JPH0376579A - ヒト‐アンジオジェニン発現ベクター及びヒト‐アンジオジェニンの製造方法 - Google Patents
ヒト‐アンジオジェニン発現ベクター及びヒト‐アンジオジェニンの製造方法Info
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- JPH0376579A JPH0376579A JP21244289A JP21244289A JPH0376579A JP H0376579 A JPH0376579 A JP H0376579A JP 21244289 A JP21244289 A JP 21244289A JP 21244289 A JP21244289 A JP 21244289A JP H0376579 A JPH0376579 A JP H0376579A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
〔産業上の利用分野〕
本発明は、ヒト−アンジオジェニンの発現ベクターおよ
びこのベクターを大腸菌に組み込んでヒト−アンジオジ
ェニンを大量に生産する方法に関する。 〔従来の技術〕 ヒト−アンジオジェニンは、血管新生因子で、培養ＨＴ
２９大腸腺癌細胞の上澄から見出された〔フェット（Ｆ
ｅｔｔ）ら、バイオケミストリー（Ｂｉｏ−ｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ）、２４．５４８０〜５４８６（１９８５）及
びストリダム（Ｓｔｒｙｄｏａ＋） ら、バイオケミ
ストリー（Ｂｉｏｃｈｅ−ｅｅｉｓｔｒｙ）、２４．
５４８６〜５４９４（１９８５））。 このヒト−アンジオジェニンは分子量１４２０００、等
電点が９．５以上のポリペプチドで、７１ノ酸配列も既
に知られており、リボヌクレアーゼＡと３５％相同的で
あり、リボヌクレアーゼ活性を有するが、この活性はり
ボヌクレアーゼへの場合よりも特異的で、１００万分の
１以下の活性であることが知られている〔シャピロ（Ｓ
ｈａｐｉｒｏ） ら、バイオケミスドリー（Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ）、２５ ３５２７〜３５３２（１９８
６） 〕。 一方、このヒト−アンジオジェニンは、その血管新生作
用のため、創傷治癒用、或いは皮膚移植用としての治療
用途が可能であり、また、リボヌクレアーゼＡとの相同
性を考慮すれば、合成低分子インヒビターを開発するこ
とにより、充実性腫瘍及びそれらの移転並びにリュウマ
チ様関節炎、糖尿病の続発症及びその他の症状に関する
診断及び治療等に利用できる。 しかし、これらの治療に用いるためには、生物活性をも
った、充分な量のヒトーアンジオジ翼ニンを得ることが
必要であるが、癌細胞の上澄から大量のヒト−アンジオ
ジェニンを集めることは、極めて、労力を有し、効率的
でなかった。また、ヒト−アンジオジェニンを遺伝子工
学的手法で産生しようとする試みも種々提案されている
（例えば、特開昭６３−３０４９８７号公報）、シかし
ながら、これらの方法においても、未だ充分に満足でき
る方法は提案されていない。 〔発明が解決しようとする課題〕 本発明は、上記課題を解決したもので、本発明の目的は
、ヒトーアンジオジエニンの発現が高く、これを効率よ
（生産できる発現ベクターを提供するとともに、大量に
しかも安価にヒト−アンジオジェニンを生産する方法を
提供することにある。 〔課題を解決するための手段〕 本発明は、ｔａｃプロモーター又はｔｒｐプロモーター
のフラグメントとプラスミドｐＵｃ１８の復製開始点（
ＯｒＯのフラグメントとヒト−アンジオジェニンのアミ
ノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡとを含む
ことから構成される発現ベクター及びこれらのベクター
を大腸菌に形質導入してヒトーアンジオジュニンを発現
させ、これを採取することからなるヒト−アンジオジェ
ニンの製造方法に関する。 本発明にいうｔａｃプロモーター又はｔｒｐプロモータ
ーのフラグメントは、第２図ａ及び第２図すに示した塩
基配列を有するもので、ＤＮＡ合威合成により容易に合
成することかできる。従って、これらのプロモーターを
合成し、これをプラスミドｐＵＣ１８の複製開始点（Ｏ
ｒｉ）のフラグメント等と組合せても良いが、市販のプ
ラスミドの切り出しや接合等を組合せることにより比較
的容易に調製できる。例えば、市販のプラスミドｐＫＫ
２２３−３ （ファルマシア製）を制限酵素Ｐｖｕ Ｉ
及びＮｒｕ Ｉで切断したｔａｅプロモーターフラグメ
ントを含むサイト部と市販、のプラスミドｐｌＪｃ１８
を１ｔｉ１１限酵素Ｐｖｕ ｌ及びＮｒｕ Ｋで切断し
た複製開始点（Ｏｒｉ）のフラグメントを含むサイト部
とをＴ４ ＤＮＡリガーゼで接合することにより、ｔａ
ｅプロモーターのフラグメントとプラスミドｐＨｃ１Ｂ
の複製開始点（Ｏｒｉ）のフラグメントとを含んだプラ
スミドを得ることができる。 一方、このプラスミドを制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＥｅｏ
４７ ｍで切断し、復製開始点（Ｏｒｉ）のフラグメ
ントを含むサイト部とをｌｌＮＡ合戒機等により合成し
たｔｒｐプロモーターのフラグメントを接合することに
より、ｔｒｐプロモーターのフラグメントとプラス元ド
ｐＬｌｃ１８の複製開始点くＯｒＯのフラグメントとを
含んだプラスミドを比較的容易に調製するこ占ができる
。 本発明では、上述のようなｔａｅプロモーターまたはｔ
