JPS60204726A - 抗ヒトプロリルドロキシラ−ゼ抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、たん白質に対する抗体に関するものである。

さらに詳しくは、本発明は、ノ・イブリドーマを用いて
のヒトプロリルヒドロキシラーゼに対するモノクローナ
ル抗体に関するものである。

ゾロリルヒドロキシラーゼはコラーゲン代謝物、ターン
ノーノミ−の元通によるコラーゲン代謝物および代謝に
関与する酵素群の一つである。

動脈硬化症における血管壁コラーゲン過剰産生、肝硬変
病における繊維性たん白質や過剰産生はと／７’ｌ隋査
端（間且１で１八六シー−ｈｈ−て層六〜脳忘中、心筋
梗塞などの重篤な合併症を引き起こさない限りその程度
を予知することのできない動脈硬化症、あるいはまた、
従来の肝機能判定法として使用されているＧＯＴ　（グ
ルタミンピルビン酸トランスアミナーゼ）、ＧＰＴ　（
グルタミンピルビン酸トランスアミナーゼ）、ＬＯＨ（
ラフデートデヒドロゲナーゼ）やγ−ＧＴＰ　（γ−グ
ルタミルトランス滅ゾチダーゼ）活性測定では予知でき
ず、バイオプシーに依存している肝硬変の診断と予後の
判定に対して、血中におけるこの酵素量の測定は重要な
意義を有する。

血中におけるこの酵素量の高感度測定法としては、ラジ
オイムノアッセイ法やエンザイムイムノアツセイ法が考
えられており、従来、このようなイムノアッセイ法に供
する抗ゾロリルヒドロキシラーゼ抗体はウサギなどの動
物をこの酵素で免疫することにより得られている。しか
し、このようにして得た抗体（特異免疫グロブリン）は
他の免疫グロブリンとの混合物であり、この酵素に親和
性の高いものが得られても精製が難かしく量的な制限が
あり、イムノアッセイに応用した場合、ロット間で特異
性および力価の７ミラツキが生じるおそれがある。はと
んどの場合、抗体の純度の増大に伴い特異抗体としての
価値も高まる。このような理由により抗体産生Ｂ細胞ま
たはその前駆細胞と連続的分裂増殖可能な骨髄腫細胞（
ミエローマ細胞）を融合させ、これら両方の細胞の特性
を有している均質々融合細胞（ハイプリドーマ）を得よ
うとする試みがなされ、そのクローンが得られることが
明らかにされている（　Ｋｄｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ
　。

２５６．４９５−４９７．１９７５　）さらに同様な手
法による悪性腫瘍抗体はじめその他種々の抗原に対する
モノクロナール抗体が作製されている（特許公告公報昭
５８−４５４０７参照）。

ヒトゾロリルヒドロキシラーゼに対する均一で特異性の
高い単クローン性抗体を連続的にかつ大量に製造する方
法は従来報告されていない。

本発明はハイプリドーマによる工ｇＧ、工ｇＡおよびＩ
ｇＭクラス抗ゾロリルヒドロキシラーゼ抗体およびその
製造方法を提供するものである。すなわち、本発明は動
物をヒトゾロリルヒドロキシラーゼで免疫し、該動物か
らの抗ヒトゾロリルヒドロキシラーゼ抗体産生細胞とミ
エローマ細胞によりハイプリドーマを形成させ、該ハイ
プリドーマをクローン化し、ついでゾロリルヒドロキシ
ラーゼに対し反応性を有する抗ゾロリルヒドロキシラー
ゼ抗体を産生ずるクローンを選択し培養することからな
る、工ｇＧ、Ｉ（（Ａおよロリルヒドロキシラーゼに存
在する抗原決定基のうちのいずれか一つの抗原決定基の
みに免疫交さ反応性を有する各単クローン性抗体を提供
するものである。

以下、実施例により、本発明をさらに詳細に説明する。

実施例１ （ａ）　抗原−ゾロリルヒドロキシラーゼ（ＥＣＩ。

１４、１１．２　）の調製 ヒト胎盤を材料としてＢｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　
５２．９−１６　（１’９７！５　）に記載のＴｕｄｅ
ｒｍａｎらの方法に従イＰｏ１ｙ　Ｌ　−Ｐｒｏｌｉｎ
ｅ　ｔ−’５ｅｐｈａｒｏｓｅ　４　ＢにＣＮＢｒでカ
ップルさせたアフイニティクロマトグラフイーでヒトゾ
ロリルヒドロキシラーゼを捕捉し、さらにＢｉ’ｏ　−
ＧｅｌＡ　”　ｌ　、５　ｍ　（Ｂｉｏ　−Ｒａｄ　）
カラムで精製、純化した。得られたその酵素標品をＪ。

