JPH05507406A - 人体適応化キメラ抗ｉｃａｍ―１抗体、製造方法および用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 人体適応化キメラ抗ＩＣＡＭ−１抗体、製造方法および用途発明の分野 本発明は、キメラ抗体分子、および特に細胞間接着分子１（ＩＣＡＭ−１）の抗 原決定基に対する特異性を有する人体適応化キメラ抗体分子、組換えＤＮＡテク ノロジーを用いたその製造方法およびその治療用途に関するものである。

本出願において、「キメラ抗体分子」という語は、第二蛋白質の少なくとも一部 分に結合したー免疫グロブリン分子に関して誘導された重および／または軽鎖の 少なくとも可変領域を含む重および／または軽鎖を有する抗体分子の記載に使用 されている。第二蛋白質は、異なる免疫グロブリン分子または非免疫グロブリン 蛋白質から誘導された追加的抗体定常領域ドメインを含み得る。「人体適応化キ メラ抗体分子」という語は、非ヒト種からの免疫グロブリンから誘導された重お よび軽鎖可変領域ドメインを有する分子の記載に使用されており、この分子の残 りの免疫グロブリン定常領域ドメインはヒト免疫グロブリンから誘導される。「 ＭＡｂＪという略語は、モノクローナル抗体を示すのに使用されている。

また本発明は、ＩＣＡＭ−１に結合することによりか粗球またはマクロファージ リネッジの細胞の細胞間接着を阻止し得るキメラ抗体の用途に関するものである 。それらの分子を使用することにより、特異的および非特異的炎症の治療方法が 提供される。

また本発明は、ウィルス性、および特にリノウイルス性疾患の処置においてＩＣ ＡＭ−１と結合し得るキメラ抗体に関するものである。

本発明はまた、ＨＩＶに曝されているかまたはＨＩＶによる影響を受けているこ とから、ＩＣＡＭ−１と結合し得るキメラ抗体の投与による抑制措置を必要とす る個体における、ＨＩＶおよび特にＨＩＶ−１による白血球感染の治療的および 予防的抑制方法に関するものである。従って、それにより、例えばＨＩ　Ｖ−１ ウイルスにより誘発されるエイズ（後天性免疫不全症候群）などの疾患に対する 治療法が得られる。

本発明はまた、ＩＣＡＭ−１と結合し得るキメラ抗体を用いた循環系がらのＨｒ ｖ−１感染細胞移動の治療的抑制方法に関するものである。従って、それにより 、例えばＨＩＶ−じイルスにより誘発されるエイズ（後天性免疫不全症候群）な どの疾患に対する治療法が提供される。

本発明は、ぜん息の処置におけるＩＣＡＭ−１と結合し得るキメラ抗体の用途に 関するものである。

発明の背景 Ａ９人体適応化抗体 何年も前から、天然免疫グロブリンは、酵素的開裂により誘導され得るその様々 なフラグメント、例えばＦａｂ、　（Ｆａｂ’）ｚおよびＦｃフラグメントを有 するものとして知られている。天然免疫グロブリンは、各上部アームの遊離末端 に向がって抗原結合部位を有する一般的にＹ形状の分子を含む。この構造の残り の部分および特にＹの輪部分は、免疫グロブｌルと関連したエフェクター機能を 仲介する。

天然免疫グロブリンは、検定、診断およびより制限された範囲ではあるが治療に おいて使用されてきた。しかしながら、特に治療におけるそれらの使用は、天然 免疫グロブリンのポリクローナル的性質により妨げられている。治療剤としての 免疫グロブリンの可能性の実現化に向かう重大な一段階は、明確にされた特異性 を有するモノクローナル抗体製造技術の発見であった（コーラ−等、「ネイチャ 刊２６５：２９５−４９７（１９７５））。しがしながら、ＭＡｂは、ネズミ骨 髄腫細胞とネズミひ臓細胞の融合により生産される。従って、それらは本質的に ネズミ蛋白質である。ヒトＭＡｂの生産についてはほとんど報告されていない。

たいていの利用可能なＭＡｂはネズミに由来することから、それらは当然ヒトに おいては抗原性であるため、ＨＡＭＡ（ヒト抗マウス抗体）応答と呼ばれる望ま しくない免疫応答を生じ得る。従って、ヒトにおける治療剤としてのネズミＭＡ ｂの使用は、ヒト対象の場合ＭＡｂに対する免疫応答が生じるため、それを完全 に除去するかまたは少なくともその有効性を低下させるという事実により本質的 に制限される。事実上、ＨＡＭＡ応答の速やかな発生によってＭＡｂの効果が無 （なり、望ましくない反応が生じるため、ネズミ起源のＭＡｂは、複数または数 種の処置が行なわれる患者においては使用され得ない。

従って、ヒトにおける抗原性がより低い非ヒトＭＡｂの製造に関する提案が為さ れている。それらの技術は、総括的に「人体適応化」技術と呼ばれ得る。これら の技術では、一般的に組換えＤＮＡテクノロジーを用いることにより、抗体分子 のポリペプチド鎖をコードするＤＮＡ配列を操作する。

特に人体適応化抗体の製造に関して提案された一方法は、いわゆるキメラ化方法 である。

上記キメラ化方法は、−抗体の完全な可変ドメインを含む抗原結合部位が別の抗 体に由来する定常ドメインに結合しているキメラ抗体の製造を含む。ががるキメ ラ化方法の幾つかの初期の実施方法は、ＥＰ−Ａ−０１２０６９４（セルチック ・リミテッド）、ＥＰ−Ａ−０１２５０２３（ジェネンテック・インコーホレイ テッドおよびシティ−・オブ・ホープ）、ＥＰ−Ａ−０１７１４９０６（Ｒｅｓ 、Ｄｅｖ、Ｃｏｒｐ、ジャパン）、ＥＰ−Ａ−０１７３４９４（スタッフォード ・ユニバージティー）、ＥＰ−Ａ−０１９４２７６（セルチック・リミテッド） に記載されている。後者のセルチック出願はまた、マウスＭＡｂの可変ドメイン 、ヒト免疫グロブリンのＣＨＩおよびＣＬドメイン、およびヒト免疫グロブリン のＦｃ蛋白質の代わりに非免疫グロブリン誘導蛋白質を含む抗体分子の製造を示 している。

Ｂ、白血球結合および融合 異質の侵入体、例えばウィルス、細菌およびアレルゲンに対して炎症応答が生じ 、これに対して宿主を適切に防御するためには、白血球およびか粗球が細胞基質 に接着し得なければならない。この事実は、２つの収束性ラインの研究から明白 になった。

第一ラインの研究は白血球膜蛋白質の試験を含む（ワリス、Ｗ、Ｊ、等、「ジャ ーナル・オブ・イムノロジー」、１３５：２３２３−２３３０（１９８５）、メ ンツアー、Ｓｊ、等、「ジャーナル・オブ・セルラー・フィジオロジー」、１２ ６＋２８５−２９０（１９８６）、ハスカード、Ｄ、Ｏ等、「ジτ−ナル・オブ ・イムノロジー」、１３７：２９０１−２９０６（１９８６）、バーラン、Ｊ、 Ｍ等、「フラッド」、６６：１６７−１７８（１９８５））。細胞接着プロセス にとって特に重要なのは、ｒｃＤ１８Ｊ群または複合体として知られている一群 の白血球膜蛋白質である。この群は３＄１のへテロダイ？　−（ＪＭａｃ−Ｉ　 Ｊ、ｒＬＦＡ−ＩＪおよびｒＰ　１５０９０」として知られている）により構成 され、それらは全て共通サブユニット（βサブユニットとして知られている）お よび特有サブユニット（αサブユニットとして知られている）を共有している（ スブリンガー、Ｔ、　Ａ、等、「イムノロジカル・レビューズＪ、６８：１１１ −１３５（１９８２）、スブリンガー、Ｔ１等、「フェデレーンヨン・ブロン− ディング」、４４：２６６０−２６６３（１９８５）、カイツアー、Ｇ等、［ヨ ーロピアン・ジャーナル・オブ・イムノロジー、１５：１１４２−１１４７（１ ９８５）、サンチェス−マトリ−１Ｆ１等、「ジャーナル・オブ・エクスペリメ ンタル・メディシン」、１５８：１７８５−１８０３（１９８３））。

白血球膜蛋白質のＣＤ１８群に対するモノ知−ナル抗体は、これらの蛋白質のき っ抗物質として作用することにより、多数のインビトロ白血球接着依存性事象を 阻止する。これには、が粗球が適当な刺激因子に応じて凝集する能力、が粗球が 蛋白質被覆プラスチックに結合する能力、が粗球が２次元アガロース検定におい て移動する能力およびか粗球が内皮細胞に結合する能力が含まれる。

第ニラインの研究は、ＣＤ１８群の白血球接着分子の共通サブユニットをコード する遺伝子に遺伝的欠陥が存在するため、細胞表面においてこれらの接着分子を 一切発現し得ない個体を含む試験に由来する。上記の個体は、「白血球接着不全 疾患Ｊ（ＬＡＤ）にり患していると言われる（アンダーソン、Ｄ、Ｃ，等、「フ ェデレーション・プロシーディング」、４４：２６７１−２６７７（１９８５） 、アンダーソン、Ｄ、Ｃ，等、「ジャーナル・オブ・インフェクシャス・ディシ ーズ去１５２：６６８−６８９（１９８５））。ＬＡＤ患者特有の特徴には、壊 死性柔組織病変、膜形成および創傷治癒障害、並びにインビトロ接着依存性白血 球機能の異常および慢性および再発性細菌感染に対する感受性がある。これらの ＬＡＤ患者がらのか粗球は、抗ＣＤ１８モノクローナル抗体の存在下でのそれら の正常対応物質の場合と同様にインビトロでは不完全な方式で行動する。すなわ ち、それらは、接着関連機能、例えば集合または内皮細胞への結合を遂行し得な い。しかしながら、さらに重要なことに、これらの患者は、か粗球が細胞基質に 接着し得ないため、正常な炎症応答を生じ得ないことが観察される。最も注目さ れるのは、これらのＬＡＤ患者からのか粗球は、それらが炎症病変付近の血管の 内皮細胞に結合し得ないため、炎症、例えば皮膚感染部位に到達し得ないという 観察結果である。上記結合は、管外遊出に必要な段階である。

すなわち、要約すると、リンパ球およびか粗球が動物の健康および生存力を維持 し得るには、それ石が他の細胞（例えば内皮細胞）に接着し得ることが必要であ る。か粗球−内皮細胞接着は、か粗球細胞表面上に存在する特異的レセプター分 子を含む細胞−細胞接触を必要とすることが見出された。これらのレセプターに より、他の白血球または内皮および他の非血管細胞への白血球の接着が可能とな る。

白血球の細胞表面レセプター分子は、互いに高度に関連していることが見出され た。白血球がこれらの細胞表面レセプター分子を欠くヒトは、慢性および再発性 感染並びに他の臨床的徴候を呈する。ＣＤ１８複合体の機能的接着分子を欠くた め白血球が正常な形で接着し得ない場合、炎症反応は緩和される。白血球接着は 組織炎症が生じるプロセスに関与しているため、白血球接着プロセスに対する理 解は、特異的および非特異的炎症に対する処置を明確にする場合に重大な価値を 有する。

さらに、リンパ球接着は異質の体または組織が同定および拒絶されるプロセスに 関与しているため、このプロセスに対する理解は、臓器移植、組織移植、アレル ギーおよび腫よう学分野において重大な価値を有する。

Ｃ９細胞間接着分子ＩＣＡＭ−１および細胞接着細胞間接着分子ＩＣＡＭ−１は 、ロズレイン、Ｒ１等の方法（「ジャーナル・オブ・イムノロジー」、１３７： １２７０−１２７４（１９８６）、これを引用して説明の一部とする）に従い最 初に同定され部分的に特性確認された。ＩＣＡＭ−１、その製法、精製および特 徴は、ＷＯ２０１０３４００に開示されており、その出願をそのまま引用して説 明の一部とする。

ＩＣＡＭ−１は、最初は内皮細胞および白血球間の細胞接着プロセスに関与する ものとして理解されていた。細胞接着は、白血球が細胞基質、例えば内皮細胞に 結合することにより、循環系から進行中の炎症部位へ移動し、外来侵入体、例え ば細菌またはウィルスに対して宿主を適切に防御するプロセスである。防御シス テムの秀逸な概説は、アイゼン、Ｈ，Ｗ、により提供されている（「マイクロバ イオロジー」第３版中、ハーバ−・アンド・ロウ、フィラデルフィア、ペンシル ベニア（１９８０）、２９０−２９５および３８１−４１８頁）。

接着プロセスに関与する内皮細胞表面上の分子の一つがＩＣＡＭ−１である。

この分子は、白血球の細胞表面に存在する糖蛋白質のＣＤ−１８、ＣＤ−１１／ １８群の分子に結合することにより接着を仲介することが示された（サンチェス −マトリ−１Ｆ１等、「ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディシン」 、１５８：１７８５−１８０３（１９８３）、カイツアー、Ｇ、　Ｄ、等、「ヨ ーロピアン・ジャーナル・オブ・イムノロジー」、１５：１１４２−１１４７（ １９８５））。

細胞間接着分子（ＩＣＡＭ−１）は、血管内皮細胞を含む様々な細胞型において 発現される誘導性細胞表面糖蛋白質であり、炎症部位で優先的に発現される。Ｉ ＣＡ、Ｍ−１はＬＦＡ−１の天然結合性リガンドであるため、ＩＣＡＭ−１−Ｌ ＦＡ−１相互作用は、細胞接着、炎症部位へのリンパ球の補充および特異的およ び非特異的炎症の両方に貢献するリンパ球機能の誘発において中心的役割を演じ ている。

Ｄ、ヒトリノウイルスに対する細胞レセプターアブラハム等（「ジャーナル・オ ブ・パイロロジー」、５１：３４０−３４５（１９８４））は、無作為に選ばれ たヒトリノウイルス（ｒＨＲＶゴ）血清型の大部分が同じ細胞レセプターに結合 し得ることを発見した。続いて、内皮細胞表面への主要血清型ＨＲＶの結合を遮 断し得るモノクローナル抗体は、コロン等により開発された（コロン等、Ｊ、Ｃ ｅ１１．　Ｂｉｏｃｈｅ＋＋、５ｖｐｐ１．　１０（Ｄ部）：２６６（１９８６ ）、コロン等、「ジャーナル・オブ・パイロロジー」、５７：７−１２（１９８ ６）、コロン等、ヨーロッパ特許出願公開第１６９１４６号）。この抗体により 認識される内皮細胞レセプター蛋白質が単離され、９０ｋｄ蛋白質であることが 見出された（トマッシ一二等、「ジャーナル・オブ・パイロロジー」、５８：２ ９０−２９５（１９８６）および後にＩＣＡＭ−１分子であることが示された（ スタウントン等、「セル」、５６：８４９−８５４（１９８９））。

