JPH04126079A - 微生物起源カルボキシペプチダーゼｂ様酵素 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は新規な微生物起源カルボキシペプチダーゼＢ様
酵素に関する。

（従来の技術） カルボキシペプチダーゼＢ（以下、ＣＰａ５ｅ　Ｂとす
る）はすでに知られており（Ｊ、Ｅ、Ｆｏｌｋ、Ｔｈｅ
　Ｅｎｚｙｒａｅｓ　（３ｒｄ　ｅｄ、）３５７〜７９
　（１９７１）　　）　、このＣ’Ｐａ５ｅ　Ｂは、ペ
プチドのＣ末端のアルギニンまたはリシンを切断するた
め、タンパクの一次構造解析用の生化学試薬として汎用
されている。さらに、このＣＰａ５ｅ　Ｂは、例えばキ
ニン（Ｋｉｎｉｎ）の不活化作用を有するため、医薬品
としての用途などが期待される。

ＣＰａ５ｅ　Ｂはヒト、ラン、ブタ、ラットの膵臓、サ
メ、ヒトデなどに存在し、ブタ膵臓抽出物を原料とした
ものが市販されている。しかし膵臓抽出物は他の酵素、
例えば、カリクレインおよびトリプシンを含んでいるた
め、工業的なスケールでこの両方の酵素とＣＰａ５ｅ　
Ｂとを分離するには、非常に大きな経費を必要とする。

さらに、動物臓器は酵素製造原料として資源的に工業規
模の生産には適していないという欠点がある。

（発明が解決しようとする課題） 本発明は、上記従来の課題を解決するものであり、その
目的とするところは、動物臓器由来のＣＰａ５ｅ　Ｂに
かわる微生物起源のＣＰａ５ｅ　Ｂ様酵素を提供するこ
とにある。

（課題を解決するための手段） 本発明者らは、上記の目的を達成すべく、種々の微生物
を検索した結果、大阪府冨田林市の土壌中から採取され
たＣｈａｅｔｏｍｉｕｍ　（ケトミウム）に属するＣｈ
ａｅｔｏｓｉｕｍ　ｓｐ、　Ｆ−３３が目的とするカル
ボキシペプチダーゼの性質を有する酵素を生産すること
を見い出した。そして、この酵素を精製し、その性質を
詳細に検討した結果、新しいタイプのｃＰａｓｅ　Ｂ様
酵素であることをｌＩＮ！認し、本発明を完成するに至
った。

本発明のＣＰａ５ｅ　Ｂ様酵素は、次の性質を有する。

（１）作用：カルボキシ末端がアルギニンまたはリシン
であるペプチドの８亥末端のアルギニンまた：よリシン
を、加水分解により遊離させる。

（２）基質特異性ニゲリシル−グリシル−チロシルアル
ギニン、ブラジキニン、ニューロテンシン断片１−８に
作用し、Ｃ末端のアルギニンを加水分解により遊離させ
る。

（３）至適ｐＨ：約８．５（トリス−塩酸緩衝液中）。

（４）至適温度＝５５℃ （５）ｐ　Ｈ安定性：２５℃にて９時間保持した場合に
、ｐＨ７〜１０において安定である。

（６）熱安定性：４℃，ｐＨ７，５にて保持すると、少
なくとも１年間は１００％の活性を示す。

５５℃で５時間加熱した場合に、９０％の残存活性を示
す。

（力分子量ニゲル濾過法により測定した場合の分子量は
約４５万である。

（８）等電点：　５．４９ 本発明のＣＰａ５ｅ　Ｂ様酵素はＣｈａｅｔｏｍｉｕｍ
属菌、特にＣｈａｅｔｏｍｉｕｍ　ｓｐ、　Ｆ−３３株
により生産される。この菌株は、発明者らにより大阪府
冨田林市より採取された土壌中から単離された新菌株で
ある。この菌株の菌学的性質を次に示す。

（Ａ）培地における生育状態 ■肉汁寒天培地 肉汁寒天培地での生育は５℃では全く起こらない。３０
℃では７日間でコロニーの直径が４．７〜５．７１に達
する。性状は白い綿状である。１４日間の培養でコロニ
ーの直径は７〜８ＣＩ１１に達する。２１日間の培養で
表面は密になり湿った状態の羊毛状となるが、着色は見
られず子のう殻も形成されない。