Ｖｉｒｏｌ、　１０．２１１−２１９　（１９７２）に
記載の１３ａｕｍらの方法に従いドデシル硫酸ノーダー
ポリアクリルアミドゲル電気泳動でその純度を調べたと
ころ約９０％であった。

（ｂ）抗体産生細胞の調製 ８週令のＢａ１ｂ／Ｃ雌マウス３匹を、まず、完全フロ
インドアジュノミント中、ヒトゾロリルヒドロキシラー
ゼで初回免疫する。マウスにそれぞれ印μグのヒトゾロ
リルヒドロキシラーゼを０．５−の溶液として腹腔内投
与する。さらに３０日口重印口重に生理食塩水に溶解し
た同量のヒトゾロリルヒ四ロキシラーゼを追加免疫する
。最終免疫として即口重に静脈内投与（５０μｆ／１０
０μＬ生理食塩水）によシ補助免疫し、３日後にマウス
を殺して牌臓を取り出し、牌細胞を調製する。

（、Ｃ１ミエローマ細胞の調製 本発明方法において使用されるミエローマ細胞には特に
限定はなく、多くのマウス、ラット、ウサギ、ヒトなど
の動物の細胞株が適用できる。

使用する細胞ラインは薬剤耐性のもので、未融合のミエ
ローマ細胞が選択培地で生存できないが、ハイプリドー
マが生存できることが好ましい。最も普通に用いられる
細胞ラインは８−アザグアニン耐性株でヒポキサンチン
−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｉ（Ｇ
ＰＲＴ　）を欠損し、ヒポキサンチンーアミノゾテリン
ーチミジン（ＨＡＴ　）培地に生育できない性質のもの
である。まだ、ミエローマ細胞株の中にはＨ鎖やＬ鎖を
合成するものがあり、このような細胞株を使用すると抗
体産生細胞の合成するＨ鎖やＬ鎖とまじりあったハイブ
リット抗体分子ができるのでＨ鎖やＬ鎖を合成しないも
のが望ましい。たとえばマウスミエローマＭＯＰＣ−２
１ライン由来（７）Ｐ３−ＮＳＩ−１−Ａｇ４−１、Ｐ
３−Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕｌ、Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８．６．
５．３、ＳＰ　２　／　０−Ａｇ１４、ＦＯ，５Ｉ９４
１５　ＸＸ０１ＢＵＩを好適に用いることができる。こ
こではＰ３−ＮＳ　１−１−ｌ−１−１株を使用シタ力
、融合前細胞数を２×１０５〜３×１０５個／ｄ以上の
濃度にならないように注意を払い、できるだけ生細胞率
を高めた。

（（１１細胞融合 以下の材料および方法を用いる。ＰＰＭＩ　１６４（１
培地はＲＰＭＩ　Ｎｏ　１６４０　（ＤｉｆｃＯＬａｂ
ｏｒａｔｏｒｉｅｓ　）に重炭酸ナトリウム（１２ｍＭ
　）、ピルビン酸ナトリウム（１ｍＭ）、Ｌ−グルタミ
７（２ｍＭ）、啄ニジリンＧカリウム（５０μ／１ａｌ
ｌ）、硫酸ストレプトマイシン（５０μｌｉ’／ｍｇ）
および硫酸アミカシン（１００μｔ　／　ｒｔｔｌ　）
を加ニドライアイステｐＨを７．２に調製し、０．２μ
ｍ　ＴＯ７０メンブレンフィルターで除菌濾過する。Ｎ
５−１培地は上記の通シ補充したＲＰＭＩ　−１６４０
培地に除菌濾過しだ仔牛脂児血清（Ｇｒａｎｉｔｅ　Ｄ
ｉａｇｎｏｓｔｉｃ　、’Ｉｎｃ、）を１５％（Ｖ／Ｖ
）の濃度に加え調製した。ＨＡＴ培地はＮＳ　−１培地
にさらにヒポキサンチン（１００μＭ）、アミノプテリ
ン（０，４μＭ）およびチミジン（１６μＭ）を加える
。ＨＴ培地はアミノプテリンを除去した以外はＨＡＴ培
地と同一組成のものである。ホリエチレングリコール４
０００　（Ｐｇ（）　４０００、Ｍｅｒｃｋ　）はＲＰ
ＭＩ　１６４０培地中５０％　（ｗ／ｗ　）無血清溶液
を調製する。

