭ　　ｍＡｂ結合の減少を示すアミノ酸
置換変異体は、その対応する野生型残基が該ｍＡｂのエ
ピトープに寄与していることを示唆している（第３表）
。アミノ酸置換変異体に対するｍＡｂの結合の減少はＲ
Ｒ１／１に対するエピトープが残基Ｄ７１およびＣ７３
に関係しており、かつＤ２６、Ｒ３９およびＣ６２の部
分の配列に関係していることを示している。Ｒ６，５に
対するエピトープはＤ２におけるＦｉｌｌの部分の配列
の突然変異で完全にかつ特異的に破壊されている。
ＬＢ−２の結合はＤｌ中のＲ４９の部分の配列およびＤ
２中のＲ１６６における配列の突然変異により特異的な
影響を受ける。
ドメイン１および２は構造的に結合しているように思え
る。Ｄｌ中の５３個の変異のうちの１２個およびＤ２中
の同じ割合の１８個の変異のうちの４個はＲＲ１／１、
Ｒ６，５並びにＬＢ−２ｍＡｂのＬＦＡ−１およびＨＲ
Ｖへの結合を阻害している。これらのリガンドは別個の
部位（該ｍＡｂ　）または単に部分的に重複している領
域（ＬＦＡ−１およびＨＲＶ、以下参照〉に結合するの
で、両Ｄ１およびＤ２を通して広く分布している突然変
異が共通の効果を生む能力はＤｌの構造がＤ２の構造と
互いに依存し合っていることを示している。
対照的にＤ３中のどの突然変異もこれらのリガンドの結
合に影響せず、またこれらの突然変異のいずれもＤ４ま
たはＤ５に局在するＣＬ２０３の結合に影響しない。こ
のことはＤｉおよびＤ２間にはコンタクトがあるがＤｉ
およびＤ２は構造的にＤ３とは独立している、すなわち
Ｄ２とＤ３０間にはつがいが存在する可能性があること
を示している。最も崩壊的な変異体はＩｇモデル（以下
参照）でＤ２中の残基に非常に近接していると推測され
ている残基Ｒ１３およびＤｆｌｉＯを含んでいる。
Ｄ２中の残基の欠失（残基Ｐ９５−Ａ１８９）は細胞表
面発現の消失を起こし、さらにこのことはＩＣＡＭ−１
の適正な折りたたみがＤｌとＤ２の相互作用に依存して
いることを示している。
２つの突然変異における構造の崩壊は異常なジスルフィ
ド結合の形成によって誘導される。１２個のＤｌおよび
Ｄ２の変異体の免疫沈殿検定および非還元５ＤＳ−ＰＡ
ＧＥはそれらのうちの２つは（Ｎ１０３／におよびＡ１
５５Ｎ／ＳＶ）はＩ　ＣＡＭ−１のジスルフィド結合二
量体であることを明らかにした。残基Ｎ１０３およびＮ
１５６はＤ２のドメイン内ジスルフィド架橋を形成する
と考えられている０１０ＢおよびＣ１５９の近くに存在
する。
ＬＦＡ−１結合に最も強い影響を与える突然変異はＤｌ
に起こるものである。最も激しい突然変異はＬＦＡ−１
結合を完全に阻害するＥ３４／Ａおよびそれを１０分の
１に減少させるＣ７３−／Ｈである（第３表）、Ｃ７３
における別の置換、Ｃ７３／Ｔは２分の１の減少を示し
た。突然変異Ｄ２６ＱＰＲ／ＡＬＰＥおよびＧ４６ＮＮ
／Ａｓ　ＩはＬＦＡ−１結合を２〜３倍減少させた。第
２ドメインにおける突然変異Ｎ１１Ｂ／Ｑ、Ｎ１５６／
Ｅ、　Ｎ　１７５／Ａおよび５１７７／ＧはＬＦＡ−１
結合を特異的におよそ２分の１に減少した。
これら４つの変異体はＤ２における４個のＮ−結合グリ
コシル化部位のうちの３個に影響することが分った。Ｄ
ＩにはＮ−結合グリコシル化部位は存在しない（第４図
）。したがってＮ−結合炭水化物のＬＦＡ−１結合に関
する役割は小さく、かつあまり重要ではない。これらの
突然変異の効果はより間接的なものかもしれない、Ｄ２
のＮ−結合グリコシル化が持つ１つの間接的効果はつが
い部分の柔軟性の変化である。Ｄ３の突然変異はいずれ
もＬＦＡ−１結合には影響せず、このことはＤ３の欠失
に効果がないことと一致している。
多数の突然変異はＨＲＶ結合に関しＤｌがＤ２よりも重
要であることおよびＬＦＡ−１結合部位が部分的に重復
することを示している。７個の変異体はＨＲＶ１４結合
が減少していたがＬＦＡ−１結合は変わらなかった。最
も大きい効果を示した２つの変異体はＤＩのアミノ酸置
換に関するものであった。実際にＱ５８／ＨはＨＲＶ１
４結合を示さず、またＱＩＴ／ＫＡは１０分の１に減少
した。Ｄｌにおける他の４つの突然変異はＨＲＶ結合に
関し特異的な２倍の効果を示した（Ｋ３９ＫＥ／ＥＲＱ
、Ｒ４９ＫＶ／ＥＫＬ、Ｄ７１／ＮおよびＫＶ　７Ｔ／
ＥＳ）、Ｄ２における突然変異Ｒ１５５ＰＱ／ＥＰＡは
ＨＲＶ１４結合を４分の１に減少させた。Ｄ３の突然変
異はＨＲＶ結合に影響しなかった。
先に述べたＦＡ−１結合に影響する４個のＤ１突然変異
のうちの３個は同様にＨＲＶ結合にも影響を与えた。変
異体Ｄ２６ＱＰＫ／ＡＬＰＥおよびＧ４６ＮＮ／ＡＳ　
ＩはＨＲＶ１４結合に１０倍かつＬＦＡ−１結合に２〜
３倍の影響を与えた。
ＬＦＡ−１結合を完全に失ったＥ３４／ＡはＨＲＶ結合
が２分の１に減少している。ＬＦＡ−１結合が減少した
Ｄｌ中の４個の突然変異はＨＲＶ結合にほとんど、ある
いは全く影響しなかった。
従ってＬＦＡ−１またはＨＲＶ結合に重大な（１０倍以
上の）影響をもつと同定された残基は機能の分離を示し
ている。ＬＦＡ−１結合を著しく減少する突然変異Ｅ３
４／ＡおよびＱ７３／ＨはＨＲＶ結合に関し、弱いかま
たは検出不可能な効果しか有していない。逆にＨＲＶ結
合に顕著な影響を有する上述の突然変異はＬＦＡ−１結
合には影響しない、しかし結合部位の重復はＬＦＡ−１
およびＨＲＶ両結合に影響する２個の変異体により示さ
れている。さらに結合部位の近接性がＬＦＡ−１または
ＨＲＶのいずれかに影響する配列部位に近い突然変異に
より示されている（以下に議論する）。
Ｄｌ中のＬＦＡ−１およびＨＲＶ１４結合に重要な１０
個の配列／残基がＤｌ中の１つの配列および潜在的な３
個のＮ−結合グリコシル化と対比して決定された。結合
に重要な残基または配列はＤｌ中には同定されたがＤｌ
中には同定されなかった。さらにＤ３中のどの置換もＬ
ＦＡ−１あるいはＨＲＶ１４の結合を変化させず、この
ことはＤ３欠失の結果を再確認している。したがってＬ
ＦＡ−１およびＨＲＶ１４とのコンタクトに重要な部位
はＤｌ中に存在する。
ＬＦＡ−１並びにＨＲＶ１４との相互作用を二価カチオ
ン要求性に関して比較した。細胞表面上またはプラスチ
ックに結合したＩ　ＣＡＭ−１の細胞表面または精製Ｌ
ＦＡ−ｌに対する結合はＨｇ　ｇ　＋依存性があること
が以前に報告されている（Ｍａｒｌｉｒｌ。
Ｓ、Ｄ、等、弘旦工よ：８１１−８１９　（１９８７）
；５ｔａｕｎｔｏｎ＋　Ｄ、Ｅ、等、　Ｎａｔｕｒｃｅ
　３３９　：　６１−６４（１９８９））。ＬＦＡ−１
を発現するＴリンパ球系列５ＫＷ３およびＨＲＶ（７）
精製Ｉ　ＣＡＭ−１への結合をプラスチック基質に関し
て比較した。
プラスチックに結合した精製Ｉ　ＣＡＭ−１を使用し、
ＬＦＡ−１発現子細胞系列はＭｇ！＋存在下でのみＩ　
ＣＡＭ−１を結合することが分った（第８図）。対照的
