JPH0381294A - エリスロポイエチンペプチドおよびこれらに対する抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〈産業上の利用分野〉 本発明は、エリスロポイエチン（ＥＰＯ）ペプチドおよ
びエピトープ特異性抗ＥＰＯ抗体の調製のためのそれら
の使用に間する。本発明は、さらにポリクローナル抗体
（抗血清）またはモノクローナル抗体であってもよいエ
ピトープ特異性抗ＥＰＯ抗体に間する。さらに、本発明
は、ＥＰＯ５ＥＰＯ誘導体またはＥＰＯペプチドの精製
のためのエピトープ特異性抗ＥＰＯ抗体の使用に関する
。

さらに、本発明は、ＥＰＯリセブター領域を模した抗イ
ディオタイプ抗体に関する。最後に、本発明は、ＥＰＯ
の検出、好ましくはエピトープ特異性の検出、上記ＥＰ
Ｏペプチド、抗ＥＰＯ抗体または抗イディオタイプ抗体
を含む医薬物およびＥＰＯまたは抗ＥＰＯ抗体の検出の
ための診断的補助物のためのエピトープ特異性抗ＥＰＯ
抗体の使用に間する。

〈従来の技術〉 エリスロポイエチン（ＥＰＯ）は、１６６個のアミノ酸
を有し、アミノ酸の位置２４．３８．８３および１２６
のグリコジル化（ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｒ＋）部位
を有する、分子盟約３４，０００である糖タンパク質ホ
ルモンである。これは、最初は２３個のアミノ酸のシグ
ナルペプチドを有する前駆体タンパク質として産生され
る。ＥＰＯは、赤血球前駆細胞の有糸分裂および分化を
刺激して、その結果、赤血球の産生を確実にする。これ
は、低酸素状態が優勢になると腎臓で産生される。赤血
球前駆細胞のＥＰＯ誘導性分化の間、グロビン合成の誘
導およびヘム複合体の合成およびフエリチンリセブター
の数の増加がある。これによって、細胞はより多くの鉄
を取り込んで機能性ヘモグロビンを合成することが可能
になる。成熟赤血球中のヘモグロビンは酸素を結合する
。このように、赤血球およびそれらに含まれるヘモグロ
ビンは、生体への酸素供給において重要な役割を果たす
。記述されてきた複雑な工程は、ＥＰＯと適当なりセブ
ターとの赤血球前駆細胞の細胞表面上における相互作用
によって始まる（Ｇｒａｂｅｒおよびにｒａｎｔｚ：　
Ａｎｎ。

Ｒｅｖ、　Ｍｅｄ、　２９．５１〜６６．１９７８を参
照されたい〉。

ＥＰＯは、ヒト尿（例えば、Ｍｉｙａｋｅら：Ｊ。

Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　２５２．５５５Ｂ−５５６４
，１９７７を参照されｋい）などの天然源から単離でき
るし、遺伝子工学的方法（例えば、ＥＰ−Ａ２１４８６
０５を参照されたい）によって調製することもできる。

腎不全症の患者はＥＰＯを産生ずることができず、した
がって、貧血症になる。組換えＥＰＯを投与することに
よって、このＥＰＯの不十分な供給を補填するおよび貧
血症状を軽減させる試みが既に成功している（Ｔｈｅ　
Ｌａｎｃｅｔ、、Ａｐｒｉｌ　４．１９８７「エリスロ
ポイエチンＪ　、７８１〜７８２、Ｅｓｃｈｂａｃｈら
：　Ｔｈｅ　Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｊｏｕｒｎａｌ
　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　３１６．７３−７８．１９
８７を参照されたい）。これにもかかわらず、ＥＰＯと
そのリセブターとの相互作用の機構に間してはまだほと
んど知られていない、しかし、ＥＰＯに対する特異性抗
体の使用は、ＥＰＯ分子の免疫学的および機能的特徴の
双方を確立するよい機会を提供するであろう。さらに、
ＥＰＯ調節の障害は、中和抗体またはＥＰＯリセブター
に結合しているＥＰＯペプチドを用いて治療されるかも
しれない、これに関連して、ペプチドは、例えば合成な
どによって、より容易に調製することができることから
、完全なＥＰＯ分子を用いるよりはむしろＥＰＯペプチ
ドを用いることが有利である。