３７℃では生育が悪く成熟に至らない。

■ツアペック寒天培地 ツアペ、り寒天培地での生育は５℃では全く起こらない
。３０℃では７日間でコロニーの直径が４〜５ｃｍに達
する。性状は白い綿状であり、肉汁寒天培地上のコロニ
ーに比べて湿状態となる。１４日間の培養ではコロニー
の直径が７〜８０Ｉ１１に達し、部分的に黒縁色となる
。３０日の培養でほぼ全体的に黒縁色となる。子のう殻
の形成は見られない。

■オートミール寒天培地 オートミール寒天培地での生育は５℃では起こらない。

３０℃では７日間でコロニーの直径は５〜６Ｃ１１に達
し、性状は羊毛状となる。１４日間でコロニーの７直径
は７〜８Ｃ１１に達し裏面が暗オリーブ緑色〜緑黄色と
なる。

■ポテト・グルコース寒天培地 ポテト・グルコース寒天培地での生育は５　’Ｃでは起
こらない。２３℃では９日間でコロニーの直径は４〜５
Ｃ１＋に達し、性状は白い綿状である。１４日間ではコ
ロニーの直径は６．５〜７．５　ｃｍに達する。

中心部と円周部を残し、中間部の内部は黒縁色となり、
中心部の裏面は黒かっ色となる。それにともなって全体
が湿った状態となり、着色部に油味を生しる。子のうは
多く認められるが子のう胞子は少ない。黒縁色の部分↓
二子のう殻の形成が認められる。

（Ｂ）生理的、生態的性質 ■最適生育条件 ｐＨ５〜７ 温度　２３゛Ｃ〜２７゛Ｃ ■生育の範囲 ｐｉ（４〜８ 温度　１５゛Ｃ〜３７゛Ｃ ■その他の顕著な特徴 ポテト・グルコース培地での培養により、カルボキシペ
プチダーゼＢ様酵素を菌体内に生産する。

（Ｃ）顕微鏡的所見 ■子のう殻：若いうちは透明であり、成熟すると黒縁色
となる。卵形〜弁球形で大きさは２００〜２４０　Ｘ１
５０〜２００　ｕｔａである。

■頂毛：暗オリーブかっ色〜はとんど黒色で隔壁があり
、直毛である。はぼ直角に分枝し、複雑な網目を形成す
る。先細にならずふっつりした先端におわる。基部での
幅７〜７．５μ憚。

■倒毛：頂毛に類イ以するが幅は狭い。基部での幅５〜
６μ隣。

■子のう：こん棒形　８胞子 ■子のう胞子：最初は無色で、後に暗オリーフかっ色と
なる。幅広いだ円形〜円形。６〜マＸ４〜６μｍ。

上記菌学的性質に基づいて、「ア・モノグラフ・オブ・
ケトミウム（Ａ　ｍｏｎｏｇｒａｐｈ　ｏｆ　ｔｈｅ　
ｇｅｎｕｓｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ）　Ｊ　（１９７０）
　〔セス（ＨＪ、５ｅｔｈ）　’Ｊ、１ケトミアシエ（
Ｃｈａｅｔｏｍｉａｃｅａｅ）　　Ｊ　（１９６３）　
（アメス　（１、Ｍ、Ａｎ＋ｅｓ）　）　、および「菌
類図鑑（下）　Ｊ　（１９７８）〔椿　啓介他〕を参照
し、これを検索したところ本菌株はケトミウムに属する
と判断された。本菌株はケトミウム・スビノスムにｉ（
以するがケトミウム・スピノスムは子のう胞子が卯形で
あり　（上記文献に記載）、本菌株式会社では幅広いだ
円形〜円形であることが異なる。さらに、ケトミウム・
スピノスムは３７℃では生育せず、オートミール寒天培
地上で灰黄かっ色になる（上記文献に記載）のに対して
、本菌株では裏面が暗オリーブ緑色〜緑黄色となり、３
７℃て生育は悪いが生育可能である点で異なる。

従って、本発明者は本菌株をＣｈａｅｔｏｍｉｕｍ　（
ケトミウム）　ｓｐ、　Ｆ−３３と命名した。本菌株は
、工業技術院微生物工業技術研究所に、微工研菌寄第１
１７１７号（ＦＥＲＭ　Ｐ−１１７１７）として寄託さ
れている。