にＨＲＶ１４のＩＣＡＭへの結合は１０ｍＭ　Ｍｇ”ま
たは５ｍＭＥＤＡＴ存在下で有意な差異を示さなかった
。このことは基質上の広範囲な濃度のＩ　ＣＡＭ−１に
ついて確認された。
したかっ７ＬＦＡ−１？　Ｉ　ＣＡＭ　　１並びニＨＲ
Ｖ：Ｉ　ＣＡＭ−１の相互作用は二価カチオン要求性が
明らかに異なる。
上述の実験はＩ　ＣＡＭ−１の細胞外領域が２０ｎｍの
つがい棒として存在することを示している。
このことは予想されている５個のＩｇ様ドメインが長く
伸びていて対を作らず、かつ並列ではなくむしろ直列に
整列していることを示す。したがってＩ　ＣＡＭ−１は
全体の構造がＭＣＡＭに似ている（Ｂｅｃｋｅｒｓ、　
Ａ、等＋　Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ、土工＝６０５−６０
９　（１９７４））。細胞外Ｉ　ＣＡＭ−１の全長は１
８．７　ｎｍであり、それゆえＩｇ　ドメイン当り３．
７　ｎｍである。５個のＩｇＧ様ドメインを含むＮＧＡ
Ｍのロングアームは１７．６−１８．７ｎｍの長さを有
しており、これはＩＣＡＭ分子の全長と本質的に等しい
（Ｂｅｃｋｅｒｓ、　Ａ、等、　Ｉｍｍｕｎｏｌｃｈｅ
ｍ。
１１　：　６０５−６０９　（１９７４））。
ＩＣＡＭおよびＮＣＡＭの構造上の別の著しい類似性に
両分子共典型的には９０度であるが柔軟性を示す変化を
伴う屈折を有することがある。
Ｉ　ＣＡＭの場合この屈折はおそらく２つのドメインの
間で起こり、その結果３個のドメインからなるロングア
ームと２個のドメインからなるショートアームを構成し
ている。ＤｌおよびＤ２の構造が互いに依存し合うとい
う知見はそのつがいがＤ２およびＤ３の間に存在するこ
とを示している。
Ｄ２−０３境界の配列はＩ　ＣＡＭ−１中量もプロリン
に冨んだ領域を示している（１０残基中４個のプロリン
）。このことはプロリンリッチを特徴とするＩｇつがい
配列と一致している。事実この領域の４個全てのプロリ
ンはマウス１ｇＧ３のつがい領域中の４個のプロリンと
同様の間隔を有している。
ＮＣＡＭの場合５個のＩｇ様トドメイン中に屈折はない
（これらはＩＣＡＭの全長に等しい見かけ上堅固なロン
グアームを形成している〉　；むしろその屈折はＩｇ様
トドメイン配列直後にある。
ＮＧＡＭのショートアームは２個のフィブロネクチン様
ドメイン（膜内セグメントおよび細胞質内ドメイン）を
含む（Ｂｅｃｋｅｒｓ、　Ａ、等＋　Ｉｍｍｕｎｏｃｈ
ｅｍ。
１１：６０５−６０９　（１９７４））。
ＩｇＧ１ドメインをもたずかつＩＣＡＭまたはＮＣＡＭ
と無関係な細胞粘着分子ＬＣＡＭも９０度屈折を有する
ことは注目される（Ｂｅｃｋｅｒ、　Ｊ、Ｗ。
等＋　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、
　（Ｕ、Ｓ、Ａ、）　８６　；１０８８−１０９２　（
１９８９））。
したがってこの細胞粘着分子に共通する性質は先端より
はむしろその分子の長いセグメントがそのレセプターと
の境界に面しかつこれを形成させるのに機能的に重要で
あるようである。それは末端の柔軟なセグメント上にあ
る結合部位を種々の角度に配向し、かつＩ　ＣＡＭ−１
分子を有する細胞の膜から種々の距離にあるレセプター
に結合させ得る。さらにつがいにより与えられるセグメ
ントの柔軟性は膜のつなぎ鎖に制限されている細胞表面
上の溶媒容積における結合部位の拡散速度を増加し、そ
れにより粘着レセプターまたはウィルスへの結合速度を
増加し、かつそれらの相互作用の効率を増加する。
このようにＩ　ＣＡＭ−１の棒状非対合ドメイン組織は
結合部位を細胞表面上の限界距離に持ち上げることによ
り粘着を容易にする。ライノウィルス結合はＬＦＡ−１
結合よりもＩＣＡＭ−１を７．４ｎ−短縮しその柔軟性
に影響を与えると予想されているドメイン４および５の
欠失により感受性が高い、このことはライノウィルスと
ＬＦＡ−１の２つの差異に関係している。第１にＨＶＲ
上の結合部位はビリョンの５回回転軸のまわりに堀を形
成する峡谷内の深さ２．５　ｎｍの裂は目に埋没してい
ると提唱されており（Ｒｏｓｓｍａｎｎ、　Ｍ、Ｇ、等
、　Ｎａｔｕｒｅ３１７　：　１４５−１５３　　（１
９８５））　　、一方インテグリンの電子顕微鏡観察は
細胞表面上の１８ｎｍ長の茎状部に支持されている１１
０Ｘ８ｎ球状結合ドメインを示している（Ｃａｒｒｅｌ
ｌ、　Ｎ、＾０等、ＬＢｉｏ１．　Ｃｈｅｗ、　　２６
０　：　１７４３−１７４９（１９８５）；Ｎｅｒａ＋
ｕｔ、　Ｍ、Ｖ、　ＥＭＢＯＪ、　　７　：　４０９３
−４０９９（１９８Ｂ））。Ｉ　ＣＡＭ−１がその短縮
により埋没している細胞性グリコカリンクス（Ｗｉｌｌ
ｉａｍｓ。
Ａ、Ｆ、等、　Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、
６　：　３８１　４０５（１９８８）はＬＦＡ−１より
も大きいライノウィルスを受けつけない、第２にライノ
ウィルスへの多数のＩ　ＣＡＭ−１分子の結合（Ｃｏｌ
ｏｎｎｏ、　Ｒ，Ｊ。
等、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、
（Ｕ、Ｓ、Ａ、）　８５　：　５４４９−５４５３　（
１９８Ｂ））はＩ　ＣＡＭ−１分子の互いの近接性を要
求し、またこの充填は短縮化または柔軟性の消失により
妨害される。またＬＦＡ−１のＩ　ＣＡＭ−１との相互
作用は多価相互作用を必要とするが、ＬＦＡ−１分子は
互いによく分離しており、かつ各１個のアルファおよび
ベータサブユニントを含むことに基づき各々１個の結合
部位を有すると考えられている。
Ｉ　ＣＡＭ−１の非対合ドメインの性質およびＤｌへの
結合に関する配列／残基の位置は提唱されているＨＲＶ
の峡谷結合部位の深い裂は目におけるＩ　ＣＡＭ−１の
Ｄ１結合と矛盾しない。ＩＣＡ？１−１およびＨＲＶの
境界は少なくとも２個のモデルで想像し得る。推定され
る二次構造に基づき、Ｉ　ＣＡＭ−１の配列に１ｇホー
ルドモデルを適用した（第９図）。ＨＲＶとのコンタク
トに関係する６個のＤ１配列中の４個、ＱＩＴＳＤ２６
ＱＰ。
Ｇ４ＢＮＮおよびＲ４９ＫＶはこのモデルではＤｌの末
端半分に存在する。深い裂は目の大きさ（巾３〜１．２
１ｍ、深さ２．５ｎａ＋）はＩｇ様ドメインの半分より
もわずかに大きいものが挿入し得るものである。ＩＣＡ
Ｍ−ＩＤＩの末端半分はその裂は目内の残基に結合し得
、その結果Ｄｌの長軸はピリオン表面のその周辺に対し
ほぼ垂直となる。
各々の深い裂は目の境界間の距離（およそ４　ｎａｐ）
はＩ　ＣＡＭ−１がピリオンの５回回転軸の回りの５個
全ての裂は目を占有するのに十分な大きさである。ＨＲ
Ｖのコンタクトに関する他の配列、Ｋ３９ＫＥ、、Ｇ５
８およびＲ１６６ＰＱはその峡谷の縁にあるＨＲＶ残基
と相互作用し得る。別にＤｌおよびＤ２中のこれらの残