ウィルスレセプターに対して指向したネズミモノクローナル抗体、ＩＣＡＭ−１ （ＥＰ３９１０８８）を用いた、リノウイルス感染、特に主要型ヒトリノウイル スによる感染の処置が提案された。

Ｅ、ＨＩＶによる感染 ＨｒＶ感染はエイズの原因である。ＨＩＶの２つの主要変異型：ＨＩＶ−１およ びＨＩＶ−２が報告されている。ＨＩＶ−１は化アメリカおよびヨーロッパで流 行しており、対照的にＨＩＶ−２はアフリカでのみ流行している。ウィルスは似 た構造を有し、似た機能をもつ蛋白質をコードする。２つの変異型の遺伝子およ び遺伝子産物のヌクレオチドおよび蛋白質配列は、互いに約４０％の相同性を有 することが見出された。

ＨＩＶ感染は、Ｔ４（「Ｔヘルパー」）リンパ球の表面に存在するレセプター分 子ｆ「ＣＤ４Ｊと呼ばれる）へのウィルス蛋白質ｆｆｇｐ１２０Ｊと呼ばれる） の結合により行なわれると考えられている（シュニットマン、Ｓ、Ｍ、等、「ジ ャーナル・オブ・イムノロジー」、１４１：４１８１−４１８６（１９８８）、 これを引用して説明の一部とする）。次いで、ウィルスは細胞に侵入し、最終的 にはＴ細胞の死をもたらすプロセスで複製を続行する。個体のＴ４集団の破壊は 、ＨＩＶ感染の直接的結果である。ＨＩＶは、末梢血単核細胞およびヒト血しよ うから採取され得る（Ｊ、Ｃｌ１ｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、、２６＋２３７１ −２３７６（１９８８）、「ニューイングランド・ジャーナル・オブ・メディシ ン」、３２１コ１６２１−１６２５（１９８９））。結果は先に評価されたもの よりも高率のウィルス血症を示唆し、Ｔ細胞感染頻度は１％程度の高さである。

Ｔ細胞が破壊された結果、感染患者が日和見感染症と戦う能力は損なわれる。

エイズにり患した個体は癌を発症することが多いが、これらの癌およびＨＩＶ感 染間の関係はほとんどの場合不離かである。

Ｔ（ｒＶウィルスの単なる複製は感染細胞にとって致命的ではあるが、一般的に はかかる複製は感染個体のＴ４細胞の小フラクションからしか検出されない。幾 つかの研究ラインにより、ＨＩＶウィルスがＴ４集団の破壊を仲介している他の 機構が解明された。

Ｈ１Ｖ複製による場合に加えて、ＨＩＶ感染細胞は細胞傷害性キラー細胞の作用 により破壊され得る。キラー細胞は通常ヒトに存在しており、宿主を監視し、遭 遇し得る異質細胞（例えば不適合の輸血または臓器移植など）を全て破壊する役 割をもつ。ＨＩＶに感染すると、Ｔ４細胞の細胞表面上にｇｐ１２０分子が現れ る。

キラー細胞はそれらのＴ４細胞を外来のもの（天然の細胞ではない）として認識 し、従ってそれらの破壊を仲介する。

ＨｒＶ感染はまた、健康な非感染細胞の破壊を誘導し得る。感染細胞は、血液系 へｇｐ１２０蛋白賀を分泌し得る。次いで、遊離８９１２０分子は、健康な非感 染細胞のＣＤ４レセプターに結合し得る。この結合により、細胞はＨＩＶ感染細 胞の外観を獲得する。細胞傷害性キラー細胞は、非感染Ｔ４細胞に結合したｇｐ １２０を認識し、細胞が異質のものであるという結論を下し、Ｔ４細胞の破壊を 仲介する。

Ｊ（ＴＶがＴ４の死を誘発し得る追加的機構および本発明にとって特に興味深い ものの一つは、「シンジチア（ｓｙｎｃｙｔｉａ）Ｊの形成による場合である。

「シンシチウム」は、数百ものＴ４細胞の融合から形成される多核巨大細胞であ る。ＨＩｖｇ染によって、感染細胞は他のＴ４細胞との融合が可能になる。それ らの融合相手はそれら自体ＨＩＶ感染し得るか、またはそれらは健康な非感染細 胞であり得る。

シンシチウムは融合し得す、すぐに死ぬ。その死によって、ＨＩＶ感染およびＨ ＩＶ非感染Ｔ４細胞が両方とも破壊される。このプロセスは、Ｔ４細胞の直接的 細抱−細胞接触を必然的に伴うため、本発明にとって特に興味深いものである。

Ｔ４感染細胞がシンジチアを形成し得るということは、それらの細胞が健康な細 胞との融合手段を獲得したことを示している。すなわち、細胞−細胞接触は、Ｈ ＩＶ感染が個体内の一細胞から別の細胞へと伝達されるプロセスにおいては根本 的に重要であり得る。

ＨＩＶ感染および特にＨＩＶ−１感染は、白血球インテグリンの細胞表面発現お よびこれらのへテロダイマーにより仲介される細胞接着反応に影響を及ぼすと思 われる（ベティット、ＡＪ、等、「ジャーナル・オブ・クリニカル・インベステ ィゲーション」、７９：１８８（１９８７）、ヒルドレス、Ｊ、Ｅ、に、等、「 サイエンス」、２４４＋１０７５（１９８９）、バレンチン、Ａｏ等、「ジャー ナル・オブ・イムノロジー」、１４４：９３４−９３７（１９９０）、ロッセン 、Ｒ，Ｄ、等、ｒＴｒａｎｓ、　Ａｓ５ｏｃ、アメリカン・フィジシャンズ」、 １０２：１１７−１３０（１９８９）、これらを全て引用して説明の一部とする ）。ＨＩＶ−１に感染すると、ＣＤ１８、ＣＤ１１ｂの細胞表面発現の場合と同 様、Ｕ９３７細胞の同型集合体が増加する（ベティット、ＡＪ、等、［ジャーナ ル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション」、７９：１８８（１９８７） ）。ＨＩＶ−１感染Ｕ９３’ｌｌ’ｌｉ＆は１．？感染Ｕ　９３７細胞よりも高 い頻度でＩＬ−１刺激された内皮に接着する。この行動は、抗ＣＤ１８または抗 ＣＤ１１ａモノクローナル抗体で感染細胞を処理するか、または抗ＩＣＡＭ−１ で内皮基質を処理することにより抑制され得る（ロッセン、Ｒ，Ｄ。

等、ｒＴｒａｎｓ、　Ａｓ５ｏｃ　アメリカン・フィジシャンズ」、１０２：１ １７−１３０（１９８９））。また、ＣＤ１８またはＣＤ１１ａに対するモノク ローナル抗体は、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）−刺激リンパ芽球様細胞およ び構造的に感染したＣＤ４陰性ＴＨＥ胞を含むシンジチアの形成を阻止し得るこ とが見出された（ヒルドレス、Ｊ、Ｅ、に、等、「サイエンス」、２４４：１０ ７５（１９８９））。抗ＣＤ１８または抗ＣＤ１１ａモノクローナル抗体でウィ ルス感染細胞のみを処理しても、シンシチウム形成にはほとんど影響しないこと が見出されたため、これらの抗体は主として非感染標的細胞を感染から防御する ことが示された（ヒルドレス、Ｊ、Ｅ。

に１等、「サイエンス」、２４４　：　１０７５（１９８９）、バレンチン、Ａ １等、「ジャーナル・オブ・イムノロジー」、１４４：９３４−９３７（１９９ ０））。バレンチン等（バレンチン、Ａｏ等、「ジャーナル・オブ・イムノロジ ーＪ、１４４：９３４−９３７（１９９０））は、連続Ｔ細胞株をＨＩＶ−１感 染Ｕ９３７細胞と共に培養したとき、ＣＤ１８に特異的なモノクローナル抗体が 形成されたシンジチアを阻止することを立証することによりこれらの観察結果を 確認した。

ＣＤ１８またはＣＤ１１ａに特異的なモノクローナル抗体がＨＩＶ感染細胞との 融合から感受性細胞を防御する機構はまだ未知の状態であり、本発明の正しい認 識には不必要であるが、放射性標識したｇｐ１２０による試験は、ＣＤ１８を含 むヘテロダイマーがウィルスの結合部位を提供しないことを示唆している（バレ ンチン、Ａ９等、「ジャーナル・オブ・イムノロジー」、１４４：９３４−９３ ７（１９９０））。すなわち、ＨＩＶ感染は、細胞−細胞相互作用、および／ま たは前記の細胞−細胞相互作用を擬態するウィルス−細胞相互作用を必然的に伴 う。細胞−細胞相互作用の結果、感染単核細胞の細胞質内の内皮バリアを通る細 胞−遊離ウィルスの輸送またはウィルスの輸送が行なわれ得る。細胞−細胞相互 作用を擬態するウィルス−細胞相互作用は、遊離ウィルスが健康な細胞に結合お よび／または感染するのを容易または可能にし得る。

すなわち、本発明は、部分的には、ＨＩＶ感染および特にＨＩＶ−１感染の結果 、ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８ヘテロダイマー、およびその結合リガンドＩＣＡＭ−１ の発現が増強されるという観察結果に由来する。この発現増強は、ＨＩＶ感染Ｔ 細胞が互いに接着または集合する（すなわち「同型集合」が行なわれる）能力を 高めるという点で意義深い。この同型集合が静止した正常白血球間で行なわれる ことは観察されていないため、この発見は、ＣＤＩＩ／ＣＤ１８レセプターおよ び／またはＩＣＡＭ−１の発現が前記集合に要求されることを示している。この 接着により、ＨＩＶ−１は感染細胞から個体の健康な細胞へと輸送され得、また 遊離ウィルスによる健康な細胞の感染が可能または容易になる。

ＩＣＡＭ−１は細胞−細胞相互作用において中心的役割を演じているため、ＩＣ ＡＭ−１に結合するネズミモノクローナル抗体は、ＨＩＶ感染の予防方法として 既に提案されている（Ｗ○９０／１３２８１）。

Ｆ、ＨＩＶ感染細胞の移動 白血球の移動および播種は、感染の成り行きから個体を防御するのに重要である 。しかしながら、これらのプロセスもまた、ウィルス感染白血球の移動および播 種に関与している。特に関心が集まるのは、ＨＩＶに感染した白血球の移動およ び播種である。それらの細胞の移動の結果、管外フォーカスが形成され、腫よう および他の異常が誘発される。

冒された臓器の組織検査は、焦点管外単核細胞浸潤物を示す。中枢神経系におけ るそれらの浸潤物からウィルス感染細胞を同定する試みにより、ＨＩＶ−１感染 細胞の存在が示された。これらの試験は、ＨＩＶ−１が主として単核細胞および マクロファージ、およびこのリネッジの他の細胞に存することを示した（Ｒ，Ｔ 。

ジョンソン等、ＦＡＳＥＢジャーナル、２：２９７０（１９８８）、Ｍ、Ｈ，ス トラー等、「ジャーナル・オブ・アメリカン・メディカル・アソシエーション」 、２５６：２３６０（１９８６）、Ｓ、ガードナー等、「ジャーナル・オブ・ア メリカン・メディカル・アソシエーション」、２５６＋２３６５（１９８６）、 Ｓ、ガードナー等、「サイエンス」、２３３：２１５（１９８６））。

以前、ＨＩＶ−１感染単核細胞様細胞の管外浸潤物の形成を刺激する機構は、充 分には解明されていなかった。これらの機構は、感染単核細胞の細胞質内の内皮 バリアを通る細胞−遊離ウィルスの輸送またはウィルスの輸送を含み得る。

ＨＩＶ−１感染は、内皮細胞に対する白血球の接着および血液から管外組織部位 への白血球の移動を容易にする分子の細胞表面発現を刺激するため（Ｃ，Ｗ、ス ミス等、「ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーションＪ、８２： １７４６（１９８８）、これを引用して説明の一部とする）、細胞移動を阻止し てＨＩＶ感染細胞の播種を防ぐ抗体の使用が提案された（Ｗ０９０／１３３１６ ）。

Ｇ、ぜん息：臨床的特徴 ぜん息は異種疾患である。それは、刺激因子に対する気管気管支の過剰応答を特 徴とする（マクファデン、Ｅ、Ｒ，等、「ハリソンズ・プリンシプルズ・オブ・ インターナル・メディシン」、第１０版中、ベータースドルフ、Ｒ，Ｇ、等編、 マクグロウーヒル、ニューヨーク（１９８３）、１５１２−１５１９頁、ケイ、 Ａ、　Ｂ、、「アラ−ジー・アンド・インフラメーション」、アカデミツク・プ レス、ニューヨーク（１９８７）、これらを引用して説明の一部とする）。臨床 的には、ぜん息では、気管気管支の広範囲な偏狭化、濃厚強粘性分泌物、呼吸困 難、咳およびぜん鳴の発作が現れる。これらの状態の各々の相対的誘因性は未知 であるが、最終的結果は、気道抵抗の増加、肺および胸部の過剰膨張、換気およ び肺血流の異常分布である。この疾患は、徴候の無い期間の合間に散在した急性 徴候の症状発現期間に現れる。急性症状発現の結果、低酸素症が発症し、致命的 になり得る。全世界の人口の約３％がこの病気にり患している。

２タイプのぜん息；アレルギー性ぜん息および特異体質性ぜん息が報告されてい る。アレルギー性ぜん息は、通常遺伝性アレルギー性疾患、例えば鼻炎、じんま 疹、湿疹等を伴う。この状態は、風媒抗原（例えば花粉、環境的または職業的汚 染物質等）の皮肉拒絶に対する陽性膨疹および激発（フレア）反応、およびＩｇ Ｅの血清レベル増加を特徴とする。アレルギー性ぜん息の発症は、多（の患者に おいてＩｇＥ抗体の存在に原因として関連していると思われる。上記特徴を呈し ないぜん息患者は、特異体質性ぜん息にり患していると考えられる。

アレルギー性ぜん息は、Ｔおよび８９２８球により制御され、マスト細胞結合前 形成１ｇＥ分子と風媒抗原の相互作用により活性化されるＩｇＥ応答に依るもの と考えられている。抗原性敵対は、個体を感作するためには長時間１ｇＥ産生を 導くのに充分な濃度で行なわれなければならない。一旦感作されると、ぜん息患 者は、非常に低レベルの抗原に応じて徴候を呈し得る。

