JPS62277A - 新規プラスミド及びそれにより形質転換された新規微生物及びそれを用いた有用生理活性物質の製造法 - Google Patents
新規プラスミド及びそれにより形質転換された新規微生物及びそれを用いた有用生理活性物質の製造法Info
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- JPS62277A JPS62277A JP60139807A JP13980785A JPS62277A JP S62277 A JPS62277 A JP S62277A JP 60139807 A JP60139807 A JP 60139807A JP 13980785 A JP13980785 A JP 13980785A JP S62277 A JPS62277 A JP S62277A
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- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（技術分野）
本発明は、新規なプラスミド及びそれにより形質転換さ
れた新規微生物並びにそれを用いた有用生理活性物質の
製造法に関する。
れた新規微生物並びにそれを用いた有用生理活性物質の
製造法に関する。
（発明の背景）
微生物は、ある特定の基質が存在すると、それを代謝す
る酵素等の有用生理活性物質の生産を行うことは、よく
知られている。たとえば、Ｎ−アシルノイラミン酸アル
ドラーゼ産生能を有する微生物を培養するにあたって、
培地中にシアル酸を存在させるとＮ−アシルノイラミン
酸アルドラーゼ産生能が飛躍的に上昇することが報告さ
れている（特公昭５６−５４１５３号公報参照）。この
事実は、裏返せば、目的とする有用生理活性物質を、微
生物を利用して大量に得ようとするには、その有用生理
活性物質の生産のための基質（誘導基質）を培地に添加
して培養を行なわなければならないことを示すものであ
る。しかしながら、これらの誘導基質は、一般に高価で
あったり、人手が困難である場合が多く、このため誘導
基質を添加して培養する方法を工業的な規模で行うこと
は困難であるばあいが少なくない。したがって、このよ
うな誘導基質を培地に添加することなく微生物を培養し
、有用生理活性物質を大量に生産することができれば、
大幅にコストの低下を計ることが可能となり、工業上、
極めて有利となる。しかしそのような技術はいまだ確立
されていない。
る酵素等の有用生理活性物質の生産を行うことは、よく
知られている。たとえば、Ｎ−アシルノイラミン酸アル
ドラーゼ産生能を有する微生物を培養するにあたって、
培地中にシアル酸を存在させるとＮ−アシルノイラミン
酸アルドラーゼ産生能が飛躍的に上昇することが報告さ
れている（特公昭５６−５４１５３号公報参照）。この
事実は、裏返せば、目的とする有用生理活性物質を、微
生物を利用して大量に得ようとするには、その有用生理
活性物質の生産のための基質（誘導基質）を培地に添加
して培養を行なわなければならないことを示すものであ
る。しかしながら、これらの誘導基質は、一般に高価で
あったり、人手が困難である場合が多く、このため誘導
基質を添加して培養する方法を工業的な規模で行うこと
は困難であるばあいが少なくない。したがって、このよ
うな誘導基質を培地に添加することなく微生物を培養し
、有用生理活性物質を大量に生産することができれば、
大幅にコストの低下を計ることが可能となり、工業上、
極めて有利となる。しかしそのような技術はいまだ確立
されていない。
（発明の目的）
本発明の目的は、有用生理活性物質の生産のための誘導
基質を含まない培地で培養しても、前記有用生理活性物
質を生産する能力を宿主に与えるような新規なプラスミ
ドを提供することである。
基質を含まない培地で培養しても、前記有用生理活性物
質を生産する能力を宿主に与えるような新規なプラスミ
ドを提供することである。
本発明の他の目的は、有用生理活性物質の生産のための
誘導基質を含まない培地で培養しても、前記有用生理活
性物質を生産する能力を有する新規な微生物を提供する
ことである。
誘導基質を含まない培地で培養しても、前記有用生理活
性物質を生産する能力を有する新規な微生物を提供する
ことである。
更に本発明の目的は、有用生理活性物質の生産のための
誘導基質を含まない培地で微生物を培養し、前記有用生
理活性物質を製造する方法を提供することである。
誘導基質を含まない培地で微生物を培養し、前記有用生
理活性物質を製造する方法を提供することである。
（発明の構成）
本発明の上記目的は、特定の誘導基質を含む培地で培養
すると特定の有用生理活性物質を生産する能力を有する
微生物の染色体ＤＮＡを制限酵素で処理して得られるＤ
ＮＡ断片、もしくは該ＤＮＡ断片に対してヌクレオチド
の置換、ヌクレオチドの欠失、ヌクレオチドの挿入およ
びヌクレオチド配列の逆位その他の突然変異によって関
連づけられておりかつ前記特定の有用生理活性物質をコ
ードするＤＮＡ断片であって天然、合成もしくは半合成
によって得られるＤＮＡ断片、を含むプラスミドであっ
て、前記誘導基質を含まない培地で培養しても前記有用
生理活性物質を生産する能力を宿主に与えるプラスミド