基はＨＲＶ残基とは結合を形成しないが結合構造に重要
なドメイン内またはドメイン間結合に寄与している。Ｉ
ＣＡＭ−１：ＨＲＶ相互作用の第２のモデルはＤｌの長
軸が周囲のピリオン表面と正確な角度を形成するよう裂
は目内の残基とＩ　ＣＡＭ−１のＤｌがコンタクトする
ものである。したがってＤｌは峡谷とより平行かつ水平
に配向することになる。このことは５回回転軸の回りの
いくつかの部位を立体傷害によりブロックすることにな
る。
３個の互いにブロックしないＩＣＡＭ−１ｍＡｂがＬＦ
Ａ−１およびライノウィルス−１４の結合をブロックす
ることから先にＩＣＡＭ−１上のＬＦＡ−１およびラノ
イウイルスー１４のコンタクト部位は非常に近接してい
ることが示された（Ｓｔａｕｒ＋ｔｏｎ、　Ｄ、Ｅ、等
、　Ｃｅ１ｌ　５６　：　８４９−８５３（１９８９）
　　）　　。
本研究ではライノウィルス−１４の結合部位を示した。
我々はＩｇの構造が非対合ドメインを有するＩｇ群で異
なるけれども１つのＩｇ　ドメイン構造を仮定してＩ　
ＣＡＭ−１および２におけるこれらの配列の位置をモデ
ル化した（第９図）（Ｗｉｌｌｉａ＊ｓ、　Ａ、Ｆ、等
ｒ　Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　　６　：
３８１−４０５　（１９８６））。変異体Ｇ４６ＮＮ／
ＡＳＩ、Ｄ２６ＱＰＫ／ＡＬＰＥおよびＲ３４／Ａの特
徴はＬＦＡ−１およびライノウィルス−１４結合部位に
おいてＩ　ＣＡＭ−１配列を共通して使用していること
を明らかにした。Ｉｇ　ドメインモデルにおけるコンタ
クト配列の推定上の位置はＬＦＡ−１およびライノウィ
ルス−１４結合部位と非常に近接しているか又は重復し
ていることと一致している。Ｇ７３やＧ４６などのＬＦ
Ａ−１結合に関する残基はライノウィルス−１４結合に
関する残基、Ｇ７３およびＲ４９と非常に近い、したが
ってライノウィルス−１４はＬＦＡ−■結合部位と重復
するＩＣＡＭ−１上の部位と結合するよう進化してきた
と思われる。しかしこれら２つの結合部位は明らかに各
々ＬＦＡ−ｌおよびライノウィルス結合を激しく、かつ
選択的に阻害するＲ３４およびＧ５８における突然変異
で区別される。ＬＦＡ−１コンタクトに関する４個のＤ
１配列中の３個はこのモデルにおいてＤｌの腹側半分に
局在する。しかし最も激しい効果を有する部位はその隣
りの半分に存在する。ドメイン１におけるライノウィル
スおよび２ＦＡ結合部位の重復は先に概説したこのドメ
インの粘着相互作用部位としての有利性の結果のように
思える。別にＩＣＡＭ−１は抗原提示細胞におけるトリ
ガー機能を有するレセプターである。このシナリオでは
、ドメイン１への結合はＩ　ＣＡＭ−１を介して例えば
ウィルスが伝染するのに役立つ鼻の分泌を活性化するこ
とによりライノウィルスに有利な応答をトリガーする。
これは進化的模倣の一例であろう。
Ｉ　ＣＡＭ−１上のコンタクト部位は他の多くのインテ
グリンリガンドとその配列や構造が異なる。
細胞外マトリクスたん白質と結合する多くのインテグリ
ンはそれらのリガンド内のＲＧＤまたはＲＧＤ様配列と
結合する（Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ、　Ｒ８等。
Ｃｅ１ｌ　　４４　：５１７−５１８　（１９８６）；
Ｈｙｎｅｓ。
Ｒ１０１等２合旦　−±８　：　５４９−５５４　　（
１９８７））。
ヒトのＩＣＡＭ−１はＲＧＤ配列を持たないがいくつか
のＲＧＤ様配列を含み（Ｓｉｍｍｏｎｓ、　Ｄ、等。
Ｎａｒｕｒｅ　　３３１　：６２４−６２７　　（１９
８８）；５ｔａｕｎｔｏｎ、　　Ｄ、Ｂ、等、に旦　５
２：９２５−９３３（１９８８）、マウスＩＣＡＭ−１
はＲＧＤ配列を含む。しかし、これらの部位はいずれも
突然変異誘発実験によりＩＣＡＭ−１へのＬＦＡ−１の
結合に重要であると決定された残基とは対応しない。Ｒ
ＧＤの連続的配列の代りにＩＣＡＭ−１中の不連続な一
群の配列が認識されているようである。このことは３個
の不連続な相補性決定領域中の残基が認識特異性を提供
するたん白質抗原へのＩｇ（７）結合と同様である（Ａ
ｌｚａｒｉ、　Ｐ、Ｍ、環上。
Ｒｅｖ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、６　：５５５−５８０　（１
９８８））。
ＩＣＡＭ−１はＲＧＤ依存様式でｉＣ３ｂおよびフィブ
リノーゲンのようなりガントにも結合する別の白血球イ
ンテグリンＭＡＣ−１に結合し得る。しかしＭＡＣ−１
に結合するＩ　ＣＡＭ−１の部位はＬＦＡ−１と結合す
る部位とは異なるようである。したがってＭＡＣ−１は
別の結合特異性とより一致するＩ　ＣＡＭ−１上のＲＧ
Ｄ様配列と結合する。
ＬＦＡ−１結合に重要であると決定されたＩＣＡＭ残基
は他のＩ　ＣＡＭにも保存されている。ヒトＩ　ＣＡＭ
−１はマウスＩ　ＣＡＭ−１と５０％、またヒトＩＣＡ
Ｍ−２と３５％の一致を示す（Ｓｔａｕｎｔｏｎ。
Ｄ、Ｅ、等、　Ｎａｔｕｒｅ　３３９：６１−６４　（
１９８９））。
ＬＦＡ−１結合に最も重要な残基Ｒ３４およびＧ７３は
マウスＩ　ＣＡＭ＝　１およびヒトＩ　ＣＡＭ−２の両
方に保存されている。このことはヒトＬＦＡ−１に対す
るマウスＩ　ＣＡＭ−１およびヒ１−ＩＣＡＭ−２の結
合能と一致している（Ｓｔａｕｎｔｏｎ＋Ｄ、Ｂ、等、
Ｎａｔｕｒｅ３３９：６１　６４（１９８９））。
ＬＦＡ−１結合に影響を与えるＮ１５６にある１個のＤ
２　　Ｎ−結合グリコシル化部位もＩ　ＣＡＭ−２に保
存されている。ライノウィルス−１４結合に重要ないく
つかの残基Ｇ５８、Ｇ４６、Ｄ７１およびＲ１６６はマ
ウスＩＣＡＭ−１またはヒトＩＣＡＭ−２に保存されて
おらず、このことはマウス細胞およびＩＣＡＭ−２がラ
イノウィルス−１４を見かけ上結合し得ないことと一致
している（Ｃｏｌｏｎｎｏ、　Ｒ８Ｊ、　　等、　Ｊ、
　Ｖｉｒｏｌ、５ユニ７−１２（１９８６））。
ＬＦＡ−１およびＨＲＶとのコンタクトに重要な配列も
ＲＲ１／１およびＬＢ−２のｍＡｂ　ｘビトーブのブロ
ックと対応しており、一方Ｒ６，５エピトープは立体障
害により結合をブロックするようには思われない。
ＩＣＡＭ−１のＬＦＡ−１の結合は二価カチオン依存性
がある。全てのインテグリンアルファサブユニットは３
個または４個の直列に反復する“ＥＦハンド様二価カチ
オン結合部位を有する（Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏ、　Ｔ、に
、　　等、＾ｄｖ、Ｉｍｍｕｎｏ１．４６　：１４９−
１８２　　（１９８９））。しかしこれらは二価カチオ
ンと配向する１個の保存的グルタミン酸を欠く点で従来
のＦＦハンド様式と異なる（Ｃｏｒｂｉ、　Ａ、Ｌ、等
ＢＭＢＯＪ、　　６：４０２３−４０２８（１９８７）