ｒｐプロモーターのフラグメントとプラスミドｐＨｃ１
８の複製開始点（Ｏｒｏのフラグメントとを含むベクタ
ーを利用するものであるが、これら以外に、使用したプ
ラスミド由来の他の遺伝子を含んでいても何ら支隊はな
いが、例えばｒｒｎＢターミネ・−ター、テ［・ラサイ
クリン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子等のフラグ
メント等を含んでいると、高発現を行うことができ、ま
たスクリーニングが簡便となり、特に好ましい。 ヒトーアンジオジュニンの遺伝子は、ヒトーアンジオジ
美ニンを構成するアミノ酸数が１２３と比較的小さいた
め、ＤＮＡ合或機を用いることにより、比較的簡便に調
製できる。勿論、ｃＤＮＡライブラリーからｅＤＮＡを
スクリーニングすることによって得ても良いことはいう
までもない。この遺伝子は、大腸菌での使用頻度の高い
コドンを用いることが好ましく、特に、第１図に示した
塩基配列の遺伝子を用いることが好ましい。 次に、上記のベクターに、ヒト−アンジオジェニンの遺
伝子を組み込むが、この方法は、前記ベクターを、Ｉ！
ｃｏ Ｒ１，Ｓ＋ｗａｌ、ＢａｍＨＩ、５ａｉｌ。 Ｐｓｔ Ｉ 、 Ｈｉｎｄｌｌ［等の制限酵素、特に、
好ましくは！！ｃｏＲＩを用いて開裂し、ヒト−アンジ
オジェニン遺伝子をＤＮＡリガーゼで結合することによ
り得ることができる。そして、これを大腸菌に導入し、
スクリーニングすることにより形質転換菌を得ることが
できる。 この形質転換菌を所定の培地で培養することにより、ヒ
ト−アンジオジェニンを生産させ、次いで、菌体を破壊
した後、遠心分離、カラムクロマトグラフィー等の手段
により、単離、精製する。 〔実施例〕 実施例１ （１） ヒトーアンジオジエニン の Ａ と
±ｆｌ製 第１図に示したヒト−アンジオジェニンの塩基配列を１
４本のフラグメントに分けてフォスホアミダイト法によ
る全自動合成ｍ＜アブライドバイオシステムズモデル３
８０＾〉で台底した。各ＤＮＡフラグメントの５′−末
端にＤＭＴｒ （ジメトキシトリチル）基を残存させた
状態で逆相Ｃ１８カラムに吸着させ、アセトニトリル０
．１Ｍ ）リエチルアンモニウムアセテート（ＴＥＡ
Ａ）のバッファー系を用いアセトニトリルの濃度勾配で
溶出させた。目的ピークを分取し、濃縮乾固後８０％酢
酸水ｌａ１！を加え、室温に２０分間放置した後、濃縮
乾固した。内容物を水に溶かし、再度逆相Ｃ１８カラム
を用いた高速液体クロマトグラフィーにより精製した。 （２）フラグメントの゛ 心 ヒト−アンジオジェニン遺伝子を第１図に示すように旧
ｎｄｍ部位でＡバートとＢバートに分けて構築した。 Ａバートについては５′−末端のフラグメントを除く６
本のフラグメント５００ｐ謡Ｏ１をリン酸化反応液５０
ｐｌ中、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ１０単位と１ｍ
ＭＡＴＰ溶液１．５μｌとを加え、３７℃で１時間加熱
した後、連結反応に用いた。さらにマＯ℃で３分間加熱
した後、連結反応に用いた。 Ａパートを構成する８本のフラグメントを２０ｐｍｏｌ
ずつ混合し、３分間加熱後、急冷し、再度７５°Ｃで１
０分間加熱した後、室温まで約２時間かけて徐冷するこ
とによりアニーリングした。これにＴ４ＤＮＡ リガー
ゼを含む溶液２０ｕ ｌ （６０ｍＭ Ｔｒｉｓ −Ｃ
２、ｐＨ７，５、５ｍＭ ＭｇＣ１ｔ、 ５■Ｍ
ＤＴＴ、 １ｔＭ ＡＴＰ）中において、１６℃
で一晩反応させた。 Ｂパートを構成する６本のフラグメントも同様にリン酸
化後、アニーリング及び連結反応させた。 反応後、水を加えて２００μ２とし、フェノール及びク
ロロホルムでタンパクを除き、冷エタノールで沈澱させ
、目的とするＡバート及びＢバートに対応する二重１１
ＤＮＡを得た。 （３） ヒ −アンジオジェニンへ のクロー
ニング クローニングベクターには大腸菌のプラスミドｐＵＣ１
８を用いた。 ｐＵｃ１８ ｌＯｕ ｇをＥｃｏＲ［３
０単位、Ｈｉｎｄｌｌ［３０単位を用いて３７”Ｃで２
時間消化した。これをアガロースゲル電気泳動に供して
ベクタ一部分を抽出し、フェノール抽出によりタンパク
を除き、エタノールで沈澱させた後、５０μｌのＴＥ！
ｌ衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃ１，ｐＨ８，０、１ｍ
ＭＥＤＴＡ）に溶解した。この溶液の５０ｎｇＯ相当量
に、上記（２）で得たＡパート及びＢパートに対応する
二重鎖ＩＩＮ＾を含む溶液Ｌｏｐ ｌ （６６ａ＋Ｍ
Ｔｒｉｓ−ＣＩ ５ｐＨ７，５，５ｍＭＭｇＣ／！＊、
５鵬Ｍ ＤＴＴ、 １ｍＭ ＡＴＰ 、 ３００単位Ｔ
４ ＤＮＡリガーゼ）を加え、１６°Ｃで一晩反応させ
た。この反応液を用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換
し、アンピシリン耐性のコロニーを得た。この形質転換
体からプラスミドＤＮＡを調製し、制限酵素による分解
パターン、さらにはＤＮＡシークエンシングを行い、ｐ
ＵＣ１８のＥｃｏＲＩと旧ｎｄｕｌとの間にＡバート及
びＢパートのフラグメントが挿入されたプラスくドｐＡ
にＮ−Ａ及びｐＡＧＮ−１’ｌが導入されていることを
確認した。 （４） ヒ −アンジオジエニン の上記ｐＡＧ
Ｎ−＾及びｐＡＧＮ−８各々ＩＯμｇ ＠ ＥｅｏＲＩ
３０単位、旧ｎｄ ＩＩＩ ３０単位を用いて３７℃
で２時間消化した。これをアガロースゲル電気泳動に供
して、約２２０ｂｐの＾バートと約１５０ｈｐのＢパー
トを抽出し、フェノール抽出によりタンパクを除き、エ