非生産性のアザグアニン耐性骨髄腫細胞Ｎ５−１（Ｐ３
−ＮＳＩ−１−Ａｇ４−１）との融合はＳｅｌｅｃｔｅ
ｄＭｅｔｈｏｄ　ｉｎ　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　Ｉｍｍｕｕ
ｏｌｏｇｙ　（ｅｄ、　Ｂ、Ｂ。

Ｍｉｓｈｅｌｌ　ａｎｄ　Ｓ０Ｍ、　Ｓｈｉｉｇｉ　）
、Ｗ、　ＨｏＦｒｅｅｍａｎ　ａｎｄｃａｍｐａｎｙ　
（１９８０）、３５１−３７２に記載（７）Ｏｉらの方
法を若干改変して行った。本融合では１．５×１０８個
の有核牌臓細胞（生細胞率９５％）を２．８Ｘ１０’個
の骨髄腫細胞ＭＳ　−１株（生細胞率９５チ）と融合す
る。牌臓細胞と骨髄細胞とを血清無添加のＲＰＭニー１
６４０培地で洗滌する。次に同じ培地にけん濁し、融合
させるだめ上記の割合で混合する。容量５０　ｒｒｔｌ
ｌの円錐形スチロール樹脂製試験管（Ｃｏｒｎｉｎｇ　
Ｇｌａｓｓ　Ｗｏｒｋｓ　）を用い、４０　ｍｌ！（７
）血清無添加ＲＰＭニー１６４０培地中４００　Ｘ’ｆ
　、　１０分間遠心し、上澄液を完全に吸出する。沈殿
細胞に３７°Ｃ加温５０％Ｐ］１ＣＧ４０００溶液１　
ｔｒｔｌを穏やかに攪拌しながら１分間で滴下し、さら
に１分間攪拌し細胞を再けん濁、分散させる。次に３７
°Ｃ加温ＲＰＭニー１６４０培地１　ｍｌを１分間で滴
下する。この操作をさらに１回繰返した後、同培地７　
ｍｌを２−３分間で常に攪拌しながら滴下し細胞を分散
させる。これを４００　Ｘ　ｆ、　１０分間遠心分離し
、上澄液を完全に吸引除去する。次にこの沈殿細胞に３
７°Ｃ加温ＮＳ　−１培地１０ｄをすみやかに加え、細
胞の大きい塊りを１０　ｗｔｌのピ滅ットを用いて注意
深くピプツテイングして分散する。さらに同培地２０　
ｒｒｔｌｌを加えて希釈し、ポリスチレン製９６穴マイ
クロウｘ　／ｌ／　（Ｃｏｒｎｉｎｇ　（）ｌａｓｓ　
Ｗｏｒｋｓ　）にウェル当り５．９×１０５個１０．１
−の細胞をまき込む。

なお、この時使用した９６穴マイクロウエルの前処理と
して０．２ｔｕｌのＭＳ　−１培地を加え、炭酸ガス培
養器中（３７°Ｃ）で１晩保温し、使用時に培地を吸引
除去する。細胞融合完了したマイクロウェルを７チ炭酸
ガス／９３チ空気中温度３７°Ｃ１湿度１００％下にイ
ンキュベートする。

（ｅ）選択培地によるハイブリドーマの選択的増殖 培養１口重に、ｅスツールピペットでＨＡＴ培地２滴（
約０．１ｍ１）を加える。２．３．５．８．１１日口重
培地の半分（０，１ｍ１）を新しいＨＡＴ培地で置き換
える。１４日１にＨＴ培地に切換え以降３−４日毎に同
操作を繰り返す。通常２−３週間で充分なハイブリドー
マの生育が観察される（融合率８３チ）。ハイブリドー
マ生育全ウェルについて次項記載の固相−抗体結合テス
トにより陽性ウェルをチェックする。次に検出された各
陽性ウェル（２０個／２８８ウェル）をフィーダとして
１０７個のマウス胸腺細胞を含むＨＴ培地１罰ヲホリス
チレン製ｕ穴セルウェル（ＣｏｒｎｉｎｇＧｌａθｓ　
ｗｏｒｋｓ　）に加え、検出された各陽性ハイブリドー
マ加個の全内容物を移す。これを同様に７係炭酸ガス存
在下３７°Ｃで約１週間インキュベートする。その間１
−２回各ウニルの上ｉ０．５ＷＬｔを新しいＨＴ培地０
．５ｗ１ｌと交換する。ノーイブリドーマの充分生育し
た時点で固相−抗体結合テストにより陽性を再確認し、
それぞれについて限界希釈法によりクローニングを行う
。なお、クローニングに使用後の残液をポリスチレン製
２５♂組織培養フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ　Ｇｌａｓｓ
　Ｗｏｒｋｓ　）に移し、凍結保存用試料を調製する。