ならびに該プラスミドにより形質転換された微生物によ
り達成される。
すると特定の有用生理活性物質を生産する能力を有する
微生物の染色体ＤＮＡを制限酵素で処理して得られるＤ
ＮＡ断片、もしくは該ＤＮＡ断片に対してヌクレオチド
の置換、ヌクレオチドの欠失、ヌクレオチドの挿入およ
びヌクレオチド配列の逆位その他の突然変異によって関
連づけられておりかつ前記特定の有用生理活性物質をコ
ードするＤＮＡ断片であって天然、合成もしくは半合成
によって得られるＤＮＡ断片、を含むプラスミドであっ
て、前記誘導基質を含まない培地で培養しても前記有用
生理活性物質を生産する能力を宿主に与えるプラスミド
ならびに該プラスミドにより形質転換された微生物によ
り達成される。
本願明細書において、「有用生理活性物質」とは、Ｎ−
アシルノイラミン酸アルドラーゼ、β−ガラクトシダー
ゼ、β−ラクタマーゼ、アルカリホスファターゼ、ペニ
シリナーゼ、キシラナーゼ等の酵素、インシュリン、ヒ
ト生長ホルモン、インターフエ・ロン等の高分子生理活
性物質を意味するものである。
アシルノイラミン酸アルドラーゼ、β−ガラクトシダー
ゼ、β−ラクタマーゼ、アルカリホスファターゼ、ペニ
シリナーゼ、キシラナーゼ等の酵素、インシュリン、ヒ
ト生長ホルモン、インターフエ・ロン等の高分子生理活
性物質を意味するものである。
本発明者は、高価な誘導基質を培地に添加することなく
有用生理活性物質を著量に生産せしめる方法につき鋭意
研究を行った。その結果、特定の誘導基質が培地中に存
在すると特定の有用生理活性物質を生産する微生物の染
色体ＤＮＡを適当な制限酵素で処理してＤＮＡ断片を得
、これを適当なベクターに組み込んで得られるプラスミ
ドで適当な微生物（前記染色体ＤＮＡを有する微生物と
同一でもよいし、異なるものでもよい）を形質転換して
得られる形質転換体の中に、誘導基質を含まない培地で
培養しても前記有用生理活性物質を生産するものがある
ことを見出し、本発明を完成するに至った。本発明にお
いては、上記特定のＤＮＡ断片の代りに、これと生物学
的機能において均等なりＮＡ断片、すなわち該ＤＮＡ断
片に対してヌクレオチドの置換、ヌクレオチドの欠失、
ヌクレオチドの挿入およびヌクレオチド配列の逆位その
他の突然変異によって関連づけられておりかつ前記特定
の有用生理活性物質をコードするＤＮＡ断片であって天
然、合成もしくは半合成によって得られるＤＮＡ断片を
も同様に使用しうることはいうまでもない。
有用生理活性物質を著量に生産せしめる方法につき鋭意
研究を行った。その結果、特定の誘導基質が培地中に存
在すると特定の有用生理活性物質を生産する微生物の染
色体ＤＮＡを適当な制限酵素で処理してＤＮＡ断片を得
、これを適当なベクターに組み込んで得られるプラスミ
ドで適当な微生物（前記染色体ＤＮＡを有する微生物と
同一でもよいし、異なるものでもよい）を形質転換して
得られる形質転換体の中に、誘導基質を含まない培地で
培養しても前記有用生理活性物質を生産するものがある
ことを見出し、本発明を完成するに至った。本発明にお
いては、上記特定のＤＮＡ断片の代りに、これと生物学
的機能において均等なりＮＡ断片、すなわち該ＤＮＡ断
片に対してヌクレオチドの置換、ヌクレオチドの欠失、
ヌクレオチドの挿入およびヌクレオチド配列の逆位その
他の突然変異によって関連づけられておりかつ前記特定
の有用生理活性物質をコードするＤＮＡ断片であって天
然、合成もしくは半合成によって得られるＤＮＡ断片を
も同様に使用しうることはいうまでもない。
本発明を適用しつる、誘導基質／有用生理活性物質の系
としては、上記シアル酸／Ｎ−アシルノイラミン酸アル
ドラーゼのほかにキシラン／キシラナーゼ、セルロース
／セルラーゼなどの系がある。しかし本発明はこれらの
系に限定されるものではない。
としては、上記シアル酸／Ｎ−アシルノイラミン酸アル
ドラーゼのほかにキシラン／キシラナーゼ、セルロース
／セルラーゼなどの系がある。しかし本発明はこれらの
系に限定されるものではない。
本発明により有利に生産される前記有用生理活性物質の
１つであるＮ−アシルノイラミン酸アルドラーゼ（Ｎ
−ａｃｙｌｎｅｕｒａｍｉｎａｔｅ ａｌｄｏｌａｓｅ
） （以下“ＮＡＬ”と称する。）は、国際生化学連
合酵素委員会の酵素番号Ｅ、Ｃ，４，１，３，３に分類
され、系統名では、Ｎ−アシルノイラミン酸：ピルビン
酸リアーゼ（Ｎ −ａｃｙｌｎｅｕｒａｍｉｎａｔｅ
：ｐｙｒｕｖａｔｅ Ｉｙａｓｅ ）と呼称される酵素
である。本酵素は、下記の反応式の如く、シアル酸（Ｎ
−アシルノイラミン酸）の分解反応を触媒する。
１つであるＮ−アシルノイラミン酸アルドラーゼ（Ｎ
−ａｃｙｌｎｅｕｒａｍｉｎａｔｅ ａｌｄｏｌａｓｅ
） （以下“ＮＡＬ”と称する。）は、国際生化学連
合酵素委員会の酵素番号Ｅ、Ｃ，４，１，３，３に分類
され、系統名では、Ｎ−アシルノイラミン酸：ピルビン
酸リアーゼ（Ｎ −ａｃｙｌｎｅｕｒａｍｉｎａｔｅ
：ｐｙｒｕｖａｔｅ Ｉｙａｓｅ ）と呼称される酵素
である。本酵素は、下記の反応式の如く、シアル酸（Ｎ
−アシルノイラミン酸）の分解反応を触媒する。
シアル酸＝Ｎ−アシルマンノサミン酸＋ピルビン酸
本酵素は、カエル肝、ラット、ウサギ、ブタウシ等の諸