タノールで沈澱させた後、各々５００ｎｇ／μ℃になる
ようＴＢ緩衝液に溶解した。ＡパートとＢバートを含む
溶液をそれぞれ５μ君を含む溶液５０μｌ （Ｔｒｉｓ
・ Ｃｊ！、ｐＨ７，５，５ｍｌ’ｌ ＹＩｇＣｎｔ、
５ｍＭ ＤＴＴ、 １ｓＭ ＡＴＰ、 ３００単位Ｔ
４ＤＮＡリガーゼ）中において１６℃で一晩反応させ、
Ａバート乏Ｂバートを連結した０反応後、フェノール及
びクロロホルム抽出によりタンパクを除き、エタノール
で沈澱させた後、３０単位のＥｅｏＲＩを用いて３７℃
で２時間消化した。これをアガロースゲル電気泳動に供
し、ヒトーアンジオジエニン遺伝子に対感する約３７０
ｂｐのフラグメントを得た。このヒ叶−アンジオジェニ
ン遺伝子を増幅し、塩基配列を確認するためにｐｌＪｃ
１８へのクローニングを行った。 ｐＵｃＩＢ ５＃
ｇを２０単位のＲｅｏ ｆｌ １で消化した後、脱リ
ン酸化酵素（アルカリホスファターゼＢＡＰ） １単位
を含む溶液Ｓｏｕ Ｉ！、 （５００ｓ＋ＭＴｒｉｓ
・Ｃｆｆ１． ｐＨ９，０，１ｍＭ ＭｇＣｊ！ｇ
、１ ａｉＭ Ｚｒ＋Ｃｊ！ｇ）を加え、３７°Ｃで３
０分間反応させた。ツメノール抽出により除タンパクし
、冷エタノールで沈澱させた後、ＴＩ！緩衝液に溶解し
た。この溶液の５０ｒｉｇ相当量に上記３７０ｂｐのア
ンジオジュニン遺伝子５００ｎｇを含む溶液１０１１
Ｎ （６６ｄ Ｔｒｉｓ−（Ｊ！ 、 ｐＨ７，５，５
ｍＭ ＭｇＣＰ、ｚ、５ａＭ ＤＴＴ 、 １ｍＭＡＴ
Ｐ、 ３００単位Ｔ４ＯＮＡリガーゼ）を加え、１６℃
で一晩反史させた。この反応液を用いて大腸菌ＪＭ １
０９株を形質転換し、Ｘ−ｇａｌ（５ブロモ−４−クロ
ロ−３−インドリル−β−ガラクトシド）とＩＰＴＧ
（イソプロピル−β−ｐ−チオガラクトシド〉入りのア
ンピシリン含有ＬＢプレート上にまき、白色コロニーを
拾い、目的の組換え体プラスミドを持つ菌株を得た。こ
の形質転換体からプラスミドＤＮＡを調製し、制限酵素
による分解パターンからクローニングの方向を決定し、
塩基配列はサンガー等の方法で確認した。このようにし
てヒト−アンジオジェニン遺伝子が挿入されたプラスミ
ドをｐＡＧＮ １と命名した。（第３図）（５）発韮と
じシ吐二Ｑ摘−製 第４図に示すように市販のプラスミドｐ■２２３３（フ
ァルマシア社製〉５μｇを制限酵素Ｐｖｕ Ｉ ２０単
位及びＮｒｕＩ２０単位で切断し、ｔａｃプロモーター
及びｒｒｎＢター電ネータネ−ター１８２１ｂ、のフラ
グメントをアガロースゲル電気泳動により回収した。 またプラスミドｐ［Ｉｃ１８ ５μｇを制限酵素Ｐｖｕ
１２０単位及びＰｖｕｎ ２０単位で切断し、複製開始
点（Ｏｒｉ）を含んでいる１４３８ｂｐのフラグメント
をアガロースゲル電気泳動により回収した。これらのフ
ラグメント１１００ｎずつを１０ｕＩｌの反応液（６６
−Ｔｒｉｓ ・Ｃｌ 、、ｐＨ１，５，５ａｉＭ Ｍｇ
Ｃ１２ｚ、５ｍＭ ＤＴＴ、 １ａｉＭＡＴＰ、 ３０
０単位Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ）中において１６°Ｃで一
晩反応させた。この反窓液を用いて大腸菌卸１０９株を
形質転換し、β−ラクタマーゼ遺伝子が再構築されたア
ンピシリン耐性のコロニーを得た。 この形質転換体からプラス改ドＤＮＡを調製し、制限酵
素による分解パターン及びコピー数の増幅を指標にして
ｐ■２２３−３のｔａｃプロモーターとｐＵｏｌＢのＯ
ｒｉを有する発現ベクターを得た。このプラスミドの塩
基配列はサンガー等の方法で確認し、ｐＭＫ２と命名し
た。次にプラスミドｐＭＫ２５μｇを２０単位のＥｃｏ
Ｒ■で切断し、脱リン酸化酵素（アルカリホスファター
ゼＢＡＰ） １単位を含む溶液５０μｌ（５００ｍＭ
Ｔｒｉｓ−Ｃ１，ｐＨ９，０、ｌｄ Ｍｇｃｇ、 、
１ｓＭＺｎＣ１２１）を加え、３７℃で３０分間反応さ
せた。フェノール抽出により除タンパクし、冷エタノー
ルで沈澱させた後、ＴＢ緩衝液に溶解した。また前述の
プラスミドｐＡＧＮ１１０μｇを３０単位のＢｅｏ Ｉ
で消化後、アガロースゲル電気泳動によりアンジオジエ
ニン遺伝子を回収した。上記処理後のプラスミドｐＭＫ
２５０ｎｇに、このアンジオジュニン遺伝子フラグメン
ト５００ ｎｇを含む溶液１０μＮ （６６ｄ Ｔｒｉ
ｓ ＝Ｃｊ！、ｐＨ７，５，５＋＋＋Ｍ ＭｇＣ１，＊
、５ｍＭ ＤＴＴ 、 ｌｄ ＡＴＰ 、 ３００単位
Ｔ４ ＤＮＡ リガーゼ）を加え、１６℃で一晩反応せ
た。この反応液を用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換
し、目的のアンジオジェニン発現ベクターを持つ菌株を
得た。この形質転換体からプラスミドＤＮＡを調製し、
制限酵素による分解パターンからクローニング方向を決
定し、正しい方向にクローン化されたアンジオジェニン
発現ベクターヲｐＭＡＧＮ１とした。尚、この発現ベク
ターにより形質転換された菌株は、Ｅ、ｃｏｌｉＪＭ１
０９ ｐＭＡＧＮ １ （微工研条寄第２５０４号）と
して寄託されている。 実施例２ ベ − ＭＴＡＧＮ の 第６図に示すように上記プラスミドｐＭＫ２１０μｇを
制限酵素Ｅｃｏ ＲＩ ３０単位及びＥｃｏ ４７ｍ３
０単位で切断し、ｔａｃプロモーターを含む断片を除去
し、複製開始点を含む２９８０ｂｐの断片をアガロース
ゲル電気泳動によって回収した。一方、第２図に示した
ｔｒｐプロモーターの塩基配列をＴＲＰ １とＴＲＰ
２とに分割してＤＮＡ合威合成台底した。 これらを逆相Ｃ１８カラムを用いた高速液体クロマトグ
ラフィーにより精製し、各々１００１００ｐをアニーリ
ングして二重＠ ＤＮＡを得た。この断片と前記ｐＭＫ