ぜん息の徴候は、誘発性抗原、環境因子、職業因子、身体的運動および感情的緊 張の存在およびレベルにより増悪し得る。

ぜん息は、メチルキサンチン類（例、テオフィリン）、ベーターアドレナリン作 用性アゴニスト（例、カテコールアミン、レゾルシノール、サリゲニンおよびエ フェドリン）、グルココルチコイド類（例、ヒドロコルチゾン）、マスト細胞か 粒消失の阻害剤（クロモン類、例えばクロモリンナトリウム）および抗コリン作 用薬（例、アトロビン）により処置され得る。

ぜん息は、肺組織への好酸球の流入（「好酸球増加」）を伴うと考えられている （フリガス、Ｅ３等、Ｊ、Ａｌｌｅｒｇｙ　Ｃ１１ｎ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、、７７ ：５２７−５３７（１９８６）、この一部を引用して説明の一部とする）。

ぜん息の免疫学的基礎に対する洞察は、気管支肺胞洗浄試験（ゴダード、Ｐ、等 、Ｊ、　Ａｌｌｅｒｇｙ　Ｃ１１ｎ、Ｉｍａｕｎｏｌ、、７０：８ｇ（１９８２ ））および上皮から削剥した呼吸器平滑筋の試験（フラバハン、Ｎ、　Ａ、等、 「ジャーナル・オブ・アプライド・フィジオロジー」、５８：８３４（１９８５ ）、バルネス、Ｐ、Ｊ、等、「ブリティッシュ・ジャーナル・オブ・ファーマコ ロジーＪ、８６：６８５（１９８５））から得られた。これらの試験はぜん息の 免疫学の根底にある機構の解明には達しなかったが、それらは、病気の免疫学的 原因に関して一般的に許容されている仮説の発展を導いた（フリガス、Ｅｌ等、 Ｊ、　Ａｌｌｅｒｇｙ　Ｃ１１ｎ、Ｉ＋ｍｕｎｏｌ、、７７：５２７−５３７（ １９８６）参照）。

ぜん息の病理の顕著な特徴は、好酸球による肺柔組織の大量浸潤および粘膜繊毛 能力の破壊である。「好酸球仮説ｊは、好酸球が気管支に誘引されることにより 、肺のマスト細胞から放出された有害な仲介物質を中和することを示唆している 。

この仮説によると、好酸球は、それらが脱か粒して細胞傷害性分子が放出される 気管支に誘引される。脱か粒時、好酸球は、マスト細胞の有害な仲介物質を酵素 的に中和する酵素、例えばヒスタミナーゼ、アリールスルファターゼおよびホス ホリパーゼＤを放出する。またこれらの分子は、粘膜繊毛器官の破壊を促進する ため、気管支分泌の清掃を阻止し、ぜん息特有の肺損傷の一因となる。

ぜん息は細胞の移動を伴うため、この移動を阻止することにより対象におけるア レルゲンの作用を緩和する抗体の使用が提案された（Ｗ０９０／１０４５３）。

Ｈ０結論 炎症を患う患者に特に抗ＩＣＡＭ−１抗体を投与することによる白血球仲介性炎 症の処置（ＥＰ−０２８９９４９およびＥＰ−０３１４８６３参照）、感染を患 う患者に特に抗ＩＣＡＭ−１抗体を投与することによるウィルス感染の処置（Ｅ Ｐ３９１０８８）、特に抗ＩＣＡＭ−１抗体を投与することによる対象のＨＩＶ 感染の阻止（Ｗ０９０／１３２８１）、特に抗ＩＣＡＭ−１抗体を投与すること によるＩ（ｒＶ感染細胞の播種の阻止（Ｗ０９０／１３３１６）、および特に抗 ＩＣＡＭ−１抗体を投与することによるアレルゲンの作用の緩和（ＷＯ９０／１ ０４５３）が以前に提案されている。

ＥＰ２８９９４９は、上記引用の治療に好ましい抗体である、ＩＣＡＭ−１に対 する特異性を有するネズミモノクローナル（Ｒ６−５−Ｄ６）の製造について記 載している。Ｒ６−５−Ｄ６（７）試料は、１９８７年１０月３０日１：ＡＴＣ ＣＨＢ９５８０寄託物としてアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに 寄託された。Ｒ６−５−Ｄ６は、ＥＰＣの規則２８（４）の規定の下でＡＴＣＣ に寄託された。

上記処置方法の基礎である現在利用可能な抗ＩＣＡＭ−Ｉ　ＭＡｂは、ネズミＭ Ａｂであり、その結果として、反復用量でヒト患者に投与された場合、重大なＨ ＡＭＡ応答を誘発し易い。これらの潜在的に非常に有用な抗体の適当な人体適応 化または他の適当な組換えＤＮＡ操作により、この望ましくないＨＡＭＡ応答を 減少または完全破壊し、すなわちそれらの用途を拡張および拡大することは、非 常に望ましい。また、これらの抗体に組換えＤＮＡテクノロジーの技術を適用し て、一般に抗ＩＣＡ、Ｍ−１人体適応化キメラ抗体を製造することも望ましい。

我々は、ネズミＭＡｂに由来する抗ＩＣＡＭ−１キメラ人体適応化抗体分子を製 造した。

発明の要旨 本発明は、キメラ抗体分子の構築方法を提供する。具体的には、本発明は、抗Ｉ ＣＡＭ−１抗体の重および／または軽鎖可変領域を含むキメラ抗体分子を提供す る。

さらに本発明は、検出可能な形で標識された本発明キメラ抗体に関するものであ る。

さらに本発明は、抗ＩＣＡＭ−１人体適応化キメラ抗体分子の製造方法を提供す る。

さらに本発明は、キメラ抗ＩＣＡＭ−１抗体の重または軽鎖可変領域をコードす るＤＮＡを提供する。

さらに本発明は、本発明のキメラ抗体を発現し得る組換えＤＮＡ分子を包含する 。

さらに本発明は、本明細書に開示された組換えＤＮＡ分子により形質転換された 場合に本発明のキメラ抗体を産生じ得る宿主細胞を包含する。

さらに本発明は、本発明キメラ抗体の診断的および治療的用途を包含する。

さらに本発明は、は乳類対象における特異的防御系の応答から生じる炎症の処置 方法であって、処置を必要とする対象に、炎症の抑制に充分な量の抗炎症剤を与 えることを含み、前記抗炎症剤がＩＣＡＭ−１に結合し得る人体適応化キメラ抗 体である方法を提供する。

さらに本発明は、ヒトおよび他のは乳類における非特異的炎症の処置方法を提供 する。

詳細には、本発明は、は乳類対象における特異的および非特異的防御系の応答か ら生じる炎症の処置方法であり、処置を必要とする対象に、炎症の抑制に充分な 量でＩＣＡＭ−１に結合し得る抗炎症剤を与えることを含み、前記抗炎症剤がＩ ＣＡＭ−１に結合し得る人体適応化キメラ抗体である方法を含む。

さらに本発明は、上記炎症処置方法であって、炎症が、成人呼吸窮迫症候群、敗 血症続発性の多重臓器損傷症候群、外傷続発性の多重臓器損傷症候群、心筋また は他の組織の再潅流損傷、急性糸球体硬化症、反応性関節炎、急性炎症成分を伴 う皮膚病、急性化膿性髄膜炎または他の中枢神経系炎症疾患、例えば卒中、熱傷 、血液透析、ルーカフニレシス（ｌｅｕｋａｐｈｅｒｅｓｉｓ）、漬よう性大腸 炎、クローン病、壊死性全腸炎、か粗球輸血関連症候群およびサイトカイン誘導 毒性から成る群から選択される状態を伴うものである方法を包含する。

さらに本発明は、移動に関してＬＦＡ−１群の機能的構成員を必要とする細胞で ある造血層よう細胞の転移抑制方法であって、処置を必要とする対象に、転移抑 制に充分な量の抗炎症剤を与えることを含み、前記抗炎症剤がＩＣＡＭ−１に結 合し得る人体適応化キメラ抗体である方法を提供する。

さらに本発明は、ＩＣＡＭ−１発現性腫よう細胞増大の抑制方法であって、処置 を必要とする対象に、増大抑制に充分な量の毒素を与えることを含み、前記毒素 が本発明キメラ抗体の一つに誘導体化される方法を提供する。

さらに本発明は、炎症の存在が疑われるは乳類対象における特異的防御系の応答 から生じる炎症の存在および位置の診断方法であって、（ａ）対象に、ＩＣＡＭ −１を発現する細胞を同定し得る検出可能な形で標識されたキメラ抗体を含む組 成物を投与し、（ｂ）結合性リガンドを検出する ことを含む方法を提供する。

さらに本発明は、炎症の存在が疑われるは乳類対象における特異的防御系の応答 から生じる炎症の存在および位置の診断方法であって、（ａＨｃＡＭ−１を発現 する細胞を同定し得る検出可能な形で標識されたキメラ抗体を含む組成物と対象 の組織試料とをインキュベーションし、（ｂ）結合性リガンドを検出する ことを含む方法を提供する。

さらに本発明は、ＩＣＡＭ−１発現性腫よう細胞の存在が疑われるは乳類対象に おける前記細胞の存在および位置の診断方法であって、（ａ）対象に、ＩＣＡＭ −１に結合し得る検出可能な形で標識されたキメラ抗体を含む組成物を投与し、 （ｂ）結合性リガンドを検出する ことを含む方法を提供する。

さらに本発明は、ＩＣＡＭ−１発現性腫よう細胞の存在が疑われるは乳類対象に おける前記細胞の存在および位置の診断方法であって、（ａ）対象の組織試料と 、ＩＣＡＭ−１に結合し得る検出可能な形で標識されたキメラ抗体を含む組成物 とをインキュベーションし、（ｂ）結合性リガンドを検出する ことを含む方法を提供する。

さらに本発明は、 （ａ）ＩＣＡＭ−１に結合し得るキメラ抗体から成る抗炎症剤、および（ｂ）デ クサメタゾン、アザチオプリンおよびシクロスポリンＡから成る群から選択され る少な（とも１種の免疫抑制剤を含む医薬組成物を包含する。

本発明はまた、抗ウイルス療法においてＩＣＡＭ−１に結合し得るキメラ抗体の 用途に関するものである。

詳細には、本発明は、処置を必要とする個体において、ウィルスがＩＣＡＭ−ル セプターに結合するウィルス感染の処置方法であって、ウィルス感染抑制に充分 な量のＩＣＡＭ−１に結合し得るキメラ抗体を個体に与えることを含む方法を提 供する。

さらに本発明は、白血球のＨＩＶ感染の抑制方法であって、ＨＩＶに暴露された かまたは冒された患者に、有効量の１（ＩＶ−１感染抑制剤を投与することを含 み、前記薬剤がＩＣＡＭ−１に結合し得るキメラ抗体である方法を提供する。

さらに本発明は、ＨＩＶがＨＩＶ−１である場合の上記方法の実施態様に関する ものである。

さらに本発明は、ウィルス感染した白血球を有する患者における前記白血球の管 外移動を抑制する方法であって、白血球がＩＣＡＭ−１に結合する能力を傷つけ るキメラ抗体の有効量を患者に投与することを含む方法を提供する。

さらに本発明は、ウィルス感染した白血球がＨＩＶ感染している場合の上記方法 の実施態様を含む。

さらに本発明は、薬剤がＩＣＡＭ−１に結合し得るキメラ抗体である場合の上記 方法の実施態様を含む。

さらに本発明は、患者におけるぜん息の処置方法であって、ＩＣＡＭ−１に結合 し得るキメラ抗体の治療有効量を患者に投与することを含む方法を提供する。

さらに本発明は、ｒｃＡＭ−１に結合し得るキメラ抗体がネズミモノクローナル 抗体Ｒ６−５−６０に由来する場合の上記方法の実施態様に関するものである。

図面の簡単な記載 図１は、Ｒ６−５−Ｄ６ネズミＭＡｂ軽鎮に関する５゛非翻訳領域、シグナル配 列、可変領域および一部定常領域のｃＤＮＡ配列を示す。

図２は、Ｒ６−５−Ｄ６ネズミＭＡｂｔ鎖に関する同様のｃＤＮＡおよびアミノ 酸配列を示す。

図３は、プラスミド発現ベクターｐＥＥ６ｈＣＭＶのプラスミドの図を示す。

図４は、軽鎖発現プラスミドｐＡＬ５の構築ストラテジーを示すプラスミドの図 を示す。

図５は、重鎮発現プラスミドｐＡＬ５の構築ストラテジーを示すプラスミドの図 を示す。

図６は、組換えおよびネズミＲ６−５−Ｄ６および対照ＭＡｂＵＰＣ１０の結合 を含む競争検定の結果を与えるグラフを示す。

図７は、キメラ軽鎖発現ベクターｐＡＬ７の構築ストラテジーを示すプラスミド の図を示す。

図８は、キメラ重鎖（１ｇＧ２アイソタイプ）発現ベクターｐＡＬ８の構築スト ラテジーを示すプラスミドの図を示す。

図９は、キメラ重鎖発現ベクターｐＡＬ８およびｐＡＬ９の概略的制限地図を示 す。

図１０は、ＧＳ増幅キメラ軽鎖発現ベクターｐＡＬ１０の構築に関与する方法を 示すプラスミドの図を示す。

図１１は、ＧＳＳキラ重鎖（１ｇＧ２アイソタイプ）発現ベクターｐＡＬ１２の 構築に関する同様のプラスミドの図を示す。

図１２は、キメラ重ＭｉＣＩｇＧ４アイソタイプ）に関する同様の図を示す。

図１３は、非還元および還元条件下における５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。各レ ーン上の表示は、一時的発現実験で使用される遺伝子の型を記載している。

ｍＬ　マウス軽　ｃＬ　キメラ軽 γ４キメラγ４重　ｍＨマウス重 γ２キメラγ２重　Ｒ７２，３対照ｃＬ／ｃＨ遺伝子図１４は、精製キメラ抗Ｉ ＣＡＭ−１抗体または（Ａ）非還元性および（ｂ）還元性ゲルの５ＤＳ−ＰＡＧ Ｅ分析を示す。