臓器、筋肉その他の動物組織、ガス壊痕菌〔ジャーナル
・才ブ・アメリカン・ケミカル・ソサエティ（Ｊｏｕｒ
ｎａｌ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａｎ ＣｈｅｍｉｃａｌＳ
ｏｃｉｅｔｙ ） 、８０．４９７ （１９５８）参照
〕、コレラ菌〔プロシーディング・オブ・ナショナル・
アカデミ−・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ
ｏｆ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ
５ｃｉｅｎｃｅ） ％ ４ ２ 、７２８
（１９５６）参照〕、クロストリジウム・パー７リンゲ
ンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎ
ｓ ）及び大腸菌〔ジャーナル・オブ・バイオロジカル
・ケミス ト リ − （Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ
旧ｏ１ｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ）
、２３５．２５２９ （１９６０）参照〕等の細菌に存
在することが報告されており、腫瘍の診断のためのシア
ル酸含量変化測定に用いられる酵素である。
臓器、筋肉その他の動物組織、ガス壊痕菌〔ジャーナル
・才ブ・アメリカン・ケミカル・ソサエティ（Ｊｏｕｒ
ｎａｌ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａｎ ＣｈｅｍｉｃａｌＳ
ｏｃｉｅｔｙ ） 、８０．４９７ （１９５８）参照
〕、コレラ菌〔プロシーディング・オブ・ナショナル・
アカデミ−・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ
ｏｆ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ
５ｃｉｅｎｃｅ） ％ ４ ２ 、７２８
（１９５６）参照〕、クロストリジウム・パー７リンゲ
ンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎ
ｓ ）及び大腸菌〔ジャーナル・オブ・バイオロジカル
・ケミス ト リ − （Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ
旧ｏ１ｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ）
、２３５．２５２９ （１９６０）参照〕等の細菌に存
在することが報告されており、腫瘍の診断のためのシア
ル酸含量変化測定に用いられる酵素である。
以下本発明につき詳細に説明する。
（ａ）プラスミド及びその副輪
本発明の新規プラスミドは、例えば、エシェリヒア属に
属する微生物の染色体外遺伝子（プラスミド）として知
られるコリシンＥ１ 因子等の、培養された細胞内で増
殖し得る形式をとるプラスミド（染色体外ＤＮＡすなわ
ちベクターＤＮＡ）に、特定の誘導基質を含む培地で特
定の有用生理活性物質、たとえばＮＡＬを生産する微生
物の染色体ＤＮＡから調製された、前記有用生理活性物
質（たとえばＮＡＬ）の生産に関与するＤＮＡ断片を組
み込んでなるプラスミドであり、前記ベクターＤＮＡと
しては、天然に存在するものを抽出したものの他、増殖
に必須な部分以外のＤＮＡの部分が一部欠落しているも
のでもよく、例えばＣｏ１Ｌの系統、ｐＭＢ９の系統、
ｐＢＲ３２２の系統、ｐｓｃｔｏｉの系統、Ｒ６にの系
統、ラムダ−ファージの系統等が挙げられる。
属する微生物の染色体外遺伝子（プラスミド）として知
られるコリシンＥ１ 因子等の、培養された細胞内で増
殖し得る形式をとるプラスミド（染色体外ＤＮＡすなわ
ちベクターＤＮＡ）に、特定の誘導基質を含む培地で特
定の有用生理活性物質、たとえばＮＡＬを生産する微生
物の染色体ＤＮＡから調製された、前記有用生理活性物
質（たとえばＮＡＬ）の生産に関与するＤＮＡ断片を組
み込んでなるプラスミドであり、前記ベクターＤＮＡと
しては、天然に存在するものを抽出したものの他、増殖
に必須な部分以外のＤＮＡの部分が一部欠落しているも
のでもよく、例えばＣｏ１Ｌの系統、ｐＭＢ９の系統、
ｐＢＲ３２２の系統、ｐｓｃｔｏｉの系統、Ｒ６にの系
統、ラムダ−ファージの系統等が挙げられる。
ＮＡＬの生産に関与するＤＮＡ断片は、前記の動物組織
、ガス壊痕菌、コレラ、菌及び大腸菌等から調製するこ
とができるが、特に大腸菌から調製された染色体ＤＮＡ
断片が有利に用いられる。例えば、エシェリヒア・コリ
ＨＢ１０１、同Ｃ６００゜同ＤＰ ５０．５ｕｐＦ、同
ｚ１７７６、同ＬＥ３９２等〔モレキユラー・クローニ
ング・エイ・ラボラトリ−・マニュアル、（Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭ
ａｎｕａｌＳＰ ５０４（１９８２）参照）〕の染色体
ＤＮＡより調製されたＤＮＡ断片を用いることができる
。
、ガス壊痕菌、コレラ、菌及び大腸菌等から調製するこ
とができるが、特に大腸菌から調製された染色体ＤＮＡ
断片が有利に用いられる。例えば、エシェリヒア・コリ