本明細書においてアミノ酸、ペプチド、保護基等の略号
による表示は当該分野における慣用記号に従うものとす
る。

囲１条註 本発明のＣＰａ５ｅ　Ｂ様酵素を製造するために生産菌
株を培養するための培地は格別である必要はな（、通常
の培地が用いられる。炭素源としてグルコース、シュー
クロース、グリセロール、デンプンなどが用いられる。

窒素源として肉エキス、酵母エキス、麦芽エキス、ポリ
ペプトン、カザミノ酸、各種アミノ酸、総合アミノ酸、
ダイズタンパク、魚粉などが用いられる。塩類としては
、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、酒石酸カリウム、硝酸ナトリウム
、リン酸−カリウム、硫酸マグネシウム、塩化カルシウ
ムなどが用いられる。その他、ふすま、米糠、菜種粕、
糖蜜、コーンステイープリカー、ポテトエキス、ビタミ
ン類なども有用である。

特に、零カルボキシペプチダーゼＢ様酵素（以下、ＣＰ
ａ５ｅ　Ｂ様酵素とする）生産菌の培養（種培養および
生産用培養を含む）の培地として好適に用いられる培地
としては、ポテトエキス・シェークロース培地が好適で
ある（実施例で詳述する）。

培養はｐｌ（５〜７、好ましくはｐｌ（６付近で、２５
℃〜３７℃１好ましくは３０℃にて、振とうまたは通気
攪拌下にて行われる。培養時間は、例えば坂ロフラスコ
を用いた場合には、４０〜１００時間が適当であり、フ
ァーメンタ−を用いた場合には４５〜５０時間が適当で
ある。

群！■採取叛 本ＣＰａ５ｅ　Ｂ様酵素は主に菌体内に存在するので、
培養終了後、ろ過あるいは遠心分離などにより集菌した
後、菌体を破砕して酵素の抽出を行う。例えば、ガラス
ピーズ、海砂などの共存下で、菌体を乳鉢、ボールミル
などを用いて磨砕する方法（市販装置としてダイノミル
Ａ、　Ｂａｃｈｏｆｅｎ社がある凍結融解法、酵素処理
法などがあげられる。菌体の破砕法は特に限定されない
が回収率の高い方法が好ましい。菌体破砕後は緩衝液を
加えた後ろ過し、あるいは遠心分離を行うことにより粗
酵素液が得られる。

この粗酵素液から精製酵素を得るには、通常、酵素の精
製に用いられている方法が単独で、もしくは組合わせて
用いられ得る。それには例えば、塩析、溶媒沈澱、各種
イオン交換カラムクロマトグラフィー、疎水クロマトグ
ラフィー、ゲル濾過法、アフィニティークロマトグラフ
ィー、遠心分離、電気泳動法などが挙げられる。例えば
、粗酵素液を硫安分画し、次いで、エタノール分画を行
い、クロマトグラフィーにかけ、そしてゲル濾過を行う
ことにより精製酵素が得られる。上記クロマトグラフィ
ー処理としては、例えば、まず、イオン交換カラム　（
Ｑ−セファロース、ＤＥＡＥ　トーヨーバールなど）に
かけ、次いで、疎水カラム（プチルトーヨーパールなど
）にかける方法が挙げられる。上記ケル濾過担体として
はトーヨーパールＨ−５５Ｓなどがある。

屑血」すを去 ３０ｔＭＢｚ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ　Ｏ，１ｒｘｉ！と１０
０ｍＭ　　トリス−塩酸（ｐＨ８，５）　０．８５ｍの
混液に酵素液０．０５ｙｒｉを加え、５５℃で反応を開
始させる。１５分間反応後、これを速やかに水冷したの
ち、２００ｍｔｌクエン酸緩衝液（ｐＨ５，０）を１ｒ
ＩＩｌとニンヒドリン試薬１〆とを順次加えて、すばや
く攪拌し、反応を停止させる。得られた反応液を沸騰水
中で５分間加熱した後、氷冷する。これに６０％（ｖ／
ｖ）エタノール２　ｄを加え、十分に混合した後、５７
０ｎａ＋における吸収を測定する。