各ゲルにおいて、 レーンｌは、対照キメラＢ７２．３抗体（１ｇＧ４）である。

レーン２は、ファーマシア低分子量マーカーである。

レーン３−９は、キ、１５抗ＩＣＡＭ　１ｇＧ２、ｆＨａ希釈中４８ｇ−０，１ ２５ａｇである。

レーン１０は、ファーマシア低分子量マーカーである。

レーン１１−１７は、キメラ抗ＩＣＡＭ　１ｇＧ４、倍加希釈中４８ｇ−０，１ ２５μｇである。

図１５は、１ｇＧ２および１ｇＧ４アイソタイプのキメラ抗ＩＣＡＭ−１抗体の ＨＰＬＣゲルろ過を示す。

プロフィールは重ね合わせられ得、１５０ｋｄテトラマ一抗体に対応する時点で 溶離する。

図１６および１７は、標準物質に対するキメラ抗体の結合検定のグラフを示す。

図１８．１９および２ｏは、標準物質に対するキメラ抗体の競争結合検定のグラ フを示す。

図２１は、抗体によるＭＬＲの阻止を示す。

図２２は、抗体による修正シュバルッマン検定における血管透過性の阻止を示す 。

好ましい態様の簡単な説明 Ａ０人体適応化抗体 本発明の第１の態様は、抗ＩＣＡＭ−１抗体の重鎮および／または軽鎖可変領域 を含有するキメラ抗体分子を提供する。

典型的な抗ＩＣＡＭ−１抗体はネズミ（げっ書類）ＭＡｂである。

とりわけ、本発明の第１の態様では、キメラ抗体は人体適応化キメラ抗津分子で ある。この場合、キメラ抗体は、ヒト抗体の重鎮および／または軽鎖定常領域ド メインに結合した非ヒト（例えばげっ書類）抗ＩＣＡＭ、−１抗体の重鎖および ／または軽鎖可変領域を含有する。このような人体適応化キメラ重鎖および／ま たは軽鎖をコードするＤＮＡは、ヒト定′１ｇ；領域ドメインをコードするＤＮ Ａに結合する非ヒト可変領域ドメインをコードするＤＮＡを含有する。

本発明のキメラ抗体分子は以下のものを含有してよい：重鎖および軽鎖の全長を 有する完全抗体分子；それの断片、例えばＦａｂまたは（Ｆｅｂ’）ｚ断片：そ れの断片または抗ＩＣＡＭ−１抗体と同じ特性を有する任意のキメラ抗体分子を 含有する軽鎖もしくは重鎮単量体または二量体。

本発明のキメラ抗体は、抗体の「化学的誘導体」でもよい。本明細書では、分子 が通常の分子の一部ではなく、付加的な化学的修飾を行った部分を含有する場合 、分子を「化学的誘導体」と称することとする。このような部分は、分子の溶解 性、吸収、生物学的半減期等を改善することができる。この部分は、また別に、 分子の毒性の低下、分子のあらゆる望ましくない副作用を排除または軽減等をさ せることができる。このような効果をもたらすことができる部分は、レミントン ズファーマシューティカル・サイエンシズ（１９８０年）に開示されている。「 毒素誘導化」分子は「化学的誘導体」の特定の種類のもので構成される。「毒素 誘導化」分子は、毒素部分を含有する分子（例えばＩＣＡＭ−１または抗体）で ある。このような分子が細胞に結合すると、毒素部分が細胞に非常に近接し、そ れにより細胞死が促進される。任意の適当な毒素部分を用いることができる；し かしながら、例えばリチン毒素、ジフテリア毒素、放射性同位元素毒素、膜チャ ネル形成毒素等を用いるのが好ましい。分子にこのような部分を結合させる方法 は当業界で周知である。また別法として、キメラ抗体をマクロサイクルに付着さ せて重金属原子をキレートすることができる。

また別に、組み換えＤＮＡ工学の方法を用いて、完全抗体分子のＦｃ断片または ＣＨ３領域がペプチド連結により機能的非免疫グロブリンタンパク、例えば酵素 または毒素分子で置換した。またはそこに付着したキメラ抗体の「化学的誘導体 ゴを産生ずることができる。

人体適応化キメラ抗体分子の場合、分子の残存部分は任意の適当なヒト免疫グロ ブリンから誘導できる。ヒト定常領域は、抗体の意図される機能、とりわけ必要 とされるエフェクター機能に注目して選択することができる。例えば、不変領域 は、ヒトＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＧまたはＩｇＭ領域である。とりわけ、ＩｇＧヒ ト定常領域は、任意のＩｇＧ１、ＩｇＧ２．１ｇＧ３およびｒｇＧ４アイソタイ プを含めて使用することができる。このように、ＩｇＧ２または好ましくはＩｇ Ｇ４アイソタイプは人体適応化キメラ抗体が治療を目的とする場合に用いること ができ、例、ｔｌｆｌＣＡＭ−１−ＬＦＡ−１相互作用を遮断するための抗体エ フェクター機能を欠失していることが必要である。キメラＩｇＧ抗ＩＣＡＭ−１ 抗体はアイソタイプに応じて結合活性が異なり、これが治療の選択に影響を及ぼ すことができる。１ｇＧ１ヒト定常領域を用いるのか最も好ましい。我々はＩｇ Ｇ１キメラ抗体が、恐ら＜ＩｇＧ１蝶番の柔軟性がより大きく、抗原に対する２ 価の結合を促進するために、Ｉ　ｇＧ　２またはＩｇＧ４よりもＩＣＡＭ−１に 対してより高度な結合活性を有するのであろうということを見出した。

人体適応化キメラ抗体分子の残存部分は、ヒト免疫グロブリンがらのタンパク配 列のみを含む必要はない。例えば、ヒト免疫グロブリン鎖の一部をコードするＤ ＮＡ配列が、ポリペプチドエフェクターまたはリポータ−分子のアミノ酸配列を コードするＤＮＡ配列に融合される遺伝子を構築することができる。

本発明のキメラ抗体分子は組み換えＤＮＡ工学により産生ずるのが好ましい。

本発明の第２の態様では、抗ＩＣＡＭ−１抗体の重鎮または軽鎖可変領域をコー ドするＤＮＡを提供する。

本発明の第３の態様は、以下の方法を含む抗ＩＣＡＭ−１人体適応化キメラ抗体 分子の産生方法を提供する： （ａ）発現ベクターにおける、少なくとも可変領域は非ヒト（げっ菌類）抗ＩＣ ＡＭ−１抗体から誘導し、抗体鎖の残りの免疫グロブリン由来部分はヒト免疫グ ロブリンから誘導する抗体重鎮または軽鎖をコードするＤＮＡ配列を有するオペ ロンの産生： （ｂ）発現ベクターにおける、少なくとも可変領域が非ヒト（げっ菌類）抗ＩＣ ＡＭ−１抗体から誘導し、抗体鎖の残りの免疫グロブリン由来の部分はヒト免疫 グロブリンから誘導する、相補的抗体軽鎖または重鎮をコードするＤＮＡ配列を 有するオペロンの産生： （Ｃ）宿主細胞をそのまたは個々のベクターによりトランスフェクトすること： および （ｄ）トランスフェクトしたセルラインを培養して人体適応化キメラ抗体分子を 産生ずること。

セルラインは２種のベクターでトランスフェクトでき、第１のベクターは軽鎖由 来のポリペプチドをコードするオペロンを含有し、第２のベクターは重鎮由来の ポリペプチドをコードするオペロンを含有する。ベクターは、コード化配列のみ を除いて同等であり、選択可能なマーカーは各ポリペプチドを等しく発現するこ とをできる限り確実にするように関与するのが好ましい。

また別に、軽鎖および重鎮の両方に由来するポリペプチドをコードする配列を含 む単一のベクターを用いることができる。

軽鎖および重鎮のコード化配列のＤＮＡは、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ、もし くはその両方を含有してよい。しかしながら、重鎮または軽鎖をコードするＤＮ Ａ配列が、ゲノムＤＮＡを少なくとも部分的に含有するのが好ましい。重鎮また は軽鎖コード化配列がｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡの融合体を含有するのが最も 好ましい。

従って、本発明はまた、本発明の方法で用いたクローニングおよび発現ベクター 並びにトランスフェクトしたセルラインをも含む。

ベクターを構築する一般法、トランスフェクション方法および培養方法は、本質 的に周知であり、本発明には包含されない。このような方法は、例えばマニアチ スら、モレキュラー・クローニング、コールド・スプリング・ハーバ−、ニュー ヨーク（１９８２年）；およびプリムローズおよびオールド、プリンシプルズ・ オブ・ジーン・マニピユレーション、ブラックウェル、オックスフォード（１９ ８０年）に示されている。

本発明の抗ＩＣＡＭ−１抗体は、抗ＩＣＡＭ−１特性を全て含む。しかしながら 、典型的なものでは、抗体は、抗体ブロックにより結合される場合にＩＣＡＭ− １／ＬＡＦ−１および／またはＩＣＡＭ−１／Ｍａｃ−１相互作用を阻害するか 、そうでなければ、改変するＩＣＡＭ−１の抗原エピトープに対する特異性を有 する。抗体は、Ｒ６−５−０６等と同一または類似のＩＣＡＭ−１抗原決定基に 対する特異性を有するのが好ましい。最も好ましいのは抗体がＲ６−５−Ｄ６抗 体から誘導される場合である。

Ｂ、治療法および診断法 本発明は、本発明のキメラ抗体を含有する治療用および診断用組成物、並びにこ のような組成物の治療および診断における用途をも含む。

抗ＩＣＡＭ−１発明の産生物で行うことができる治療的用途は、抗ＩＣＡＭ−１ 抗体で行うことができる任意の治療的用途を含み、例えばヨーロッパ特許第０２ ８９９４９号、ヨーロッパ特許第０３１４８６３号および対応する出願に記載さ れている任意または全ての治療的用途を含む。

１、抗炎症剤 Ａ、特殊な炎症 ＣＤ１８またはＣＤ−１１／１８複合体の構成要素に対するモノクローナル抗体 は、内皮への結合（ハスカード、Ｄ、ら、ジャーナル・オブ・イムノロジ−１３ ７巻２９０１−２９０６頁（１９８６年））、ホモタイプの付着（ロートレイン 、Ｒ１ら、ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メジ２２１６３巻１１３２ −１１４９頁（１９８６年））、抗原およびミトゲン誘起のリンパ球増殖（ダビ グノン、Ｄ。

ら、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス・オ ブ・ジ・ユナイテッド・ステーブ・オブ・アメリカ７８巻４，５３５−４５３９ 頁（１９８１年））、抗体形成（フィッシャー、Ａ、ら、ジャーナル・オブ・イ ムノロジ−１３６巻３１９８−３２０３頁（１９８６年））、並びに細胞傷害Ｔ セル（クレンスキー、Ａ、Ｍ、ら、ジャーナル・オブ・イムノロジ−１３２巻２ １８０−２１８２頁（１９８４年）、マクロファージ（ストラスマン、Ｇ、ら、 ジャーナル・オブ・イムノロジ−１３６巻４３２８−４３３３頁ぐ１９８６年） ）、および抗体依存性細胞傷害反応に関与する全ての細胞（コール、Ｓ、ら、ジ ャーナル・オブ・イムノロジ−１３３巻２９７２−２９７８頁（１９８４年）） の溶菌活性のような全ての白血球のエフェクター機能を含む、白血球の多くの付 着依存性機能を阻害する。

上記機能の全てにおいて、抗体は白血球が、最終産物を阻害する適当な細胞性物 質に付着する能力を阻害する。これらの機能を阻害するためにポリクローナルお よびモノクローナル抗体の両方を用いることができるが、本発明はキメラ抗ＩＣ ＡＭ−１抗体を使用することにより改善を加える。

以前に論じたように、ＩＣＡＭ−１分子がＬＦＡ−１分子群の構成要素に結合す ることは、細胞の付着において中心的に重要である。付着の過程を経て、リンパ 球は外来性抗原の存在に関して動物を継続的に監視できる。これらの過程は正常 では望ましいが、器官移植拒絶反応、組織移植片拒絶反応および多くの自己免疫 疾患の原因でもある。従って、細胞の付着を低減または阻害することのできるい かなる手段も、器官移植（例えば腎臓）、組織移植片の受容者または自己免疫疾 患の患者には非常に望ましいであろう。

ＩＣＡＭ−１に結合可能なキメラ抗体は、哺乳類の対象において抗炎症剤として 非常に適している。重要なことに、このような薬物は、一般的な抗炎症剤および 非ヒト化抗体とは、これらが選択的に付着を阻害できるという点で異なり、通常 の薬物で見出される腎毒性のようなその他の副作用を引き起こさず、ネズミＭＡ ｂｓの使用に関連したＨＡＭＡの量を制限する。従って、ＩＣＡＭ−１に結合可 能なキメラ抗体は哺乳動物の対象において、このような副作用の恐れなしに器官 （例えば腎臓）もしくは組織の拒絶反応を防御する、または自己免疫反応を改変 するために用いることができる。

重要なことに、ＩＣＡＭ−１の認識可能な人体適応化抗体を用いると、ＨＬＡ不 適合な個体間でさえ器官移植を行うことができるようになる。

本発明の第４の態様において、特殊な炎症を抑制する方法を提供し、この方法は 本発明のキメラ抗体を炎症の抑制に十分量を、このような処置を必要とする受容 対象に供することを含む。薬物の用量、投与経路等が炎症を軽減または防御する のに十分な場合、量が炎症を「抑制する」のに十分であると称せられる。

キメラ抗体は単独もしくは１種またはそれ以上の別の免疫抑制剤と組み合わせて （とりわけ器官（例えば腎臓）または組織移植の受容者に）投与できる。このよ うな組成物は［予防」または「治療」目的のどちらかで投与できる。予防用に供 する場合、免疫抑制組成物は、器官または組織移植の時（例えば前に、その時、 または直後であるが、器官拒絶反応には先行してあらゆる炎症反応または症状に 先行して供する。組成物の予防的な投与により、続いておこるあらゆる炎症反応 （例えば移植した器官および組織等の拒絶反応）を防御または軽減する。治療用 に供する場合、免疫抑制組成物は急性炎症（例えば器官または組織の拒絶反応） の症状の発現時（または直後）に供する。組成物を治療的に投与すると、あらゆ る急性炎症（例えば移植した器官または組織の拒絶反応）を軽減する。

従って、本発明の抗炎症剤は、炎症の発現の前に予期される炎症を抑制するため に）、または炎症の発症後のどちらかに投与できる。

ＩＣＡＭ−１分子は主に炎症部位例えば遅延型過敏反応が起こる部位に発現する ため、ＩＣＡＭ−１分子に結合可能な抗体（とりわけ抗ＩＣＡＭ−１モノクロー ナル抗体から誘導されるキメラ抗体）は、このような反応を軽減または排除する 治療能力を有する。この治療的用途の可能性は、２種の方法のいずれかで利用で きる。第１に、ＩＣＡＭ−１に結合可能なキメラ抗体を含有する組成物を、遅延 型過敏反応を経験する患者に投与できる。例えば、このような組成物をツタ毒、 オーク毒などの抗原と接触していた患者に供してよい。

第６の態様において、本発明のキメラ抗体の１つを抗原と一緒に患者に投与し、 引き続いておこる炎症反応を防御する。このように、抗原をＩＣＡＭ−１結合キ メラ抗体と共に付加的に投与することにより、個体をその抗原が次に表れたとき に一時的に耐性化することができる。