）。インテグリンから失なわれたこの残基はリガンド中
の残基と置き換り、その結果金属がレセプターおよびリ
ガンドの両方に配向するという仮説が立てられた（Ｃｏ
ｒｂｉ、　Ａ、Ｌ、　等。
ＢＭＢＯＪ、　　６：４０２３−４０２８　（１９８７
））。
ＬＦＡ−１の結合に最も重要なＩＣＡＭ−１の残基、グ
ルタミン酸３４（Ｒ３４）は仮定された二価カチオンと
の配向を提供する。同様のメカニジスムが二価カチオン
非依存性のライノウィルス−１４のＩＣＡＭ−１への結
合に存在するとは思われない。ライノウィルス結合に対
する二価カチオン要求性に関する以前になされた示唆（
Ｒｕｅｃｋｅｒｔ。
Ｒ４Ｒ９Ｆｉｅｌｄ　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、　Ｆｉｅｌｄ
ｓ、　Ｂ、Ｎ１等編、レーベンプレス版ＮＹ、（１９８
５）ｐｐ７０５−７３８）は別のレセプターに結合する
マイナーな血清型群に関する研究に基づいているようで
ある。
結合とは反対に安定性はライノウィルスの５回回転軸に
存在するアスパラギン１４１と配向するカチオンに影響
を受ける（Ｒｏｓｓｍａｎｎ、　Ｍ、Ｇ、等。
Ｎａｔｕｒｅ　　３１７：１４５−１５３　　（１９８
５））。
ＩＣＡＭ−１およびＣＤ４は細胞およびウィルス粘着に
おいてこれらの機能に顕著な平行性を示すＩｇスス−−
ファミリーの一貫である。ＣＤ４はＭ　ＨＣｎ型分子を
結合するＴ細胞上の粘着レセプターであり、かつＨＩＶ
ウィルスのレセプターとしても使用される。ＣＤ４は４
個の細胞外ドメインを有する。ＣＤ４に関する最近の研
究によりアミノ末端側のＩｇ様ドメインにおける突然変
異が第ニドメイン中の突然変異のより小さい効果を伴な
いＭＨＣｎ型およびＨＩＶの結合に最も強い影響を有す
ることが分った。ＭＨＣｎ型およびＨＩＶに対する結合
部位は重複しているが別個のものである（Ｐｅｔｅｒｓ
ｏｎ、　Ａ、等、Ｃｅ１ｌ　　５４：６５−７２　　（
１９８８）　　；Ｃ１ａｙｔｏｎ、　　Ｌ、に、　　等
、　　Ｎａｔｕｒｅ３３９　：　５４８−５５１　　（
１９８９）　　；Ｌａｍａｒｒｅ。
（１９８８）、これら全ての文献は参考として本明細書
で引用している）。いくつかのＣＤ４ｍＡｂエピトープ
はＤｌおよび２由来の残基を含むように思われ、このこ
とはこれらのドメインの近接する物理的会合を示してい
る（Ｌａｎｄａｎ、　Ｎ、Ｒ，等。
Ｎａｔｕｒｅ　３３４：１５９−１６７　（１９８８）
）。
これらすべての点においてＩ　ＣＡＭ−１およびＣＤ４
の細胞粘着およびウィルス結合部位に関する知見は同じ
である。
少なくとも２つの異なるモデルがライノウィルスの峡谷
における推定上のレセプタ一部位に対するＩ　ＣＡＭ−
１ドメインの結合を想定し得る。上述のようにライノウ
ィルス−１４のコンタクトに関するＤ１配列の大部分く
９個のうちの６個）はＤｌの末端半分に存在する（第９
図）。ライノウィルスの峡谷にあるレセプター結合部位
は上部巾３ｎｍ、塵中１．２　ｎｍおよび深さ２．５　
ｎｍの深い裂は目内にあると考えられている（Ｒｏｓｓ
ｍａｎｎ＋　Ｍ、Ｇ、等。
Ｎａｔｕｒｅ　３１７　：１４５−１５３　（１９８５
）　　１Ｃｏｌｏｎｎｏ、　Ｒ，Ｊ、等、Ｐｒｏｃ、　
Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。
（Ｕ、Ｓ、Ａ、）８５　：　５４４９−５４５３　（１
９８８）；Ｒｏｓｓ＋ｎａｎｎ、　Ｍ、Ｇ、等、　Ａｎ
ｎ、　　Ｒｅｖ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　　５８　：５３３
−５７３　（１９８９））。この裂は目の大きさは挿入
されうるＩｇ様ドメインの半分よりわずかに大きい（４
ｎ＋ｎ長および２−２．５　ｎｍ巾）。したがってＩＣ
ＡＭ−ＩＤＩの末端半分内にあるコンタクト配列は裂は
目内の残基との結合を形成し、その結果Ｄｌの長袖は峡
谷の底とほぼ垂直になる。
５回回転軸の周囲の各々の深い裂は目の中心間の距離お
よそ５ｎｍはＩＣＡＭ−１分子が５個全ての裂は目を占
有するのに十分な大きさである。Ｄｌの末端半分に存在
しないライノウィルス−１４のコンタクトに関係する残
りの配列に３９ＤＢ　ＳＱ　５８、およびＲ１６６ＰＱ
は峡谷の縁に存在するライノウィルス−１４の残基と相
互作用を起こし得る。
ＩＣＡＭ−１／ライノウィルス−１４相互作用の第２の
モデルはＩＣＡＭ−ＩＤＩが裂は目の残基と接触し、そ
の結果Ｄｉの長軸が峡谷の底とより鋭角となりＤｌおよ
びＤ２が峡谷においてより長く横たわるものである。こ
れはいくつかの隣り合うライノウィルス−１４結合部位
の立体除害によるプロフキングを起こす。
したがって本発明はＩＣＡＭとＬＦＡまたはＨＲＶとの
コンタクトの主要問題を解決した。
Ｉ　ＣＡＭ−１のコンタクト配列の同定はＬＦＡ−１お
よび／またはＨＲＶ結合を妨害するＩＣＡＭ−１フラグ
メントおよび合成ペプチドの設計のための付加的情報を
提供する。例えばこのデータはＤｌのみを含むＩ　ＣＡ
Ｍ−１フラグメントがＬＦＡ−１およびＨＲＶ両方の相
互作用を阻害するのに十分であることを示している。し
かしここに提示されている結果はより効果的結合構造は
ＤＩおよびＤ２の両方を含むことを示唆している。不連
続なＩ　ＣＡＭ−１配列がコンタクトに関係しているよ
うに思われるので多くのコンタクト配列を含む長いペプ
チドフラグメントまたはいくつかのより短かいペプチド
をＬＦＡ−１およびＨＲＶ相互作用と競合させるのに用
い得る。
したがってＩ　ＣＡＭ−１の最初の２個のドメイン内に
ある重要な結合部位の同定はＩ　ＣＡＭ−１の可溶性フ
ラグメントがライノウィルス感染の予防および炎症病状
の治療に潜在的な能力を有することを示している（たと
えば再潅流や移植などに対して〉。このような薬剤はラ
イノウィルス主要グループにより引き起こされる一般的
な風邪の症状を有するケースの５０％に治療効果がある
（Ｓｐｅｒｂｅｒ、　Ｓ、Ｊ、等＋　Ａｎｔｉｍｉｃｒ
＋　Ａ　ｅｎｔｓ　Ｃｈｅｍｏ。
３２：４０９−４１９　（１９８Ｂ））、再潅流の場合
、白血球が一時的に血液を奪われた組織に移動しこれを
損傷する。筋収縮遅滞梗塞および虚血ショックの場合の
再潅流による有意なダメージはＬＦＡ−１およびその他
の白血球インテグリンに対するｍＡｂによりブロックさ
れることが示された（Ｖｅｄｄｅｒ、　Ｎ、Ｂ、等、　
Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、　　８上：９３９−９
４４　（１９８８）　　；５ｔｅｐｓｏｎ、　Ｐ、Ｊ、
等。
Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、　　８１　：　６２
４−６２９　（１９８８）これらの文献は参考として本