本酵素の１単位（Ｕ）は、５５℃で１分間当り１モルの
基質を分解する（１モルのＡｒｇを遊離する）ことので
きる酵素量とする。

本測定に用いるニンヒドリン試薬は、ニンヒドリン１５
ｇをメチルセロソルブフ゛３００　ｄで？審問したＡ液
と、０．ＯＩＭ　ＫＣＮ　５ｄにメチルセロソルブ２５
０１１１を溶解させたＢＷｌとを１：５の比で混合して
調製する。

か１鋲１１資 以下の酵素の性質のうち、基質特異性、阻害、分子量、
等電点、およびＫｍ値については後述の実施例により得
られる精製標品を用いて測定を行った。至適ｐＨ及び安
定ｐｉ（範囲、至適温度および熱安定性については、次
のようにして得られる部分精製標品を用いた。まず、菌
体抽出液に硫安を８０％飽和で加え、得られた沈澱を、
１００ｍＭ　）　’）スー塩酸（ｐＨ７，５）に対し透
析した。この透析内液を同緩衝液で平衡化したＱ−セフ
ァロースに吸着させた後、溶出液のＮａＣ１濃度を０〜
１Ｍに直線的に高めて溶出させ、部分精製標品を得た。

■作用 カルボキシ末端がアルギニンまたはリシンであるペプチ
ドの該末端のアルギニンまたはリシンを、加水分解によ
り遊離させる。末端がアルギニンのペプチドに最もよく
作用する。

■基質特異性 表１に示す合成ペプチドの分解性を調べた。まず、５％
エタノールを含む１００ｄ　　ｌ−リス−塩酸（ｐｉ（
８，５）に各基質（合成ペプチド）を１１の割合で加え
、５５℃にわいて所定の時間反応させた。ニンヒドリン
法（活性測定法に準する）により生成した遊離アミノ酸
を定量することにより、基質分解速度を算出した。その
結果を表１に示す。

（以下余白） 表１から、本発明ＣＰａ５ｅＢ様酵素：よ、Ｃ末端がＡ
ｒｇのペプチドを最もよく分解することがわかる。

Ａｒｇと同様に塩基性アミノ酸であるＬｙｓをＣ末端に
有するペプチドも比較的よく分解するが、その速度はＡ
ｒｇの場合の約１７９であった。この点で、本酵素は、
ＣＰａ５ｅ　Ｂ、例えば、Ｔｈｅ　ＥｎｚｙＩｌｅ、　
３ｒｄ　ｅｄ。

３、５７−７９（１９７１）に記載のＣＰａ５ｅ　Ｂ　
（この酵素は、末端か＾ｒｇのペプチドおよび末端がＬ
ｙｓのペプチドを同程度の割合で分解する）と異なる。

Ｃ末端から２番目のアミノ酸残基がＰｈｅ　（芳香族ア
ミノ酸）であるペプチドの場合には、同程度の分解能が
認められるが、Ｇｌｙ、　Ａｌａ、　ｌｉｅ、　Ｌｅｕ
などの脂肪族アミノ酸の場合にはＣ末端のアミノ酸の種
類によりそれぞれ分解能が異なることがわかる。

次に、本酵素による各種天然ペプチドの分解を調べた。

１Ｉｌｌ’ｌの基質を含む１抛門リン酸緩衛液（ｐＨ７
，５）中、５５゛Ｃにおいて所定の時間酵素を反応させ
た。遊離したアミノ酸をアミノ酸分析計（日立高速アミ
ノ酸分析計８３５形）で測定した。その結果を表２に示
す。

表２の結果と同様、Ｃ末端から２番目のアミノ酸残基が
Ｔｙｒ、　Ｐｈｅなど芳香族アミノ酸の場合には高い分
解活性が示された。これに対し、Ａｌａでは１７３〜１
／４に活性が低下し、Ｌｅｕではまったく分解が行こら
なかった。さらに、本ＣＰａ５ｅ　Ｂ様酵素はＣ末端か
ら２番目のアミノ酸残基がＰｒｏの場合にも比較的良好
に分解が行われた。これは、上記ＴｈｅＥｎｚｙｒ＠ｅ
に記載のＣＰａ５ｅ　Ｂが、Ｃ末端から２番目がＰｒｏ
であるペプチドをほとんど分解しないのとは大きく異な
る点である。