位置１〜２６．４０〜５９．８０〜９９．９９〜１１Ｂ
、１１〜１２９．１３１〜１５０および１４７〜１６６
に対応するＥＰＯペプチドおよびこれらＥＰＯペプチド
のいくつかに対する抗体は、既にＳｙｔｋｏｗｓｋｉお
よびＤｏｎａｈｕｅ　（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　ＣｈｅＩｌ
ｌ。

２６２．１１６１〜１１６５．１９８７）によって開示
されている。

ＥＰＯの生物学的活性を中和することができた抗体は、
Ｓｙｔｋｏｗｓｋ　ｉおよびＤｏｎａｈｕｅによって、
位置９９〜１１Ｂおよび１１１〜１２９に対応するＥＰ
ＯペプチドについてのみＷ＠製されている。彼らは、こ
のことから、（単一の）リセブター結合領域がＥＰＯの
アミノ酸位置９９〜１２９に位置していると結論づけて
いる。これに間違して、ＥＰＯペプチドが免疫化のため
のキャリアにゲルタールアルデヒド残基を介して結合さ
れていることを想起せねばならない。ＥＰ−Ａ２１４８
６０５には、遺伝子工学によるＥＰＯおよびその誘導体
の調製の他に、位置１〜２０Ｓ４１〜５７．１１６〜１
２８および１４４〜１６６を含むＥＰＯペプチドが記述
されている。これらＥＰＯペプチドに対するポリクロー
ナルウサギ抗体もまた記述されている（ＥＰ−Ａ２１４
８，８０５．９０頁を参照されたい）。

しかし、ＥＰＯペプチド１１６〜１２８に対する抗体は
、ＥＰＯと反応しない、いかなる中和抗体またはＥＰＯ
のリセブター領域に対する抗体も、ＥＰ−Ａ２１４８，
６０５には記載されていない。

〈発明が解決しようとする課題〉 このように、本発明が基づく技術的課題は、ＥＰＯのざ
らなる機能的および免疫学的特徴の決定を可能にする新
規のＥＰＯペプチドを提供することである。さらに、本
発明の目的は、ＥＰＯリセブターに結合して、したがっ
て、ＥＰＯ脚節の障害を治療するために適している新規
のＥＰＯペプチドを提供することにある０本発明が基づ
くさらなる技術的課題は、ＥＰＯの検出およびＥＰＯ機
能の障害の治療に適している該ＥＰＯペプチドに対する
抗体を提供することである。

上記の技術的課題は特許請求の範囲に記述される態様を
提供することによって解決される。

〈発明の具体的説明〉 したがって、本発明は、天然ＥＰＯのアミノ酸位置番号
に対応するアミノ酸位置１〜３５（Ｐ４）、７〜２３　
（Ｐ４／１）、４４〜７Ｂ　（Ｐ３）、５２〜６３　（
Ｐ３／１）、７４〜１０９（ＰＩ）、８４〜９５．（Ｐ
Ｉ／１）、９３〜１３７（Ｐ５）、１１０〜１２３　（
Ｐ５／１）、１４２〜１６６（Ｐ２）または１５２〜１
６６　（Ｐ２／１）を本質的に含むＥＰＯペプチドに間
する。本発明によるＥＰＯペプチドＰＩＳＰＩ／１、Ｐ
３およびＰ３／１は、免疫原性が高く、高力価（タイタ
ー）のエピトープ特異性抗ＥＰＯ抗体の調製を可能にす
る。ＥＰＯペプチドＰ２およびＰ２／１は、驚異的に中
和抗ＥＰＯ抗体の調製を可能にする。本発明によれば、
これらＥＰＯペプチドは、以前には同定されなかった他
のりセブター領域を表すと考えられる。したがって、本
発明によるこれらＥＰＯペプチドは、ＥＰＯｉ節の障害
の治療にとくに適している。ＥＰＯペプチドＰ４および
Ｐ４／ｌも同様に高い免疫原性を示す。この領域におけ
るヒトＥＰＯとサルおよびネズミＥＰＯとの１００％の
相似性から、本発明によるこれらＥＰＯペプチドに対す
る抗体は、単なるヒトＥＰＯの検出以外にも適している
。本発明によるＥＰＯペプチドＰ５およびＰ５／１は、
例えばウェスタンプロットにおける天然および部分的に
変性したＥＰＯの検出に用いることができる抗ＥＰＯ抗
体の調製に適している。これらＥＰＯペプチドは、５ｙ
ｔｋｏｖｓｋｉおよびＤｏｎａｈｕｅ　（前出）によっ
て既に記述されているリセブター領域にある。