（ｆ）　固相−抗体結合テスト＜よる抗ゾロリルヒドロ
キシラーゼ抗体生産ノ・イブリドーマの検索 拳法はＡｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、ｌＱ４．２０５−２
１４　（１９８０）に記載のＲ，ｅｎｎａｒｄらの方法
を若干改変したもので、ハイプリドーマ抗体の検出に適
している。

％穴ミクロタイトレージョンプレート（ＦｌｏｗＬａｂ
ｏｒａｔｏｒｉｅｓ　、■ｎｃ、　）を０．５〜１．Ｏ
ｐｔのゾロリルヒドロキシラーゼでコートし、さらにそ
の他を１０．１牛血清アルブミン（ＢＳＡ　）でブロッ
クする。これにノ・イブリドーマ生育ウェルの上清の一
部を加えて室温で約１時間インキュベートする。２次抗
体として西洋わさびペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウス
ＩｇＧ　（ＴＡＧＯ，工ｎｃ、　）を加えさらに室温で
約１時間インキュベートする。次に過酸化水素と基質で
ある０−フェニレンジアミンを加え生成した褐色の程度
を肉眼で定性的に判定するか、あるいはコロナ２波長マ
イクロプレート光度計（ＭＴＰ　−２２、コロナ電気株
式会社）で定量した。

ｆｇｌ　クローニング 各ウェル中には２種以上のハイプリドーマが生育してい
る可能性があるので、限界希釈法によりクローニングを
行い、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを取得す
る。Ｎ５−１培地ｔｕｌ当りフィダーとして１０７個の
マウス胸腺細胞を含むクローニング培地を調製し９６穴
マイクロウエルの３６．３６およびＵウェルにウェル当
シ５．１および０．５個のハイプリドーマを加える。５
．１２日口重約０．１罰のＮＥｌ＝１培地を追加する。

クローニング開始後１４−６日で充分なハイプリドーマ
の生育が認められ、コロニー形成陰性ウェルが５０％以
下の群について固相−抗体結合テストを行う。テストし
た全ウェルが陽性でない場合、抗体陽性ウェル中のコロ
ニー数を確認し、ウェル中に１コロニーのウェルを４−
６個選び再クローニングする。最終的に８個のクローン
を得た。

（ｈ）単一抗体のインビトロおよびインビボ増殖単一抗
体は得られたクローンをＮ５−１培地などの適当な培養
液で培養（インビトロ増殖）し、その培養土清液から得
ることができる（単一抗体たん白濃度は１０−１００μ
２／罰）。一方、大量に抗体を得るためには牌細胞とミ
エローマ細胞の由来動物と同系の動物（Ｂａｌｂ／Ｃマ
ウス）に腫瘍形成促進剤プリスタン（’２．６，１０　
、１４−テトラメチルペンタデカン、Ａｌｄｒｉｃｈ　
Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃａｍ−ｐａｎｙ、　Ｉｎ’ｃ、）
をマウス−匹当り０．５ｍ／腹腔内投与する。１−３週
間後にノ・イブリドーマ１×１０７個を同じく腹腔内投
与することによシインピボで１−２週間後に単一抗体た
ん白質濃度４−７■／　ｍｅの腹水を得ることができる
。

（ｉ）　単−抗ゾロリルヒドロキシラーゼ抗体の重鎖、
軽鎖のアイソタイプ 得られた各々の腹水を先ずゾロリルヒドロキシラーぜを
コートしたミクロタイトレージョンプレートに固相−抗
体結合テストについて前述したように結合させる。洗滌
後、アイソタイプ特異性ウサギ抗マウス１２抗体（Ｚｙ
ｍｅｄ　Ｌａｂｏ−ｒａｔｏｒｉｅｓ　）を加える。洗
滌後、西洋わさび波ルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギＩ
ｇＧ　（Ｈ＋　Ｌ　）抗体を加え、基質として２，２′
−アジノー：）（３−エチルベンゾチアゾリン硫酸−６
）および過酸化水素を用いて検出した。その結果をまと
めて第１表に示した。調べた抗体の内４個は免疫。