このように、本発明のＣＰａ５ｅ　Ｂ様酵素は、Ａｒｇ
、Ｌｙｓなどの塩基性アミノ酸をＣ末端に有するペプチ
ドをよく分解するという点では従来のＣＰａ５ｅ　Ｂと
同様であるが、次の点において異なることが明らかであ
る。

（ｉ）ＡｒｇをＣ末端に有するペプチドの方がＬｙｓを
Ｃ末端に有するペプチドの場合より１０倍近く分解が速
い。

（ｉｉ）Ｃ末端から２番目のアミノ酸がＰｒｏであるペ
プチドについても比較的良好に分解が行なわれる。

（ｉｉｉ　）　Ｃ末端から２番目のアミノ酸が芳香族ア
ミノ酸の場合には、比較的良好に分解が行われる。

■至ｉ！ｌｐＨおよび安定ｐＨ 本酵素を用い、ｐＨ６〜１０の範囲のｐｌ（条件下で活
性測定法に準じて酵素反応を行った。各ｐＨにおける酵
素の相対活性を第１図に示す。第１図において、・はト
リス−塩酸、△はＫＨｚＰＯ４−ＮａｚＨＰＯ４、口は
ホウ酸’　ＫＣＩ−ＮａｚＣＯ：＋、そして○はＮａｚ
ＨＰＯ４−クエン酸の各緩衝液を用いた結果を示す。第
１図から、至適ｐＨは５５℃において約８．５であるこ
とがわかる。

本酵素を所定のｐＨのＢｒｉ　ｔｔｏｎ−Ｒｏｂｉｎｓ
ｏｎ緩衝液に２．７６　Ｘ　１０−’Ｕ／ｍｌの割合に
溶解し、２５℃で９時間保持した後に残存活性を測定し
た。その結果を第２図に示す。第２図から安定ｐＨ範囲
は、ｐＨ７，０から１０．０であることがわかる。

■作用適温の範囲 本酵素を用いＢｚ−Ｇｌｙ−Ａｒｇを基質とし、３０〜
７０℃の範囲の温度条件下で、活性測定法に準して酵素
反応を行った。その相対活性を第３図に示す。第３図か
ら本酵素の至適温度は約５５℃であることがわかる。

■熱安定性 本酵素をｐｌ（７，５，４℃にて保持したところ少なく
とも１年間は失活しなかった。ｐＨ７，５，５５℃にて
４時間保持した後にも９０％の残存活性を示巳な。

本酵素を２．７６Ｘ１０−’Ｕ／ｓ＋１の濃度でｐＨ７
，５において、第４図に示す温度（５５℃〜１００℃）
にて１５分間保持し、その残存活性を求めた。その結果
を第４図に示す。第４図から本酵素は、ｐＨ７，５で１
５分間保持したときに５５℃まで安定であり、８０℃以
上において完全に失活することがわかる。

■阻害 表３に示す化合物を０．７＋＋Ｍの割合で含む１０抛ｈ
トリス−塩酸（ｐｉ（８，５）中で、本酵素（３，８Ｘ
　１Ｏ−ｑＵ／ｍｌ）を１０分間インキュベートした後
、残存活性を測定した。その結果を表３に示す。

（以下余白） 表３ 化合物 残存活性 （％） ヨード酢酸 ヨードアセドア Ｎ−エチルマレイ ＴＰＣＫ” ＭＳＦｂ ＬＣＫＣ ＺＰＣＫ’ ＤＴＴ” ＥＤＴＡ　’ ０−フェナンス口 ＰＣＭＢ’ リン ｇ：ｐ りＵ１１！マーキｌリーフヱニルスル本二フクアシフト
表３に示すように、本酵素はＣＰａ５ｅ　Ｂと同様にＥ
ＤＴＡ、　ｏ〜フェナンスロリンなどの金属キレート則
で強く阻害された。このことから、本酵素はメタル酵素
であることが明らかである。しかし、本酵素はＤＴＴ、
　ＰＣＭＢによっても阻害されることから一３Ｓ結合、
−５Ｈ基も活性の発現に必要であると考えられる。従っ
て、同じ（メタル酵素であるＣＰａ５ｅＢとは異なる酵
素であると考えられる。

