JPH0375151B2

JPH0375151B2 -

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Publication number: JPH0375151B2
Application number: JP10488886A
Authority: JP
Priority date: 1986-05-09
Filing date: 1986-05-09
Publication date: 1991-11-29
Also published as: JPS6255075A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、病原性菌として知られているボルデ
テラ（Bordetella）属に属する微生物の培養方法
及びその際に使用される培地に関する。ボルデテラ属に属する微生物としては、百日咳
菌、パラ百日咳菌、気管支敗血症菌等があり、特
に百日咳菌は、100日つづくといわれる特有の咳
を伴う、気管、気管支、および小気管支がおかさ
れる急性の感性症である百日咳の主たる病原菌と
して知られている。従つて、臨床上は、かかる百
日咳菌等の迅速・確実な検出が望まれており、そ
のために臨床分離菌の生育を促進するような培養
方法あるいは培地が必要である。また、百日咳の
予防のためには百日核ワクチン（死菌の全菌体ワ
クチン又はコンポーネントワクチン）が用いられ
るが、ワクチンを効率良く生産するためにも、百
日咳菌の生育を促進するような培養方法あるいは
培地が望ましい。また、例えば、百日咳相菌の
培養物（培養培地と菌体）からは、糖尿病治療乃
至予防薬としての展開が期待しうるところの、イ
ンシユリン分泌増強活性物質（Ｉ slet
activatingprotein、以下IAPと略記する）や、百
日咳菌のワクチンコンポーネントとして注目され
ているleukocytosis promoting factor−
hemagglutinin（以下以下LPF−HAと略記する）
やfilamentous−hemagglutinin（以下Ｆ−HAと
略記する）等、医療上有効な生物学的活性物質が
得られるが、かかる生物学的活性物質を効率良く
製造するためにも、百日咳菌の効率的培養方法が
必要である。 Bordetella属に属する菌、とりわけ百日咳相
菌の生育用の培地としては、コーエンら（アメリ
カン・ジヤーナル・オブ・パブリツク・ヘルス；
American Journal of Public Health 36 371
〜376（1946））やサザーランドら（ジヤーナル・
オブ・パソロジー・アンド・バクテリオロジー；
Journal of Pathology and Bacteriology 82
431〜438（1961））の考案した。活性炭やスターチ
或いはイオン交換樹脂を含む培地が知られてい
る。しかし、活性炭やイオン交換樹脂は不均一系
を形成し、菌増殖の経時変化を追跡するのに適さ
ないし、又、非特異的吸着性の為、脂肪酸等の菌
の生育に抑制を及ぼす因子の除去効果は必ずしも
選択的とは云えない。菌の生育に及ぼすスターチ
の効果も充分とは云えず、上記の欠陥を補う新し
い培地の開発が望まれていた。又、臨床的に百日
咳菌を単一コロニーとして分離するに際しては、
百日咳患者の口咳噴霧液を直接ボルデー・ヂヤン
グ培地（以下、BG培地と略す）の如き血液を含
む固型寒天培地に接触させることが必要とされる
が、これらの培地は、新鮮血液を必須成分とする
ため保存性に乏しく、ひつきようコロニー形成能
の再現性が悪いという欠点を有していた。従つて
かかる点からも一定の化学組成を有し、且つ、保
存性に富む臨床用分離培地の開発が望まれてい
た。近年、ステナー（Stainer）及びシヨルテー
（Scholte）によつてこの百日咳菌の大量培養のた
めの合成培地が開発された（ジヤーナルオブジ
エネラルマイクロバイオロジー（J.gen.
Microbiol）63巻、211−220頁、1971年）。この
ステナー・シヨルテー培地（以下SS培地と略記
する）は天然物由来の血液及びポリペプトン等、
ロツト差に変動の考えられる物を含まないため、
菌の培地組成を厳密にコントロールし得るので、
菌性状に変化をもたらすことなく、培養を行い得
ること、及び前述したIAPもしくはLPF−HAの
如き生物学的活性物質の分離・精製に際し、不要
な他種蛋白質の爽雑を防ぎ得る等の特徴を有すの
で近年百日咳ワクチン及び百日咳菌よりの生物学
的活性物質を工業的規模で製造するのに広く用い
られているが、撹拌下もしくは静置下の液体培養
条件でLPF−HAの産生等が十分でなく、また接
種サイズが10⁷cells／ml以下の場合、安定な生育
特性が得られないという欠点を有する。またSS
培地に寒天を１〜２％となるように加えて固化し
て得た寒天培地（以下SSA培地と略記する）で
は、10⁷cells以下の播種（シード）でのコロニー
形成は認められないという大きな欠陥を有する。本発明の目的は、ボルデテラ属に属する微生物
の安定でかつ効率的な培養方法を提供することに
ある。本発明の他の目的は、かかる培養において
使用される培地を提供することにある。そして、かかる本発明の目的は、ボルデテラ属
に属する微生物を培養するに際し、カザミノ酸を
0.1〜20ｇ／、アスコルビン酸を0.01〜１ｇ／
及びグルタチオンを0.1〜５ｇ／及びメチル
シクロデキストリンを0.001〜５ｇ／含有する
培地用いることを特徴とする、ボルデテラ属に属
する微生物の培養方法、並びにカザミノ酸、アス
コルビン酸、グルタチオン及びメチルシクロデキ
ストリンを含有する培地によつて達成される。本発明におけるボルデテラ属に属する微生物と
は、百日咳菌、パラ百日咳菌、気管支敗血症菌を
いう。本発明において好ましく用いられるのは百
日咳菌であり、なかでも百日咳相菌が好まし
い。ボルデテラ属に属する微生物の菌学的性質及
び培養条件等に関しては、Bergys Manusl of