グロブリン鎖γｌ／にを、１個がγ２ｂ／に、２個がα
／に　をそして１個がμ／に　を有していた。

実施例２ 単一抗体の精製および抗体価 腹水中にはゾロリルヒドロキシラーゼと関連のない宿主
動物由来の抗体も含有されているが、エンザイムイムノ
アツセイに際して数万〜数１０万倍に希釈して用いる場
合には全く問題にならない。しかし必要に応じて腹水を
硫安分画（４０チ飽和）後、ＤＥｉＡＥ　−８ｅｐｈａ
ｃｅｌ　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ＦｉｎｅＣｈｅｍｉｃ
ａｌｓ　）によるイオン交換カラムクロマトグラフィー
法、またはｐｒｏｔｅｉｎ　Ａ　−５ｅｐｈａｒｏｓｅ
ＣＬ　−４Ｂ　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈ
ｅｍｉｃａｌｓ　）によるアフィニティークロマトグラ
フィー法単独、あるいは５ｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ　−３
ＱＱ　５ｕｐｅｒｆｉｎｅ　（ＰｈａｒｍａｃｉａＦｉ
ｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ　）によるゲル濾過法の組合
わせにより精製することができる。得られた抗体の内Ｉ
ｇＧ１クラスハ食塩０．０３Ｍを含む４Ｑ　ｍＭす／酸
緩衝液、ｐＨ８，０で平衡化したＤＦｉＡＦｉ　−５ｅ
ｐｈａｃｅｌ　（２Ｘ　３８　ｃｍ　）カラムの非吸着
画分に得られ、カラムに吸着したマウス由来のたん白質
と分離できた。

この１ｇＣｈ画分をさらに０．４２Ｍ食塩を含む５９　
ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７，４で平衡化した５ｅｐｈａ
ｃｒｙｌ　Ｂ−３ＱＱ　５ｕｐｅｒｆｉｎｅカラＡ　（
１，５ｘ　９３．５ｃｒｎ）でゲル濾過した（第１図）
。またＩｇＧａｂクラスはＩｍｍｕｎｏｃｈｅｍ、１５
．４２９−４３６．　（１９７８）　Ｋ記載のＨ７らの
方法に従ってＰｒｏｔｅｉｎ　Ａ　−５ｅｐｈａｒｏｅ
ｅ　ＣＬ　−４Ｂカラム（１，６Ｘ　３ｃｒｎ）で分画
した。第２図に示したように工ｇＧ２ｂは５０ｍＭ酢酸
緩衝液、ｐＨ４，３で溶出された。このようにして精製
した工ｇＧｌおよびＩｇＧｇｂクラスの純度をドデシル
硫酸ノーグーポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析し
たところ分子量約５２　Ｋ　（Ｈ鎖）および約２５　Ｋ
　（Ｌ鎖）の２つのメインのバンドが検出された。Ｉｇ
ＭおよびＡクラスの精製についてはＤＮＡ’Ｅ　’−５
ｅｐｈａ−ｃｅｌの平衡化緩衝液を食塩０．０６Ｍを含
む４０ｍＭ　リン酸緩衝液、１）Ｈ８，Ｏを使用し、食
塩０．０６　Ｍから０．５Ｍまでのグラディエンドで溶
出した以外はＩｇＧ１クラスの場合と同様の条件で精製
した。

Ｖｏｉｄ、　Ｖｏｌｕｍｅに溶出された１ｇＭクラスの
純度をＩｇＧクラスの場合と同様にゲル電気泳動で調べ
たところ、分子量約８０Ｋ（Ｈ仙）と約２５Ｋ（Ｌ鎖）
の２つのメインバンドが検出された。工ｇＡについては
分子量約６４Ｋ（Ｈ鎖）と約２５Ｋ（Ｌ鎖）の２つのメ
インバンドが検出された。

以上のようにして精製した単一抗体の力価を固相−抗体
結合テストにより測定した。なお、酵素標識第２抗体と
してＩｇＡクラスのものにははルオキシダーゼ標識ヤギ
抗マウスＩｇＡ　（ＺｙｍｅｃｌＬａｂｏｒａｔｏｒｉ
ｅｓ工ｎｃ、）および１ｇＭクラスのものについては波
ルオキ７ダーゼ標識ヤギ抗マウスエｇＭ　（Ｚｙｍｅｄ
　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ工ｎｃ、　）を用いた。