ペプチドＰ２、Ｐ４およびＰ５は、とくに、天然に生じ
るＥＰＯ分子上の対応するエピトープとよく似ている。

なぜならば、これらＥＰＯペプチドと反応する特異性抗
体は、例えば、ＥＬ　Ｉ　ＳＡまたはウェスタンプロッ
トなどにおける天然のＥＰＯの検出に適しているからで
ある。

本発明によるペプチドは、天然のＥＰＯまたは遺伝子工
学的によるＥＰＯの化学的または酵素的切断によって調
製することができる。これらは、さらに、遺伝子工学的
にまたは合成によって直接に調製することもできる０本
発明によれば、合成的調製が好ましい。

好ましい態様において、本発明によるＥＰＯペプチドＰ
Ｉ、ＰＩ／１、Ｐ３、Ｐ３／１、Ｐ４、Ｐ４／１、Ｐ５
またはＰ５／１は、次のようなアミノ酸配列を有する。

Ｐｉ　　　ＶＬＲＧＱＡＬＬＶＮＳＳＱＰＷＥＰＬＱＬ
Ｈ’ＶＤＫＡＶＳＧＬＲ５ＬＴＴＬＬ；Ｐｉ／Ｉ　５Ｓ
ＱＰＷＥＰＬＱＬ）ｒＶ；５ ＬＨＶＤＫＡＶＳＧＬＲ５Ｉ、ＴＴＬＬＲＡＬＲＡＱＫ
ＥＡＩＳＰＰＤＡＡＳＡＡＰＬＲＴＸＴＡＤＴ　；また
は Ｐ５／Ｉ　ＦＲＫＬＦＲＲＡＬＲＡＱＫＥＡ工５ＰＦＤ
とくに好ましい態様において、ＥＰＯペプチドＰ２およ
びＰ２／１は、次のようなアミノ酸配列を有する。

ｐ２　　　　　　　　　　ＹＴＧＥＡＣＲＴＧＤＲまた
はＰ２／Ｉ　ＫＩＸＬＹＴＧＥＡＣＲＴＧＤＲ本発明に
よるＥＰＯペプチドは、エピトープ特異性抗ＥＰＯ抗体
の調製に用いることができる。

これらペプチドは、高度精製物の利点を提供し、これは
、各免疫化において再現的に定義された（　ｒｅｐｒｏ
ｄｕｃｉｂ！ｙ　ｄｅｆｉｎｅｄ）高い力価の抗血清を
誘導する免疫原として、有効とされる。

本発明によるＥＰＯペプチドは、ポリクローナルエピト
ープ特異性抗ＥＰＯ抗体（抗血清）およびモノクローナ
ルエピトープ特異性抗ＥＰＯ抗体の双方の調製に用いる
ことができる。これら抗体は既知の方法で調製される。

しかし、本発明によれば、ＥＰＯペプチドは、好ましく
は、システィン残基を介して免疫化のためのキャリア材
料と結合する。ＥＰＯペプチドがシスティン残基を含ま
ない場合には、通常の方法で付ける。

本発明は、さらに、本発明によるＥＰＯペプチドを用い
て調製することができるエピトープ特異性抗ＥＰＯ抗体
に間する。これら抗ＥＰＯ抗体は、特定のＥＰＯエピト
ープまたはＥＰＯ領域に対して有利に向けられている。

