JPH037584A - ＡｃｃＩ制限エンドヌクレアーゼの製造方法 - Google Patents
ＡｃｃＩ制限エンドヌクレアーゼの製造方法Info
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- JPH037584A JPH037584A JP1143359A JP14335989A JPH037584A JP H037584 A JPH037584 A JP H037584A JP 1143359 A JP1143359 A JP 1143359A JP 14335989 A JP14335989 A JP 14335989A JP H037584 A JPH037584 A JP H037584A
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- restriction endonuclease
- acci restriction
- plasmid
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明はＡｃｅ Ｉ制限エンドヌクレアーゼの遺伝子を
含む染色体ＤＮＡ断片を組み込んでなる新しい組換えプ
ラスミド、該プラスミドを導入して形質転換した宿主及
び該宿主を培養してＡｃｅ Ｉ制限エンドヌクレアーゼ
を製造する方法に関する。
含む染色体ＤＮＡ断片を組み込んでなる新しい組換えプ
ラスミド、該プラスミドを導入して形質転換した宿主及
び該宿主を培養してＡｃｅ Ｉ制限エンドヌクレアーゼ
を製造する方法に関する。
（従来の技術）
■型制限酵素はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）ｔＮ中のあ
る特定の塩基配列を認識し、これを切断する極めで特異
性の高い酵素であり、このすぐれた特異性により遺伝子
工学の分野で幅広く利用されている。
る特定の塩基配列を認識し、これを切断する極めで特異
性の高い酵素であり、このすぐれた特異性により遺伝子
工学の分野で幅広く利用されている。
現在までのところ、細面等から約１００種類の■型制限
酵素が発見され、商品化されている。本発明のＡｃｅ
１ ｍ限エンドヌクレアーゼも、この■型制限酵素のひ
とつであり、ＤＮＡの塩基配列中のΦ ＧＴ ＡＧＣＴＣＴを認識し、これを切断する酵素であ
り、アシネトバクタ−カルコアセチカス（Ａｃｉｎｅｔ
ｏｂａｃｆｅｒ ｃａｆｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ）におい
て生産されることが知られている（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａ
ｃ１ｄｓ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ Ｌ１ｒ１６ｓ（１９８５
）） 。
酵素が発見され、商品化されている。本発明のＡｃｅ
１ ｍ限エンドヌクレアーゼも、この■型制限酵素のひ
とつであり、ＤＮＡの塩基配列中のΦ ＧＴ ＡＧＣＴＣＴを認識し、これを切断する酵素であ
り、アシネトバクタ−カルコアセチカス（Ａｃｉｎｅｔ
ｏｂａｃｆｅｒ ｃａｆｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ）におい
て生産されることが知られている（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａ
ｃ１ｄｓ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ Ｌ１ｒ１６ｓ（１９８５
）） 。
■型制限酵素を遺伝子工学の分野で利用するには最低限
衣の４つの条件を満足する必要がある。
衣の４つの条件を満足する必要がある。
すなわち ■他の制限酵素を含まない。
■フォ゛スファターゼを含まない。
■非特異的ＤＮａｓｅを含まない。
■３′および５Ｉ−エキソヌクレアーゼを含まない。
であり、そのため市販されている制限酵素は除核酸法、
塩析法、ゲル濾過法、イオン交換クロマトグラフィー法
、アフィニティークロマトグラフィー法等を組み合わせ
ることにより高純度に精製されている０本発明のＡｃｃ
ｒ制限エンドヌクレアーゼについても、他の制限酵素
と同様の方法が試みられたが、特にＡｃｅ Ｉ制限エン
ドヌクレアーゼにおいては、アシネトバクタ−カルコア
セチ力、ス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏ
ａｃｅｔｉｃｕｓ）はＡｃｅ Ｉ制限エンドヌクレアー
ゼ以外にＣＧ ＣＧをｖ！ａｌＩｌｉシ、これを切φ 断する制限酵素、Ｑｃｃ Ｉ！及びＴ ＣＣＧＧＡを認