明細書で引用している）。
したがってまとめるとリンパ球上のＬＦＡ−１（ＣＤ　
１１　ａ／ＣＤ　１　Ｂ）は他の細胞上のＩＣＡＭ−１
（ＣＤ５４）に結合し免疫および炎症応答の際に重要な
細胞−細胞粘着を促進する。さらにヒトライノウィルス
（ＨＲＶ）の主要グループはＩＣＡＭ−１を細胞レセプ
ターとして使用する。
電子顕微鏡はＩ　ＣＡＭ分子が約１９ｎａ＋長の棒状を
していることを示した。この棒はしばしば１２ｎｍのロ
ングアームおよび７ｎ細のショートアームを与える９０
度の屈折を有する。これらの大きさはロングアームの３
個及びショートアームの２個の合計５個のＩｇ様トドメ
イン棒軸に対し小角度に配向しているモデルを示唆して
いる。ＬＦＡ−１、ＨＲＶおよび４個のモノクローナル
抗体（ｍＡｂ　）の結合に重要なＩ　ＣＡＭ−１配列は
そのＩｇ様トドメイン欠失および推定されるベータター
ンにおけるアミノ酸置換を有するＩ　ＣＡＭ−１変異体
の特性により同定した。Ｉ　ＣＡＭ−１の２個のアくノ
末端側１ｇ様ドメイン（ＤｉおよびＤ２）は構造的に相
互作用するようであり、またＤ２中のＮ−結合グリコシ
ル化部位はその構造的完全性に重要であると思われ、か
つＬＦＡ−１結合にわずかな効果を有している。Ｉ　Ｃ
ＡＭ−１のアミノ末端Ｉｇ様ドメイン（ＤＩ）はＬＦＡ
−１およびＨＲＶの両方に対する主要なコンタクト部位
を含む、結合部位は重複しているが別個のものであるよ
うである。またＨＲＶ結合は二価カチオン依存性が無い
点でＬＦＡ−１とは異なる。ＬＦＡ−１はインテグリン
であるが、それはＩ　ＣＡＭ−１中の　ＲＧＤまたはＲ
ＯＤ様配列配列識しない、全体的に云うと解析によりラ
イノウィルスはＩ　ＣＡＭ−１結合部位の選択において
ＬＦＡ−１を模倣していることを示し、これが進化的適
合部位である可能性を生じた。
例　　９ Ｉ　ＣＡＭ−１の可溶性官能性誘導体はライノウィルス
感染を阻害する 上述のようにライノウィルスはピコルナウィルス群に属
し、かつ多くの一般的風邪の原因である（Ｓｐｅｒｔｅ
ｒ、　Ｓ、Ｊ、等、＾ｎｔｉａ＋１ｃｒｏｂ、　Ａ　ｅ
ｎｔｓ　Ｃｈｅｓｏｔｈｅｒ＋３２：４０９−４１９　
（１９８Ｂ））、大部分のライノウィルスおよびいくつ
かのコクサキーウイルス〈またピコルナウィルス〉はヒ
ト細胞上に共通の細胞表面レセプターを共有している。
ＩＣＡＭ　−１はライノウィルスの主要サブグループに
対する細胞レセプターであり（Ｓｔａｕｎｔｏｎ、　Ｄ
、Ｅ、等、偽旦５６　：　８４９−８５３　（１９８９
）ＨＧｒｅｖｅ、Ｊ、Ｍ。
等、聾旦ユｊ　８３９−８４７　（１９８９））、また
抗Ｉ　ＣＡＭ−１抗体は主要ライノウィルス群の細胞へ
の結合を阻害し得る。この知見の観点から主要ライノウ
ィルス群の細胞への結合をブロックする可溶性Ｉ　ＣＡ
Ｍ−１官能性誘導体の能力を研究した。
上述のように細胞質内ドメインを切断したＩＣＡＭ−１
の可溶性誘導体を生成するため、Ｐｅｔｅｒｓｏｎおよ
び５ｅｅｄ（Ｐｅｔｅｒｓｏｎ＋　Ａ、等、　Ｃｅ１ｌ
　　５３：　　６５−７２（１９８８））により修正さ
れたＫｕｎｋｅｌの方法（Ｋｕｎｋｅｌ、　Ｔ、Ａ、　
Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　５ｃｉ（Ｕ、Ｓ
、Ａ、）８２：４８８−４９２　（１９８５））に基づ
くオリゴヌクレオチド指定突然変異誘発を用いて読み枠
内停止コドン（ＤｃｙｔとＤ５との間）を生成した。こ
の実験でＹ４５２　　Ｅ／Ｆ　　ＴＡＣと命名された変
異体Ｉ　ＣＡＭ−１遺伝子を生威し、これは発現により
切断された分泌型のＩ　ＣＡＭ−１（ｓｌｃＡＭ−１）
を産生ずる（例８参照）。
ＳＶ４０初期領域由来のプロモーター、スプライスシグ
ナルおよびポリアデニル化シグナルにより制御されるハ
ムスターのＤＨＦＲ遺伝子および上述の変異体ＩＣＡＭ
−１ｃＤＮＡコード領域を含む発現ベクターを構築した
。ＦｓｐｌおよびＦｌｉｎｄ■消化によりプラスミドｐ
ＢＲ３２２ＤＨＦＲ（Ｍｕｌｌｉｇａｎ、　Ｒ，Ｃ，等
、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、ＵＳ
Ａ７８　：　２０７２−２０７６　（１９８１）”）か
らハムスターＤＨＦＲ遺伝子を単離し、つづいてＢａａ
旧／ＨｉｎｄＩ［Ｉで切断したｐｓＶ２ｇｐｔ　　（Ｍ
ｔｔｃｈｅｌｌ。
Ｐ、Ｊ、等、　Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　６
　：　４２５　４４０（１９８６））に平滑末端ライゲ
ーションした。
変異体ｓＩＣＡＭ−ｌ（可溶性Ｉ　ＣＡＭ−１）ｃＤＮ
ＡをＮｏｔ　Ｉ消化で単離した。その後クレノーを用い
て末端を充填し、その分子をＨｉｎｄｌＩＩで消化した
。ついでこの分子をｐＢＲ３２２ＤＨＦＲ発現ベクター
（ｇｐｔ遺伝子を除くためＡｐａｌによる消化、クルノ
ーによる末端充填およびＨｉｎｄｌＩ［による消化によ
り調製した。）にライゲーションした。したがってｓＩ
ＣＡＭ−１遺伝子はＳＶ４０を基にした発現ベクター中
のハムスターＤＨＦＲ遺伝子に物理的に結合している。
その後この完全なベクターをリン酸カルシウム共沈殿法
を用いてチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）ＫＩ　
　ＤＵＸ−Ｂ　１１細胞にトランスフェクトした（Ｇｒ
ａｈａｍ、　Ｆ、Ｌ、等、　７５２　：４５６−４６７
　（１９７３））。非選択培地における２日間の増殖後
その細胞を０．０５〜２μＭのメソトレキセートを含む
がヒボキサンチンおよびチミジンを欠く選択培地に移し
た。ついでそのクローンを単離しサブクローン後ＥＬＩ
ＳＡ法によりｓＩＣＡＭ−１の産生をテストした。最も
多量のｓｌｃＡＭ−１を分泌するコロニーをさらに２回
の遺伝子増殖を行ないＣＨＯ１１８Ａと命名した安定な
細胞系列を誘導した。ｓｌＣＡＭ−１源として好ましい
該細胞系列は培養培地中に約１μｇ／　ｖｐ　ｌの濃度
でｓｌｃＡＭ−１を分泌する。
抗Ｉ　ＣＡＭ−１モノクロ一ナル抗体Ｒ６，５を用いた
免疫アフィニテイクロマトグラフイーによりＣＨＯ１１
８Ａ細胞の上清からｓＩｃＡＭｌを精製した。この目的
のため業者の説明書に従かい充填樹脂り目当り５ｍｇの
最終濃度となるようにＲ６，５をＣＮＢｒ活性化セファ
ロース４Ｂ（ファルマシアＬＫＢ）に共有結合した。全
てのクロマトグラフ操作は４℃で行ない、また全てのバ
ッファには０．２０／＋−のアプロチニンおよび１ｍＭ
フェニルメチルスルホニルフルオライドを含めた。
およそ１間のｓｌｃＡＭ−１を含む濾過上清１リツトル
を３０ｔａｌのＲ６，５−セファロースカラムにｌ＋ｊ
！／ｗｉｎの流速で流した。その後このカラムを２゜５
ｖａｌ／ｗｉｎの流速で２００ｍｇの１０＋ｓＭトリス