これによって、これらを、正常ＥＰＯ力価または治療中
のＥＰＯ力価のエピトープ特異性検出を行うために分析
系において採用することが可能になる。

本発明によるエピトープ特異性抗ＥＰＯ抗体は、ポリク
ローナル抗体（抗血清）またはモノクローナル抗体であ
る。本発明によるポリクローナル抗体は本発明によるＥ
ＰＯペプチドを用いて調製されることから、これらの調
製は再現性があり、明確に決められて高力価である。し
たがって、これらは有効とされる全てのＥＰＯ検出系に
おける使用にきわめてとくに適している。

他の態様において、本発明は、上記の抗ＥＰＯ抗体の結
合部位に対するおよびＥＰＯリセブター領域を模した抗
イディオタイプ抗体に間する。これら抗イディオタイプ
抗体は、細胞性ＥＰＯリセブターに結合する。これら抗
イディオタイプ抗体は、好ましくは、抗Ｐ２または抗Ｐ
２／１抗体の結合領域に対して向けられる。

本発明による好ましい態様において、エピトープ特異性
抗ＥＰＯ抗体は、ＥＰＯの生物学的な活性を中和する。

本発明の他の好ましい態様において、上記の抗イディオ
タイプ抗体は、ＥＰＯリセブターを有する細胞を認識し
て、影響する。

本発明による他の態様において、本発明によるエピトー
プ特異性抗ＥＰＯ抗体は、ＥＰＯ１ＥＰＯ誘導体または
ＥＰＯペプチドのＭｉ！に用いられる。関連する精製工
程は、例えば、免疫吸着クロマトグラフィーやアフィニ
ティークロマトグラフィーなどの、通常のクロマトグラ
フィーの形態をとる。本発明によるエピトープ特異性抗
ＥＰＯ抗体は、適宜、この目的のためのクロマトグラフ
ィーに適したキャリアー素材と結合する。

本発明は、また、ＥＰＯの検出、好ましくはＥＰＯのエ
ピトープ特異性の検出、のための本発明によるエピトー
プ特異性抗ＥＰＯ抗体の使用に間する。抗体は、また、
ＥＰＯ変異体（ｍｕｔｅｉｎｓ）の識別検出のために用
いることができる。そのようなＥＰＯ変異体は、例えば
、−次構造、すなわち、それらのアミノ酸配列において
修飾することができる。特異的にそのようなＥＰＯ変異
体と反応する抗ＥＰＯ抗体を、適当に適応させたＥＰＯ
ペプチドを用いて、前に示したようにして調製すること
ができる０本発明は、とくに、本発明によるＥＰＯペプ
チド、エピトープ特異性抗ＥＰＯ抗体および／または抗
イディオタイプ抗体を含む診断補助物に間する。

他の態様において、本発明は、少なくとも一つの本発明
によるＥＰＯペプチドを含むまたは本発明のエピトープ
特異性抗ＥＰＯ抗体を含む、医薬物に間する。これら医
薬物は、好ましくは、細胞性ＥＰＯリセブターをブロッ
クするＥＰＯペプチドを含む、他の好ましい態様におい
て、本発明による医薬物はＥＰＯの生物学的な活性を中
和する本発明によるエピトープ特異性抗ＥＰＯ抗体を含
む。また、医薬物は、適宜、薬剤学的に許容される補助
物および添加物を含む。

ＥＰＯ調節の障害は、本発明の該医薬物によって治療す
ることができる。

ペプチドを、好ましくは、ポリスチレンマトリックス（
ジビニルベンゼンと１％交交差台したもの）上での固相
法によって調製した。機能基（−Ｎ　Ｈ２）のポリスチ
レンマトリックスの負荷は、好ましくは、−０，４〜０
．８　ｍ＋ｉｏｌ／　ｇマトリックスであった。ペプチ
ドは塩基不安定性Ｆｍｏｃ基を用いて調製したので、ア
ンカー分子としてはｐ−アルコキシベンジルエステルを
用いた。一般に、ジクロロメタンおよびジメチルホルム
アミドを、例外的にはＮ−メチルピロリドンを、合成中
に用いた。洗浄液および反応液の量は、約１５ｍ１が好
ましい。アミノ酸のα−Ｎ８２基をＦｍｏｃ基によって
保護したことから、次の保護基を三官能性アミノ酸の側
鎖として選択した。