２ ＥｃｏＲ１及びＥｃｏ ４１ｍで消化した断片とを
Ｔ４ＤＮＡ リガーゼにより１６℃で一晩反応させた。 この反応液を用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、
ｔｒｐプロモーターとＰＭに２の複製開始点（Ｏｒｉ）
を有する発現ベクターを得た。このプラスミドの塩基配
列はサンガー等の方法で確認し、ｐｎｒ ｉと命名した
。このｐＭＴ １５ｕｇを２０単位のＥｃｏＲｌで消化
した後、アルカリホスファターゼ１単位を含む溶液５０
μｌを加え、３７°Ｃで３０分間反応させた。フェノー
ル抽出により除タンパクし、冷エタノールで沈澱させた
後、ＴＥ緩衝液に溶解した。このフラグメント５０ｎｇ
と前記アンジオジェニン遺伝子５００ｎｇをＴ４ＤＮＡ
リガーゼにより１６°Ｃで一晩反応させた。 この反応液を用いて大ＩＪｉｉｉｉＪＭ１０９株を形質
転換し、アンジオジェニン発現ベクターを持つ菌株を得
た。 この形質転換体からプラスミドＤＮＡを調製し、制限酵
素による分解を行いクローニング方向を決定し、正しい
方向にクローン化されたプラスミドをｐＭＴＡＧＮ １
とした。尚、この発現ベクターにより形質転換された菌
株は、Ｅ、ｃｏｌｉ ＪＭ１０９ ｐＭＴＡＧＮ １
（微工研条寄第２５２４号）として寄託されている。 実施例３ ヒ −アンジオジェニンの 上記の発現ベクターｐＭＡＧＮ １により形質転換され
た大腸菌Ｅ、ｃｏｌｉ ＪＭ１０９株を５０ ｔｔ ｇ
／ ｄのアンピシリンを含むＬＢ培地（バクトドリプト
ン１０ｇ／ ｔ、バクトイ−ストエキストラクト５ｇ＃
！、ＮａＣｊ！ １０ｇ／ｉ！、、ｐＨ７，５）で培養
した。−晩培養後、培養液１ｍを集菌し、レムリのサン
プル緩衝液に懸濁し、加熱溶解後、ＳＤＳポリアクリル
アミドゲル電気泳動に供した。泳動後、クマシーブリリ
アントブルーにより染色し、脱色したところ、分子量約
１４．０００の位置にアンジオジェニンの発現が確認さ
れた。 電気泳動したゲルをデンシトメーターにかけ発現効率を
調べた。その結果、ヒト−アンジオジェニンは全菌体蛋
白質の約１０〜２０％の発現を示し、培地ｌｊ！当たり
６０−１２０ｇの生産量であった。またプラスミドＩ）
ＭＴＡＧＮ １により形質転換された大腸Ｅ。 ｃｏｌｔ ＪＭ１０９株を５０ ａ ｇ／−のアンピシ
リンを含むＭ９培地（グリコース５ｇ／ ｌ 、カリξ
）酸５ｇ／ ｊ！ 。 ＮａｘＨＰＯａ ６ｇ／ｌ、 ＫｌｌｚＰＯ４３ｇ／
ｊ！５ＮａＣＩ Ｉｇ／ｊ！、チアミン塩酸塩ｌＯ■／
１２ 、１ｍＭ Ｍｇ５Ｏａ 、１００μＨＣａＣｌ
宜、トリプトファン５０ｗｇ／ ｌ ５ｐＨ７，２）
で培養した。その結果ヒトーアンジオジエニンの発現量
は全菌体蛋白質の約７％であり、培地１７！当たりの生
産量は３０ｍｇ／ｊ！でｐＭＡＧＮ １と比較すると低
い値であった。一方大量培養系に移すと発現量は多くな
り、発現量は２００［／ｊ！を示した。実施例２のプラ
スミドｐＭＴＡＧＮ １が挿入された大腸菌は大量培養
や高密度培養に適している。なお、大腸菌Ｈ８１０１株
にｐＭＴＡＧＮ １を組込むとヒト−アンジオジェニン
は発現したが、その発現量はＪＭ１０９株を用いたとき
よりも低く、宿主により発現量に差があり、この点から
みて大腸菌ＪＭ １０９株はヒト−アンジオジェニンの
発現に好適な宿主であるといえる。
びこのベクターを大腸菌に組み込んでヒト−アンジオジ
ェニンを大量に生産する方法に関する。 〔従来の技術〕 ヒト−アンジオジェニンは、血管新生因子で、培養ＨＴ
２９大腸腺癌細胞の上澄から見出された〔フェット（Ｆ
ｅｔｔ）ら、バイオケミストリー（Ｂｉｏ−ｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ）、２４．５４８０〜５４８６（１９８５）及
びストリダム（Ｓｔｒｙｄｏａ＋） ら、バイオケミ
ストリー（Ｂｉｏｃｈｅ−ｅｅｉｓｔｒｙ）、２４．
５４８６〜５４９４（１９８５））。 このヒト−アンジオジェニンは分子量１４２０００、等
電点が９．５以上のポリペプチドで、７１ノ酸配列も既
に知られており、リボヌクレアーゼＡと３５％相同的で
あり、リボヌクレアーゼ活性を有するが、この活性はり
ボヌクレアーゼへの場合よりも特異的で、１００万分の
１以下の活性であることが知られている〔シャピロ（Ｓ
ｈａｐｉｒｏ） ら、バイオケミスドリー（Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ）、２５ ３５２７〜３５３２（１９８
６） 〕。 一方、このヒト−アンジオジェニンは、その血管新生作
用のため、創傷治癒用、或いは皮膚移植用としての治療
用途が可能であり、また、リボヌクレアーゼＡとの相同
性を考慮すれば、合成低分子インヒビターを開発するこ
とにより、充実性腫瘍及びそれらの移転並びにリュウマ
チ様関節炎、糖尿病の続発症及びその他の症状に関する
診断及び治療等に利用できる。 しかし、これらの治療に用いるためには、生物活性をも
った、充分な量のヒトーアンジオジ翼ニンを得ることが
必要であるが、癌細胞の上澄から大量のヒト−アンジオ
ジェニンを集めることは、極めて、労力を有し、効率的
でなかった。また、ヒト−アンジオジェニンを遺伝子工
学的手法で産生しようとする試みも種々提案されている
（例えば、特開昭６３−３０４９８７号公報）、シかし
ながら、これらの方法においても、未だ充分に満足でき
る方法は提案されていない。 〔発明が解決しようとする課題〕 本発明は、上記課題を解決したもので、本発明の目的は
、ヒトーアンジオジエニンの発現が高く、これを効率よ