Determinative Bacteriology、第８版、1974年、
The Williams ＆ Willkins Co.発行やJ.Exp
Med.129巻、第523−550頁、1969年あるいは細菌
学実習提要、第３版、第80頁以下、昭和47年、丸
善発行等がありすでに公知である。本発明の培地の成分とし用いられるカザミノ酸
は、カゼインの酸による加水分解物であり、乾燥
した粉末として入手できる。また、アスコルビン
酸はビタミンＣとして知られており、グルタチオ
ンは、酵母および動物の肝臓、筋肉などに広く分
布しているペプチドの一種である。グルタチオン
は酸化型のものでも還元型のものでも、又それら
の混合物であつてもよい。本発明の培地には、カ
ザミノ酸が0.1〜20ｇ／、好ましくは0.5〜10
ｇ／、好ましくは0.1〜0.4ｇ／、グルタチオ
ンが0.1〜５ｇ／、好ましくは0.1〜１ｇ／含
まれていることが必要である。上記範囲外の場合
には、本発明の目的が十分には達成されない。本発明の培地には、前記成分に加えて、メチル
シクロデキストリンを0.001〜５ｇ／、好まし
くは0.005〜５ｇ／含有せしめる。メチルシク
ロデキストリンは、そのまま、前記成分を含有す
る培地に添加混合しても良いが、あらかじめグル
タチオンと包接化合物をつくらせこの包接化合部
に添加してもよい。本発明におけるメチルシクロ
デキストリンとはメチルエーテル化シクロデキス
トリンをいい、中でも、ヘキサキス（２，６−Ｏ
−ジメチル）α−シクロデキストリン（Me α−
CD）やヘプタキス（２，６−Ｏ−ジメチル）β
−シクロデキストリン（Me β−CD）が好まし
い。本発明において培地とは、ブイヨンやペプトン
水などの従来公知の液状培地、あるいは液状培地
に寒天、ゼラチン、卵白、血清などを加えて固形
にした従来公知の固形培地を意味するが、好まし
いのはSS培地（又はSSB培地）、及びこれに寒天
を１〜２％（Ｗ／Ｖ）程度添加し固化したSSA
培地である。例えば、SS培地は、通常、１あ
たり、グルタミン酸ナトリウム、ｌ−プロリン、
塩化カリウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウ
ム、トリスヒドロキシメチルアミノメタンを、そ
れぞれ10.7、0.24、2.5、0.5、0.2、0.1、0.02、
1.525ｇを含む水溶液を濃塩酸でPH7.6に調整した
後、121℃で15分間オートクレーブで滅菌して得
られる基礎培地に、ｌ−シスチン、硫酸第１鉄、
アスコルビン酸、ニアシン、グルタチオンを１
あたり、それぞれ４、１、２、0.4、10ｇを含む
溶液をミリポアフイルター（0.45μ）で除菌して
得られる補液を、基礎培地に対して1.0％（Ｖ／
Ｖ）の割合で加えて得られる。本発明において
は、かかる培地にカザミノ酸、アスコルビン酸及
びグルタチオンの必要量が添加され、更にメチル
シクロデキストリンの必要量が添加される。本発明の培地は、菌が安定に且つ効率良く生育
するので、百日咳の臨床分離菌の生育及び検出の
ために好ましく使用することができる。また、糖
尿病治療薬としての医療効果が期待されるIAP、
百日咳ワクチンコンポーネントとして期待される
LPF−HAやＦ−HA及び菌体ワクチン等の活性
物質の製造上も極めて有利な培地である。かかる培地を用いたボルデテラ属に属する微生
物の培養方法及び条件は特に限定されるものでは
なく、従来公知の方法及び条件を採用できるが、
静置培養よりは振とう培養の方が好ましく、培養
温度は30〜38℃、培養時間は10〜100時間が適当
である。培養物（培養培地と菌体）から、生成された生
物学的活性物質を採取する方法、手段も特に限定
されるものではなく、公知の方法、手段を利用で
きる。例えば、LPF−HAを得るには、百日咳
相菌（ボルデテラ・パタシス東浜株）を本発明の
培地にて35℃で48時間培養し、得られる培養液の
遠心上清（PH8.3）を、PH8.0の0.01Mリン酸緩衝
液で平衡化したハイドロキシアパタイトカラムに
通過せしめる。そして、得られる通過液をPH6.0
の0.01Mリン酸緩衝液で平衡化したハイドロキシ
アパタイトカラムに吸着させ、これを0.5M塩化
ナトリウムを含む0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）で
溶出して蛋白分画を得る。この蛋白分画をハプト
グロビン−セフアロース4Bを支持体とするアフ
イニテイークロマトグラフイーに吸着させ、
0.5M NaCl及び3Mのチオシアン化カリウムを含
む0.1M燐酸緩衝液（PH7.0）で脱着してLPF−
HAを得ることができる。またPH8.0のハイドロキシアパタイトカラムに
吸着されたものを、0.5M塩化ナトリウムを含む
0.1M燐酸緩衝液（PH7.0）で溶出して蛋白分画を
得る。この蛋白分画をハプトグロビンセフアロー
ス4Bを支持体とするアフイニテイークロマトグ
ラフイーに通過せしめ、通過液よりＦ−HAを得
ることができる。以下、実施例により本発明を詳述する。実施例１通常のSSA培地（アスコルビン酸を0.02ｇ／
含む）中のグルタチオンの濃度を1.5倍、即ち
0.15ｇ／に変更し、更にカザミノ酸の濃度が
各々０、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0ｇ／となるよ
うに、又Me β−CDの濃度が各々０、0.05、
0.10、0.25、0.50、1.0ｇ／となるように調整し
た改良SSA培地に、約100個の百日咳相菌東浜
株をスプレツドして、35℃で３日間培養した。そ
して、形成されたコロニーの数を、同条件下の
BG培地で形成されたコロニー数と比較した。そ
の結果を第１表に示した。Me β−CDの0.50〜
1.0ｇ／の添加によつて、コロニーはBG培地の
場合とほぼ等しい数だけ形成されていることがわ
かる。カザミノ酸の0.5〜5.0ｇ／の存在は出現
コロニーの形態をより明白にしていた。