／　０．１５　Ｍ　Ｒａｃｌで洗浄して未結合物質を除
去した。結合したｓｌｃＡＭ−１をｌ＠ｊ！／Ｉａｉｎ
の流速の５０−Ｍトリエチルアミン１０．１５ＭＮａＣ
１／ｐ）Ｉ　１１．　Ｏで溶出した。フラクションを採
取し直ちに最終濃度２０５Ｍとなるように１Ｍトリス（
ｐＨ６，０）を加えて中和した。
溶出したｓＩＣＡＭ−１を含むフラクションは１０％〜
１５％ポリアクリルアミド勾配ゲルを用いた５ＤＳ−Ｐ
ＡＧＥおよび銀染色で同定した。
電気泳動および染色は業者の説明書に従いファルマシア
ファストゲルシステムおよび銀染色キットを用いて行っ
た。ｓｌｃＡＭ　　１を含むフラクションを集め、セン
トリコン−３０マイクロコンセントレータ−（アミコン
社、デンバー、ＭＡ）を用いておよそＩＯ倍に濃縮した
。
１回の実験の精製ｓＩＣＡＭ−ｌのたん白質含量をバイ
オラドプロティンアッセイ　（バイオラドラボラトリー
ズ社、リッチモンド、ＣＡ）を業者の説明書に従って用
いることにより測定し、またこの物質の一部を参照標準
物質として使用するため凍結保存した。つづいてサンプ
ル中のｓＩＣＡＭ−１濃度をこれらの参照標準物質およ
び非重複エピトープに結合する（Ｍａｒｌｉｎ、未公開
データ）２個の抗Ｉ　ＣＡＭ−１モノクロ一ナル抗体、
Ｒ６，５およびＲ６，１を用いた“サンドイツチ”型Ｅ
ＬＩＳＡで測定した（Ｒｏｔｈｌｅｉｎ、　Ｒ，等、Ｊ
、　Ｉｎ＋＋５ｕｎｏ１．１４１：１６６５−１６６９
　（１９８８））。Ｒ６，１は１０μｇ／ｍｌ溶液１０
０μｌを１時間インキュベーションすることにより９６
穴プレート（Ｎｕｎｃイムノプレート）のプラスチック
に結合させた。
以後の各ステップは試薬１００μｌの３７℃、２０分間
のインキュベーションと、つづくリン酸緩衝液による洗
浄により行った。（１）参照標準ｓＩＣＡＭまたは未知
物質の連続希釈物の結合、（２）ビオチン化Ｒ６，５（
１μｇ／ｍｉ）の結合、および（３）業者推薦濃度のホ
ースラディッシバーオキシダーゼ結合ストレプトアビジ
ン（ジムドラボラトリーズ、サウスサンフランシスコ、
ＣＡ）の結合。基質ＡＢＴＳ　（ジムド）の添加および
室温２０分間のインキュベーション後、４１Ｑｒ＋ｍの
吸光度を測定した。その後ｓｌｃＡＭ−ｉの濃度を参照
標準曲線との比較により決定した。
放射能標識ライノウィルス結合検定はＡｂｒａｈａｍお
よびＣｏ１ｏｎｎｏの方法を修正して行った（Ａｂｒａ
ｈａｍ。
Ｇ１等Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　　５１　；　３４０−３４
５（１９８４））。
簡単に云うとＨｅＬａの細胞に２０　ｍＭ　ＭｇＣＲ２
および２ｍＭグルタミンを補った無メチオニンＲＲＭ１
１６４０中４〜６時間かけてＨＲＶ１４を感染させ、つ
づいて−酸化した細胞変性効果が観察されるまで２％ウ
シ胎児血清および１００μＣｉ／＋ｒ＋ｊ！〔３ＳＳ〕
−メチオニンを含む同培地中でインキュベートした（通
常感染後１８時間まで）。３回の凍結融解後上清中のウ
ィルスをポリエチレングリコールで沈殿化し遠心により
回収した。報告されている方法の修正してその後放射能
標識ウィルスを３０％スクローステップクラジェントを
通してペレット化することにより（ベックマンＳＷ４１
０−ターを用いて３４９０Ｑｒｐｍ　　２時間）回収し
た。ＨｅＬの細胞（集密化２４穴プレート）に対する放
射能標識ウィルス（Ｉ　Ｘ　１０’　Ｃｐｍ））の結合
はシンチレーション計数の前に細胞および結合ウィルス
の可溶化に１％トリトンＸ−１００および高温９Ｍ尿素
による洗浄を順次行うこと以外はＡｂｒａｈａｍおよび
Ｃｏ１ｏｎｎｏ　（Ａｂｒａｈａｍ、　Ｇ、等、Ｊ。
Ｖ　１ｒｏｌ、　５１　：３．４０−３４５　（１９８
４）　）の方法に従って行った。典型的実験において投
入ｃｐｓのおよそ２５％〜３０％が細胞に結合した。
上述の最初の精製操作を用い、ｓｌｃＡＭ−１のミリグ
ラム量を９５％以上の純度に精製した。
精製したｓｌｃＡＭ−１は８２．０００の見かけの相対
分子量（Ｍｒ）を有し、これは５個全ての細胞外１．様
ドメインを含む分子の推定サイズと一致する。精製ｓｌ
ｃＡＭ−ｌは膜結合Ｉ　ＣＡＭ−１（ｓＩ　ＣＡＭ−１
）に対して住職した３個の異なるモノクローナル抗体、
ＲＲ１／１、Ｒ６，５およびＣＬ２０３と結合した。こ
れらの抗体は競合結合検定法で地形的に異なる部位に結
合することが検定され、またｓＩＣＡＭ−１に対する結
合はそれが天然の■Ｉ　ＣＡＭ−１と同様な全体的構造
を維持していることを示している。
ライノウィルス感染のインヒビターとして作用する精製
ｓｌｃＡＭ−ｌの能力は定量的インビトロウィルス細胞
変性効果（ＣＰ　Ｅ）検定法で測定した（Ｓｔａｕｎｔ
ｏｎ、　Ｄ、　Ｅ、等、Ｃｅ１ｌ　５６　：８４９−８
５３　（１９８９））。
この実験のため主要群血清型ＨＲＶ５４（１００’ｒｃ
ｒｐｓ。）を指示される濃度のｓＩＣＡＭ−１〈または
同精製操作由来のバッファコントロールの等価希釈物〉
の存在下ＨｅＬａ　１ｔｌＩ胞上にブレーティングし、
４日後先に報告されている方法に従がいその細胞変性効
果を測定した（Ｓｔａｕｎｔｏｎ、　Ｄ。
Ｂｏ等、Ｃｅ１ｌ　　５６：　　８４９−８５３　（１
９８９）　）。
第１０図に示されているように、ＳＩＣＡＭ−１は主要
群ヒトライノウィルス５４株（ＨＲＶ５４）の強力なイ
ンヒビターであった。１μｇ／ｃｎｌのｓｒＣＡＭ−１
はＣＰＥを有意にくおよそ５０％〉阻害し、また１　０
μｇ／ｍｌで９０％以上の阻害が達成された。対照的に
ｓＩＣＡＭ−１ピークに隣接するカラムフラクション由
来のバッファコントロールはなんの効果も有していない
。
ｓｌｃＡＭ−１による阻害の特異性をライノウィルスの
メジャーおよびマイナー両サブグループの代表物、他の
ピコルナウィルスおよび無関係の外被化ＤＮＡウィルス
であるヘルペスシンプレックスウィルスＩ型（Ｈ３Ｖ−
１＞を用いてテストした。
この実験のため精製ｓＩＣＡＭ　　１　　（５μｇ／ｍ
ｊ７）を以下に示したウィルス（１００Ｔ　ＣＩ　Ｄ、
。）と共に）（’ｅＩ、ａ細抱上にブレーティングし、
４日後に細胞変性効果を測定した：ＨＲＶ５４（メジャ
ーグループライノウィルス）　、ＨＲＶ　（マイナーグ
ループライノウィルス）、ＣＯＸ、Ａ１３（コクサキー
Ａ１３、メジャーグループレセプターを用いたピコルナ
ウィルス）、ＣＯＸ、Ｂ１（コクサキー８１、メジャー
グループレセプターを使用しない）　、Ｐｏ１ｉｏ　　
（ポリオウィルスＩ〉、ＨＲＶ−１（ヘルペスシンプレ
ックスウィルス、Ｉ型）。
第１１図に示したようにｓｌｃＡＭ　　１はＨＲＶ５４
を阻害するが細胞レセプターとしてＩＣＡＭ−１を使用
しないマイナーグループ株のＨＲＶ２には有意な影響を
与えない。さらにｓＩＣＡＭ−１は、レセプターとして
ＩＣＡＭ−１を使用することが知れられているもう１つ