ＨＢ１０１、同Ｃ６００゜同ＤＰ ５０．５ｕｐＦ、同
ｚ１７７６、同ＬＥ３９２等〔モレキユラー・クローニ
ング・エイ・ラボラトリ−・マニュアル、（Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭ
ａｎｕａｌＳＰ ５０４（１９８２）参照）〕の染色体
ＤＮＡより調製されたＤＮＡ断片を用いることができる
。
また前記ベクターＤＮＡに前記染色体ＤＮＡ断片を組み
込む方法は、既知のいずれの方法も適用しうる。例えば
、適当な制限酵素（Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ）で処理
して染色体ＤＮＡを特定部位で切断し、次いで同様に処
理したベクターＤＮＡと混合し、リガーゼによって再結
合する方・法が用いられる。
込む方法は、既知のいずれの方法も適用しうる。例えば
、適当な制限酵素（Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ）で処理
して染色体ＤＮＡを特定部位で切断し、次いで同様に処
理したベクターＤＮＡと混合し、リガーゼによって再結
合する方・法が用いられる。
ベクターＤＮＡとして、ｐＢＲ３２２プラスミドを用い
、これに前記エシェリヒア・コリＨＢ１０１から調製さ
れた染色体ＤＮＡ断片を組み込むことにより、新規プラ
スミドｐＮＬ１が得られる。ｐＮＬ１プラスミドの制限
酵素切断地図を第１図に示す。第１図から明らかなよう
に、このプラスミドは、ｐＢＲ３２２プラスミドＤＮＡ
の制限酵素サイトのＨｉｎｄ ｍサイトに、前記エシェ
リヒア・コリＨＢ １０１のＮ−アシルノイラミン酸ア
ルドラーゼの生産に関与する遺伝情報を担うＤＮＡ断片
が組み込まれているＬ ２． ＯＫ ｂの塩基対を有す
る円形分子である（第２図参照）。
、これに前記エシェリヒア・コリＨＢ１０１から調製さ
れた染色体ＤＮＡ断片を組み込むことにより、新規プラ
スミドｐＮＬ１が得られる。ｐＮＬ１プラスミドの制限
酵素切断地図を第１図に示す。第１図から明らかなよう
に、このプラスミドは、ｐＢＲ３２２プラスミドＤＮＡ
の制限酵素サイトのＨｉｎｄ ｍサイトに、前記エシェ
リヒア・コリＨＢ １０１のＮ−アシルノイラミン酸ア
ルドラーゼの生産に関与する遺伝情報を担うＤＮＡ断片
が組み込まれているＬ ２． ＯＫ ｂの塩基対を有す
る円形分子である（第２図参照）。
（ｂ） １ｉ！！生物の調製
このようにして得られた前記染色体ＤＮＡ断片とベクタ
ーＤＮＡの結合物を既知の形質転換法例えば、シヨ”／
ト・ガン法（ｓｈｏｔ ｇｕｎ ｍｅｔｈｏｄ ）によ
り受容菌の微生物菌体中に導入すると、所望の遺伝形質
とベクターＤＮＡの形質を併せもつ形質転換株が得られ
る。
ーＤＮＡの結合物を既知の形質転換法例えば、シヨ”／
ト・ガン法（ｓｈｏｔ ｇｕｎ ｍｅｔｈｏｄ ）によ
り受容菌の微生物菌体中に導入すると、所望の遺伝形質
とベクターＤＮＡの形質を併せもつ形質転換株が得られ
る。
受容菌としては、前記のエシェリヒア・コリＨＢ１０１
、同Ｃ６００、同ＤＰ、５ｕｐＦ、同χ１７７６、同Ｌ
Ｅ３９２等の通常この種の技術分野で用いられる微生物
が有利に用いられる。その典型的な例としてエシェリヒ
ア・コリＨ８１０１株が挙げられる〔モレキュラー・ク
ローニング・エイ・ラボラトリ−・マニュアル、（Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒＣ１ｏ旧ｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ Ｍａｎｕａｌ Ｐ 、 ５０４ （１９８２
）参照；遺伝形質Ｆ−、ｈｓｄ ｓ２０ （ｒＢ
、 ｍｉ）、ｒｅｃ Ａ ｌ ３、ａｒａ −１４
、ｐｒｏ Ａ２、ｌ ａｃ Ｙ ｌ ｓｇａｌ Ｋ
２ 、ｒｐｓ Ｌ ２０ （Ｓ ｍ ’ ） 、
ｘ ｙ ｌ −５、ｍ ｔ Ｉｌ−１、ｓｕｐ Ｅ
４４ λ−）〕。
、同Ｃ６００、同ＤＰ、５ｕｐＦ、同χ１７７６、同Ｌ
Ｅ３９２等の通常この種の技術分野で用いられる微生物
が有利に用いられる。その典型的な例としてエシェリヒ
ア・コリＨ８１０１株が挙げられる〔モレキュラー・ク
ローニング・エイ・ラボラトリ−・マニュアル、（Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒＣ１ｏ旧ｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ Ｍａｎｕａｌ Ｐ 、 ５０４ （１９８２
）参照；遺伝形質Ｆ−、ｈｓｄ ｓ２０ （ｒＢ
、 ｍｉ）、ｒｅｃ Ａ ｌ ３、ａｒａ −１４
、ｐｒｏ Ａ２、ｌ ａｃ Ｙ ｌ ｓｇａｌ Ｋ
２ 、ｒｐｓ Ｌ ２０ （Ｓ ｍ ’ ） 、
ｘ ｙ ｌ −５、ｍ ｔ Ｉｌ−１、ｓｕｐ Ｅ
４４ λ−）〕。
このエシェリヒア・３９８８１０１株に、前記プラスミ
ドｐＮＬ１を導入して形質転換法により得られる微生物
は、新規微生物であり、エシェリヒア・コリＨＢ １０
１ （ｐ ＮＬ １ ） ［Ｂｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａ：ｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＬ１）：］と呼称され