【表】レート
※：コロニーは小さい。
実施例２通常のSSB培地の基礎培地に、カザミノ酸を10
ｇ／となるように添加し、更にグルタチオンが
1.5倍、アスコルビン酸が20倍になるように調整
した補液を1.0％（Ｖ／Ｖ）の割合で加えた。か
くして得られた改良SSB培地（カザミノ酸を10
ｇ／、アスコルビン酸を0.4ｇ／、グルタチ
オンを0.15ｇ／含む）に、Me β−CDを各々
０、0.05、0.5、2.0、5.0ｇ／となるように加
え、それぞれの200mlを坂口フラスコに分注した
後、百日咳相菌東浜株を1.5×10⁹個／mlとなる
ように接種し、35℃で培養した。その結果を第１
図と第２図に示した。第１図は菌濃度（IOU／ml）と培養時間の関係
を、第２図は、LPF−HA活性の経時変化を示し
ている。本発明の培地を用いると百日咳菌の増殖
及びLPF−HA産生が著しいことがわかる。そし
て、かかる効果はMe β−CDの添加によつて促
進されていることもわかる。なお、菌濃度とLPF−HA活性は以下の如き方
法で求めたものである。菌濃度は培養液の濁度
（OD650）を測定して求めた。IOUと
International Opacity Unitの略であり、IIOU
＝10⁹個／mlに相当する。LPF−HA活性は、以
下の如き方法で産生されたLPF−HAを採取しそ
の活性を測定した。培養液の遠心上清（PH8.6）
を、PH8.0の0.01Mリン酸緩衝液で平衡化したハ
イドロキシアパタイトカラムに通過せしめ、得ら
れる通過液をPH6.0に調整した後、今度はPH6.0の
0.01Mリン酸緩衝液で平衡化したハイドロキシア
パタイトカラムに吸着させ、これを0.5M塩化ナ
トリウムを含む0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）で溶
出して蛋白分画を得た。この蛋白分画をハプトグ
ロビン−セフアロースを支持体とするアフイニテ
イークロマトグラフイーに吸着させ、0.5M
NaCl及び3Mのチオシアン化カリウムを含む
0.1Mトリス緩衝液で脱着してLPF−HAを得た。
LPF−HA活性は、佐藤らの酵素抗体法（ELISA
法、第28回毒素シンポジウム（1981年７月23日〜
24日、岩手県八幡平）講演要旨集、第141〜144頁
参照）によつて測定し、LPF−HAの活性単位
（ｕ）は、OD400ｍμが、単位容量（ml）当り0.1
を与える各サンプルの希釈倍数であらわした。実施例３実施例２と同様な方法で（但し、Me β−CD
は添加せずに）、アスコルビン酸、グルタチオン、
カザミノ酸を種々の濃度で含む培地を準備し、実
施例２と同じ方法で百日咳菌を接種、培養し、48
時間後のLPF−HA活性を測定した。結果は第２、３、４表に示した通りであつた。