のピコルナウィルスであるコクサキーＡ１３による感染
を阻害する（Ｃｏｌｏｎｎｏ、、　Ｒ，Ｊ、　　等、　
　Ｉ）　９３−１０２、Ｐｏ５ｉ−ｔｉｖｅ　５ｔｒａ
ｎｄ　ＲＮＡ　Ｖｉｒｕｓｅｓ　（Ａｌａｎ　Ｒ，Ｌｉ
ｓ社））。
対照的にｓｌｃＡＭ　　１はポリオウィルス、コクサキ
ーＢｌ　　（ＩＣＡＭ−１を介して結合しないピコルナ
ウィルス）またはＨＲＶ−１を阻害しない。
ウィルス阻害の特異性はｓｌｃＡＭ−１が細胞のウィル
ス増殖を支える能力に関する一般的効果を介してではな
く、むしろウィルス結合の阻害を介して感染を防ぐこと
を示している。このことは３ＳＳ−メチオニン標識ウィ
ルス結合検定を用いてウィルス結合に関するｓｌｃＡＭ
　　１の効果を測定することにより測定された。
この実験のために（３５ｓ）−メチオニン標識ＨＲＶ１
４を指示濃度のｓＩＣＡＭ−１、りＤ？トグラフィーパ
フファコントロールまたは２００μｇ／ｖａｌの抗Ｉ　
ＣＡＭ−１モノクロ一ナル抗体ＣＬ２０３またはＲ６，
５と混合した。先に示されているように抗体Ｒ６，５は
Ｉ　ＣＡＭ−１とＬＦＡ−１またはＨＲＶ５４のいずれ
かとの相互作用を阻害し、一方抗体ＣＬ２０３はこれを
阻害しない（Ｓｔａｕｎｔｏｎ、　Ｄ、　Ｅ、等、■旦
５６：８４！１Ｂ５３（１９８９））。４℃３０分の再
インキュベーションの後この混合物をＨｅＬａ細胞上に
ブレーティングし、洗浄後結合ｃｐｓを測定した。
第１２図に示したように、ｓＩＣＡＭ　　１は投与量に
依存してＨＲＶ１４（ライノウィルスメジャーサブグル
ープ）の結合を阻害したが、一方バッファコントロール
は影響しなかった。ポジティブコントロールの抗Ｉ　Ｃ
ＡＭ　−Ｉ　　Ｍａｂ　Ｒ６，５も効果を示したが一方
ネガティブコントロールのＭａｂＣＬ２０３（これはＩ
　ＣＡＭ−１と結合するがその機能は阻害しない〉は有
意な効果を示さなかった（Ｓｔａｕｎｔｏｎ、　ｏ、　
Ｂ、等、蝕旦　５６：　８４９−８５３　（１９８９）
参照）。ウィルス結合検定はＣＰＥ検定よりも実質的に
高い濃度のウィルス粒子を使用しており、このことはＣ
ＰＥに比べ結合阻害が低いことを示していることに注意
すべきである。
多量の精製ｓＩＣＡＭ　　１を産生し得ることはＸ線結
晶学的実験を可能にし、その分子の３次元構造の解析を
可能にする。精製ｓｌｃＡＭ　　Ｉを使用すると検定法
を発展させることにより抗ライノウィルス剤の設計また
は検出が容易となる。
これらの実験はｓｌｃＡＭ−１がメジャーグループライ
ノウィルス感染の強力かつ特異的なインヒビターである
ことを示している。ｓＩＣＡＭ−１はメジャーグループ
ウィルスであるＨＲＶ５４を阻害するがレセプターとし
てＩ　ＣＡＭ−１を使用していないライノウィルスのマ
イナーグループの一員であるＨＲＶ２を阻害しないこと
が分った。
ｓＩＣＡＭの抗ウィルス活性はｓｌｃＡＭ　　１または
その官能性誘導体が抗ウイルス治療に使用し得ることを
示している。ウィルス上のＩＣＡＭ１結合部位は高度に
保存されており（Ｒｏｓｓｍａｎ＋Ｍ、　Ｇ、　Ｊ、　
Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　　２６４　：１４５８７−１
４５９０　　（１９８９））かつその変異能は機能的に
抑制されているようである。したがってＩ　ＣＡＭ−１
□ウィルス相互作用の部位を指向する薬剤は薬剤耐性変
異体の生成による中和を回避するウィルス能力の制限と
合せてウィルス感染の感受的第１段階を阻害する二重の
利点を有している。
ｓｌｃＡＭ−１がインビトロでライノウィルスのメジャ
ーグループの感染を阻害し得、かつライノウィルス感染
の症状を緩和または予防する治療効果を有することをデ
ータが示している。
本発明はその特定の実施態様と合せて記述されているが
これをさらに修正し得、かつこの適用が一般に本発明の
原則に従がい、かつ本発明に属する分野における従来の
、または習慣的実施態様に用いられかつ本特許請求の範
囲に従うことが明らかな先に示した基本的特性に適用し
得る本公開物からの免税も含め全ての本発明の変化物、
用途または応用を含むことを意図するものであることが
理解されよう。
【図面の簡単な説明】
第１図は、ＩＣＡＭ−Ｉ　ＣＤＮＡの核酸及びアミノ酸
配列を示す。図中、第１のＡＴＧコドンは第５８位にあ
る。ＩＣＡＭ−１）’Ｊプシンペプチドに対応する翻訳
した配列にアンダーラインを付した。疎水性推定シグナ
ルペプチド及び膜透過配列には太いアンダーラインを付
し、Ｎ−結合ジリコシル化部位を四角でくくった。第２
９７６位のボリアデモル化シグナルＡＡＴＡＡＡの上に
線を引いた。第１図に示す配列はＨＬ−６０ｃＤＮＡク
ローンのものである。内皮細胞ｃＤＮＡの配列はその長
さのほとんどの部分と同じであり、はんの小さな違いが
あるだけである。 第２図はＩＣＡＭ−１相同ドメイン及び免疫グロブリン
超遺伝子群への相関を示す。（Ａ）５つの相同ドメイン
の配列（Ｄ＋−ｓ）　：列んだ２以上の同じ残基は囲っ
ている。ＮＣＡＭドメインに２回以上含まれる残基、お
よびセットＣ２およびＣＩのドメイン中に含まれる残基
はＩＣＡＭ−１内部繰返しによって配列している。ＩＣ
ＡＭ−１のドメイン中の予想βストランドの位置は棒線
および配列上の小文字でマークしており、また免疫グロ
ブリンＣドメイン中のβ−ストランドの公知の位置は棒
線及び配列下の大文字でマークしている。 ＩＣＡＭ−１ドメイン内の推定ジスルフィド架橋の位置
はＳ−３によって示している。ＩＣＡＭ−１に相同性の
たん白質ドメインの（Ｂ−Ｄ）配列：各たん白質はＦＡ
ＳＴＰプログラムを用いてＮＢＲデータベースを調査す
ることによって先ず配列した。各たん白質配列はＭＡＧ
、ＮＣＡＮ。 Ｔ細胞レセプターαサブユニットＶドメイン、ＩｇＭμ
鎖およびα−１−Ｂ−糖たん白質である。 第３図はＩＣＡＭアミノ末端ドメインの配列を示す。 第４図はドメイン欠落位置を示すＩＣＡＭ−１の図式化
したものである。 第５図はＣＯ５細胞におけるＩＣＡＭ−１欠落変異体の
発現を示す。ＣＯ３細胞をフローサイトフルオロメトリ
ー（ｆｌｏｗ　ｃｙｔｏｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｙ）　、
次いでＲＲ１／１を用いた間接免疫発光で分析した。 第６図はＣＯ３細胞におけるＩＣＡＭ−１欠落変異体の
発現を示す。ＣＯ３細胞をフローサイトフルオロメトリ
ー、次いでＭＡｂｓＲＲ１／１（固体バー）、Ｒ６，５
（オープンバー）、ＬＢ−２（ストリップバー）又はＣ
Ｌ２０３（ハツチバー）を用いた間接免疫発光で分析し
た。特定発光強度をモック　（ｍｏｃｋ）　　）ランス
フェクトした細胞に基づくバックグランドを差し引いて
求めた。 第７図はＩＣＡＭ−１欠落変異体とＬＦＡ−１およびＨ
ＲＶ１４の結合を示す。ＩＣＡＭ−１欠落変異体発現Ｃ