昭和６０年６月２１日付にて工業技術院微生物工業技術
研究所へ寄託され、その受託番号は、微工研菌寄第８３
２０号（ＦＥＲＭ Ｐ−８３２０）である。このよう
にして得られたエシェリヒア・コリＨＢＩ ０１ （ｐ
ＮＬ１）の菌学的性質を、ＤＮＡ受容菌であるエシェリ
ヒア・コリＨＢ１０１！（７）１生質と比較すると、前
者が、シアル酸を含まない培地でのＮ−アシルノイラミ
ン酸アルドラーゼ生螢能及びアンピシリン耐性を有する
のに対し、後どがこれらの特性を有しない点以外は、全
く同一である。
ドｐＮＬ１を導入して形質転換法により得られる微生物
は、新規微生物であり、エシェリヒア・コリＨＢ １０
１ （ｐ ＮＬ １ ） ［Ｂｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａ：ｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＬ１）：］と呼称され
昭和６０年６月２１日付にて工業技術院微生物工業技術
研究所へ寄託され、その受託番号は、微工研菌寄第８３
２０号（ＦＥＲＭ Ｐ−８３２０）である。このよう
にして得られたエシェリヒア・コリＨＢＩ ０１ （ｐ
ＮＬ１）の菌学的性質を、ＤＮＡ受容菌であるエシェリ
ヒア・コリＨＢ１０１！（７）１生質と比較すると、前
者が、シアル酸を含まない培地でのＮ−アシルノイラミ
ン酸アルドラーゼ生螢能及びアンピシリン耐性を有する
のに対し、後どがこれらの特性を有しない点以外は、全
く同一である。
（Ｃ）有用生理活性物質の生産
工程（ｂ）で得られた形質転換株を培養するには、特定
の遺伝情報によって生成される物質の生産に適己た培地
であって且つ宿主微生物の生育に適した培地を用い得る
が、本発明方法では、通常、エシェリヒア・コリの生育
培地として用いられるＬＢ培地（トリプトン、酵母エキ
ス、食塩）、ＢＰＢ培地（Ｄｉｆｃｏ ；ポリペプト
ン、酵母エキス、リン酸カリウム）、栄養・寒天培地（
Ｄｉｒｃｏ ０００１）トリプトン・食塩培地等を基本
培地として調製したものを用いればよい。
の遺伝情報によって生成される物質の生産に適己た培地
であって且つ宿主微生物の生育に適した培地を用い得る
が、本発明方法では、通常、エシェリヒア・コリの生育
培地として用いられるＬＢ培地（トリプトン、酵母エキ
ス、食塩）、ＢＰＢ培地（Ｄｉｆｃｏ ；ポリペプト
ン、酵母エキス、リン酸カリウム）、栄養・寒天培地（
Ｄｉｒｃｏ ０００１）トリプトン・食塩培地等を基本
培地として調製したものを用いればよい。
その他、必要に応じて炭素源、窒素源の他にアミノ酸、
ビタミン等の栄養素を添加してもよい。
ビタミン等の栄養素を添加してもよい。
しかしながら、誘導基質、例えばＮＡＬを生産せしめる
ための培地に、従来必要とされたＮ−アシルノイラミン
酸を添加する必要のないことはいうまでもない。
ための培地に、従来必要とされたＮ−アシルノイラミン
酸を添加する必要のないことはいうまでもない。
培養方法は、ｐＨ１温度、酸素供給量等の条件として通
常のエシェリヒア属の微生物の生育に適した条件を採り
得るが、前記微生物を培地に接種した後、前記微生物が
生育してその菌体量が最大に達したとき、即ち対数増殖
後期まで生育させるのが好ましい。培養温度は、通常３
０〜３７℃、ｐＨ条件は、ｐＨ５〜８の範囲、特に中性
付近が適当である。
常のエシェリヒア属の微生物の生育に適した条件を採り
得るが、前記微生物を培地に接種した後、前記微生物が
生育してその菌体量が最大に達したとき、即ち対数増殖
後期まで生育させるのが好ましい。培養温度は、通常３
０〜３７℃、ｐＨ条件は、ｐＨ５〜８の範囲、特に中性
付近が適当である。
得られた菌体を集菌後、遠心分離、超音波破砕工程等に
より抽出し、次いで硫安分画、凍結乾燥等、通常この種
の高分子生理活性物質の分離精製方法にしたがって処理
することにより目的の高分子生理活性物質を得ることが
できる。
より抽出し、次いで硫安分画、凍結乾燥等、通常この種
の高分子生理活性物質の分離精製方法にしたがって処理
することにより目的の高分子生理活性物質を得ることが
できる。
（発明の効果）
本発明によれば、有用生理活性物質生産のための誘導基
質を培地に添加することなしに、大量に有用生理活性物
質を生産することができる。
質を培地に添加することなしに、大量に有用生理活性物
質を生産することができる。
本発明は、酵素蛋白の他、抗生物質、多糖類その他の高
分子醗酵生産物の生産に適用しうるので有用生理活性物
質の工業的醗酵生産に著しく寄与するものである。
分子醗酵生産物の生産に適用しうるので有用生理活性物
質の工業的醗酵生産に著しく寄与するものである。
以下、本発明を実施例により、更に詳細に説明するが、
本発明は、何らこれらに限定されるものではない。
本発明は、何らこれらに限定されるものではない。
実施例１
（１） Ｎ−アシルノイラミン酸アルドラーゼ生産能
の遺伝情報をもつ染色体ＤＮＡの調製 Ｎ−アシルノイラミン酸の存在下でＮ−アシルノイラミ
ン酸アルドラーゼを生産する能力を有するエシェリヒア
・コＩＪＨＢ１０１をＮＢＴ培地〔（ｇ、ｌり ：ペ
プトン１０．０、牛肉エキス６、ＯＮａＣｊ２３．Ｏチ
ミン０．０５をｐＨ７，０に調製したもの〕中、３７℃