識し、これを切断する制限酵素、Ａｃｃ ｍをも同時に
生産するため、これを除くことが非常に困難であった。
塩析法、ゲル濾過法、イオン交換クロマトグラフィー法
、アフィニティークロマトグラフィー法等を組み合わせ
ることにより高純度に精製されている０本発明のＡｃｃ
ｒ制限エンドヌクレアーゼについても、他の制限酵素
と同様の方法が試みられたが、特にＡｃｅ Ｉ制限エン
ドヌクレアーゼにおいては、アシネトバクタ−カルコア
セチ力、ス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏ
ａｃｅｔｉｃｕｓ）はＡｃｅ Ｉ制限エンドヌクレアー
ゼ以外にＣＧ ＣＧをｖ！ａｌＩｌｉシ、これを切φ 断する制限酵素、Ｑｃｃ Ｉ！及びＴ ＣＣＧＧＡを認
識し、これを切断する制限酵素、Ａｃｃ ｍをも同時に
生産するため、これを除くことが非常に困難であった。
（発明の解決しようとする課題）
本発明者らは、上記方法の欠点である＾ｃｃＩ［制限エ
ンドヌクレアーゼ及び＾ｃｃＴ［（制限エンドヌクレア
ーゼを同時に生産するという点を解消し、Ａｃｃ Ｉ制
限エンドヌクレアーゼだけを産生ずる菌株を造成すべ（
鋭意研究を行なった。その結果、前記アシネトバクタ−
カルコアセチカス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａ
ｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ）からＡｃｃ Ｉ制限エンドヌ
クレアーゼの遺伝子を含む染色体ｔｌＮへ断片を抽出し
、これをベクターに組み込んで組換えプラスミドを作成
し、該プラスミドの導入により形質転換させた宿主を得
るに成功するとともに、該宿主が１１ｃｃ ！ ＠限エ
ンドヌクレアーゼだけを生産するという事実を発見した
０本発明はこの新しい知見に基づいて完成されたもので
ある。
ンドヌクレアーゼ及び＾ｃｃＴ［（制限エンドヌクレア
ーゼを同時に生産するという点を解消し、Ａｃｃ Ｉ制
限エンドヌクレアーゼだけを産生ずる菌株を造成すべ（
鋭意研究を行なった。その結果、前記アシネトバクタ−
カルコアセチカス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａ
ｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ）からＡｃｃ Ｉ制限エンドヌ
クレアーゼの遺伝子を含む染色体ｔｌＮへ断片を抽出し
、これをベクターに組み込んで組換えプラスミドを作成
し、該プラスミドの導入により形質転換させた宿主を得
るに成功するとともに、該宿主が１１ｃｃ ！ ＠限エ
ンドヌクレアーゼだけを生産するという事実を発見した
０本発明はこの新しい知見に基づいて完成されたもので
ある。
（課題を解決する手段）
即ち、本発明はアシネトバクタ−カルコアセチカス（Ａ
ｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｑｕ
ｓ）由来のＡｃｃ Ｉ制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を
含む染色体ＤＮＡ断片を組み込んだ組換えプラスミド、
該プラスミドで形質転換された宿主及び、該宿主を培養
して、該培養物からＡｃｃ Ｉ制限エンドヌクレアーゼ
を採取することを特徴とするへｃａｌ制限エンドヌクレ
アーゼの製造方法である。
ｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｑｕ
ｓ）由来のＡｃｃ Ｉ制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を
含む染色体ＤＮＡ断片を組み込んだ組換えプラスミド、
該プラスミドで形質転換された宿主及び、該宿主を培養
して、該培養物からＡｃｃ Ｉ制限エンドヌクレアーゼ
を採取することを特徴とするへｃａｌ制限エンドヌクレ
アーゼの製造方法である。
本発明の上記組換えプラスミド及びこれを導入した宿主
はＡｃｃ Ｉ制限エンドヌクレアーゼだけを生産するた
め、その精製工程においてへｃｃｌＩ制限エンドヌクレ
アーゼ及びＡｃｅ ｍ制限エンドヌクレアーゼを除去す
る必要がなく、大量のＡｃｃ １制限エンドヌクレアー
ゼを容易に製造することが可能となった。
はＡｃｃ Ｉ制限エンドヌクレアーゼだけを生産するた
め、その精製工程においてへｃｃｌＩ制限エンドヌクレ
アーゼ及びＡｃｅ ｍ制限エンドヌクレアーゼを除去す
る必要がなく、大量のＡｃｃ １制限エンドヌクレアー
ゼを容易に製造することが可能となった。
以下本発明につき詳細に説明する。
（ａ） プラスミド及びその調製
本発明の組換えプラスミドは、例えば、エシェリヒア属
に属する微生物の染色体外遺伝子（プラスミド）として