（生産できる発現ベクターを提供するとともに、大量に
しかも安価にヒト−アンジオジェニンを生産する方法を
提供することにある。 〔課題を解決するための手段〕 本発明は、ｔａｃプロモーター又はｔｒｐプロモーター
のフラグメントとプラスミドｐＵｃ１８の復製開始点（
ＯｒＯのフラグメントとヒト−アンジオジェニンのアミ
ノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡとを含む
ことから構成される発現ベクター及びこれらのベクター
を大腸菌に形質導入してヒトーアンジオジュニンを発現
させ、これを採取することからなるヒト−アンジオジェ
ニンの製造方法に関する。 本発明にいうｔａｃプロモーター又はｔｒｐプロモータ
ーのフラグメントは、第２図ａ及び第２図すに示した塩
基配列を有するもので、ＤＮＡ合威合成により容易に合
成することかできる。従って、これらのプロモーターを
合成し、これをプラスミドｐＵＣ１８の複製開始点（Ｏ
ｒｉ）のフラグメント等と組合せても良いが、市販のプ
ラスミドの切り出しや接合等を組合せることにより比較
的容易に調製できる。例えば、市販のプラスミドｐＫＫ
２２３−３ （ファルマシア製）を制限酵素Ｐｖｕ Ｉ
及びＮｒｕ Ｉで切断したｔａｅプロモーターフラグメ
ントを含むサイト部と市販、のプラスミドｐｌＪｃ１８
を１ｔｉ１１限酵素Ｐｖｕ ｌ及びＮｒｕ Ｋで切断し
た複製開始点（Ｏｒｉ）のフラグメントを含むサイト部
とをＴ４ ＤＮＡリガーゼで接合することにより、ｔａ
ｅプロモーターのフラグメントとプラスミドｐＨｃ１Ｂ
の複製開始点（Ｏｒｉ）のフラグメントとを含んだプラ
スミドを得ることができる。 一方、このプラスミドを制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＥｅｏ
４７ ｍで切断し、復製開始点（Ｏｒｉ）のフラグメ
ントを含むサイト部とをｌｌＮＡ合戒機等により合成し
たｔｒｐプロモーターのフラグメントを接合することに
より、ｔｒｐプロモーターのフラグメントとプラス元ド
ｐＬｌｃ１８の複製開始点くＯｒＯのフラグメントとを
含んだプラスミドを比較的容易に調製するこ占ができる
。 本発明では、上述のようなｔａｅプロモーターまたはｔ
ｒｐプロモーターのフラグメントとプラスミドｐＨｃ１
８の複製開始点（Ｏｒｏのフラグメントとを含むベクタ
ーを利用するものであるが、これら以外に、使用したプ
ラスミド由来の他の遺伝子を含んでいても何ら支隊はな
いが、例えばｒｒｎＢターミネ・−ター、テ［・ラサイ
クリン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子等のフラグ
メント等を含んでいると、高発現を行うことができ、ま
たスクリーニングが簡便となり、特に好ましい。 ヒトーアンジオジュニンの遺伝子は、ヒトーアンジオジ
美ニンを構成するアミノ酸数が１２３と比較的小さいた
め、ＤＮＡ合或機を用いることにより、比較的簡便に調
製できる。勿論、ｃＤＮＡライブラリーからｅＤＮＡを
スクリーニングすることによって得ても良いことはいう
までもない。この遺伝子は、大腸菌での使用頻度の高い
コドンを用いることが好ましく、特に、第１図に示した
塩基配列の遺伝子を用いることが好ましい。 次に、上記のベクターに、ヒト−アンジオジェニンの遺
伝子を組み込むが、この方法は、前記ベクターを、Ｉ！
ｃｏ Ｒ１，Ｓ＋ｗａｌ、ＢａｍＨＩ、５ａｉｌ。 Ｐｓｔ Ｉ 、 Ｈｉｎｄｌｌ［等の制限酵素、特に、
好ましくは！！ｃｏＲＩを用いて開裂し、ヒト−アンジ
オジェニン遺伝子をＤＮＡリガーゼで結合することによ
り得ることができる。そして、これを大腸菌に導入し、
スクリーニングすることにより形質転換菌を得ることが
できる。 この形質転換菌を所定の培地で培養することにより、ヒ
ト−アンジオジェニンを生産させ、次いで、菌体を破壊
した後、遠心分離、カラムクロマトグラフィー等の手段
により、単離、精製する。 〔実施例〕 実施例１ （１） ヒトーアンジオジエニン の Ａ と
±ｆｌ製 第１図に示したヒト−アンジオジェニンの塩基配列を１
４本のフラグメントに分けてフォスホアミダイト法によ
る全自動合成ｍ＜アブライドバイオシステムズモデル３
８０＾〉で台底した。各ＤＮＡフラグメントの５′−末
端にＤＭＴｒ （ジメトキシトリチル）基を残存させた
状態で逆相Ｃ１８カラムに吸着させ、アセトニトリル０
．１Ｍ ）リエチルアンモニウムアセテート（ＴＥＡ
Ａ）のバッファー系を用いアセトニトリルの濃度勾配で
溶出させた。目的ピークを分取し、濃縮乾固後８０％酢
酸水ｌａ１！を加え、室温に２０分間放置した後、濃縮
乾固した。内容物を水に溶かし、再度逆相Ｃ１８カラム
を用いた高速液体クロマトグラフィーにより精製した。 （２）フラグメントの゛ 心 ヒト−アンジオジェニン遺伝子を第１図に示すように旧
ｎｄｍ部位でＡバートとＢバートに分けて構築した。 Ａバートについては５′−末端のフラグメントを除く６
本のフラグメント５００ｐ謡Ｏ１をリン酸化反応液５０
ｐｌ中、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ１０単位と１ｍ
ＭＡＴＰ溶液１．５μｌとを加え、３７℃で１時間加熱
した後、連結反応に用いた。さらにマＯ℃で３分間加熱
した後、連結反応に用いた。 Ａパートを構成する８本のフラグメントを２０ｐｍｏｌ
ずつ混合し、３分間加熱後、急冷し、再度７５°Ｃで１
０分間加熱した後、室温まで約２時間かけて徐冷するこ
とによりアニーリングした。これにＴ４ＤＮＡ リガー