９６穴ミクロタイトレージヨンプレートの各ウェル中に
生成した褐色をコロナ２波長マイクロプレート光度計Ｍ
ＴＰ−２２で測定した結果を第３図に示した。ＩｇＧク
ラスのクローン番号３−２Ｂ１２．２−ＩＣ２，３−３
Ｈ９および３−６Ｈ５が固相化抗原との結合能が強く、
検出限界は抗体量０．１〜０．２１であったが、２−５
Ｇ８においては測定した抗体量０．５〜５００　ｎｒの
範囲で結合能は弱かった。一方、工ｇＡおよび１ｇＭク
ラスについてはその結合能はクローン番号２−６０９．
２−７７８次いで３−４Ｈ２の順に強かった。特に３−
４Ｈ２（ＩｇＭ　）においては高濃度側で著しく結合が
増大した。なお、これらの検出限界は抗体量０．５〜１
．０１であった。なお、得られた８種類の単一クローン
抗体の内クローン番号２−ＩＣ２および２−６Ｇ９を除
きラット胎児（内臓除去）ゾロリルヒドロキシラーゼと
もヒトゾロリルヒドロキシラーゼの場合と同様に反応し
た（第２表）。

実施例３ 単−抗ゾロリルヒドロキシラーゼ抗体の活性阻害 精製単一抗体の抗ヒトゾロリルヒドロキシラーゼ活性は
Ａｎａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、１５．３８４−３９４　（
１９６６）記載の）ｌｕｔｔｏｎらの方法に従った。基
質としてニワトリ胎児プロトコラーゲ／の４−Ｌ−プロ
リンを３Ｈ標識したものを用い、生成した３Ｈ標識水（
３ＨＨＯ）を真空蒸留で捕捉する。この水一定量にグレ
イ試薬を加えＰａｃｋａｒｄ　Ｔｒｉ　−Ｃａｒｂシン
チレーションカウンターで放射能を測定する５すなわち
、試験管当シ０．２μグのゾロリルヒドロキシラーぜに
所定量の各単一抗体を加えて加°Ｃ１１５分間プレイン
キュペイジョンし１次いで上記基質を加えて更にＩ′Ｃ
，３０分間インキュペイジョンした。調べた抗体の内Ｉ
ｇＧクラスにおいてはクローン番号２−ＩＣ２のみ抗ゾ
ロリルヒドロキシラーゼ活性を示した。一方、工ＥＡお
よびＭクラスにおいてはいずれも抗ゾロリルヒドロキシ
ラーゼ活性を示したが、その程度は工ｇＭグラスよシ、
■ｇＡクラスの方が大であった（第３表）。

Δお、上記実験は得られた単一抗体のゾロリルヒドロキ
シラーゼ活性中心の抗原決定基との反応性を調べたもの
であり、例えば、上記２−ＩＣ２についても活性は完全
には阻害されなかった。

しかし、この酵素−抗体複合体は更にヤギ抗マウスＩｇ
Ｇ・を加えて遠心分離した上澄液には全く活性は認めら
れなかった。

実施例４ 胎盤中のゾロリルヒドロキシラーゼの間接螢光抗体法に
よる検出 胎盤をアセトン−ドライアイスで１結しクリオスタット
で４μの厚さに切断し、冷アセトンで５分間固定した後
、その切片に各腹水１：１ｏ。

希釈液を加え室温で１時間反応させた。次にリン酸緩衝
液（ＦＢＩＳ）、ｐＨ’　７　、２で洗滌後、螢光試薬
標識第２抗体として使用した腹水中のイムノグロブリン
のクラスにょシフルオレスセインイソチオシャネイト標
識ヤギ抗マウスＩｇＧ　、　ＩｇＡあるいは工ｇＭ（１
：５０希釈、ＭｉｌｅＳおよびＺｙｍｅｄＬａｂｏｒａ
ｔｒｉｅｓ工ｎｃ、　）を反応させた。洗滌後切片を５
０係グリセリンで封入しオリン、ｅス螢光顕微鏡（パノ
ツクス）で観察しゾロリルヒドロキシラーゼの局在を検
索した。調べた抗体８種類の全てで免疫反応は認められ
たが、内でもクローキシラーゼ抗体非産性ハイブリドー
マからの腹実施例５ 単一および、３？　ＩＪクローナル抗体併用によるゾロ
リルヒドロキシラーゼの定量 ポリクローナル抗体は実施例１の場合と同様にヒト胎盤
より精製したヒトゾロリルヒドロキシラーゼをフロイン
ト完全アジュバントと共に白ウサギ（♀）に初回免疫す
る。２００μグのゾロリルヒドロキシラーゼを１　ｒａ
ｇのアジュバントとの混合液として背部１５ケ所に皮下
投与した。さらに４ケ月間、２週間ごとに背部皮下にフ
ロイント完全アジュバント中、２００μｍを追加免疫し
た。

各追加免疫後血清を採取し、その抗体価を実施例１（ｆ
）記載の固相−抗体結合テストにより測定した。なお、
この場合２次抗体として西洋わさび滅ルオキシダーゼ標
識ヤギ抗つサギエｇＧ（Ｍｉｌｅｓ　Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｉｅｓ、　Ｉｎｃ、）を用いた。Ａｎａｌ。