次に、本酵素の活性に与える各種イオンの影響について
検討した。まず、１　ｍＭ　ＥＤＴＡを含む１００ｍＭ
トリス−塩酸（ｐＨ７，５）に対し、酵素液を４℃で１
２時間透析し、次いで再度１００ｍＭ　トリス−塩酸（
ｐｉ（７，５）に対し透析を行ってＥＤＴＡを除去した
。これに表４に示す化合物を、所望のイオンが１ｍＭと
なるような濃度で添加し、該酵素の活性を測定した。

（以下余白） 表４ ＮａＣＩ ＣｏＣ１□ ｅＳＯａ ｅＣＩｚ ＰｂＡｃ。

Ｚｎ５Ｏ。

ｇＳＯａ ｎＣ１ｚ ＣａＣ１ｔ ａＣ１ｚ ｕＳＯａ ＨｇＣ１゜ ＣｄＣ１！ 表４に示すように、試験した範囲内のイオン種では活性
化は認められず、むしろ阻害された。特にＣｏＣｌ２を
添加した場合には活性化が著しく低下した。これは従来
のＣＰａ５ｅ　Ｂと大きく異なる特徴である。

■分子量 トーヨーバールＨＷ５５Ｓを用いた、ゲルろ過による分
子量は約４５万である。

■等電点 ファストゲルｒＥｐ３−９ヲ用いたファストシステム（
ファルマシア社製）を用い、ｐＩカリブレジョンキット
ｐＨ２，５〜６．５をスタンダードとして本酵素の等電
点を測定した。その結果、本酵素の等電点は５．４９で
あった。

■Ｂｚ−Ｇｌｙ−Ａｒｇに対するＫＩＩＩ値Ｂｚ−Ｇｌ
ｙ−Ａｒｇを基質として１００１Ｍトリス−塩酸（ｐＨ
８，５）中で反応を行ない、Ｋ＋ｓ値を算出した。その
結果、Ｋｍ値は０．５９ｍＭであった。

既欠１ＩＩＩλＬ較 本酵素と、これまでに報告されているＣＰａ５ｅ　Ｂと
の比較を行なった結果、次の相違が明らかとなった。

■両酵素とも、塩基性アミノ酸であるＡｒｇまたはＬｙ
ｓをＣ末端に有するペプチドの該末端のＡｒｇまたはＬ
ｙｓを加水分解により特異的に遊離させる。

本発明のＣＰａ５ｅ　Ｂ様酵素は、Ａｒｇを有する基質
に対して、より有利に働き、その分解速度は、Ａｒｇを
有する基質に対する方がＬｙｓを有する基質に対するよ
りも約１０倍速い。これに対して、従来のＣＰａ５ｅＢ
は、ＡｒｇをＣ末端に有する基質およびＬｙｓをＣ末端
に有する基質に同程度に作用する。

０本酵素は、Ｃ末端から２番目のアミノ酸残基が芳香族
アミノ酸であるＰｈｅであるペプチド、および脂肪族ア
ミノ酸のうちＰｒｏであるペプチドに作用して、比較的
良好にこれを分解する。これに対して、従来のＣＰａ５
ｅ　Ｂはこれらの分解性が低い。

■両酵素とも金属酵素であるが、本酵素の場合にはＣｏ
Ｃ１ｚまたはＺｎ５Ｏ，による活性化が認められない。

さらにＤＴＴまたはＰＣＭＢによっても阻害を受ける。

これに対して、従来のＣＰａ５ｅ　Ｂは、ＣｏＣ１，ま
たはＺｎＳＯ４による活性化が認められ、かっ、ＤＴＴ
またはＰＣＭＢにより阻害を受けにくい。

このように、本発明の酵素はペプチドのＣ末端のＡｒｇ
またはＬｙｓを特異的に遊離するという性質については
、従来のＣＰａ５ｅ　Ｂと同じである。しかしながら、
基質特異性、阻害剤に対する感受性という点で全く異な
る新規酵素である。従って、本酵素はＣＰａ５ｅ　Ｂ様
酵素と命名された。

（以下余白） （実施例） 以下に本発明を実施例につき説明する。

（Ａ）菌体の培養 皮をむいて１　ｃｍ角に切ったじやがいも２００ｇに対
し水を５００ｄ！加え、加熱・沸騰させて１時間抽出を
行った。冷却後、さらしでａ、過を行い、最後↓こ、１
０００ｄになるように蒸留水を加えた。このようにして
得られたポテトエキスに２％（−／ν）のシュークロー
スを添加し、ポテトエキス・シュークロース培地とした
。