ゼを含む溶液２０ｕ ｌ （６０ｍＭ Ｔｒｉｓ −Ｃ
２、ｐＨ７，５、５ｍＭ ＭｇＣ１ｔ、 ５■Ｍ
ＤＴＴ、 １ｔＭ ＡＴＰ）中において、１６℃
で一晩反応させた。 Ｂパートを構成する６本のフラグメントも同様にリン酸
化後、アニーリング及び連結反応させた。 反応後、水を加えて２００μ２とし、フェノール及びク
ロロホルムでタンパクを除き、冷エタノールで沈澱させ
、目的とするＡバート及びＢバートに対応する二重１１
ＤＮＡを得た。 （３） ヒ −アンジオジェニンへ のクロー
ニング クローニングベクターには大腸菌のプラスミドｐＵＣ１
８を用いた。 ｐＵｃ１８ ｌＯｕ ｇをＥｃｏＲ［３
０単位、Ｈｉｎｄｌｌ［３０単位を用いて３７”Ｃで２
時間消化した。これをアガロースゲル電気泳動に供して
ベクタ一部分を抽出し、フェノール抽出によりタンパク
を除き、エタノールで沈澱させた後、５０μｌのＴＥ！
ｌ衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃ１，ｐＨ８，０、１ｍ
ＭＥＤＴＡ）に溶解した。この溶液の５０ｎｇＯ相当量
に、上記（２）で得たＡパート及びＢパートに対応する
二重鎖ＩＩＮ＾を含む溶液Ｌｏｐ ｌ （６６ａ＋Ｍ
Ｔｒｉｓ−ＣＩ ５ｐＨ７，５，５ｍＭＭｇＣ／！＊、
５鵬Ｍ ＤＴＴ、 １ｍＭ ＡＴＰ 、 ３００単位Ｔ
４ ＤＮＡリガーゼ）を加え、１６°Ｃで一晩反応させ
た。この反応液を用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換
し、アンピシリン耐性のコロニーを得た。この形質転換
体からプラスミドＤＮＡを調製し、制限酵素による分解
パターン、さらにはＤＮＡシークエンシングを行い、ｐ
ＵＣ１８のＥｃｏＲＩと旧ｎｄｕｌとの間にＡバート及
びＢパートのフラグメントが挿入されたプラスくドｐＡ
にＮ−Ａ及びｐＡＧＮ−１’ｌが導入されていることを
確認した。 （４） ヒ −アンジオジエニン の上記ｐＡＧ
Ｎ−＾及びｐＡＧＮ−８各々ＩＯμｇ ＠ ＥｅｏＲＩ
３０単位、旧ｎｄ ＩＩＩ ３０単位を用いて３７℃
で２時間消化した。これをアガロースゲル電気泳動に供
して、約２２０ｂｐの＾バートと約１５０ｈｐのＢパー
トを抽出し、フェノール抽出によりタンパクを除き、エ
タノールで沈澱させた後、各々５００ｎｇ／μ℃になる
ようＴＢ緩衝液に溶解した。ＡパートとＢバートを含む
溶液をそれぞれ５μ君を含む溶液５０μｌ （Ｔｒｉｓ
・ Ｃｊ！、ｐＨ７，５，５ｍｌ’ｌ ＹＩｇＣｎｔ、
５ｍＭ ＤＴＴ、 １ｓＭ ＡＴＰ、 ３００単位Ｔ
４ＤＮＡリガーゼ）中において１６℃で一晩反応させ、
Ａバート乏Ｂバートを連結した０反応後、フェノール及
びクロロホルム抽出によりタンパクを除き、エタノール
で沈澱させた後、３０単位のＥｅｏＲＩを用いて３７℃
で２時間消化した。これをアガロースゲル電気泳動に供
し、ヒトーアンジオジエニン遺伝子に対感する約３７０
ｂｐのフラグメントを得た。このヒ叶−アンジオジェニ
ン遺伝子を増幅し、塩基配列を確認するためにｐｌＪｃ
１８へのクローニングを行った。 ｐＵｃＩＢ ５＃
ｇを２０単位のＲｅｏ ｆｌ １で消化した後、脱リ
ン酸化酵素（アルカリホスファターゼＢＡＰ） １単位
を含む溶液Ｓｏｕ Ｉ！、 （５００ｓ＋ＭＴｒｉｓ
・Ｃｆｆ１． ｐＨ９，０，１ｍＭ ＭｇＣｊ！ｇ
、１ ａｉＭ Ｚｒ＋Ｃｊ！ｇ）を加え、３７°Ｃで３
０分間反応させた。ツメノール抽出により除タンパクし
、冷エタノールで沈澱させた後、ＴＩ！緩衝液に溶解し
た。この溶液の５０ｒｉｇ相当量に上記３７０ｂｐのア
ンジオジュニン遺伝子５００ｎｇを含む溶液１０１１
Ｎ （６６ｄ Ｔｒｉｓ−（Ｊ！ 、 ｐＨ７，５，５
ｍＭ ＭｇＣＰ、ｚ、５ａＭ ＤＴＴ 、 １ｍＭＡＴ
Ｐ、 ３００単位Ｔ４ＯＮＡリガーゼ）を加え、１６℃
で一晩反史させた。この反応液を用いて大腸菌ＪＭ １
０９株を形質転換し、Ｘ−ｇａｌ（５ブロモ−４−クロ
ロ−３−インドリル−β−ガラクトシド）とＩＰＴＧ
（イソプロピル−β−ｐ−チオガラクトシド〉入りのア
ンピシリン含有ＬＢプレート上にまき、白色コロニーを
拾い、目的の組換え体プラスミドを持つ菌株を得た。こ
の形質転換体からプラスミドＤＮＡを調製し、制限酵素
による分解パターンからクローニングの方向を決定し、
塩基配列はサンガー等の方法で確認した。このようにし
てヒト−アンジオジェニン遺伝子が挿入されたプラスミ
ドをｐＡＧＮ １と命名した。（第３図）（５）発韮と
じシ吐二Ｑ摘−製 第４図に示すように市販のプラスミドｐ■２２３３（フ
ァルマシア社製〉５μｇを制限酵素Ｐｖｕ Ｉ ２０単
位及びＮｒｕＩ２０単位で切断し、ｔａｃプロモーター
及びｒｒｎＢター電ネータネ−ター１８２１ｂ、のフラ
グメントをアガロースゲル電気泳動により回収した。 またプラスミドｐ［Ｉｃ１８ ５μｇを制限酵素Ｐｖｕ
１２０単位及びＰｖｕｎ ２０単位で切断し、複製開始
点（Ｏｒｉ）を含んでいる１４３８ｂｐのフラグメント
をアガロースゲル電気泳動により回収した。これらのフ
ラグメント１１００ｎずつを１０ｕＩｌの反応液（６６
−Ｔｒｉｓ ・Ｃｌ 、、ｐＨ１，５，５ａｉＭ Ｍｇ
Ｃ１２ｚ、５ｍＭ ＤＴＴ、 １ａｉＭＡＴＰ、 ３０
０単位Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ）中において１６°Ｃで一
晩反応させた。この反窓液を用いて大腸菌卸１０９株を
形質転換し、β−ラクタマーゼ遺伝子が再構築されたア
ンピシリン耐性のコロニーを得た。 この形質転換体からプラス改ドＤＮＡを調製し、制限酵
素による分解パターン及びコピー数の増幅を指標にして