１３ｉｏｃｈθｍ、１６．３８４−３９４　（１９６６
）に記載のＨｕｔｔｏｎらの方法に従って得られた抗血
清のプロＩＪ　）レヒドロキシラーゼ活性抑制作用を調
べたところ、４μｔで５６％の活性を阻害した。また、
この抗血清は０ｔｔＣｈｔｅｒｌＯ町免疫拡散法および
免疫電気泳動法で１本の沈降線を生じたことからゾロリ
ルヒドロキシラーゼに特異的なものであると判定された
。次に第２版酵゛素免疫測定法（石川栄治、河合忠、宮
井潔編集）医学書院（１９８２）、３０−４９に記載の
サンドインチ法を用いヒ１ｌｆｉＴ中および組織中のゾ
ロリルヒドロキシラーゼ量を測定した。ビニール製９６
穴ミクロタイトレージヨンプレート（ファルコン３９１
２　）をすでに得られた精製単一抗体でコートし、さら
にその他を１０チＢＳＡでブロックする。一方、抗原試
料は健常人および種々の肝繊維化の程度を示す人の血液
および肝組織を用いた。すなわち、各血液２ゴを２００
０Ｘｆ、５分間遠心分離し上清液の崩潰５μｔを用いた
。また、肝組織は組織湿重量当シ２０倍量の０．２５Ｍ
シュクロース、０．０１　ｍＭ　ＦｉＤＴＡ　オよび０
．１ｍＭ’、ｊチオスレイトールを含む１０ｍＭトリス
−塩酸緩衝液、ｐＨ７，４で抽出し、その遠心（１５０
０Ｘｆ）上清液５μｔを用いた。これらの試料溶液を抗
血清処理ミクロタイトレーンヨンプレートに添加し室温
で約１時間インキュベートする。

さらにウサギ抗血清および２次抗体として西洋わさびペ
ルオキシダーゼ標識ヤギ抗つサギエｇＧを加え、さらに
室温で約１時間インキュベートする。次に過酸化水素と
基質である０−フエニレンジアミンを加え生成した赤褐
色をコロナ２量線を示したが、その検出限界は約２ｎＳ
’であった。また、このサンドインチ法により血中およ
び肝組織中でゾロリルヒドロキゾラーゼが検出でき、ヒ
ト肝繊維化に伴う血中ゾロリルヒドロキシラーゼ量の増
加が認められた（第５図）。

なお、抗原に対する高親和性の単一クローン（クローン
番号３−４Ｈ２、第３図参照）単独あるいは他の単一ク
ローンの併用によるサンドイツチ法によシ、ポリクロー
ナルなウサギ抗力清を用いた場合よりも検出感度および
精度の点で同等かあるいは上昇が充分考えられる（特開
昭５７−５０１４９３）。また、本定量では酵素標識抗
体を用いたが、１２５工標識抗体（単一クローンおよび
ポリクローン）を用いるラジオイムノアッセイ法あるい
は免疫実験操作法ＸＩ　、　３４９７−３５１９（１９
８２）に記載の古式らの酵素標識Ｔａｂ’を用いるエン
ザイムイムノアツセイ法も試料中のゾロリルヒドロキシ
ラーゼ定量に応用できる。

２−ＩＣ２１ｇ＝Ｇ２ｂ　γ２ｂ／９ ２　５Ｇ８　ＩｇＧ□　、□／え ２　６Ｇ９　ＩｇＡ　α／に ２−７　Ｆ　８　ＩｇＡ　α／に ３−２Ｂ１２　工ｇＧよ　γ□／に ３−３Ｈ９工ｇＧ□　γ、／に ３−４Ｈ２工ｇＭ　μ／に 第　２　表 ２−ＩＣ２− ２−５０８＋ ２−６０９　− １−７Ｆ８　＋ ３−２Ｂ１２　＋ ３−３Ｈ９＋ ３−４Ｈ２＋ ３−６Ｈ５＋ 第　３　表 ２−ＩＣ２−２２，１係３１３．４７３．５２−５（）
８−１９．９　ｏＯ ＩｇＧ　３−２Ｂ１２−１７．２００ ３−３Ｈ９−０００ ３−６Ｈ５−８，０００’ ２−７Ｆ８８１．３８４，１８３．２９０．０