ＬＦＡ−１を欠如するＬＡＤ患者には炎症反応が起こらないので、ＬＦＡ−１の 天然リガンド、ＩＣＡＭ−１の拮抗がまた炎症反応をも阻害するのであろうと思 われる。ＩＣＡＭ−１に対して抗体が炎症を阻害する能力は、慢性炎症性疾患お よび自己免疫疾患、例えばエリテマトーデス、自己免疫性甲状腺炎、実験的アレ ルギー性脳を髄炎（ＥＡＥ）、多発性硬化症、糖尿病レイノー症候群のある種の 形態、リウマチ柱間接炎等の処置において、治療に用いる基礎となる。このよう な抗体は乾癖の処置においても治療に用いることができる。一般的に、ＩＣＡＭ −１に結合能力のあるキメラ抗体は、ステロイド療法により一般に処置できる疾 患に用いることができる。

Ｂ、非特殊炎症 本発明は、内皮細胞のＩＣＡＭ−１が顆粒球−内皮細胞を付着させるのに必要な 顆粒球上で、Ｃ０１８分子群の構成要素に結合し、ＩＣＡＭ−１の拮抗物質がこ のような付着を阻害することができるという発見に由来する。このような阻害が 、一般的な非特殊組織炎症の処置方法を提供する。

細胞の付着は白血球が非特殊炎症部位に移動でき、および／または炎症に寄与す る種々エフェクター機能を実行できるために必要であるので、細胞の付着を阻害 する薬物はこの炎症を軽減または防御するであろう。「非特異的防衛機構反応」 は免疫学的な記憶能力のない白血球によりもたらされる反応である。このような 細胞には顆粒球およびマクロファージが含まれる。本明細書で用いる炎症は、炎 症が非特異的防衛機構の反応により誘起される、もたらされるまたは関与する場 合、非特異的防衛機構の反応の結果であると称せられる。少なくとも部分的には 非特異的防衛機構の反応の結果である炎症の実例には、例えば二数血症または外 傷により２次的におこる成人呼吸困難症候群（ＡＲＤＳ）または多発性器官傷害 症候群：心筋またはその他の組織の再潅流傷害：急性糸球体腎炎：反応性関接炎 ；急性炎症の部分を有する皮膚炎：急性化膿性随膜炎またはその他の中枢神経系 炎症性疾患、例えば発作：温熱傷害、血液透析；白血球搬出；潰瘍性大腸炎：ク ローン病；壊死性全腸炎；顆粒球輸血関連症候群；およびサイトカイン誘起毒性 のような状態に関連した炎症を含む。

本発明の第５の態様において、このような処置を必要とする対象に本発明のキメ ラ抗体の１つを有効量供することを含む、非特殊炎症の処置方法を提供する。

２、診断および予後用適用 ＩＣＡＭ−１は主に炎症部位に発現するので、ＩＣＡＭ−１に結合能力のあるキ メラ抗体は、患者の感染および炎症部位を想定または可視化する手段として用い ることができる。

本発明の第８の態様において、キメラ抗体は放射性同位元素、親和性標識（例え ばビオチン、アビジン等）、蛍光組織、常磁性原子等を用いることにより検出可 能なように標識化し、患者に供して感染または炎症部位を限局化する。このよう な標識化を達成する方法は当業界に周知である。診断の想定化における抗体の臨 床適用は、グロスマン、Ｈ，Ｂ、、ウロール、クリン、ノース・アメル、１３巻 ４６５−４７４頁（１９８６年）、アンガー、　Ｅ、　Ｃ，ら、インベスト、ラ ジオール。

２０巻６９３−７００頁（１９８５年）、およびカーラ、　Ｂ、　Ａ、ら、サイ エンス２０９巻２９５−２９７頁（１９８０年）に記載されている。

このような検出可能なように標識化した抗体の集中点の検出は、炎症または腫瘍 の発展部位を表示する。ある態様において、炎症のためのこの試験は、血球を含 む組織試料を除去し、このような試料を検出可能なように標識化した抗体の存在 下恒温培養することにより行われる。好ましい態様においては、この技術は、磁 気イメージング、蛍光写真法等を用いることにより非損傷的な方法で行う。この ような診断試験は器官移植の受容者の、潜在的な組織拒絶反応の初期の徴候を監 視するのに用いることができる。このような検定は、個体がリウマチ柱間接炎ま たはその他の慢性炎症性疾患の傾向があるかを決定したい時にも用いることがで きる。

３、治療または診断目的で投与した抗原物質の導入に対する補助治療用または診 断用薬物、例えばウシインスリン、インターフェロン、組織型プラスミノーゲン 活性化物質またはネズミモノクローナル抗体に対する免疫反応は、これらの薬物 の治療的または診断的価値を実質的に低下させ、実際に血清病のような病気を引 き起こし得る。このような状態は、本発明のキメラ抗体を用いることにより治療 することができる。この態様において、このような抗体は、治療用または診断用 薬物と組み合わせて投与できる。

本発明の第９の態様において、ＩＣＡＭ−１に特異的なキメラ抗体を有効量加え ることは、受容者の薬物認識を防御し、従って受容者の薬物に対する免疫反応の 開始を防御するために対象に投与することである。このような免疫反応の欠如は 、結果的に患者が治療用または診断用薬物の付加的な投与を受ける能力になる。

４、キメラ抗体の抗ウイルス的用途 本発明のもう１つの様相は、ＩＣＡＭ−１がある種のウィルスの細胞受容体であ り、従ってウィルスがヒト細胞に付着し感染するのに必要であることを発見した ことに関係する（グレー１．Ｊ、Ｍ、ら、セル５６巻８３９−８４７頁（１９８ ９年）ニスタウントン、　Ｄ、　Ｅ、ら、セル５６巻８４９−８５３頁（１９８ ９年）、これらは共にそのまま引用により本明細書に包含させる）。とりわけ、 ライノウィルス、および特に主要な面線型のライノウィルスは、細胞表面上に存 在するＩＣＡＭ−１分子に結合する能力により、感染をもたらすことができると いうことが見出されている。

本発明の第１０の態様は、ウィルス感染を処置するためにＩＣＡＭ−１に対し結 合能力を有するキメラ抗体を使用することを指示している。このような抗体はウ ィルスの接触のために内皮細胞のＩＣＡＭ−１を阻害できるので、これらの個々 の受容者に投与すると結果的にウィルス結合できる受容体が減少し、従って個体 の細胞に接触し感染するウィルスの率を低下させる。

ＩＣＡＭ−１はウィルス、とりわけビコルナビリンダー属内の主要な面線型のラ イノウィルス、Ａ群コクサッキーウイスル（コロノン、Ｒｊ、ら、ジャーナル・ オブ・ピロロジ−５７巻７−１２頁（１９８６年）およびメンゴウイスル（ロス マン、Ｍ、Ｇ、ら、ピロロジ−１６４巻３７３−３８２頁（１９８８年）と相互 に作用し、結合する能力がある。この相互作用はＩＣＡＭ−１分子の領域１に存 在するＩＣＡＭ−１アミノ酸残基によりもたらされる。しかしながら、このよう な相互作用はＩＣＡＭ−１の領域２および３に存在するアミノ酸の寄与により支 えられる。従って、この態様の好ましいキメラ抗体では、抗体はＩＣＡＭ−１の 領域１．２および３に結合する能力がある。さらに好ましいのは、ＩＣＡＭ−１ の領域１および２に結合能力のあるキメラ抗体である。最も好ましいのは、ＩＣ ＡＭ−１の領域１に結合能力のあるキメラ抗体である。

本発明の抗つイスル剤は、「予防」または「治療」目的で投与できる。予防用に 供する場合、抗つイスル剤はライスル感染のあらゆる症状に先行して（例えば感 染の前、その時または直後であるが、このような感染のあらゆる症状より先んじ て）供する。薬物を予防的に投与することにより、続いておこるあらゆるライス ル感染を防御もしくは軽減するか、またはこのような感染が別の人に伝染する可 能性を低下させる。

治療的に供する場合、抗つイスル剤は急性ライスル感染の症状（例えば鼻の充血 、発熱等）の発症時（または直後）に供する。薬物を治療的に投与することによ り、あらゆる急性のライスル感染を軽減する。

従って、本発明の抗つイスル剤は、（予期される感染を抑制するために）ライス ル感染の発現に先立って、がまたはこのような感染の発現後に投与できる。

５、ＨＩＶ感染の抑制およびＨＩＶ感染細胞の散在化の防御本発明の第１１の態 様は、ＨＩＶ感染を抑制する方法を提供し、この方法にはＨＩＶ感染した個体に ＨＩＶ感染抑制剤を有効量投与することを含む。本発明はとりわけＨＩＶ−１感 染を抑制する方法に関するものであるが、この方法は、本発明の薬物により抑制 できる方法で、細胞に感染する任意のＨＩＶ変異型（例えばＨＩＶ−２）に適用 できると理解すべきである。このような変異型は本発明の目的に関してＨＩＶ− １と同等である。

本発明の１つの様相は、ＬＦＡ−１および、ある場合はＨＩＶ感染により刺激さ れるＩＣＡＭ−１の発現が、感染細胞と非感染細胞との接触時間を増加させるこ とができる細胞−細胞間付着反応を促進し、ライスルの感染細胞から非感染細胞 への転移を助長するという認識から導かれる。従って、ＩＣＡＭ−１に結合能力 のあるキメラ抗体はＨＩＶ、とりわけＨＩＶ−１による感染を抑制することがで きる。

ＩＣＡＭ−１に結合する分子がＨＩＶ感染を抑制できる１つの方法は、ＨＩＶ感 染細胞により発現されるＩＣＡＭ−１が健常ＴセルのＣＤＩＩ／ＣＤ１８受容体 に結合する能力を低下させることによる。細胞がＣＤ１１ａ／ＣＤ１８受容体ま たはＩＣＡＭ−１リガンド分子に結合する能力を低下させるために、ＩＣＡＭ＝ １に結合可能なキメラ抗体を用いることができる。

本発明の薬物は、受容者である対象にＨＩＶ感染を抑制させるに十分量を投与す ることを目的とする。薬物の用量、投与経路等がこのようなＨＩＶ感染を軽減ま たは防御するのに十分な場合、用量がＨＩＶ感染を「抑制する」のに十分である と称せられる。薬物はＨＩＶ感染にさらされたまたは感染した患者に供される。

本発明のキメラ抗体は、ＨＩＶ感染の処置において「予防」かまたは「治療」目 的にできる。予防的に投与する場合、ライスル感染のあらゆる症状に先行して（ 例えばこのような感染の前、その時または直後であるが、このような感染のあら ゆる症状より先に）抗体を投与する。抗体を予防的に投与することにより、引き 続いておこるあらゆるＨＩＶ感染を防御または軽減させる。治療的に投与する場 合、抗体はライスル感染した細胞を検出した時（または直後）に投与する。抗体 を治療的に投与することにより、あらゆるさらなるＨＩＶ感染を軽減する。

従って、本発明の薬物は、ライスル感染の発現の前に（予期されるＨＩＶ感染を 抑制するために）、またはこのようなライスル感染した細胞を実際に検出した直 後に（さらなる感染を抑制するために）投与できる。

とりわけ、本発明はエイズのため治療を改善し、およびＨＩＶ感染、特にＨＩＶ −１感染を抑制するための手段を強化し、以下のものとの併用投与を含む：（Ｔ ）　ＩＣＡＭ−１、可溶性ＩＣＡＭ−１誘導体、ＣＤＩＩ（ＣＤ１１ａ、ＣＤ１ １ｂかまたはＣＤ１１ｃ）、可溶性ＣＤ１１誘導体、ＣＤ１８、可溶性ＣＤ１８ 誘導体、またはＣＤＩＩ／ＣＤ１８ヘテロニ量体、もしくはＣＤＩＩ／ＣＤ１８ ヘテロニ量体の可溶性誘導体および／または（ＩＩ）　ＩＣＡＭ−１に対して結 合能力のあるキメラ抗体であって、（ｍ）　ＣＤ４もしくは可溶性ＣＤ４に関連 する細胞または粒子を有し、および／または （ＩＶ）ＣＤ４に結合能力のある分子（好ましくは抗体または抗体断片）本発明 の第１２の態様において、ＨＩＶ感染した細胞の転移を抑制する方法をも提供し 、この方法は、ＨＩＶ感染した個体に抗転移剤を有効量投与することを含む。

本発明の抗転移剤には、ＨＩＶ感染したＴセルのＩＣＡＭ−１に対する結合能力 を劣化させることができる任意のキメラ抗体を含有する。ＩＣＡＭ−１に結合す るキメラ抗体は、ＨＩＶ−感染したＴセルが発現するＩＣＡＭ−１の、ＣＤ１１ ／ＣＤ１８受容体発現細胞への結合能力を劣化させることにより、転移を抑制す るのであろう。細胞のＣＤ１１ａ／ＣＤ１８受容体への結合能力を劣化させるた めに、ＩＣＡＭ−１に結合できるキメラ抗体を用いることができる。

本発明の薬物は、受容対象にＨｒＶ（またはその他のライスルで）感染したＴセ ルの転移を抑制するに十分な量を投与することを目的とする。薬物の投与量、投 与経路等がこのような転移を軽減または防御するのに十分な場合、用量はＴセル の転移を「抑制する」のに十分であると称せられる。

キメラ抗体は、「予防」または「治療」目的で投与できる。予防的に投与する場 合、キメラ抗体はライスル感染のあらゆる症状に先立って（例えばこのような感 染の前、その時または直後に、しかしこのような感染のあらゆる症状に先行して ）投与する。キメラ抗体を予防的に投与すると、引き続いておこるライスル感染 したＴセルのあらゆる転移を防御または軽減する。治療的に投与する場合、キメ ラ抗体はライスル感染したＴセルを検出した時（またはその直後）に投与する。

抗体を治療的に投与すると、このようなＴセルのあらゆるさらなる転移を軽減す る。

従って、本発明の抗体はライスル感染の発現より先に（感染したＴセルの予期さ れる転移を抑制するため）、かまたはこのようなライスル感染した細胞を実際に 検出した後に投与できる。

６、ぜん息の処置 本発明の第１３の態様において、ＩＣＡＭ−１に結合能力のあるキメラ抗体をぜ ん息の処置に用いる。

本発明の抗ぜん息薬の治療効果は、このような薬物を任意の適当な手段（すなわ ち静脈内、筋肉内、皮下、腸内つまり非経口）で患者に投与して得ることができ る。本発明の薬物は鼻スプレー、綿棒等で鼻の中に投与するのが好ましい。特に 、このような薬物を口内吸入すなわち口内用スプレーもしくは口内用エアロゾル により投与するのが好ましい。薬物を注射により投与する場合、連続注入または １回もしくは多回ポーラスにより投与できる。