ｐ■２２３−３のｔａｃプロモーターとｐＵｏｌＢのＯ
ｒｉを有する発現ベクターを得た。このプラスミドの塩
基配列はサンガー等の方法で確認し、ｐＭＫ２と命名し
た。次にプラスミドｐＭＫ２５μｇを２０単位のＥｃｏ
Ｒ■で切断し、脱リン酸化酵素（アルカリホスファター
ゼＢＡＰ） １単位を含む溶液５０μｌ（５００ｍＭ
Ｔｒｉｓ−Ｃ１，ｐＨ９，０、ｌｄ Ｍｇｃｇ、 、
１ｓＭＺｎＣ１２１）を加え、３７℃で３０分間反応さ
せた。フェノール抽出により除タンパクし、冷エタノー
ルで沈澱させた後、ＴＢ緩衝液に溶解した。また前述の
プラスミドｐＡＧＮ１１０μｇを３０単位のＢｅｏ Ｉ
で消化後、アガロースゲル電気泳動によりアンジオジエ
ニン遺伝子を回収した。上記処理後のプラスミドｐＭＫ
２５０ｎｇに、このアンジオジュニン遺伝子フラグメン
ト５００ ｎｇを含む溶液１０μＮ （６６ｄ Ｔｒｉ
ｓ ＝Ｃｊ！、ｐＨ７，５，５＋＋＋Ｍ ＭｇＣ１，＊
、５ｍＭ ＤＴＴ 、 ｌｄ ＡＴＰ 、 ３００単位
Ｔ４ ＤＮＡ リガーゼ）を加え、１６℃で一晩反応せ
た。この反応液を用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換
し、目的のアンジオジェニン発現ベクターを持つ菌株を
得た。この形質転換体からプラスミドＤＮＡを調製し、
制限酵素による分解パターンからクローニング方向を決
定し、正しい方向にクローン化されたアンジオジェニン
発現ベクターヲｐＭＡＧＮ１とした。尚、この発現ベク
ターにより形質転換された菌株は、Ｅ、ｃｏｌｉＪＭ１
０９ ｐＭＡＧＮ １ （微工研条寄第２５０４号）と
して寄託されている。 実施例２ ベ − ＭＴＡＧＮ の 第６図に示すように上記プラスミドｐＭＫ２１０μｇを
制限酵素Ｅｃｏ ＲＩ ３０単位及びＥｃｏ ４７ｍ３
０単位で切断し、ｔａｃプロモーターを含む断片を除去
し、複製開始点を含む２９８０ｂｐの断片をアガロース
ゲル電気泳動によって回収した。一方、第２図に示した
ｔｒｐプロモーターの塩基配列をＴＲＰ １とＴＲＰ
２とに分割してＤＮＡ合威合成台底した。 これらを逆相Ｃ１８カラムを用いた高速液体クロマトグ
ラフィーにより精製し、各々１００１００ｐをアニーリ
ングして二重＠ ＤＮＡを得た。この断片と前記ｐＭＫ
２ ＥｃｏＲ１及びＥｃｏ ４１ｍで消化した断片とを
Ｔ４ＤＮＡ リガーゼにより１６℃で一晩反応させた。 この反応液を用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、
ｔｒｐプロモーターとＰＭに２の複製開始点（Ｏｒｉ）
を有する発現ベクターを得た。このプラスミドの塩基配
列はサンガー等の方法で確認し、ｐｎｒ ｉと命名した
。このｐＭＴ １５ｕｇを２０単位のＥｃｏＲｌで消化
した後、アルカリホスファターゼ１単位を含む溶液５０
μｌを加え、３７°Ｃで３０分間反応させた。フェノー
ル抽出により除タンパクし、冷エタノールで沈澱させた
後、ＴＥ緩衝液に溶解した。このフラグメント５０ｎｇ
と前記アンジオジェニン遺伝子５００ｎｇをＴ４ＤＮＡ
リガーゼにより１６°Ｃで一晩反応させた。 この反応液を用いて大ＩＪｉｉｉｉＪＭ１０９株を形質
転換し、アンジオジェニン発現ベクターを持つ菌株を得
た。 この形質転換体からプラスミドＤＮＡを調製し、制限酵
素による分解を行いクローニング方向を決定し、正しい
方向にクローン化されたプラスミドをｐＭＴＡＧＮ １
とした。尚、この発現ベクターにより形質転換された菌
株は、Ｅ、ｃｏｌｉ ＪＭ１０９ ｐＭＴＡＧＮ １
（微工研条寄第２５２４号）として寄託されている。 実施例３ ヒ −アンジオジェニンの 上記の発現ベクターｐＭＡＧＮ １により形質転換され
た大腸菌Ｅ、ｃｏｌｉ ＪＭ１０９株を５０ ｔｔ ｇ
／ ｄのアンピシリンを含むＬＢ培地（バクトドリプト
ン１０ｇ／ ｔ、バクトイ−ストエキストラクト５ｇ＃
！、ＮａＣｊ！ １０ｇ／ｉ！、、ｐＨ７，５）で培養
した。−晩培養後、培養液１ｍを集菌し、レムリのサン
プル緩衝液に懸濁し、加熱溶解後、ＳＤＳポリアクリル
アミドゲル電気泳動に供した。泳動後、クマシーブリリ
アントブルーにより染色し、脱色したところ、分子量約
１４．０００の位置にアンジオジェニンの発現が確認さ
れた。 電気泳動したゲルをデンシトメーターにかけ発現効率を
調べた。その結果、ヒト−アンジオジェニンは全菌体蛋
白質の約１０〜２０％の発現を示し、培地ｌｊ！当たり
６０−１２０ｇの生産量であった。またプラスミドＩ）
ＭＴＡＧＮ １により形質転換された大腸Ｅ。 ｃｏｌｔ ＪＭ１０９株を５０ ａ ｇ／−のアンピシ
リンを含むＭ９培地（グリコース５ｇ／ ｌ 、カリξ
）酸５ｇ／ ｊ！ 。 ＮａｘＨＰＯａ ６ｇ／ｌ、 ＫｌｌｚＰＯ４３ｇ／
ｊ！５ＮａＣＩ Ｉｇ／ｊ！、チアミン塩酸塩ｌＯ■／
１２ 、１ｍＭ Ｍｇ５Ｏａ 、１００μＨＣａＣｌ
宜、トリプトファン５０ｗｇ／ ｌ ５ｐＨ７，２）
で培養した。その結果ヒトーアンジオジエニンの発現量
は全菌体蛋白質の約７％であり、培地１７！当たりの生
産量は３０ｍｇ／ｊ！でｐＭＡＧＮ １と比較すると低
い値であった。一方大量培養系に移すと発現量は多くな
り、発現量は２００［／ｊ！を示した。実施例２のプラ
スミドｐＭＴＡＧＮ １が挿入された大腸菌は大量培養
や高密度培養に適している。なお、大腸菌Ｈ８１０１株
にｐＭＴＡＧＮ １を組込むとヒト−アンジオジェニン
は発現したが、その発現量はＪＭ１０９株を用いたとき
よりも低く、宿主により発現量に差があり、この点から
みて大腸菌ＪＭ １０９株はヒト−アンジオジェニンの
発現に好適な宿主であるといえる。