【図面の簡単な説明】

第１図はクローン番号３−２Ｂ１２（工ｇＧｘ）の腹水
を硫安分画、ＤＩＡＩ　−５ｅｐｈａｃθｌイオン交換
クロマトグラフイー処理後、８ｅｐｂａｃｒｙｌ　Ｂ　
−３ＱＱ　８ｕｐｅｒ−ｆｉｎｅカラムでゲル濾過した
時のたん自溶出図であシ、第２図はクローン番号２−Ｉ
Ｃ２（工ｇＧ２ｂ）の腹水を硫安分画後、Ｐｒｏｔｅｉ
ｎ　Ａ　−５ｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ　−４Ｂカラムによ
るアフィニティークロマトグラフィ一時のたん自溶出図
であり、第３図は固相−抗体結合テスト法による精製各
年−抗体のヒトゾロリルヒドロキシラーゼとの結合図で
ある。（−←−）３−２Ｂ１２、（−門一）２−６０９
、（−妊一）３−４Ｈ２、（−戸）２−５０８：、←−
ムーー）２−ＩＣ２、（−−Ｘ−→３−３Ｈ９，←−０
＝−）３−６Ｈ５、（−・−−）　２−７　Ｆ　８゜ 第４図は精製単一抗体（クローン番号２−５０８、工ｇ
Ｇ１）を用いてのヒトゾロリルヒドロキシラーゼの検量
線でちる。第４図において、（ベト）は、１チＢＳＡに
よるブロッキング、（−＋−）は、１チオパルミンによ
るブロッキング。非抗ゾロリルヒドロキシラーゼ抗体産
生ハイプリトーマからの腹水を同様に精製したものを対
照とした。 （−−ｏ−−工％ＢｓＡブロッキング、および−・−−
１％オパルミ／ゾロッキング）。 第５図は健常人および各種肝疾、（！恵者血清のゾロリ
ルヒドロキシラーゼ量。 特許出願人　富士薬品工業株式会社 手続補正書 昭和６０年７月１日 特許庁技官志賀　学殿 ■、π件の表示 昭和５９年特許願ｒＪＳ６１２２８号 ２、発明の名称 抗ヒトプロリルヒドロキシラーゼ抗体 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 住所　富山県高岡市長慶寺５３０番地 名称富士薬品工業株式会社 ４、代理人 住所　東京都千代田区麹町３丁目２番地相互第一ビル ６、補正の対象　明細書の発明の詳細な説明の欄７、補
正の内容 （１）明＃ｌＩｌ書３Ｊｊ１２行のｒ４９５−４９７．
１１１７５）　Ｊの記載を、「４９５−４９７．１９７
５Ｊ。」の記載に訂正する。 （２）回、７ｊＬの下から４行のｒＮｓ−ＩＪの記載を
、［Ｎ５−ＩＪの記載に訂正する。 （３）同、８頁８行の「非生産性のアザグアニン」の記
載を「８−アザグアニン」の記載に訂正する。 （４）同、８頁１０行のｒ　Ｉｍｍｕｕｏｌｏｇｙ　４
の記載を。 ｒ　Ｉｍｓ＋ｕｎｏｌｏｇｙ　Ｊの記載に訂正する。 （５）同、８頁１２行の１°Ｃａｍｐａｎｙ　Ｊの記載
を、［：ｏｍｐａｎｙ　Ｊの記載に訂正する。 （６）同、１１真下から４打のｒｌＯ％」の記載を、「
１．０％」の記載に訂正する。 （７）同、１２頁下から６行のｒ５．ｌ　Ｊの記載を、
ｒ５．ＩＪの記載に訂正する。 （８）同、１２頁末行の「５０％以下」の記載を、「５
０％以上」の記載に訂正する。 （９）同、１４頁６行のｒｌ’ｇ」の記載を、「Ｉｇ」
の記載に訂正する。 （１０）同、１５頁１０行のｒＯ，０３Ｊの記載を、ｒ
　Ｏ，０８Ｊの記載に訂正する。 （１１）同、１８頁１２行の「グレイ試薬」の記載を、
「プレイ試薬」の記載に訂正する。 （１２）同、２２頁５行の「精製単一抗体」の記載の後
に、ｒ　（２−５Ｇ８）Ｊの記載を挿入する。 （１３）同、２２頁５行のｒｌＯ％」の記載を、「１．
０％」の記載に訂正する。 （１４）同、２６頁第３表の表中に記載の「プロリルヒ
ドロキシラーゼ」を、［プロリルヒドロキシラーゼ抗体
」に訂正する。 以上

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. ヒトプロリルヒドロキシラーゼに存在する抗原決定基の
   うちのいずれか一つの抗原決定基のみに免疫交さ反応性
   を有する各単クローン性抗体。