知られるコリシンＥｌ因子等の、培養された細胞内で増
殖し１うる形式をとるプラスミドに、アシネトバクタ−
カルコアセチカス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａ
ｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ）由来のＡｃｃ Ｉ制限エンド
ヌクレアーゼ遺伝子を含む［ｌＮ＾断片を組み込んでな
るプラスミドである。
に属する微生物の染色体外遺伝子（プラスミド）として
知られるコリシンＥｌ因子等の、培養された細胞内で増
殖し１うる形式をとるプラスミドに、アシネトバクタ−
カルコアセチカス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａ
ｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ）由来のＡｃｃ Ｉ制限エンド
ヌクレアーゼ遺伝子を含む［ｌＮ＾断片を組み込んでな
るプラスミドである。
前記ベクターＤＮＡとしては、天然に存在するものを抽
出したものの他、増殖に必須な部分以外のＤＮＡの部分
が一部欠落しているものでもよく、例えばＣｏ１Ｂ、の
系統、ｐＭＢ９の系統、ｐＢＲ３２２の系統、ｐｓｃｌ
ｏｌの系統、Ｒ６にの系統、ラムダ−ファージの系統等
が挙げられる。
出したものの他、増殖に必須な部分以外のＤＮＡの部分
が一部欠落しているものでもよく、例えばＣｏ１Ｂ、の
系統、ｐＭＢ９の系統、ｐＢＲ３２２の系統、ｐｓｃｌ
ｏｌの系統、Ｒ６にの系統、ラムダ−ファージの系統等
が挙げられる。
また前記ベクターＤＮＡに前記染色体ＤＮＡ断片を組み
込む方法は、既知のいずれの方法も適用しうる０例えば
、適当な制限酵素（Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ）で処理
して染色体ＤＮＡを特定部位で切断し、次いで同様に処
理したベクターＤＮＡと混合し、リガーゼによって再結
合する方法が用いられる。
込む方法は、既知のいずれの方法も適用しうる０例えば
、適当な制限酵素（Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ）で処理
して染色体ＤＮＡを特定部位で切断し、次いで同様に処
理したベクターＤＮＡと混合し、リガーゼによって再結
合する方法が用いられる。
ベクターＤＮＡとして、ｐＵｃ１９プラスミドを用い、
これにアシネトバクタ−カルコアセチカス（Ａｃｉｎｅ
ｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃａｔｉｃｕｓ）から
調整された染色体ＤＮＡ断片を組み込むことにより、新
規プラスミドｐＡｃｃ Ｉ ＲＭ ８が得られる。
これにアシネトバクタ−カルコアセチカス（Ａｃｉｎｅ
ｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃａｔｉｃｕｓ）から
調整された染色体ＤＮＡ断片を組み込むことにより、新
規プラスミドｐＡｃｃ Ｉ ＲＭ ８が得られる。
ｐＡｃｃ Ｉ ＲＭ ８プラスミドの調整工程及び制限
酵素地図を第１図に示す、第１図から明らかなように、
このプラスミドはｐＵｃ１９プラスミドの制限酵素サイ
トのＢａｍ＋Ｈｚサイトに、アシネトバクタ−カルコア
セチカス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａ
ｃｅｔｉｃｕｓ）のＡｃｅ Ｉ制限エンドヌクレアーゼ
遺伝子を含むＤＮＡ断片が組み込まれた８ｋｂの塩基対
を有する円形分子である。
酵素地図を第１図に示す、第１図から明らかなように、
このプラスミドはｐＵｃ１９プラスミドの制限酵素サイ
トのＢａｍ＋Ｈｚサイトに、アシネトバクタ−カルコア
セチカス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａ
ｃｅｔｉｃｕｓ）のＡｃｅ Ｉ制限エンドヌクレアーゼ
遺伝子を含むＤＮＡ断片が組み込まれた８ｋｂの塩基対
を有する円形分子である。
Φ） 微生物の調製
このようにして得られた前記染色体ＤＮＡ断片とベクタ
ーＤＮＡの結合物を既ち形質転換法、例えばシッット・
ガン法（ｓｈｏｔ ｇｕｎ ｍｅｔｈｏｄ）により受容
菌の微生物菌体中に導入すると、所望の遺伝形質とベク
ターＤＮＡの形質を併わせもつ形質転換株が得られる。
ーＤＮＡの結合物を既ち形質転換法、例えばシッット・
ガン法（ｓｈｏｔ ｇｕｎ ｍｅｔｈｏｄ）により受容
菌の微生物菌体中に導入すると、所望の遺伝形質とベク
ターＤＮＡの形質を併わせもつ形質転換株が得られる。
受容菌としては、前記のエシェリヒア・コリＤＢ１０１