本発明の抗ぜん息薬は、受容対象にぜん息の症状の重篤度、程度または期間を減 少または軽減するのに十分な量を投与することを目的とする。

本発明のキメラ抗体は、単独でまたは１つもしくはそれ以上のさらなる抗ぜん息 薬（例えばメチルキサンチン類（例えばテオフィリン）、ベーター・アドレナリ ンアゴニスト（例えばカテコラミン類、レゾルシノール類、ヤリゲニン類および エフェドリン）、糖質コルチコイド類（例えばハイドロコルチゾン）および抗コ リン剤（例えばアトロビン））と組み合わせて投与でき、ぜん息の症状の処置に 必要なこのような薬物の量を減らすことができる。

本発明のキメラ抗体は、「予防」または「治療」目的で投与できる。予防的に投 与する場合、キメラ抗体はあらゆるぜん息の症状に先行して投与する。キメラ抗 体を予防的に投与すると、引き続いておこるあらゆるぜん息の反応を防御または 軽減する。治療的に投与する場合、キメラ抗体はぜん息の症状の発症時（または その直後）に投与する。抗体を治療的に投与すると、あらゆる当面のぜん息の発 作を軽減する。従って本発明の抗体は、予期されるぜん息発作の発現より前に（ 予期される発作の重篤度、期間または程度を軽減するために）かまたは経験の開 始直後に投与することができる。

Ｃ１本発明の組成物の投与 ＩＣＡＭ−１に結合能力のあるキメラ抗体の治療効果は、患者に天然狭雑物を実 質的に含まないキメラ抗体を有効量投与することにより得ることができる。本明 細書に開示する本発明のキメラ抗体は、これらを含有する製剤が、これらの産生 物が通常および自然に共存する物質を実質的に含まない場合、「実質的に天然の 狭雑物を含有しない」と称せられる。

本発明は動物、組織培養かまたは組み換えＤＮＡの手段により産生できるキメラ 抗体にまで範囲を広げる。

患者にキメラ抗体を投与する場合、投与する薬物量は、患者の年齢、体重、身長 、性別、一般的な健康状態、以前の病歴等に応じて変化するであろう。

一般的に、受容者に約１ｐｇ／ｋｇから１　Ｏｎ／に、ｇ（患者の体重）の範囲 の用量で抗体を投与するのが望ましいが、これより低量または高量でも投与でき る。

ＩＣＡＭ−１に結合能力のあるキメラ抗体は、患者に静脈内、筋肉内、皮下、腸 内、局所吸入、鼻腔内すなわち非経口的に投与できる。抗体を投与する場合、連 続投与または１回もしくは多回ポーラスにより投与できる。

投与が受容患者にとって耐性がよければ、組成物は「医薬的に許容され得る」と 称せられる。このような薬物は、投与した量が生理学的に有意である場合、「治 療的に有効な量」と称せられる。薬物の存在が受容患者に検出可能な生理学的変 化をもたらす場合、この薬物は生理学的に有意である。

本発明のキメラ抗体は、公知の方法に準じて、医薬的に有用な組成物を調製する ために製剤化でき、それによりこれらの抗体は医薬的に許容され得る担体賦形剤 と混合物中に組み合わされる。適当な賦形剤およびそれらの製剤は、その他のヒ トタンパク、例えばヒト血清アルブミンを含めて、例えばレミントンズ・ファー マンニーティカル・サイエンシズ（第１６版、オソール、Ａ編、マック、イース トンＰＡ（１９８０年））に記載されている。効果的な投与に適した医薬的に許 容され得る組成物を作るために、このような組成物はキメラ抗体の有効量を適量 の担体賦形物と共に含有するであろう。

作用時間を調製するために、さらに医薬的方法を用いることができる。放出を制 御した製剤は、重合体を用いてキメラ抗体を複合体化または吸収させて作ること ができる。適当な高分子化合物（例えばポリエステル類、ポリアミノ酸、ポリビ ニル、ピロリドン、エチレンビニルアセテート、メチルセルロース、カルボキン メチルセルロースまたは硫酸プロタミン）および高分子化合物の濃度、並びに放 出制御のための封入方法を選択することにより、分配の制御を行うことができる 。放出制御した製剤により作用時間を制御するための別の可能な方法は、キメラ 抗体を重合体物質、例えばポリエステル類、ポリアミノ酸類、ヒドロゲル類、ポ リ（乳酸）またはエチレンビニルアセテート共重合体の粒子中に封入することで ある。また別に、抗体を重合体粒子の中に封入する代わりに、これらの物質をコ アセルベーション技法または界面重合化により製造されたマイクロカプセル、各 々例えばヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンマイクロカプセルおよびポ リ、メチルメタンレート）マイクロカプセル中に、またはコロイド状薬物分配機 構、例えばリポソーム、アルブミン微小球、ミクロ乳剤、ナノ粒子、およびナノ カプセルに、またはマクロ乳剤に補足することができる。このような技術はレミ ントンズ・ファーマシューティカル・サイエンシズ（１９８０年）に開示される 。

材料および方法 １、使用細胞 抗ＩＣＡＭ−１抗体を産生ずるハイブリドーマセルフラインＲ６−５−Ｄ６は、 ベーリンガー・インゲルハイム・ファーマシューテイカルズ・インコーポレーシ ョンより提供され（ロット番号Ｒ６−５−Ｄ６−Ｂ９−Ｂ２　０−２９−８６） 、グルタミンおよび５％ウン胎仔血清を補充した抗生物質不含ダルベツコ改変イ ーグルス培地（ＤＭＥＭ）中で成長させ、判定用の過成長上清およびＲＮＡ抽出 用細胞を得るために分割した。過成長させた上清は、ネズミＩｇ０２ａ／カッパ ー抗体を含有することが示された。細胞培養上清は、抗体Ｒ６−５−Ｄ６を含有 することを調べ、確認した。

２、分子生物学的方法 基本的な分子生物学的方法はマニアティスら（１９８２年）（マニアテイスら、 モレキュラー・クローニング、コールド・スプリング・ハーバ−、ニューヨーク （１９８２年））の方法をいくつかの点で少し改変したものであった。ＤＮＡ配 列決定はサンガーら（１９７７年）（サンガーら、プロシーディング・オブ・ナ ショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス・オブ・ジ・ユナイテッド・ステーブ ・オブ・アメリカ７４巻５４６３−５４６７頁（１９７７年））およびアメルシ ャム・インターナショナル・ブルク・シークエンジング・ハンドブックに報告さ れるように行った。ＣＯ８細胞発現および代謝標識化実験はライントルら（１９ ８７年）（ライントルら、プロット　エング、１．６巻４９９−５０５頁（１９ ８７年））に報告されるように行った。チャイニーズ・ハムスター卵巣（ＣＨＯ ）ｈランスフエクションおよび細胞培養はボルマン（１９８８年）（ゴルマン、 Ｃ，ＤＮＡクローニング２巻１４３−１９０頁版（１９８８年））およびベビン トンおよびヘントシエル（１９８８年）（ベビントンら、ＤＮＡクローニング３ 巻１６３−１８８頁版（１９８８年））に報告されるように行った。

３、研究検定 ３．１１分泌抗体軽鎖の検定 ＣＨＯセルラインからの上清は、軽鎖発現ベクターでトランスフェクションした 後、安定したセルラインを発展させる最初の段階として分泌した軽鎖を検定し、 全キメラ抗体を産生じた。方法は以下のとおりである：９６ウエルマイクロタイ タープレートをＦ　（ａｂ’　）　！ヤギ抗ヒトカッパ軽鎖で被覆した。プレー トを水で洗浄し、試料を加え、室温で１時間恒温培養した。プレートを洗浄し、 Ｆ　（ａｂ’　）２ヤギ抗ヒトＦ　（ａｂ’　）　２西洋ワサビペルオキシダー ゼ（ＨＲＰＯ）複合体を次に加え、さらに１時間恒温培養した。酵素基質を次に 加えて反応させた。

３．２、アセンブリー検定 アセンブリー検定は形質転換したＣＯ８細胞の上清およびトランスフェクトした ＣＨＯ細胞の上清で行い、無傷で存在するＩｇＧの量を測定した。

３、２．１．マウス遺伝子でトランスフェクトしたＣＯ８およびＣＨＯ細胞細胞 上清中での無傷マウスＩｇＧのアセンブリー検定は、以下の様式のＥＬＩＳＡで あった：ａｂウェルマイクロタイタープレートをＦ（ａｂ’）２ヤギ抗マウスＩ ｇＧＦｃで被覆した。プレートを水で洗浄し、試料を加え、常温で１時間恒温培 養した。プレートを洗浄し、Ｆ　（ａｂ’　）２ヤギ抗マウス１ｇＧＦ（ａｂ’ ）２（ＨＲＰ○複合化）を次に加えた。次いで酵素基質を加えて反応させた。Ｕ ＰＣＩＯ、マウスＩｇＧ２ａの骨髄腫を標準として用いた。

３２．２　キメラ遺伝子でトランスフェクトしたＣＯ８およびＣＨＯ細胞ＣＯ８ 細胞上清中の無傷ヒト抗体ＩＣＡＭ−１のアセンブリー検定は、以下の様式のＥ ＬＩＳＡであった： ９６ウエルマイクロタイタープレートをＦ　（ａｂ’　）２ヤギ抗ヒトＩｇＧＦ ｃで被覆した。プレートを洗浄し、試料を加え、室温で１時間恒温培養した。プ レートを洗浄し、モノクローナルマウス抗ヒトカッパ鎖を鎖、室温で１時間恒温 培養した。

プレートを洗浄し、Ｆ　（ａｂ’　）ｚヤギ抗マウスＩｇＧＦｃ（ＨＲＰＯ複合 化）を加えた。

次に酵素基質を加えて反応させた。キメラＢ７２゜３（ボッドマーら、国際特許 出願発行ＷＯ第８９１０１７８３号ＸＩｇＧ４）およびプールし精製したヒトＩ ｇＧ２および１ｇＧ４（ケミコン）を最初に標準として用いた。後に精製したキ メラＩｇＧ４抗ＩＣＡＭ−１を用いたが、これはキメラＩｇＧ１抗ＩＣＡＭ−１ を用いた研究の標準である。この検定でモノクローナル抗カッパ鎖を用いること により、キメラ抗体の量を標準から読み取れるようになる。

３．３　抗原結合活性の検定 ３、３．１　直接結合 ＣＯ８およびＣＨ○細胞上清からの物質および精製キメラ抗体は、ＩＣＡＭ−１ 陽性細胞での抗ＩＣＡＭ−１抗原結合活性を直接検定で検定した。方法は以下の とおりである。

ＪＹ細胞（ヒｌ−Ｂリンパ芽球類似セルラインで、細胞表面でＩＣＡＭ−１を構 造的に発現する）を培養中維持した。ＪＹ細胞の単一層を、ポリーＬ−リジンお よびバラホルムアルデヒドを用いて９６ウエルＥＬＩ　ＳＡプレート上に固定し 、プレートをウシ血清アルブミンのＰＢＳ溶液で遮断した。試料を単一層に加え 、室温で１時間恒温培養した。プレートはＰＢＳを用いて穏やかに洗浄した。次 にＦ（ａｂ’）ｔヤギ抗ヒトＩｇＧＦｃ（ＨＲＰＯ複合化）またはＦ　（ａｂ’ 　）ｚヤギ抗マウスＩｇＧＦｃ（ＨＲＰＯ複合化）をヒト化またはマウス試料に 適当に加えた。次いで酵素基質を加えて反応させた。細胞ベースの検定の陰性対 照はキメラＢ７２．３（１ｇＧ４）またはプールし精製したヒトＩｇＧ２および １ｇＧ４（ケミコン）であった。陽性対照はネズミＲ６−５−Ｄ６であった。

３、３．２　競合結合 ＪＹ細胞の単一層は３．３．１のとおりに調製した。抗体試料を加え、４℃で１ 晩恒温培養した。ビオチニル抗体ＩＣＡＭ−１を全てのウェルに加えた。混合物 を室温で２時間放置した。プレートを洗浄し、ストレプトアビジン・ＨＲＰＯか またはストレプトアビジン・ベーターガラクトシダーゼを加えた。さらに恒温培 養した後、酵素基質を加えて反応させた。

３、３．３　混合リンパ球反応検定 正常な健常供与者から末梢血を静脈穿刺により得た。血液（７，５ｍＡ）をフィ コール／ハイバーク密度グラジェント（ファルマシア・密度＝１．０７８）７． ５ｍｊ！上で室温で層にし、１０００　ｘｇで２０分間遠心にかけた。細胞を洗 浄し、血球計で計数し、５０μｇ７ｍｌのゲンタマイシン、１ｎＭのし一グルタ ミン（ギブゴ）および５％の加熱して不活化した（５５℃、３０分）ヒトＡＢ血 清（フロー・ラボラトリーズ）を含有するＲＰＭＩ−１６４０培養培地（以後Ｒ ＰＭＩ培養培地と称する）に懸濁した。

末梢血単核細胞（応答細胞）をリンプロ丸底マイクロタイタープレート（＃７６ −０１３−０５）中培地に６．２５Ｘ１０”セル／ａｌで培養した。別の供与者 からの刺激細胞に１００ＯＲで放射線照射し、同じ濃度で応答細胞と共に培養し た。

応答細胞をウェルに加え、次にモノクローナル抗体を加え、最後に刺激細胞を加 えた。培養物あたりの全容量は０．２ｍｌであった。対照は応答細胞のみと含有 した。培養プレートを５％ＣＯ２−加湿空気雰囲気下で５日間３７℃で恒温培養 した。ウェルは０．５μＣｉの三重水素化チミジン（３ＨＴＸ二ニー・イングラ ンド・ニューフレア）で培養の最後の１８時間パルスを発生した。

細胞を自動多重試料収穫器（スカトロン、ノルウェー）を用いてグラスファイバ ーフィルター上に収穫し、蒸留水ですすいだ。フィルターをオーブン乾燥し、ベ ックマン・リープイー・セーフ液体シンチレーションカクテル中、ＬＫＢベータ ープレート液体シンチレーションカウンターで計測した。

３．４．イン・ビボ検定 ３、４．１゜改変シュワルツマン反応 エンドトキシンを皮肉注射し、続いて１８−２４時間後にチモサンを静脈内に抗 原投与注射することにより、ウサギの皮膚に局所的なシュワルツマン反応を作り 出すことができる。皮膚の予め注射した部位に発展する出血性壊死は、微小血栓 、血管的好中球凝集、血小板およびフィブリンの滞積、血管透過性の増大並びに 赤血球（ＲＢＣ）の塊状血管外遊出という特徴がある。我々はこの試験計画を改 変して、ンノモロガスサルに用いた。離れた、別個の皮膚の部位にエントドキノ ン（３μｇ／部位）または通常の生理食塩水を皮肉注射し、１８時間後にこれら の同じ部位にチモサン（３００μｇ／部位）を注射した。その結果生じる炎症反 応を、チモキサン注射後も時間に、＋２’Ｉ−ＢＳＡを用いて、生理食塩水注射 部位に比較してエンドトキシン注射部位の血管透過性の増大を測定することによ り定量化した。Ｒ６，５（抗ＩＣＡＭ−１）、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２および１ｇＧ ４、Ｒ６，５のキメラ体並びにＲ１５，７（ＬＦＡ−１ベーター）の阻害効果を 正常のマウスＩｇＧのものと比較した。全てのＩｇＧ製剤はチモサン注射の前に ３ｕ／ｋｇを静脈内投与した。