で４時間振盪培養を行ない対数増殖後期の菌体を集菌後
、フェノール法にるＤＮＡ抽出法によって染色体ＤＮＡ
を抽出、精製し、染色体Ｄ Ｎ Ａ ２ ｍｇを１等だ
。
の遺伝情報をもつ染色体ＤＮＡの調製 Ｎ−アシルノイラミン酸の存在下でＮ−アシルノイラミ
ン酸アルドラーゼを生産する能力を有するエシェリヒア
・コＩＪＨＢ１０１をＮＢＴ培地〔（ｇ、ｌり ：ペ
プトン１０．０、牛肉エキス６、ＯＮａＣｊ２３．Ｏチ
ミン０．０５をｐＨ７，０に調製したもの〕中、３７℃
で４時間振盪培養を行ない対数増殖後期の菌体を集菌後
、フェノール法にるＤＮＡ抽出法によって染色体ＤＮＡ
を抽出、精製し、染色体Ｄ Ｎ Ａ ２ ｍｇを１等だ
。
（２）染色体ＤＮＡ断片のベクターへの挿入（１）で得
た染色体ＤＮＡｌ０μｇをとり制限酵素Ｈｉｎｄ ＩＩ
Ｉを加え、３７゛℃で３時間反応させて切断した。
た染色体ＤＮＡｌ０μｇをとり制限酵素Ｈｉｎｄ ＩＩ
Ｉを加え、３７゛℃で３時間反応させて切断した。
一方、ベクターとして用いるアンピシリン、テトラサイ
クリン抵抗性のｐＢＲ３２２プラスミド〔ベセスダ・リ
サーチ・ラボラトリーズ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅ５ｅ
ａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ）社（米国）製
〕をＨｉｎｄ ＩＩＩで完全に切断して６５℃５分の熱
処理後、前者と混合し、Ｔ、ファージ由来のＤＮＡリガ
ーゼによって１０℃、２４時間ＯＮ八への連結反応を行
ない、６５℃５分の熱処理後、反応液に２倍容のエタノ
ールを加えて染色体ＤＮＡを組み込んだプラスミドＤＮ
Ａを沈澱、採取した。
クリン抵抗性のｐＢＲ３２２プラスミド〔ベセスダ・リ
サーチ・ラボラトリーズ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅ５ｅ
ａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ）社（米国）製
〕をＨｉｎｄ ＩＩＩで完全に切断して６５℃５分の熱
処理後、前者と混合し、Ｔ、ファージ由来のＤＮＡリガ
ーゼによって１０℃、２４時間ＯＮ八への連結反応を行
ない、６５℃５分の熱処理後、反応液に２倍容のエタノ
ールを加えて染色体ＤＮＡを組み込んだプラスミドＤＮ
Ａを沈澱、採取した。
（３）Ｎ−アシルノイラミン酸アルドラーゼの生産に関
与した遺伝子を担うプラスミドによる形質転換 エシェリヒア・コリに一１２株とエシェリヒア・コリ８
株のハイブリッド株であるエシェリヒア・３９８８１０
１株をＬＢ培地〔純水ｌＩｌあたりトリプトン（Ｄｉｒ
ｃｏ ） １０ ｇ、、酵母エキス５ｇ、ＮａＣｊ！
１０ｇをｐＨ７，０に調製したもの］１０ｒｒ＋ｊ！に
接種し、３７℃で振盪培養を行ない、対数増殖期まで生
育させた後に集菌した。
与した遺伝子を担うプラスミドによる形質転換 エシェリヒア・コリに一１２株とエシェリヒア・コリ８
株のハイブリッド株であるエシェリヒア・３９８８１０
１株をＬＢ培地〔純水ｌＩｌあたりトリプトン（Ｄｉｒ
ｃｏ ） １０ ｇ、、酵母エキス５ｇ、ＮａＣｊ！
１０ｇをｐＨ７，０に調製したもの］１０ｒｒ＋ｊ！に
接種し、３７℃で振盪培養を行ない、対数増殖期まで生
育させた後に集菌した。
これを水冷下、最終濃度で０．０３ Ｍ Ｃａ Ｃ１
２の溶液に懸濁させてコンピテントな細胞とした。
２の溶液に懸濁させてコンピテントな細胞とした。
この細胞懸濁液に（２）で得たプラスミドＤＮＡの溶解
液を加えて、水冷下で６０分反応させ、４２℃、１〜２
分間ヒートショックを与えて、前記プラスミドＤＮＡを
細胞内に取りこませた。
液を加えて、水冷下で６０分反応させ、４２℃、１〜２
分間ヒートショックを与えて、前記プラスミドＤＮＡを
細胞内に取りこませた。
次いでこの細胞懸濁液を別途前記ＬＢ培地に接種し、３
７−ｔ’、３〜５時間振盪培養して形質転換反応を行な
った後、アンピシリン耐性を有し、且つＮ−アシルノイ
ラミン酸アルドラーゼ活性ノ高い株を分離し集菌、洗浄
して、エシェリヒア・コリ（ｐＮＬ１）（微工研菌寄第
８３２０号）を得た。
７−ｔ’、３〜５時間振盪培養して形質転換反応を行な
った後、アンピシリン耐性を有し、且つＮ−アシルノイ
ラミン酸アルドラーゼ活性ノ高い株を分離し集菌、洗浄
して、エシェリヒア・コリ（ｐＮＬ１）（微工研菌寄第
８３２０号）を得た。
（４） エシェリヒア・コリＨＢＩ Ｏ１（ｐＮＬ１
）によるＮ−アシルノイラミン酸アルドラーゼの生産 〔３）で得られた形質転換株、エシェリヒア・コリＨＢ
Ｉ ０１ （ｐＮＬ１）（微工研菌寄第８３２０号）を
前記ＬＢ培地１００ｍｊ！を含む５００ｍｌ容のフラス
コで３７℃にて１６時間振盪培養を行なった。これを遠
心分離にて集菌、洗浄後、ｐｌ＋７．５に調製した０、
１ Ｍリン涼暖衝液２０ｍｊ７に懸濁し、０℃で１０
分間の超音波破砕し、酵素抽出液を得た。次いで、ここ
に得られた抽出液を硫安で塩析し、３０〜８０％飽和区
分（飽和度は０ｓｂｏｒｎｅ法で表示）を凍結乾燥して
Ｎ−アシルノイラミン酸アルドラーゼの粗粉末５０ｍｇ
を得た。ここに得られた粗粉末Ｌ ｍｇあたりのＮ−ア
シルノイラミン酸アルドラーゼ活性は０．３単位であっ