、同Ｃ６００、同ＤＰ、 ５ｕｐＦ、同ｘ１７７６、同
ＬＨ３９２等の通常この種の技術分野で用いられる微生
物が有利に用いられる。その典型的な例としてエシェリ
ヒア・コＩＪＦＩＢＩＯＩ株が挙げられる〔モレキュラ
ー・クローニング・エイ・ラボラトリ−・マニュアル、
（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｐ、５０４（１９Ｂ２
） 参照；遺伝形質Ｆ−２ｈｓｄ ｓ２０ （ｒ−１＋１ｌ
ｌ−１） ｒｅＣＡ１３、ａｒａ、１４、ｐｒｏ Ａ２
、ｆａｃＹｌ、ｇａｌ Ｋ２、ｒｐｓ Ｌ２０（Ｓｍ’
）、ｘｙｌ−５、＋＊ｔｊ！−１、ｓｕｐ Ｅ４４λ−
）〕。
、同Ｃ６００、同ＤＰ、 ５ｕｐＦ、同ｘ１７７６、同
ＬＨ３９２等の通常この種の技術分野で用いられる微生
物が有利に用いられる。その典型的な例としてエシェリ
ヒア・コＩＪＦＩＢＩＯＩ株が挙げられる〔モレキュラ
ー・クローニング・エイ・ラボラトリ−・マニュアル、
（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｐ、５０４（１９Ｂ２
） 参照；遺伝形質Ｆ−２ｈｓｄ ｓ２０ （ｒ−１＋１ｌ
ｌ−１） ｒｅＣＡ１３、ａｒａ、１４、ｐｒｏ Ａ２
、ｆａｃＹｌ、ｇａｌ Ｋ２、ｒｐｓ Ｌ２０（Ｓｍ’
）、ｘｙｌ−５、＋＊ｔｊ！−１、ｓｕｐ Ｅ４４λ−
）〕。
このエシェリヒア・コリ■ＢＩＯＩ株に、前記プラスミ
ドｐＡｃｃ Ｉ ＲＭ８を導入して形質転換法により得
られる微生物ば、新規微生物であり、エシェリヒア・コ
リＨＢＩＯＩ（ｐＡｃｃ ＩＲＭ８） （Ｅｓｃｈｅｒ
ｉｃｈｉａ Ｃｏ１１ＨＢＩＯＩ（ｐＡｃｃ Ｉ ＲＭ
８） ）と呼称され、平成元年５月２５日付にて工業技
術院微生物工業技術研究所へ寄託され、その寄託番号は
、微工研菌寄第１０７４０号（ＦＥＲＭ Ｐ−１０７４
０）である、このようにして得られたエシェリヒア・コ
リＨＢＩＯＩ（ｐＡｃｃ Ｔ ＲＭ８）の菌学的性質を
、ＤＮＡ受容菌であるエシェリヒア・コＩＪｔＩＢＩＯ
Ｉ株の性質を比較すると、前者がＡｃｃ Ｉ制限エンド
ヌクレアーゼの生産能及びアンピシリン耐性を有するの
に対し、後者がこれらの特性を有しない点以外は、全く
同一である。
ドｐＡｃｃ Ｉ ＲＭ８を導入して形質転換法により得
られる微生物ば、新規微生物であり、エシェリヒア・コ
リＨＢＩＯＩ（ｐＡｃｃ ＩＲＭ８） （Ｅｓｃｈｅｒ
ｉｃｈｉａ Ｃｏ１１ＨＢＩＯＩ（ｐＡｃｃ Ｉ ＲＭ
８） ）と呼称され、平成元年５月２５日付にて工業技
術院微生物工業技術研究所へ寄託され、その寄託番号は
、微工研菌寄第１０７４０号（ＦＥＲＭ Ｐ−１０７４
０）である、このようにして得られたエシェリヒア・コ
リＨＢＩＯＩ（ｐＡｃｃ Ｔ ＲＭ８）の菌学的性質を
、ＤＮＡ受容菌であるエシェリヒア・コＩＪｔＩＢＩＯ
Ｉ株の性質を比較すると、前者がＡｃｃ Ｉ制限エンド
ヌクレアーゼの生産能及びアンピシリン耐性を有するの
に対し、後者がこれらの特性を有しない点以外は、全く
同一である。
（Ｃ） 制限エンドヌクレアーゼの生産工程（ｂ）で
得られた形質転換株を培養するには、特定の遺伝情報に
よって生成される物質の生産に適した培地であって且つ
宿主微生物の生育に適した培地を用い得るが、本発明方
法では、通常、エシェリヒア・コリの生育培地として用
いられるＬＢ培地（トリプトン、酵母エキス、食塩）
、ＢＰＢ培地（Ｄｉｒｃｏ ； ポリペプトン、酵母エ
キス、リン酸カリウム）、栄養・寒天、培地（Ｄｉｒｃ
ｏ ０００１ ） トリプトン・食塩培地等を基本培地
として調製したものを用いればよい。
得られた形質転換株を培養するには、特定の遺伝情報に
よって生成される物質の生産に適した培地であって且つ
宿主微生物の生育に適した培地を用い得るが、本発明方
法では、通常、エシェリヒア・コリの生育培地として用
いられるＬＢ培地（トリプトン、酵母エキス、食塩）
、ＢＰＢ培地（Ｄｉｒｃｏ ； ポリペプトン、酵母エ
キス、リン酸カリウム）、栄養・寒天、培地（Ｄｉｒｃ
ｏ ０００１ ） トリプトン・食塩培地等を基本培地
として調製したものを用いればよい。
その他、必要に応じて炭素源・窒素源の他にアミノ酸、
ビタミン等の栄養素を添加してもよい。
ビタミン等の栄養素を添加してもよい。
培養方法は、ｐＨ、温度、酸素供給量等の条件として通
常のエシェリヒア属の微生物の生育に適した条件を採り
得るが、前記微生物を培地に接種した後、前記微生物が
生育してその菌体量が最大に達したとき、即ち対数増殖
後期まで生育させるのが好ましい、培養温度は、通常３
０〜３７°Ｃ，ｐＨ条件は、ｐ）１５〜８の範囲、特に
中性付近が適当である。
常のエシェリヒア属の微生物の生育に適した条件を採り
得るが、前記微生物を培地に接種した後、前記微生物が