結果 ４、ＣＤＮＡライブラリーの構築 ４、．１．ｍＲＮＡの調製およびｃＤＮＡの合成細胞は第１項に記載のとおり成 長させ、１．４　Ｘ　１０’セルを収穫し、グアニジニウム／ＬｉＣ１抽出法を 用いてｍＲＮＡを抽出した。ｃＤＮＡはオリゴ−ｄＴからプライミングにより調 製し、ｃＤＮＡ全長を生じた。ｃＤＮＡをメチル化し、Ｅｃ。

ＲＩリンカ−を加えてクローニングした。

４．２　ライブラリーの構築 ＣＤＮＡライブラリーは、ＥｃｏＲＩ切断し、仔つシ腸フォスファターゼで５′ リン酸塩基を除去した（ＥｃｏＲＩ　／　ＣＩ　Ｐ）ｐＳ　Ｐ　６４ベクターＤ ＮＡにライゲートした。ライゲーションは軽鎖の場合形質転換効率の高いベセス ダ・リサーチ・ラブダ（ＢＲＬ）のエンエリキア・コリＨＢＩＯＩ（Ｅ　コリＨ ＢＩＯＩ）を、重鎮の場合電気泳動により調製されるＥ、コリＬＭＩ　Ｏ３５（ ドーワーら、ヌクル、アンッズ・レス、１６巻６１２７頁（１９８８年））を形 質転換するために用いた。ＣＤＮＡライブラリーを調製した。軽鎖のために１１ ６００コロニーをふるい分けし、重鎮のために２５０００コロニーをふるい分け した。

５、スクリーニング 重鎮または軽鎖プローブのどちらかに陽性のＥ、コリコロニーをマウスカッパ定 常領域の配列に相補的であるオリゴヌクレオチド・５“ＴＣＣＡＧＡＴＧＴＴＡ ＡＣＴＧＣＴＣＡＣを用Ｌ・て軽鎖をオリゴヌクレオチドふるい分けしてか、ま たは予め単離したマウスＩｇＧ２ａ定常領域クローンの９８０塩基対のＢａｍＨ Ｉ−ＥｃｏＲＩ制限断片を用いて同定した。６個の軽鎖クローンおよび１０個の 重鎮クローンを同定し、第二段のふるい分けに供した。第二段のふるい分けで陽 性となったクローンを成長させ、ＤＮＡを調製した。遺伝子挿入物の大きさはゲ ル電気泳動により評価し、ｃＤＮＡの全長を含有できる大きさのＤＮＡ挿入物の 配列決定をした。

６、ＤＮＡ配列決定 ｃＤＮＡ全長の５°未翻訳部域のＤＮＡ配列、信号配列、可変領域および３゛未 翻訳部域を得、軽鎖は図１、重鎮は図２に示す。

７、ｃＤＮＡ発現ベクターの構築 セルチック発現ベクターは図３に示すようにプラスミドｐＥＥ６−ｈＣＭＶを基 礎とする（ベビントン、Ｃ，Ｒ，、発行国際特許出願ＷＯ第８９１０１０３６号 ）。

発現すべき遺伝子を挿入するためのポリリンカーは、ヒトサイトメガロウィルス （ｈＣＭＶ）の主要な極初期のプロモーター／エンハンサーの後に導入した。ト ランスフェクトした真核細胞のプラスミドを選別するためのマーカー遺伝子は、 ｐＥＥ６−ｈＣＭＶの個有のＢａｍＨ１部位にＢａｍＨＩカセットとして挿入で きる。

重要な遺伝子を挿入する前に、ネオおよびｇｐｔマーカーを挿入するのは通常的 に行われている。一方、ＧＳマーカーは、カセット中に内部ＥｃｏＲＩ部位が存 在するために最後に挿入する。選別可能なマーカーは、複製の開始点をも提供す るＳＶ４０後期プロモーターから発現し、それによりベクターはＣＯ８細胞一過 性発現系での発現に用いることができる。マウス配列はＥｃｏＲＩ断片として用 いられ、軽鎖ではＥＥ６−ｈＣＭＶネオ（図４）に、および重鎖ではＥ　Ｅ　６ −ｈＣＭＶ　−ｇｐｔ（図５）にクローン化した。

ｓ、ｃｏｓ細胞におけるｃＤＮＡの発現プラスミドｐＡＬ５（図４）およびｐＡ Ｌ６（図５）をＣＯ８細胞に共トランスフェクトし、一過性の発現実験で得られ た上清は、ＪＹ細胞に結合する集合抗体を含有することが示された（図６）。３ ＳＳメチオニンを用いた代謝標識化実験により、重鎮および軽鎖の集合体を発現 することが示された。

９、キメラ遺伝子の構築 キメラ遺伝子の構築は、以前に報告された実験方法に従った（ライントルら、１ ９８７年（ライントルら、プロット、エング、１．６巻４９９−５０５頁（１９ ８７年））。可変領域の配列の３°末端の近くの制限部位を同定し、マウス可変 領域の残りの部分をコードし、選ばれた定常領域に付着する適当な制限部位を含 有するオリゴヌクレオチドアダプターを付着するのに用いられる。

９．１　軽鎖遺伝子の構築 マウス軽鎖ｃＤＮＡ配列は、可変領域の３′末端の近くの５ｆａＮＩ部位を示し た。

可変領域の大部分の配列は３９７塩基対のＥｃｏＲＩ−８ｆａＮＩ断片として単 離された。オリゴヌクレオチドアダプターは、可変領域の３′部域の残りの部分 を５ｆａＮＩ部位から置き換え、予じめ定常領域に組み込んだ特殊なのＭａｒ１ 部位まで、およびこれを含むヒト定常領域の５゛残存分を含むように設計された 。リンカ−はＮａｒＩ切断ｐＲＢ３２のヒトＣｋ遺伝子にライゲートし、Ｃｋ断 片に適用した５ｆａＮ　１　＝ＥｃｏＲＩはライゲート混合物から精製した。定 常領域は、３経路の反応で、ＥｃｏＲＩ　−Ｓ　ｆａＮ　Ｉ切断可変領域ＤＮＡ で、ＥｃｏＲｒ／ＣｒＰｐＥＥ６−ｈＣＭＶ−ネオ処理ベクターにライゲートし た。Ｅ、コリに形質転換した後、クローンを単離し、リンカ−および接合部分の 配列をＤＮＡ配列決定により確認した。

図７はキメラ軽鎖構築のための実験方法を示す。

９．２　重鎖遺伝子の構築 ９、２．１　重鎖遺伝子アイソタイプの選択ヒトＩｇＧ２およびＩｇＧ４アイソ タイプの両方をコードするキメラ重鎖遺伝子を構築した。

９、２．２　遺伝子の構築 重鎖ｃＤＮＡ配列は、可変領域の３′末端の近くにＢａｎＩ部位を示した。可変 領域の大部分の配列は４２４塩基対ＥｃｏＲＩ／ＣＩＰ／ＢａｎＩ断片として単 離した。

オリゴヌクレオチドアダプターは、ＢａｎＩから可変領域の３′部域の残存部分 を、予め定常領域の最初の２個のアミノ酸に組み込むようにした特殊なＨｉｎｄ ｌｌｒまでおよびこれを含んで置き換わるように設計された。リンカ−をＨｉｎ ｄｌ［［切断ｐＲＢ４１およびｐＲＢ２１のＣＨ遺伝子切断片にライゲートし、 域断片に適用したＢａｎＩ−ＢａｍＨＩをライゲート混合物から精製した。Ｅｃ ｏＲＩ−ＢａｎＩ可変領域断片を定常領域の各々に、および発現ベクター（Ｅｃ ｏＲＩ　／　Ｂｃｉ　Ｉ　／　Ｃｒ　Ｐ処理ｐＥＥ　６−ｈＣＭＶ−ｇｐｔ）中 に、３経路でライゲートした。Ｅ、コリＨＢＩＯＩに形質転換した後、クローン を単離し、リンカ−および接合部分の配列をＤＮＡ配列決定により確認した。

図８はキメラＩｇＧ２および１ｇＧ４重鎮を構築するための実験方法を示し、図 ９はｐＡ　Ｌ　８　（Ｉ　ｇＧ　２　）およびｐＡ　Ｌ　９　（ｒ　ｇＧ　４　 ）のプラスミド地図の概要を示す。

９．２．３　１ｇＧ１重鎖遺伝子の構築プラスミドｐＥ１００１は、ｐＥＥ６− ｈＣＭＶｇｐｔを基礎とする発現ベクターである。これはヒ［ｇＧ１定常領域遺 伝子を含有する。Ｃｈｉ領域の５番めおよび６番めのコドンに生じるＡｐａ１部 位はこのベクターに特有であり、ｈＣＭＶプロモーターに対するＨｉｎｄｌｌ［ 部位３′と同じである。ヒトｃＨ１の最初の５個の残存部分をコードする配列に 沿った抗ＩＣＡＭ−１重鎮遺伝子のＶＨ部域をｐＡＬ９から単離し、予めＨｉｎ ｄＩｔ７およびＡｐａｌで切断したｐＥｌｏｏｌに挿入し、ｐＪＡ２００を得た 。ｐＡＬ９から持ち込んだｃＨ１残存部分は、ＩｇＧ１０ものと同等であり、従 ってｖ−Ｃ接合部分で生じた配列は新規なものではない。

１０、キメラ発現ベクターの構築 １０、Ｉ　ＧＳ分離ベクター ｐＡＬ７、ｐＡＬ８およびｐＡＬ９（囚７．８および９）のＧＳ化は、ネオおよ びｇｐｔＢａｍＨＩカセットをＳＶ４０遅延プロモーターから発現させることか できるＧＳ遺伝子を含有する５　９キロ塩基対カセツトでネオおよびｇｐｔＢａ ｍＨＩを置換することにより構築した（プラスミドの図は図７．１０−１２参照 ）。

１１、キメラ遺伝子の発現 １１、Ｉ　ＣＯ５細胞における発現 キメラ抗体プラスミドｐＡＬ７（ｃＬ）をｐＡＬ８（ｃＨＩｇＧ２）、ｐＡＬ９ （ｃＨＩｇＧ４）またはｐＪＡ２００（ｃＨＩｇＧｌ）のいずれかとＣＯ３細胞 に共トランスフェクトし、一過性の発現実験からの上清は、ＪＹヒトＢセルライ ンに結合する抗体の集合体を含有することが示された。代謝性抗体はＪＹヒトＢ セルラインに結合する。３５８メチオニンを用いた代謝標識化実験では重鎮およ び軽鎖の集合体の発現が認められた（図１３）。キメラ抗体は全てＪＹ細胞によ く結合する。しかしながら競合検定によりｃＬ／ｃＨＩｇＧ２またはｃＬ／ｃＨ ＩｇＧ４の組み合わせから誘導される抗体は、ビオチニル化したＩＣＡＭ−１の マウス抗体と同様に競合しなかった。ｃＬ／ｃＨＩｇＧ１抗体はｃＬ／ｃＨＩｇ Ｇ２またはｃＬ／ｃＨＢＩｇＧ４抗体よりもよく競合した。

１１２　チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞における発現安定したセル ラインは以下のとおり調製した：ネオかまたはＧＳマーカーを含有するキメラ軽 鎖発現ベクターｐＡＬ７およびｐＡＬｌｏをＣａＰＯｎ沈澱法によりＣＨＯ−Ｋ ｌ細胞にトランスフェクトした。選択的溶媒で成長させた後、陽性のセルライン を同定し、特異的産生速度を、分泌した軽鎖を検出するためのＥＬＩＳＡ様式検 定を用いて測定した。軽鎖を高濃度で分泌する２種のセルライン（以下の表参照 ）を選別し、ｐＡＬ８かまたはｐＡＬ９でトランスフェクトして、ＩｇＧ２およ びＩｇＧ４キメラ重鎖遺伝子をｇｐｔマーカーと共に導入した。

周辺のラインは、各々のトランスフェクションより得た。特異的産生速度を測定 ４沈澱法により、キメラ軽鎖発現セルラインネオ２４にトランスフェクトした。

１２、キメラ抗体の精製 セルラインＧ５２５Ｇ２−１２、ネオ２４Ｇ４−２４および２４．１．４８の回 転培養物の上清からの収穫物２×ＩＬから、およびネ第２４Ｇ２−９からの収穫 物２Ｘ０．５Ｌからもまた、タンパクＡセファロースを用いた親和性クロマトグ ラフィーにより抗体を精製した。細胞培養上清は、０．２Ｍグリシンナトリウム でｐＨ８，８に調整し、ｐＨ８，８のグリシン／グリシン塩緩衝液で予め平衡に したタンパクＡセファロースカラムに適用した。試料を載せた後カラムを平衡化 緩衝液で洗浄した。次に０．２Ｍリン酸酸水素ナナトリウムよび０．１Ｍクエン 酸から成る漸減ｐＨグラジェントの溶液を用いて溶出した。抗体含有分画をプー ルし、ｐＨを６．５に調整し、次に試料をリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で 透析した。

精製した適切な抗体の集合体を、還元および非還元ＳＤＳポリアクリルアミドゲ ル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により（図１４）および高速液体クロマトグラ フィー（ＨＰＬＣ）ゲル濾過により（図１５）試験した。同定はＮ末端アミノ酸 配列決定およびアミノ酸組成分析により確認した。

１３、精製抗体の分析 １３．１　直接結合および競合結合検定の結果キメラ抗体は全てＪＹ細胞によく 結合した（図１６および１７）。しがしながら、競合検定において、ｃＬ／ｃＨ ＩｇＧ１抗体のみがビオチニル化マウス抗体に対するマウス抗体とほぼ同様に、 ＩＣＡＭへの結合で競合した（図１８）。ｃＬ／ｃＨＩｇＧ４抗体は、マウス抗 体の阻害活性の約３０％を示しく図１９）、ｃＬ／ｃＨＩｇＧ２抗体はマウス抗 体の阻害活性の約１０％を示した（図２０）。