本発明は、ｔａｃプロモーターまたはｔｒｐプロモータ
ーのフラグメントとプラスミドｐＵｃ１８の複製開始点
（ＯｒＯを含むフラグメントとヒト−アンジオジェニン
のアａ）酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡと
を含むヒト−アンジオジェニン発現ベクターを用いてヒ
トーアンジオジ玉ニンを発現するようにしたため、発現
量を著しく向上でき、ヒトーアンジオジＩニンを大量に
、しかも安価に、効率よく生産することがで色るｔいう
格別の効果を奏する。
ーのフラグメントとプラスミドｐＵｃ１８の複製開始点
（ＯｒＯを含むフラグメントとヒト−アンジオジェニン
のアａ）酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡと
を含むヒト−アンジオジェニン発現ベクターを用いてヒ
トーアンジオジ玉ニンを発現するようにしたため、発現
量を著しく向上でき、ヒトーアンジオジＩニンを大量に
、しかも安価に、効率よく生産することがで色るｔいう
格別の効果を奏する。
第１図は、ヒト−アンジオジェニンの好ましい塩基配列
の例を、第２図Ａはｔａｅプロモーターの又、第２図Ｂ
は、ｔｒｐプロモーターを含む塩基配列の好ましい例を
それぞれ示す、また、第３図は、ヒト−アンジオジェニ
ン遺伝子を調製する過程の概略を示す、第４図は、プラ
スミドｐＭＫ ２を、第５図は、プラスミドｐＭＡＧＮ
１を、第６図はプラスミドｐＭＴＡＧＮ １をそれぞ
れ調製する過程の概略を示した図である。
の例を、第２図Ａはｔａｅプロモーターの又、第２図Ｂ
は、ｔｒｐプロモーターを含む塩基配列の好ましい例を
それぞれ示す、また、第３図は、ヒト−アンジオジェニ
ン遺伝子を調製する過程の概略を示す、第４図は、プラ
スミドｐＭＫ ２を、第５図は、プラスミドｐＭＡＧＮ
１を、第６図はプラスミドｐＭＴＡＧＮ １をそれぞ
れ調製する過程の概略を示した図である。
Claims (2)
- （１）ｔａｃプロモーターまたはｔｒｐプロモーターの
フラグメントとプラスミドｐＵＣ１８の複製開始点（Ｏ
ｒｉ）のフラグメントとヒト−アンジオジェニンのアミ
ノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡとを含む
ことを特徴とするヒト−アンジオジェニン発現ベクター
。 - （２）ｔａｃプロモーターまたはｔｒｐプロモーターの
フラグメントとプラスミドｐＵＣ１８の複製開始点（Ｏ
ｒｉ）のフラグメントとヒト−アンジオジェニンのアミ
ノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡとを含む
ベクターを大腸菌に形質導入してヒト−アンジオジェニ
ンを発現させ、これを採取することを特徴とするヒト−
アンジオジェニンの製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP21244289A JPH0376579A (ja) | 1989-08-18 | 1989-08-18 | ヒト‐アンジオジェニン発現ベクター及びヒト‐アンジオジェニンの製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP21244289A JPH0376579A (ja) | 1989-08-18 | 1989-08-18 | ヒト‐アンジオジェニン発現ベクター及びヒト‐アンジオジェニンの製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0376579A true JPH0376579A (ja) | 1991-04-02 |
Family
ID=16622681
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP21244289A Pending JPH0376579A (ja) | 1989-08-18 | 1989-08-18 | ヒト‐アンジオジェニン発現ベクター及びヒト‐アンジオジェニンの製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0376579A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0687731A1 (en) | 1990-11-08 | 1995-12-20 | Japan Energy Corporation | Secretion vector, transformed microorganisms containing said vector and manufacture of products from said microorganism |
-
1989
- 1989-08-18 JP JP21244289A patent/JPH0376579A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0687731A1 (en) | 1990-11-08 | 1995-12-20 | Japan Energy Corporation | Secretion vector, transformed microorganisms containing said vector and manufacture of products from said microorganism |
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