Ｏ３細胞のプラスチック結合ＬＦＡ−１への粘着及び３
５　Ｓ　ｍｅｔラベル化ＨＲＶ１４への結合を調べた。 多重実験についての標準誤差（２−４）を示す。 第８図は、２価カチオン不存在下におけるＨＲＶ１４の
ＩＣＡＭ−１への結合を示す。プラスチック結合ＩＣＡ
Ｍ−１の濃度が増加するに従い、該ＩＣＡＭ−ｌへの３
５ＳＨＲＶ１４の結合は、１０ｍＭｇ”（オープンサー
クル〉のＨＲＶバッファー中で、又はＭ　ｇ２−を含ま
ないが５　ｍＭＥ　Ｄ　Ｔ　Ａ　（オープントライアン
グル）を含むＨＲＶバッファー中で生じた。 第９図はＩＣＡＭ　　Ｉ　　ＤＩ及びＤ２ターシャリ−
構造のモデル：ＬＦＡ−１とＨＲＶ結合部位の位置を示
す。■ｇコンスタントドメインの基本ターシャリ−モデ
ル（Ｗｒｉｇｈｔ、　Ｓ、　Ｄ、、　　ら、ｐｒｏｃ。 Ｎａｔｌ。Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ、　　［ＪＳＡ　　８
５：　７７３４−７７３８（１９８８））を、予想ｂス
トランド（太い矢印）及びＩＣＡＭ−Ｉ　　Ｄｉ及びＤ
２のｂターン（Ｓｔａｕｎｔｏｎ、　　Ｄ、　Ｅ、　　
ら、　　Ｎａｔｕｒｅ　　　３　３　９　　：　　６　
１　−６４　（１９８９ａ））に適応するように変えた
。 ＬＦＡ−１又はＨＲＶ１４結合に関与する残基を示す。 ＬＦＡ−１／ＨＲＶ　ｌ　４結合（×倍低下）について
の対応変異体の効果をそれぞれ示した（アウトラインプ
リント）。Ｄ２　　Ｎリンクオリゴサツカライドの位置
を示す。 第１０図は主グループラインウィルスにより誘発された
細胞変性効果をｓＩＣＡＭ　　１が抑制することを示す
。 第１１図はラインウィルス主グループレセプターを利用
するピコルナウィルスにより誘発されたＣＰＥを、精製
ｓＩＣＡＭ−ｌが特異的に抑制することを示す。 第１２図はラインウィルスピリオンが細胞に結合するの
を精ｊｌｌｓｌｃＡＭ−１が抑制することを示す。 野性型結合率 （％） 阻害率 （％） 比蛍光強度 結合率 （％） ％結合阻害率 （％） 阻害率 （％） 手 続 補 正 書（方式） １、事件の表示 平成２年特許願第６５４９５号 ２、発明の名称 細胞間粘着分子の官能性誘導体を 用いた抗ウィルス剤 ３、補正をする者 事件との関係

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、ウィルス感染の抑制に十分な量のＩＣＡＭ−１のフ
    ラグメント又はＩＣＡＭ−１の官能性誘導体のフラグメ
    ントを治療を必要とする患者に投与することを含むヒト
    のウィルス感染の治療法。 ２、（ａ）ウィルスを含む疑いのある生物試料を検出可
    能に標識されているＩＣＡＭ−１の官能性誘導体とイン
    キュベートすること、 （ｂ）上記検出可能に標識されているＩＣＡＭ−１の官
    能性誘導体がウィルスに結合するかどうかを測定するこ
    と、 を含むウィルス感染の存在を診断する方法。 ３、ＩＣＡＭ−１の官能性誘導体に結合したウィルスを
    含むワクチン組成物を受容者に投与することを含むウィ
    ルス感染の予防方法。 ４、前記ウィルスがピルナウィルス属、Ａ型コクサッキ
    ウィルス及びメンゴウィルスの中の主要血清型のライノ
    ウィルスからなる群から選ばれる請求項１ないし３のい
    ずれか１項記載の方法。 ５、前記ウィルスがピロルナウィルス属の中の主要血清
    型のライノウィルスである請求項４記載の方法。 ６、前記フラグメントが、 （１）ＩＣＡＭ−１のドメイン１、２、３、４及び５； （２）ＩＣＡＭ−１のドメイン１、２、３及び４；（３
    ）ＩＣＡＭ−１のドメイン１、２及び３；（４）ＩＣＡ
    Ｍ−１のドメイン１及び２； （５）ＩＣＡＭ−１のドメイン１、 からなる群から選ばれる請求項１記載の方法。 ７、前記フラグメントが可溶性フラグメントである請求
    項１記載の方法。 ８、前記フラグメントが可溶性フラグメントである請求
    項６記載の方法。 ９、前記フラグメントが指示される位置に以下のアミノ
    酸：Ｑ１Ｔ、Ｒ１３、Ｄ２６ＱＰＫ、Ｑ２７、Ｋ３９Ｋ
    Ｅ、Ｇ４６ＮＮ、Ｒ４９ＫＶ、Ｑ５８、Ｄ６０、Ｄ７１
    、Ｋ７７Ｔ、Ｎ１０３、Ａ１１５Ｎ及びＲ１６６ＰＱの
    うちの少なくとも１つを含む請求項１記載の方法。 １０、前記フラグメントが指示される位置に以下のアミ
    ノ酸：Ａ３ＧＬ、Ｌ２７、Ａ３４、Ｈ７３、Ｔ７３及び
    Ｑ１１８のうちの少なくとも１つを含む請求項１記載の
    方法。 １１、前記ＩＣＡＭＩの官能性誘導体が、 （１）ＩＣＡＭ−１のドメイン１、２、３、４及び５； （２）ＩＣＡＭ−１のドメイン１、２、３及び４；（３
    ）ＩＣＡＭ−１のドメイン１、２、及び３；（４）ＩＣ
    ＡＭ−１のドメイン１及び２； （５）ＩＣＡＭ−１のドメイン１、 からなる群から選ばれるＩＣＡＭ−１のフラグメントを
    含む請求項２ないし３のいずれか１項記載の方法。 １２、前記官能性誘導体が可溶性官能性誘導体である請
    求項２ないし３のいずれか１項記載の方法。 １３、前記官能性誘導体が可溶性官能性誘導体である請
    求項１１記載の方法。 １４、前記官能性誘導体が指示される位置に以下のアミ
    ノ酸：Ｑ１Ｔ、Ｒ１３、Ｄ２６ＱＰＫ、Ｑ２７、Ｋ３９
    ＫＥ、Ｇ４６ＮＮ、Ｒ４９ＫＶ、Ｑ５８、Ｄ６０、Ｄ７
    １、Ｋ７７Ｔ、Ｎ１０３、Ａ１１５Ｎ及びＲ１６６ＰＱ
    のうちの少なくとも１つを含む請求項２ないし３のいず
    れか１項記載の方法。 １５、前記官能性誘導体が指示される位置に以下のアミ
    ノ酸：Ａ３ＧＬ、Ｌ２７、Ａ３４、Ｈ７３、Ｔ７３及び
    Ｑ１１８のうちの少なくとも１つを含む請求項２ないし
    ３のいずれか１項記載の方法。 １６、可溶性官能性誘導体である請求項１５記載の官能
    性誘導体。 １７、指示される位置に以下のアミノ酸：Ｑ１Ｔ、Ｒ１
    ３、Ｄ２６ＱＰＫ、Ｑ２７、Ｋ３９ＫＥ、Ｇ４６ＮＮ、
    Ｒ４９ＫＶ、Ｑ５８、Ｄ６０、Ｄ７１、Ｋ７７Ｔ、Ｎ１
    ０３、Ａ１１５Ｎ及びＲ１６６ＰＱのうちの少なくとも
    １つを有するＩＣＡＭ−１の官能性誘導体。１８、指示
    される位置に以下のアミノ酸：Ａ３ＧＬ、Ｌ２７、Ａ３
    ４、Ｈ７３、Ｔ７３及びＱ１１８のうちの少なくとも１
    つを有するＩＣＡＭ−１の官能性誘導体。 １９、可溶性官能性誘導体である請求項１７ないし１８
    のいずれか１項記載の官能性誘導体。 ２０、免疫グロブリンの一部分に結合した請求項１９記
    載の官能性誘導体を含むキメラ分子。
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