このポテトエキス・シュークロース培地を滅菌し、Ｃｈ
ａｅｔｏｍｉｕｍ　ｓｐ、　Ｆ−３３株を植菌し、３０
℃＆こて３日間種培養を行った。別に、上記ポテトエキ
ス・シュークロース培地３．５！を５２容のファーメン
タ−に入れ、１２０℃にて１５分間殺菌を行った。

これに上記種培養した培養物３００　ｄを加え、３０℃
１攪拌数１１００ｒｐ、通気量ｌ！／Ｉｌ】ｎの条件下
で培養を行った。酵素活性が最大となる培養４５時間後
に、さらしとろ紙を用いた吸引ろ過により集菌を行い、
菌体７０ｇを得た。

（Ｂ）酵素の単離および精製 この菌体７０ｇに対しほぼ同量の海砂を加え乳鉢中で菌
体を破砕した。これに、１１００Ｉｌ１トリス−塩酸（
ｐＨ７，５）　２００ｉｆを加えて、しばらく放置し、
さらしとろ紙を用いた吸引ろ過を行い、ろ液（粗酵素抽
出液）２００雌（全活性７．７３Ｘ１０−’Ｕ　、比活
性０．０２３２）を得た。以上の抽出操作は水冷下で行
った。

この粗酵素抽出液を用い、以下に述べるように精製を行
った。まず、粗酵素抽出液を、４０〜６０％飽和で硫安
分画し、酵素を沈澱物として回収した。

この沈澱物を１００ｍＭ　　トリス−塩酸（ｐＨ７，５
）に溶解した後、４℃で一晩透析を行い、ひき続き、エ
タノール分画（４０〜６０％シ／ν）を行い、再び酵素
を沈澱物として回収した（全活性４．１８Ｘ１０−’Ｕ
　、比活性？、６４　；収率５４％）。

この沈澱物を１１００ＩＩトリス−塩酸（ｐＨ６，０）
に溶解した後、同緩衝液に対し透析した。透析内液を、
あらかしめ同緩衝液で平衡化しておいたＱ−セファロー
ス（１，６Ｘ　１３ｃｍ　；ファルマシア社製）に吸着
させだ後、１００ｍＭ　　トリス−塩酸（ｐＨ６，ｏ　
；　０．ＩＭ　ＮａＣ１を含む）で、充分にカラムを洗
浄し、ＮａＣＩｆｉ度を０．１Ｍから０．４Ｍに直線的
に高めることにより酵素を溶出させた。本酵素は溶離液
のＮａＣＩｆｉ度が０．３Ｍ付近から溶出された（全活
性３．３９ＸｌＯ−’Ｕ　、比活性４０．８　；収率４
４％）。

次に、活性画分を１００ｍＭ　　トリス−塩酸（ｐＨ７
，５）に対して透析した後、あらかじめ同緩衝液で平衡
化したＤＥＡＥ　トーヨーパール６５０Ｍ　（Ｉ　Ｘ　
９ｃｍ　；東ソー社製）カラムに吸着させた。０．１Ｍ
　ＮａＣ１を含む１００ｍＭ　　トリス−塩酸（ｐＨ７
，５）で充分に洗浄した後、０、目〜０．１５Ｍ　Ｎａ
Ｃ１の直線濃度勾配により、フラクション当り２Ｉｄず
つの溶出を行った。本ＣＰａ５ｅ　Ｂ様酵素はＮａＣ１
濃度が０．１２Ｍ付近から溶出されたく全活性２．６０
Ｘ１０−’Ｕ　、比活性１４４；収率３４％）。

溶出された活性画分を１１００１ＩＩトリス−塩酸（ｐ
Ｈ７，５，３Ｍ　ＮａＣｌを含む）に対して透析した後
、あらかしめ同緩衝液で平衡化しておいたブチルｈ　−
ヨーパール６５０（ＩＸ９ｃｍ；東ソー社製）に吸着さ
せ、同緩衝液で洗浄した後、３ＭからＯＭにＮａＣ１濃
度を直線的に減少させることにより酵素の溶出を行った
。本ＣＰａ５ｅ　Ｂ様酵素は、ＮａＣ１１度が約１門の
付近で溶出された（全活性１．７８Ｘ１０−’Ｕ　、比
活性２７８．収率２３％）。