セリン、スレオニン、チロシン ｔｅｒｔ、−ブチルエステル グルタミン酸、アスパラギン酸 ｔｅｒｔ、−ブチルエステル アルギニン　　　４−メトキシ−２，３，６−ドリメチ
ルフエニルースルフオニル システィン　　　ｔｅｒｔ、−ブチルメルカプトリジン
　　　　　ｔｅｒｔ、−ブチルオキシカルボニルアミノ
酸を、好ましくは、活性エステルを介して、結合させて
、ＨＯＢｔ／ジイソプロピルカルボジイミドによってそ
こで活性化することは、とくに好ましい。

反復性のα−ＮＨ２保護基除去を、塩基、好ましくはＤ
ＭＦ中の２０％ピペリジンを用いて、室温で行った。

樹脂を、これら各反応段階、結合または脱ブロッキング
、の後にＤＭＦおよびイソプロピルアルコールで洗浄し
た。酸分解（ａｃｉｄｏｌｙｓｉｓ）の結果、側鎖基か
ら保護基がまたマトリックスからペプチドが、同時に除
去された。これは、好ましくは、トリフルオロ酢酸およ
びエタンジチオールの混合物（９：Ｌ　　ｖ／ｖ）を用
いて行われた。システィンのスルフヒドリル基を、メル
カプト基を有する物質、例えば、ジチオスレイトールま
たはブチルフォスフイン、によって遊離させた。

合成ペプチドをその化学組成および純度について調べた
。ペプチドの組成をアミノ酸分析によって決定した。こ
の目的のために、少量のサンプルを６Ｎ塩酸を用いてフ
ェノールの存在下で１１０℃で２４または７２時間加水
分解して、個々のアミノ酸を定量的に決定した。ペプチ
ド含有量は約８５％であった。ペプチドを、適宜、ＲＰ
−ＨＰＬＣ（逆相高速液体クロマトグラフィー）を用い
て既知の方法で精製した。ペプチドの純度を、０１８逆
相カラム上でのＨＰＬＣによって決定した。この目的の
ために、燐酸塩／アセトニトリル勾配を用いて、８５％
以上の純度を見出した。

ペプチドのキャリア分子への結合 ペプチドを、好ましくは、システィン残基を介して高分
子量キャリアタンパク質、例えばアルブミンまたは卵ア
ルブミン、好ましくは鍵穴アオガイ（ｋｅｙｈｏｌｅ　
ｌ１ＩＩｐｅｔ）ヘモシアニン（ＫＬＨ）に結合させた
。結合は、システィンのメルカプト基とのチオエーテル
結合を介して行われた。この型の結合は、ペプチドが定
義されたやり方でキャリアタンパク質に結合されるとい
う利点を有する。

ペプチドがシスティン残基を含まない場合には、システ
ィン残基を付けた。

セファロース樹脂へのペプチドの結合 ペプチドを、臭化シアンで活性化したセファロースを用
いる標準工程によってセファロースに結合させた。

血胤五Ω１１ ウサギの免疫化 ＥＰＯペプチドに特異的な抗体を産生ずるために、ペプ
チド−ＫＬＨ抱合体をアジュバントと乳化して、５週間
免疫化法に従ってウサギに注射した。

この期間の後、動物は特異性抗体を生産しており、放血
させた。

特異的抗体の検出 固相ＥＬ　Ｉ　ＳＡを、血清のペプチドまたはＥＰＯ特
異性についての分析に用いた。抗血清中またはアフィニ
ティークロマトグラフィーによって精製しておいた抗体
画分中のペプチド特異性およびＥＰＯ特異性抗体の含有
量を、精ｉ！ＥＰＯまたはＥＰＯペプチドで被覆された
プラスチック製マイクロタイタープレート中で、酵素結
合抗つサギーＩｇ抗血清を用いて、決定した。これと平
行して、抗体をウェスタンプロット中で調べて、３４〜
３８ｋＤａの特異性ＥＰＯバンドを検出した。