【表】

【表】実施例４ (1) 培養通常のSSB培地の基礎培地に10ｇ／のカザ
ミノ酸及び２ｇ／のMe β−CDを加え、こ
れにグルタチオン酸が20倍となるように調整し
た補液を1.0％（Ｖ／Ｖ）の割合で加えた。か
くして得られた改良SSB培地４に、1.0×10⁹
個／mlとなるように百日咳相菌を接種し、
5.0の培養器を用いて培養を行つた。48時間
後、菌濃度は約10¹²個／ml、LPF−HAは
ELISA値で1250U／mlとなつた。培養終了液を
6000rpm×30分遠心分離して得られた上清
（3.6）を、以降のLPF−HA精製に供した。 (2) 培養液からのLPF−HAの分離精製培養上清3.6（PH8.3）を、４℃前後で0.01
モルリン酸バツフアー（PH８）で平衡化したハ
イドロキシルアパタイト（BDHケミカルズ社
製）カラム（100ml）に、流速200ml／時間で流
した。0.01Mリン酸緩衝液（PH８）0.4でカ
ラムを洗い、得られた通過液4.0を濃塩酸で
PH6.0に調整した。この溶液を、0.01Mリン酸
緩衝液（PH6.0）で平衡化したハイドロキシル
アパタイトカラム（140ml）に、流速100ml／時
間で流した。0.01Mリン酸緩衝液（PH6.0）0.5
でカラムを洗い、次いで0.1モルリン酸緩衝
液（PH7.0）250mlで洗い、更に0.5モル食塩を
含む0.1モルリン酸緩衝液（PH7.0）で溶出、分
画した。得られた蛋白画分を集め（100ml）0.5
モル食塩を含む0.1モルリン酸緩衝液で平衡化
したハプトグロビン−セフアロース4Bカラム
（30ml）に通した。吸着したものを、３モルチ
オシアン酸リと0.5モル食塩を含む0.1モルリン
酸緩衝液で溶出、分画した。得られた蛋白画分
を集め、0.5モル食塩を含む0.1モルリン酸緩衝
液（PH7.0）に対し透析してLPF−HAを20.7mg
得た。このものは、ポリアクリルアミドゲル（ポリ
アクリルアミド濃度7.5％、1N KOH−氷酢酸
緩衝液（PH4.3））デイスク電気泳動で単一バン
ドを示し、泳動位置は既存のLPF−HAと一致
した。またこのもののELISA値は、111.0U／
μｇであつた。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の培地を用いた場合の菌濃度
と培養時間の関係を示す図であり、第２図は同じ
くLPF−HA活性と培養時間の関係を示す図であ
る。

Claims

【特許請求の範囲】１ボルデテラ（Bordetella）属に属する微生物
を培養するに際し、カザミノ酸を0.1〜20ｇ／、
アスコルビン酸を0.01〜１ｇ／、グルタチオン
を0.1〜５ｇ／及びメチルシクロデキストリン
を0.001〜５ｇ／含有する培地を用いることを
特徴とする、ボルデテラ属に属する微生物の培養
方法。２ボルデテラ属に属する微生物を検出及び／又
は培養するための培地であつて、カザミノ酸を
0.1〜20ｇ／、アスコルビン酸を0.01〜１ｇ／
、グルタチオンを0.1〜５ｇ／及びメチルシ
クロデキストリンを0.001〜５ｇ／含有してい
ることを特徴とする培地。