溶出された活性画分を１００＋ａＭ　　トリス−塩酸（
ｐＨ７，５）に対して充分に透析し、その内液を、あら
かじめ同緩衝液で平衡化したＱ−セファロース　（１×
９ｃｍ；ファルマシア社製）に吸着させた。これを、０
．２３ＭのＮａＣ１を含む同緩衝液で洗浄した後、Ｎａ
Ｃ！濃度を０．２３Ｍから０．４Ｍに直線的に高めた溶
離液を用いて酵素の溶出を行った。酵素活性はＮａＣ１
濃度が約０．４門のときに完全に溶出された（全活性０
．６１８ＸＩＯ−’Ｕ　　；比活性１７０．収率８．０
％）。

さらに、溶出された活性画分を１００ｍＭ　　トリス塩
酸（ｐＨ９，０）に対して透析した後、この透析内液を
同緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ　）−ヨーバール６５０
Ｍ（０，５Ｘ５ＣＩ１１、東ソー社製）に吸着させ、０
．１８ＭＮａＣｌを含む同緩衝液で充分に洗浄した。酵
素の溶出は０．１８Ｍから０．２５ＭのＮａＣｌの直線
濃度勾配により行った。酵素活性はＮａＣｌＪ度が約０
．２Ｍ付近に溶出されたく全活性０．２７４　Ｘｌ０−
’Ｕ　　、比活性１０６；収率３．５％）。

最後に、活性画分１２−を限外濾過（アミコン８（５０
型）を用いて２　ｔｘＲに濃縮した。この濃縮酵素液を
、あらかしめ１００ｍＭ　　トリス−塩酸（ｐＨ７，５
）で平衡化しておいたトーヨーパールＨＷ　５５Ｓカラ
ム（２，ＣＸ９０ｃｍ、東ソー社製）にかけ、流速４５
．６ｄ／時間でフラクション当り２ｄづつを分取した（
全活性０．０２７　ｘＬＯ−’Ｕ　　Ｈ比活性３４．２
　、収率０．３５％）。

以上の一連の操作により、収率０．３５％で比活性が１
４７０の精製酵素が得られた。この精製標品の純度をｐ
Ｈ７，５フアストゲル（ファルマシア社製）を用い検討
した結果、単一であることが明らかとなった。

上記精製酵素、および部分精製酵素の性質を調べたとこ
ろ、「酵素の性質」の項に記載した各性質が確認された
。

（発明の効果） 本発明によれば、このように、新規なカルボキシペプチ
ダーゼＢ様酵素が得られる。この酵素は微生物起源であ
るため生産が容易である。さ呟こ、既知のカルボキシペ
プチダーゼとは基質特異性が異なるため、このような性
質のちがいを利用して、蛋白の一次構造決定用試薬など
、種々の用途に利用することが可能である。

４、　゛の　　　なｉ゛ 第１図は本発明酵素の至適ｐＨを示すグラフ；第２図は
該酵素の安定ｐＨ範囲を示すグラフ；第３図は該酵素至
適温度を示すグラフ；そして第４図は該酵素の安定範囲
を示すグラフである。

以上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、以下の理化学的性質を有するカルボキシペプチダー
   ゼＢ様酵素。 （１）作用：カルボキシ末端がアルギニンまたはリシン
   であるペプチドの該末端のアルギニンまたはリシンを、
   加水分解により遊離させる。 （２）基質特異性：グリシル−グリシル−チロシル−ア
   ルギニン、ブラジキニン、ニューロテンシン断片１−８
   に作用し、Ｃ末端のアルギニンを加水分解により遊離さ
   せる。 （３）至適ｐＨ：約８．５（トリス−塩酸緩衝液中）。 （４）至適温度：５５℃ （５）ｐＨ安定性：２５℃にて９時間保持した場合に、
   ｐＨ７〜１０において安定である。 （６）熱安定性：４℃、ｐＨ７．５にて保持すると、少
   なくとも１年間は１００％の活性を示す。 ５５℃で５時間加熱した場合に、９０％の残存活性を示
   す。 （７）分子量：ゲル濾過法により測定した場合の分子量
   は約４５万である。 （８）等電点：５．４９ ２、Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ属由来である、請求項１に記
   載の酵素。