生育してその菌体量が最大に達したとき、即ち対数増殖
後期まで生育させるのが好ましい、培養温度は、通常３
０〜３７°Ｃ，ｐＨ条件は、ｐ）１５〜８の範囲、特に
中性付近が適当である。
得られた菌体を集菌後、遠心分離、超音波破砕工程等に
より抽出し、次いで除核酸法、塩析法・ゲル濾過法、イ
オン交換クロマトグラフィー法、アフィニティクロマト
グラフィー法等を組み合わせることによりＡｃｃ Ｉ制
限エンドヌクレアーゼを得ることができる。
より抽出し、次いで除核酸法、塩析法・ゲル濾過法、イ
オン交換クロマトグラフィー法、アフィニティクロマト
グラフィー法等を組み合わせることによりＡｃｃ Ｉ制
限エンドヌクレアーゼを得ることができる。
（発明の効果）
本発明のプラスミド及びこれを導入した形質転換株はＡ
ｃｅ Ｉ制限エンドヌクレアーゼだけを生産するため、
その精製工程において、Ａｃｃ ＩＩ制限エンドヌクレ
アーゼ及びＡｃｃ ｍ制限エンドヌクレアーゼを除去す
る必要がなく、これにより大量のへｃａｌ制限エンドヌ
クレアーゼを容易に製造することが可能となった。
ｃｅ Ｉ制限エンドヌクレアーゼだけを生産するため、
その精製工程において、Ａｃｃ ＩＩ制限エンドヌクレ
アーゼ及びＡｃｃ ｍ制限エンドヌクレアーゼを除去す
る必要がなく、これにより大量のへｃａｌ制限エンドヌ
クレアーゼを容易に製造することが可能となった。
以下本発明を実施例により、更に詳細に説明するが、本
発明は何らこれらに限定されるものではない。
発明は何らこれらに限定されるものではない。
実施例１
（１） Ａｃｃｌ制限エンドヌクレアーゼの遺伝子を
もつ染色体［ＩＮＡの調製 アシネトバクタ−カルコアセチカス（Ａｃｉｎｅｔ。
もつ染色体［ＩＮＡの調製 アシネトバクタ−カルコアセチカス（Ａｃｉｎｅｔ。
ｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ）をＬ−ｂ
ｒｏｔｈ培地〔純粋１１あたりトリプトン（Ｄｉｒｃｏ
） １０ ｇ−、酵母エキス５ ｇ 、 ＮａＣｌ Ｌ
ｏｇをｐＨ７，０に調製したもの）５０ｄに接種し、３
０℃で振盪培養を行なった。１４時間後に菌体を集めた
０次に集めた菌体を１０■／成のリゾチーム〔太陽化学
■製〕、２０％シーＩＩ！、１ ｎＭ ＥＤＴＡを含む
５０ｍＭ ）リス塩酸緩衝液（ｐＨ７，６）２０ｄに懸
濁し、３７℃で１０分間静置した０次に１％ラウロイル
サルコシン酸を含む０．１Ｍ ＥＤＴ溶液（ｐＨ９，６
）４４ｄ及び５．４４■／ＩＩｉのプロナーゼ溶液２．
０ ｍを加え、５０°Ｃで３０分間静置した。
ｒｏｔｈ培地〔純粋１１あたりトリプトン（Ｄｉｒｃｏ
） １０ ｇ−、酵母エキス５ ｇ 、 ＮａＣｌ Ｌ
ｏｇをｐＨ７，０に調製したもの）５０ｄに接種し、３
０℃で振盪培養を行なった。１４時間後に菌体を集めた
０次に集めた菌体を１０■／成のリゾチーム〔太陽化学
■製〕、２０％シーＩＩ！、１ ｎＭ ＥＤＴＡを含む
５０ｍＭ ）リス塩酸緩衝液（ｐＨ７，６）２０ｄに懸
濁し、３７℃で１０分間静置した０次に１％ラウロイル
サルコシン酸を含む０．１Ｍ ＥＤＴ溶液（ｐＨ９，６
）４４ｄ及び５．４４■／ＩＩｉのプロナーゼ溶液２．
０ ｍを加え、５０°Ｃで３０分間静置した。
次に塩化セシウム６６ｇ、１０■／ｄのエチジウムブロ
マイド溶液３．３ｄを加え、混合した後に３８．００Ｏ
ｒｐｍ ４０時間の遠心分離を行なった。ｏｉａ層を注
射器で抜きとり、ｎ−ブタノール抽出によってエチジウ
ムブロマイドを除去し、１ ｍＭ ＥＤＴＡを含む１０
５Ｍ ）リス塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）に透析すること
により約３８０μｇの染色体ＤＮＡを取得した。
マイド溶液３．３ｄを加え、混合した後に３８．００Ｏ
ｒｐｍ ４０時間の遠心分離を行なった。ｏｉａ層を注
射器で抜きとり、ｎ−ブタノール抽出によってエチジウ
ムブロマイドを除去し、１ ｍＭ ＥＤＴＡを含む１０
５Ｍ ）リス塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）に透析すること
により約３８０μｇの染色体ＤＮＡを取得した。
（２） 染色体ＤＮＡ断片のベクターへの挿入（１）
で得られた染色体ＤＮＡ ３μｇについて０．０２ユニ
ツトの５ａｕ３＾Ｉ制限エンドヌクレアーゼを加え、３
７℃１時間の反応を行なうことにより、これを部分分解
した。
で得られた染色体ＤＮＡ ３μｇについて０．０２ユニ
ツトの５ａｕ３＾Ｉ制限エンドヌクレアーゼを加え、３
７℃１時間の反応を行なうことにより、これを部分分解
した。
次にベクタープラスミドｐＵｃ１９ （東洋紡績■製］
１μｇについて、４ユニツトのＢａｍＨＩ制限エンドヌ
クレアーゼを加え、３７°Ｃ１時間の反応を行なうこと