た。上記において比較のため、前記ＬＢ培地にてＤＮＡ
受容菌であるエシェリヒア・コＵ ＨＢ １０１菌を同
様に培養し、上記と同様に処理した結果、得られたＮ−
丁シルノイラミン酸アルドラーゼの粗粉末は５０ｍｇで
、粉末１ ｍｇあたりのＮ−アシルノイラミン酸アルド
ラーゼ活性は０．００３単位であった。このことがらＮ
−アシルノイラミン酸アルドラーゼの生産に関与する遺
伝情報を担うＤＮＡ断片を含むプラスミドで形質転換さ
れたエシェリヒア・コリＨＢＩ ０１ （ｐＮＬ１）菌
はシアル酸を含まない栄養培地において、ＤＮＡ受容菌
であるエシェリヒア・コリＨＢ１０１菌の約１００倍の
Ｎ−アシルノイラミン酸アルドラーゼ生産能を有するこ
とが明白である。なお、Ｎ−アシルノイラミン酸アルド
ラーゼの活性の測定は、ｐＨ７，５の１００ｍＭリン酸
緩衝液中で２４ｍＭのＮ−アシルノイラミン酸を含む混
合液を調製し、その混合液に適当量の粗酵素抽出液を加
えて最終液量を０．３ ｍ １とし、３７℃で反応を行
ない生成するピルビン酸をＤＮＰ法〔日本分析化学会、
分析化学ライブラリー、３．１８２、□ 。
）によるＮ−アシルノイラミン酸アルドラーゼの生産 〔３）で得られた形質転換株、エシェリヒア・コリＨＢ
Ｉ ０１ （ｐＮＬ１）（微工研菌寄第８３２０号）を
前記ＬＢ培地１００ｍｊ！を含む５００ｍｌ容のフラス
コで３７℃にて１６時間振盪培養を行なった。これを遠
心分離にて集菌、洗浄後、ｐｌ＋７．５に調製した０、
１ Ｍリン涼暖衝液２０ｍｊ７に懸濁し、０℃で１０
分間の超音波破砕し、酵素抽出液を得た。次いで、ここ
に得られた抽出液を硫安で塩析し、３０〜８０％飽和区
分（飽和度は０ｓｂｏｒｎｅ法で表示）を凍結乾燥して
Ｎ−アシルノイラミン酸アルドラーゼの粗粉末５０ｍｇ
を得た。ここに得られた粗粉末Ｌ ｍｇあたりのＮ−ア
シルノイラミン酸アルドラーゼ活性は０．３単位であっ
た。上記において比較のため、前記ＬＢ培地にてＤＮＡ
受容菌であるエシェリヒア・コＵ ＨＢ １０１菌を同
様に培養し、上記と同様に処理した結果、得られたＮ−
丁シルノイラミン酸アルドラーゼの粗粉末は５０ｍｇで
、粉末１ ｍｇあたりのＮ−アシルノイラミン酸アルド
ラーゼ活性は０．００３単位であった。このことがらＮ
−アシルノイラミン酸アルドラーゼの生産に関与する遺
伝情報を担うＤＮＡ断片を含むプラスミドで形質転換さ
れたエシェリヒア・コリＨＢＩ ０１ （ｐＮＬ１）菌
はシアル酸を含まない栄養培地において、ＤＮＡ受容菌
であるエシェリヒア・コリＨＢ１０１菌の約１００倍の
Ｎ−アシルノイラミン酸アルドラーゼ生産能を有するこ
とが明白である。なお、Ｎ−アシルノイラミン酸アルド
ラーゼの活性の測定は、ｐＨ７，５の１００ｍＭリン酸
緩衝液中で２４ｍＭのＮ−アシルノイラミン酸を含む混
合液を調製し、その混合液に適当量の粗酵素抽出液を加
えて最終液量を０．３ ｍ １とし、３７℃で反応を行
ない生成するピルビン酸をＤＮＰ法〔日本分析化学会、
分析化学ライブラリー、３．１８２、□ 。
（１９７０）］で定量することによって行なった。酵素
活性における１単位は反応温度３７℃において１分間に
１μモルのピルビン酸を生成する活性をいう。
活性における１単位は反応温度３７℃において１分間に
１μモルのピルビン酸を生成する活性をいう。
第１図は、ｐＮＬ １プラスミドの調製工程を示す図で
あり、第２図はｐＮＬ１プラスミドの制限酵素切断地図
を示すものである（便宜的に直線で示しである）。 第１図
あり、第２図はｐＮＬ１プラスミドの制限酵素切断地図
を示すものである（便宜的に直線で示しである）。 第１図
Claims (11)
- （１）特定の誘導基質を含む培地で培養すると特定の有
用生理活性物質を生産する能力を有する微生物の染色体
ＤＮＡを制限酵素で処理して得られるＤＮＡ断片、もし
くは該ＤＮＡ断片に対してヌクレオチドの置換、ヌクレ
オチドの欠失、ヌクレオチドの挿入およびヌクレオチド
配列の逆位その他の突然変異によって関連づけられてお
りかつ前記特定の有用生理活性物質をコードするＤＮＡ
断片であって天然、合成もしくは半合成によって得られ
るＤＮＡ断片、を含むプラスミドであって、前記誘導基
質を含まない培地で培養しても前記有用生理活性物質を
生産する能力を宿主に与えるプラスミド。 - （２）宿主がエシェリヒア属に属する微生物である特許
請求の範囲第１項記載のプラスミド。 - （３）エシェリヒア属に属する微生物が、エシェリヒア
・コリＨＢ１０１である特許請求の範囲第２項記載のプ
ラスミド。 - （４）有用生理活性物質が、Ｎ−アシルノイラミン酸ア
ルドラーゼである特許請求の範囲第１項記載のプラスミ
ド。 - （５）ＤＮＡ断片が、エシェリヒア属に属する微生物の
染色体ＤＮＡから調製されたＤＮＡ断片である特許請求
の範囲第１項記載のプラスミド。 - （６）エシェリヒア属に属する微生物が、エシェリヒア
・コリＨＢ１０１である特許請求の範囲第５項記載のプ
ラスミド。 - （７）プラスミドがｐＮＬ１プラスミドである特許請求
の範囲第１項記載のプラスミド。 - （８）特定の誘導基質を含む培地で培養すると特定の有
用生理活性物質を生産する能力を有する微生物の染色体
ＤＮＡを制限酵素で処理して得られるＤＮＡ断片、もし