これらの測定結果、Ｒ６−５−Ｄ６から誘導したキメラ抗ＩＣＡＭ−１抗体は、 アイソタイプに応じて抗原結合活性が異なることを示している。ＩｇＧ１抗体は 、マウス親抗体とほぼ同様の結合活性がある。ＩｇＧ４抗体はマウス抗体の競合 結合活性の３０％で、１ｇＧ２の相対活性は１０％である。これらの抗体は全て 結合部位が同一であるので、この結果は予想外である。我々は、これらの差異は 、アイソタイプの蝶番の柔軟性が異なるために抗体に付与された結合活性の変化 のためと考える。キメラＩｇＧ４Ｆａｂの親和性の測定により、これがマウスＦ ａｂと同じ親和性を有することが示され、従ってキメラＩｇＧ４の構築を変化さ せルノが偏好性であることを確認した。

１３．２　混合リンパ球反応検定の結果移植のイン・ビトロモデルであるＭＲＬ は、キメラＩｇＧ４およびＩｇＧ１により、マウスＲ６−５−６Ｄ抗体に匹敵す る程度に阻害された。このことは、キメラＭＡｂが特異的免疫学的な事柄を阻害 し、従ってイン・ビボで自動免疫および移植に用いることができることを示して いる（図２１参照）。

１３．３　改変シュワルツマン反応検定の結果抗ＩＣＡＭ−ＩＭＡｂの存在下イ ン・ビポで顆粒球機能を試験するために、霊長類シュワルツマン反応を行った。

キメラＩｇＧ１は、霊長類モデルの活性化好中球がもたらす血管漏出の阻害にお いて、キメラＩｇＧ４よりゎずかに活性であるマウスＭＡｂよりもわずかに活性 であった。このことは、キメラ抗ＩＣＡＭ−１抗体が再潅流傷害およびその他の 急性炎症性疾患に関与する、好中球がもたらす損傷の緩和に有効であろうという ことを示している（図２２参照）。

ｗ　ｗ　ｗ　ｗ　ｗ ロ　ψ　Ｎ　Ｏ）　ｗ ｌ−１１−１１ＮＩ　ＮＩ　ｐＨ ロ　ロ　ロ　８ ０　へ　ＣＯＷ ゆ　−−１−ｌ　へ　Ｉ　ｎ　１ Ｆｉｇ、３ ＥｃｏＲＴリンカ−を加える ｃＤＮＡ ＥｃｏＲＩリンカ−を加える マウスｃＤＮＡ　ヒト　カッパ　鎖　遺伝子ＥｃｏＲＩ／５ｆａＮＩ切断　Ｎａ ｒｌ切断ＶＬフラグメント精製　Ｊアダプターを加えるＦｉｇ、　７ マウスｃＤＮＡ　ヒト１９Ｇ２定常領域遺伝子ＥｃｏＲＩ　／Ｂａｎ１切断　Ｈ ｉｎｄ３切断ＶＨフラグメントを精製　Ｊアダプターを加えるＢａｎ１／Ｂａｍ ＨＩ切断 ｐＡＬ８．キメラ重鎖発現ベクター ｌ９Ｇ２アイソタイプ Ｆｉｇ、　１１ Ｆｉｇ、　１２ Ｆｉｇ、　１４　（ｉ） Ａ。

Ｆｉｇ、　１４（ｉｉ） Ｂ。

ＡＬＩ 直接ＪＹ細胞ＥＬＩＳＡ： 濃度、　Ｌｏｇ（ｎｇ／ｍｌ） Ｆｉｇ、　１７ 競争的」Ｙ　細胞　ＥＬＩＳＡ： Ｒ６−５−６Ｄ　対　キメラ　＋ｇＧ４濃Ｋ　、　Ｌｏ９（ｎ９／ｍｌ） 濃度、　Ｌｏｇ（ｎ９／ｍｌ） キメラＩＧＧ２　対Ｒ６−５−６０，ＪＹ−細胞ＥＬＩＳＡ凡Ｍ　△△△Ｒ６− ５−６Ｄ　ロロロＣＨＩＧＧ２Ｆｉｇ、　２０ 阻害％ 阻害％　対　正常　ｍｌｇＧ 要約書 本発明は、細胞間接着分子ＩＣＡＭ−１に結合し得る人体適応化キメラ抗体を開 示している。具体的には、ＩｇＧ１．１ｇＧ２およびＩｇＧ４サブタイプの人体 適応化抗ＩＣＡＭ−１抗体が開示されている。これらの抗体は、特異的および非 特異的炎症、リノウイルス感染、ＨＩＶ感染、ＨＩＶ感染細胞の播種、およびぜ ん息の処置に有用である。さらに、開示されている人体適応化抗体は、炎症およ び感染部位およびＩＣＡＭ−１発現性腫ようの診断および位置測定方法において 有用であり得る。

国際調査報告 ｍＬ＋＋、１１＝”、ｌｌ　Ａ＋？ｕ、＋、ｕ、−、、＋　代ゴ八巧９１１０２ ９４６ｈ−＝−＝叫、す、自−、、、、ＰＣＴ１０３９１１０２９４６

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）抗ＩＣＡＭ−１抗体の重および／または軽鎖可変領域を含むキメラ抗体分 子。 （２）人体適応化キメラ抗体である、請求項１記載のキメラ抗体分子。 （３）エフェクターまたはレポーター分子が結合している、請求項１または２記 載のキメラ抗体分子。 （４）少なくとも１つのキメラ重鎖および少なくとも１つのキメラ軽鎖を含む、 請求項１−３記載のキメラ抗体分子。 （５）ＩｇＧヒト定常領域ドメインを含む、請求項２−４記載のキメラ抗体。 （６）ＩｇＧ２またはＩｇＧ４ヒト定常領域ドメインを含む、請求項５記載のキ メラ抗体。 （７）ＩｇＧ１ヒト定常領域ドメインを含む、請求項５記載のキメラ抗体。 （８）キメラ抗体が、Ｒ６−５−Ｄ６抗体と同じまたは類似エピトープ（複数も 可）に対する結合特異性を有する、請求項１−７記載のキメラ抗体。 （９）キメラ抗体がＲ６−５−Ｄ６抗体に由来する、請求項１−８記載のキメラ 抗体。 （１０）抗ＩＣＡＭ−１抗体の重または軽鎖可変領域をコードするＤＮＡ配列。 （１１）抗ＩＣＡＭ−１抗体の可変領域を含むキメラ重または軽鎖をコードする ＤＮＡ分子。 （１２）人体適応化キメラ重または軽鎖をコードする、請求項１１記載のＤＮＡ 。 （１３）ヒトＩｇＧ定常領域ドメインを含む人体適応化キメラ重鎖をコードする 、請求項１２記載のＤＮＡ。 （１４）ヒトＩｇＧ２、好ましくはＩｇＧ４または特にＩｇＧ１定常領域ドメイ ンを含む、請求項１３記載のＤＮＡ。 （１５）請求項１０−１４のいずれか１項記載のＤＮＡを含むベクター。 （１６）キメラ抗ＩＣＡＭ−１軽鎖およびキメラ抗ＩＣＡＭ−１重鎖をコードす るＤＮＡを、機能し得るように組み合わせた形で含む発現ベクター。 （１７）請求項１５または１６記載のベクターにより形質転換された宿主細胞。 （１８）抗ＩＣＡＭ−１人体適応化キメラ抗体の製造方法であって、（１）抗体 重または軽鎖をコードするＤＮＡ配列を有するオペロンを含む発現ベクターを製 造し（ただし、可変ドメインのＣＤＲのうちの少なくとも一つは非ヒト（ネズミ ）抗ＩＣＡＭ−１抗体から誘導され、抗体鎖の残りの免疫グロブリンに由来する 部分はヒト免疫グロブリンから誘導される）、（２）相補性抗体軽または重鎖を コードするＤＮＡ配列を有するオペロンを含む発現ベクターを製造し（ただし、 可変ドメインのＣＤＲのうちの少なくとも一つはネズミ（非ヒト）抗ＩＣＡＭ− １抗体から誘導され、抗体鎖の残りの免疫グロブリンに由来する部分はヒト免疫 グロブリンから誘導される）、（３）各ベクターにより宿主細胞をトランスフェ クションし、（４）トランスフェクションしたセルラインを培養してキメラ抗体 を製造することを含む方法。 （１９）ヒトまたは動物対象に、請求項１−９のいずれか１項記載の抗体生成物 の有効量を投与することを含む処置方法。 （２０）ほ乳類対象における特異的防御系の応答から生じる炎症の処置方法であ って、処置を必要とする対象に炎症の抑制に充分な量の抗炎症剤を与えることを 含み、前記抗炎症剤がＩＣＡＭ−１と結合し得るキメラ抗体である方法。 （２１）キメラ抗体が請求項１−９記載の１つまたはそれ以上の抗体である、請 求項２０記載の方法。 （２２）炎症が遅延型過敏反応である、請求項２０記載の方法。 （２３）炎症が乾せんの徴候である、請求項２０記載の方法。 （２４）炎症が自己免疫疾患の徴候である、請求項２０記載の方法。 （２５）自己免疫疾患が、レイノー症候群、自己免疫甲状腺炎、ＥＡＥ、多発性 硬化症、リウマチ様関節炎およびエリテマトーデスから成る群から選択される、 請求項２４記載の方法。 （２６）炎症が臓器移植拒絶に対する応答である、請求項２０記載の方法。 （２７）臓器移植が腎臓移植である、請求項２６記載の方法。 （２８）炎症が組織移植拒絶に対する応答である、請求項２０記載の方法。 （２９）さらに、ＬＦＡ−１に結合し得る抗体、前記抗体の機能的誘導体（ただ し、この機能的誘導体はＬＦＡ−１に結合し得る）、およびＬＦＡ−１の非免疫 グロブリンきっ抗物質から成る群かおら選択される薬剤の投与を含む、請求項２ ０記載の方法。 （３０）ほ乳類対象における非特異的防御系の応答から生じる炎症の処置方法で あり、処置を必要とする対象に、炎症の抑制に充分な量の抗炎症剤を与えること を含み、前記抗炎症剤がＩＣＡＭ−１に結合し得るキメラ抗体である方法。 （３１）炎症が、成人呼吸窮迫症候群、敗血症続発性の多重臓器損傷症候群、外 傷続発性の多重臓器損傷症候群、組織の再潅流損傷、急性糸球体硬化症、反応性 関節炎、急性炎症成分を伴う皮膚病、中枢神経系炎症疾患、例えば卒中、熱傷、 血液透析、白血球搬出、漬よう性大腸炎、クローン病、壊死性全腸炎、か粒球輸 血関連症候群およびサイトカイン誘導毒性から成る群から選択される状態を伴う ものである、請求項３０記載の方法。 （３２）キメラ抗体が請求項１−９記載の抗体の一つまたはそれ以上である、請 求項３０または３１記載の方法。 （３３）移動に関してＬＦＡ−１群の機能的構成員を必要とする細胞である造血 腫よう細胞の転移抑制方法であって、処置を必要とする患者に、転移抑制に充分 な量の抗炎症剤を与えることを含み、前記抗炎症剤がＩＣＡＭ−１に結合し得る キメラ抗体である方法。 （３４）ＩＣＡＭ−１に結合し得るキメラ抗体が請求項１−９記載の抗体の群ら 選択される、請求項３３記載の方法。 （３５）ＩＣＡＭ−１発現性腫よう細胞増大の抑制方法であって、処置を必要と する患者に、増大抑制に充分な量の毒素を与えることを含み、前記毒素素がＩＣ ＡＭ−１に結合し得る毒素誘導体化キメラ抗体から成るものである方法。 （３６）処置を必要とする個体におけるウイルス感染の処置方法であって、ウイ ルス感染染抑制に充分な量のＩＣＡＭ−１に結合し得るキメラ抗体を個体に与え ることを含む方法。 （３７）ウイルスが、ピコルナビリダエ、Ａ群コクサッキーウイルスまたはメン ゴウイルス属内の主要血清型のリソウイルスである、請求項３６記載の方法。 （３８）ウイルスが主要血清型のリソウイルスである、請求項３７記載の方法。 （３９）キメラ抗体が請求項１−９記載の抗体の少なくとも一つである、請求項 ３６−３８のいずれか１項記載の方法。 （４０）白血球のＨＩＶ感染の抑制方法であって、ＨＩＶに暴露されたかまたは 冒された患者に、有効量のＨＩＶ−１感染抑制剤を投与することを含み、前記薬 剤がＩＣＡＭ−１に結合し得るキメラ抗体である方法。 （４１）ＨＩＶがＨＩＶ−１である、請求項４０記載の方法。 （４２）キメラ抗体が請求項１−９記載の抗体の少なくとも一つである、請求項 ４０または４１のいずれか１項記載の方法。 （４３）ウイルス感染した白血球を有する患者における前記白血球の管外遊走を 抑制する方法であって、有効量の抗遊走剤を患者に投与することを含み、前記薬 剤が白血球のＩＣＡＭ−１結合能力を傷つけ得るキメラ抗体である方法。 （４４）ウイルス感染細胞がＨＩＶにより感染している、請求項４３記載の方法 。 （４５）キメラ抗体が請求項１−９記載の抗体の少なくとも一つである、請求項 ４３または４４記載の方法。 （４６）処置を必要とする個体におけるぜん息の処置方法であって、ＩＣＡＭ− １に結合し得るキメラ抗体のぜん息抑制に充分な量を個体に投与することを含む 方法。 （４７）キメラ抗体が請求項１−９記載の抗体の少なくとも一つである、請求項 ４６記載の方法。 （４８）人体適応化キメラ抗体が、腸溶的手段、非経口手段、局所手段、吸入手 段または鼻腔内手段により投与される、請求項１９−４７のいずれか１項記載の 方法。 （４９）人体適応化キメラ抗体が予防的に投与される、請求項４８記載の方法。 （５０）人体適応化キメラ抗体が治療的に投与される、請求項４８記載の方法。 （５１）非経口手段が、筋肉内、静脈内または皮下経路である、請求項４８、４ ９または５０記載の方法。 （５２請求項１−９のいずれか１項記載の抗炎症剤を医薬的に許容し得る担体と 組み合わせて含む医薬組成物。 （５３）少なくとも１種の他の免疫抑制剤と組み合わせた形態の請求項５２記載 の医薬組成物。 （５４）ほ乳類対象におけるＩＣＡＭ−１発現性腫よう細胞の診断方法であって 、（ａ）対象に、ＩＣＡＭ−１に結合し得る検出可能な形で標識されたキメラ抗 体を含む組成物を投与し、 （ｂ）ＩＣＡＭ−１に結合したキメラ抗体を検出することを含む方法。 （５５）ほ乳類対象における炎症の診断方法であって、（ａ）ＩＣＡＭ−１を発 現する細胞に結合し得る検出可能な形で標識されたキメラ抗体を含む組成物と対 象の組織試料とをインキュベーションし、（ｂ）前記細胞に結合したキメラ抗体 を検出することを含む方法。