によりこれを完全分解し、更に１ユニツトのアルカリフ
ォファターゼを加え、３７°Ｃ１１時間の反応を行なう
ことにより、５゛末端のリン酸を除去した。
１μｇについて、４ユニツトのＢａｍＨＩ制限エンドヌ
クレアーゼを加え、３７°Ｃ１時間の反応を行なうこと
によりこれを完全分解し、更に１ユニツトのアルカリフ
ォファターゼを加え、３７°Ｃ１１時間の反応を行なう
ことにより、５゛末端のリン酸を除去した。
以上の方法により得られた３μｇの染色体［ＩＮＡ断片
と１ＭｇのｐＢＲ３２２のＤＮＡ断片を混合し、更に１
ｍＭＡＴＰ及び５ｍＭジチオスレイトールの存在下に５
ユニツトのＴ４ファージ由来のＤＮＡＩＪガーゼを用い
て１５°Ｃ５１６時間の連結反応を行なうことにより染
色体ＤＮＡを組み込んだプラスミドＤＮＡを取得した。
と１ＭｇのｐＢＲ３２２のＤＮＡ断片を混合し、更に１
ｍＭＡＴＰ及び５ｍＭジチオスレイトールの存在下に５
ユニツトのＴ４ファージ由来のＤＮＡＩＪガーゼを用い
て１５°Ｃ５１６時間の連結反応を行なうことにより染
色体ＤＮＡを組み込んだプラスミドＤＮＡを取得した。
（３） Ａｃｃｌ制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を含
む組換えプラスミドによる形質転換 エシェリヒア・コリに一１２株とエシェリヒア・３９８
株のハイブリッド株であるエシェリヒア・１１７８８１
０１株（インビトロジエン社製）をＬＢ培地〔純水１２
あたりトリプトン（Ｄｉｒｃｏ）１０ ｇ、酵母エキス
５ ｇ ５ＮａＣＩ ＬｏｇをｐＨ１，０に調製したち
の１０−に接種し、３７゛Ｃで振盪培養行ない、対数増
殖期まで生育させた後に集菌した。これを水冷下、最終
濃度で０．０３Ｍ ＣａＣ１□の溶液に懸濁させてコン
ピテントな細胞とした。この細胞混濁液に（２）で得た
プラスミド１）ＨＡの溶解液を加えて、水冷下で６０分
反応させ、４２°Ｃ，１〜２分間ヒートシロツクを与え
て、前記プラスミドＤＮ＾を細胞内に取りこませた０次
いでこの細胞懸濁液を別途前記ＬＢ培地に接種し、３７
°Ｃ１３〜５時間振盪培養して形質転換反応行なった後
、アンピシリン耐性を有し、且つへｃｃｌ制限エンドヌ
クレアーゼを生産する株を分離し、エシェリヒア・コリ
ＨＢＩＯＩ （ｐＡｃｃ ［ＲＭ８）（微工研菌寄第
１Ｑ’７４０号）を得た。
む組換えプラスミドによる形質転換 エシェリヒア・コリに一１２株とエシェリヒア・３９８
株のハイブリッド株であるエシェリヒア・１１７８８１
０１株（インビトロジエン社製）をＬＢ培地〔純水１２
あたりトリプトン（Ｄｉｒｃｏ）１０ ｇ、酵母エキス
５ ｇ ５ＮａＣＩ ＬｏｇをｐＨ１，０に調製したち
の１０−に接種し、３７゛Ｃで振盪培養行ない、対数増
殖期まで生育させた後に集菌した。これを水冷下、最終
濃度で０．０３Ｍ ＣａＣ１□の溶液に懸濁させてコン
ピテントな細胞とした。この細胞混濁液に（２）で得た
プラスミド１）ＨＡの溶解液を加えて、水冷下で６０分
反応させ、４２°Ｃ，１〜２分間ヒートシロツクを与え
て、前記プラスミドＤＮ＾を細胞内に取りこませた０次
いでこの細胞懸濁液を別途前記ＬＢ培地に接種し、３７
°Ｃ１３〜５時間振盪培養して形質転換反応行なった後
、アンピシリン耐性を有し、且つへｃｃｌ制限エンドヌ
クレアーゼを生産する株を分離し、エシェリヒア・コリ
ＨＢＩＯＩ （ｐＡｃｃ ［ＲＭ８）（微工研菌寄第
１Ｑ’７４０号）を得た。
（４） エシェリヒア・コ’Ｊ ＨＢＩＯＩ（ｐＡｃ
ｃ Ｉ ＲＭ８）によるＡｃｃ １制限エンドヌクレア
ーゼの生産（３）で得られた形質転換株エシェリヒア・
コリＨＢＩＯＩ（ｐＡｃｃ Ｉ ＲＭ８） （微工研菌
寄第１０７４０号）を前記ＬＢ培地５００ ｄを含む２
１容のフラスコで３７°Ｃ１１６時間振盪培養を行なワ
た。これを遠心分離にて集菌、洗浄後、ｌＯ＋＊Ｍ Ｍ
ｇＣ１□、７１ＩＩＭ２−メルカプトエタノールを含ん
だ２０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７，５） ２５ｍ
に懸濁し、０°Ｃで１０分間の超音波破砕を行なった。
ｃ Ｉ ＲＭ８）によるＡｃｃ １制限エンドヌクレア
ーゼの生産（３）で得られた形質転換株エシェリヒア・
コリＨＢＩＯＩ（ｐＡｃｃ Ｉ ＲＭ８） （微工研菌
寄第１０７４０号）を前記ＬＢ培地５００ ｄを含む２
１容のフラスコで３７°Ｃ１１６時間振盪培養を行なワ
た。これを遠心分離にて集菌、洗浄後、ｌＯ＋＊Ｍ Ｍ
ｇＣ１□、７１ＩＩＭ２−メルカプトエタノールを含ん
だ２０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７，５） ２５ｍ
に懸濁し、０°Ｃで１０分間の超音波破砕を行なった。
更に１２．０００ｒｐ−で１０分間の遠心分離により酵
素抽出液を得た。