くは該ＤＮＡ断片に対してヌクレオチドの置換、ヌクレ
オチドの欠失、ヌクレオチドの挿入およびヌクレオチド
配列の逆位その他の突然変異によって関連づけられてお
りかつ前記特定の有用生理活性物質をコードするＤＮＡ
断片であって天然、合成もしくは半合成によって得られ
るＤＮＡ断片、を含むプラスミドであって、前記誘導基
質を含まない培地で培養しても前記有用生理活性物質を
生産する能力を宿主に与えるプラスミドによって形質転
換された微生物。 - （９）形質転換された微生物がエシェリヒア・コリＨＢ
１０１（ｐＮＬ１）である特許請求の範囲第８項記載の
微生物。 - （１０）特定の誘導基質を含む培地で培養すると特定の
有用生理活性物質を生産する能力を有する微生物の染色
体ＤＮＡを制限酵素で処理して得られるＤＮＡ断片、も
しくは該ＤＮＡ断片に対してヌクレオチドの置換、ヌク
レオチドの欠失、ヌクレオチドの挿入およびヌクレオチ
ド配列の逆位その他の突然変異によって関連づけられて
おりかつ前記特定の有用生理活性物質をコードするＤＮ
Ａ断片であって天然、合成もしくは半合成によって得ら
れるＤＮＡ断片、を含むプラスミドであって、前記誘導
基質を含まない培地で培養しても前記有用生理活性物質
を生産する能力を宿主に与えるプラスミドによって形質
転換された微生物を、誘導基質を含まない培地で培養し
、培養物から有用生理活性物質を採取することを特徴と
する有用生理活性物質の製造法。 - （１１）誘導基質が、Ｎ−アシルノイラミン酸であり、
有用生理活性物質がＮ−アシルノイラミン酸アルドラー
ゼである特許請求の範囲第１０項記載の有用生理活性物
質の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60139807A JPS62277A (ja) | 1985-06-26 | 1985-06-26 | 新規プラスミド及びそれにより形質転換された新規微生物及びそれを用いた有用生理活性物質の製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60139807A JPS62277A (ja) | 1985-06-26 | 1985-06-26 | 新規プラスミド及びそれにより形質転換された新規微生物及びそれを用いた有用生理活性物質の製造法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62277A true JPS62277A (ja) | 1987-01-06 |
Family
ID=15253894
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60139807A Pending JPS62277A (ja) | 1985-06-26 | 1985-06-26 | 新規プラスミド及びそれにより形質転換された新規微生物及びそれを用いた有用生理活性物質の製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS62277A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS63209589A (ja) * | 1987-02-27 | 1988-08-31 | Toyobo Co Ltd | Ｎａｌ（ｎ―アシルノイラミン酸アルドラーゼ）の製造方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS611384A (ja) * | 1984-06-14 | 1986-01-07 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | Ｎ−アセチルノイラミン酸リア−ゼの製法 |
| JPS6181786A (ja) * | 1984-08-30 | 1986-04-25 | Marukin Shoyu Kk | Ｎ―アシルノイラミン酸アルドラーゼ遺伝子を含む組換えプラスミド及び形質転換微生物 |
-
1985
- 1985-06-26 JP JP60139807A patent/JPS62277A/ja active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS611384A (ja) * | 1984-06-14 | 1986-01-07 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | Ｎ−アセチルノイラミン酸リア−ゼの製法 |
| JPS6181786A (ja) * | 1984-08-30 | 1986-04-25 | Marukin Shoyu Kk | Ｎ―アシルノイラミン酸アルドラーゼ遺伝子を含む組換えプラスミド及び形質転換微生物 |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS63209589A (ja) * | 1987-02-27 | 1988-08-31 | Toyobo Co Ltd | Ｎａｌ（ｎ―アシルノイラミン酸アルドラーゼ）の製造方法 |
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