素抽出液を得た。
次にこの酵素抽出液に硫安粉末を水冷下添加溶解し、３
０〜８０％飽和画分を（飽和度は０ｓｂｏｒｎｅ法で表
示）を遠心分離により回収した。この回収沈澱物を２ｍ
Ｍメルカプトエタノール、５％グリセロルーを含んだ１
０ｍＭＩＪン酸緩衝液（ｐＨ７，５） ’２ ｒｔｄｌ
に溶解し、更に透析チューブに入れて、１００倍量の同
緩衝液に対して１液透析した。続いて同緩衝液にて平衡
化したホスホセルロース（ワットマン社製）のカラム（
容量２０−）に吸着させた。５倍量の同緩衝液で洗浄後
０−１．０Ｍ ＭＣＩグラジェント溶出を行なった。Ｂ
ａｎ１［Ｉ制限エンドヌクレアーゼはＭＣＩ濃度０．５
Ｍ付近で溶出された。溶出した酵素液を透析チューブに
入れ、２ｍＭメルカプトエタノール、５０％グリセロー
ルを含んだリン酸緩衝液に透析することにより５戚の酵
素液が得られた。得られた酵素液の酵素活性を測定した
ところ５００ユニツトであった。
０〜８０％飽和画分を（飽和度は０ｓｂｏｒｎｅ法で表
示）を遠心分離により回収した。この回収沈澱物を２ｍ
Ｍメルカプトエタノール、５％グリセロルーを含んだ１
０ｍＭＩＪン酸緩衝液（ｐＨ７，５） ’２ ｒｔｄｌ
に溶解し、更に透析チューブに入れて、１００倍量の同
緩衝液に対して１液透析した。続いて同緩衝液にて平衡
化したホスホセルロース（ワットマン社製）のカラム（
容量２０−）に吸着させた。５倍量の同緩衝液で洗浄後
０−１．０Ｍ ＭＣＩグラジェント溶出を行なった。Ｂ
ａｎ１［Ｉ制限エンドヌクレアーゼはＭＣＩ濃度０．５
Ｍ付近で溶出された。溶出した酵素液を透析チューブに
入れ、２ｍＭメルカプトエタノール、５０％グリセロー
ルを含んだリン酸緩衝液に透析することにより５戚の酵
素液が得られた。得られた酵素液の酵素活性を測定した
ところ５００ユニツトであった。
この様にして得られた酵素液は他の制限エンドヌクレア
ーゼ、フォスファターゼ、非特異的ＤＮａｓｅなどを含
んでおらず遺伝子工学の分野で利用することが可能であ
った。
ーゼ、フォスファターゼ、非特異的ＤＮａｓｅなどを含
んでおらず遺伝子工学の分野で利用することが可能であ
った。
なお、Ａｃｅ ｌ制限エンドヌクレアーゼの活性の測定
は、１μｇのλ−ＤＮＡを２０＋＋Ｍ トリス塩酸緩衝
液、１０＋Ｍ塩化マグネシウム溶液、５０ｍＭ硫酸アン
モニウム、７ ｍＭ ２−メルカプトエタノールからな
る反応液４５μ２に溶解し、その混合液に５μ２の酵素
液を加えて、３７°Ｃで１時間の反応を行なった後、ア
ガロース電気泳動を行なうことにより測定する。
は、１μｇのλ−ＤＮＡを２０＋＋Ｍ トリス塩酸緩衝
液、１０＋Ｍ塩化マグネシウム溶液、５０ｍＭ硫酸アン
モニウム、７ ｍＭ ２−メルカプトエタノールからな
る反応液４５μ２に溶解し、その混合液に５μ２の酵素
液を加えて、３７°Ｃで１時間の反応を行なった後、ア
ガロース電気泳動を行なうことにより測定する。
酵素活性における１単位は、３７°（ｐＨ７，５におい
て１時間に１μｇのλ−ＤＮＡを完全に分解する酵素活
性をいう。
て１時間に１μｇのλ−ＤＮＡを完全に分解する酵素活
性をいう。
第１図はｐＡｃｃ Ｉ ＲＭ８の調製工程および制限酵
素地図を示す。
素地図を示す。
Claims (3)
- （１）アシネトバクターカルコアセチカス（Ａｃｉｎｅ
ｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ）由来
のＡｃｃＩ制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を含む染色体
ＤＮＡ断片を組み込んだ組換えプラスミド。 - （２）アシネトバクターカルコアセチカス（Ａｃｉｎｅ
ｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ）由来
のＡｃｃＩ制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を含む染色体
ＤＮＡ断片を組み込んだ組換えプラスミドで形質転換さ
れた宿主。 - （３）アシネトバクターカルコアセチカス（Ａｃｉｎｅ
ｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ）由来
のＡｃｃＩ制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を含む染色体
ＤＮＡ断片を組み込んだ組換えプラスミドで形質転換さ
れた宿主を培養して、該培養物からＡｃｃＩ制限エンド
ヌクレアーゼを採取することを特徴とするＡｃｃＩ制限
エンドヌクレアーゼの製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1143359A JP2518051B2 (ja) | 1989-06-06 | 1989-06-06 | ＡｃｃＩ制限エンドヌクレア―ゼの製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1143359A JP2518051B2 (ja) | 1989-06-06 | 1989-06-06 | ＡｃｃＩ制限エンドヌクレア―ゼの製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH037584A true JPH037584A (ja) | 1991-01-14 |
| JP2518051B2 JP2518051B2 (ja) | 1996-07-24 |
Family
ID=15336953
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1143359A Expired - Lifetime JP2518051B2 (ja) | 1989-06-06 | 1989-06-06 | ＡｃｃＩ制限エンドヌクレア―ゼの製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2518051B2 (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1997034006A1 (en) * | 1996-03-13 | 1997-09-18 | Takara Shuzo Co., Ltd. | Plasmid |
| US7603196B2 (en) | 2004-02-28 | 2009-10-13 | Applied Materials, Inc. | Methods and apparatus for material control system interface |
| US7603195B2 (en) | 2003-11-06 | 2009-10-13 | Applied Materials, Inc. | Methods and apparatus for integrating large and small lot electronic device fabrication facilities |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH022366A (ja) * | 1987-12-17 | 1990-01-08 | New England Biolabs Inc | ＡｃｃＩ制限エンドヌクレアーゼの製造方法。 |
-
1989
- 1989-06-06 JP JP1143359A patent/JP2518051B2/ja not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH022366A (ja) * | 1987-12-17 | 1990-01-08 | New England Biolabs Inc | ＡｃｃＩ制限エンドヌクレアーゼの製造方法。 |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1997034006A1 (en) * | 1996-03-13 | 1997-09-18 | Takara Shuzo Co., Ltd. | Plasmid |
| US6165749A (en) * | 1996-03-13 | 2000-12-26 | Takara Shuzo Co., Ltd. | Plasmid |
| US6770481B1 (en) | 1996-03-13 | 2004-08-03 | Takara Shuzo Co., Ltd. | Gene isolation method |
| US7603195B2 (en) | 2003-11-06 | 2009-10-13 | Applied Materials, Inc. | Methods and apparatus for integrating large and small lot electronic device fabrication facilities |
| US7603196B2 (en) | 2004-02-28 | 2009-10-13 | Applied Materials, Inc. | Methods and apparatus for material control system interface |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2518051B2 (ja) | 1996-07-24 |
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