中和抗体の決定 クリスタル（にｒｙｓｔａｌ）増殖試験（Ｅｘｐ、　Ｈ
ｅｍａｔｏｌ。

７．６４９−６６０．１９８３）を用いて、ｒｈｕＥＰ
ｏ−特異性またはｒｈｕＥＰｏペプチド−特異性抗血清
について中和する性質を調べた。雌ＮＭＲｌマウスに４
８ｍｇ／ｋｇのフェニルヒドラジン次亜塩素酸塩（ｐｈ
ｅｎｙｌ−ｈｙｄｒｏｚｉｎｅ　　ｈｙｐｏｃｈｌｏｒ
ｉｄｅ）を三日続けて注射した。最後の注射の４８時間
後に、動物の牌臓を除去して、単一細胞懸濁液を調製し
た。赤血球前駆体細胞を、フィコール勾配（Ｄ＝１．０
７７）によって濃厚富化した０ｗ１胞の増殖を誘導する
ために、３Ｘ１０５ｉ［胞／ウェルを９６ウエルマイク
ロタイタープレート中で０　、１　ｐｎ＋ｏｌ／ｍｌの
ｒｈｕＥ　Ｐ　Ｏとインキュベートした。阻害試験を行
うために、ＥＰＯを抗血清の希釈物と前培養してから増
殖試験に用いた。

エピトープ特異性抗体を、標準法によって精製した。す
なわち、ＰＢＳに対して透析しておいた硫安沈澱から抗
体をセファ０−スに一晩吸着させて、非結合物をｐＨ７
，０のＰＢＳで洗い出してから次いで、特異性抗体をｐ
Ｈ２，５の水性酸（ａｑｕｅｏｕｓ　ａｃｉｄ）で溶出
した。溶出液を固体燐酸ナトリウムで直ちにｐＨ７，０
に中和して、ＰＢＳに対して透析した。

セファロース樹脂へのエピトープ特異性抗体の結合 エピトープ特異性抗体を、臭化シアンで活性化したセフ
ァロースへ標準方法で結合させた。

アフィニクロマトグラフィーによるエリスロポイエチン
の精製 細胞培養上清からのエリスロポイエチンを、エピトープ
特異性抗体カラムに吸着させて、生物学的活性の損失な
しで、通常の工程でｐＨをｐＨ７〜８からｐＨ２〜３に
変化させることによって溶出することができた。

以下の諸例は本発明を説明するものである。次の略号が
ここで用いられる。

ｔ　−Ｂ　ｕ　　　ｔｅｒｔ、−ブチルエーテルＭｔｒ
　　　４−メトキシ−２，３，６−）リメチルフェニル
スルフォニル ジメチルホルムアミド ヒドロキシベンゾトリアゾル ｔｅｒｔ、−ブチルオキシカルボニル フルオレニルメトキシカルボニル γ−マレイミド酪酸Ｎ−ヒドロキシ サクシニミドエステル ＤＭＦ ＯＢ　　ｔ Ｂｏｃ Ｆｍｏｃ ＭＢＳ 例」− 免疫化抗原のｖ４製 ａ）ペプチド（Ｐ　２／　１　’）の合成ペプチドを完
全自動ペプチド合成機を用いて合成した。保護基を、Ｉ
ｇのＦｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｍｔｒ＞−ｐ−アルコキシベン
ジル−エステル−樹脂から１５ｍ１の２０％ピペリジン
／ＤＭＦ　（ｖ／ｖ）で除去して、次いで、ＤＭＦおよ
びイソプロパツールで数回洗浄した＊　　１ｍｍｏｌの
Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ｔ−Ｂｕ）（３倍過剰量）および１
５＋ｏｌのＤＭＦに溶解した２０３ｓｇ（７）ＨＯＢｔ
を加えた。１．１ｍｌの１Ｍジイソプロピルカルボジイ
ミド溶液（ジクロロメタン）を加えた後、１．５時間結
合を行った。過剰の試薬をＤＭＦのイソプロパーノール
溶液で洗浄して除いた。この結合のやり方をＮ末端アミ
ノ酸まで維持した＊　Ｂｏｃ−保護アミノ酸を最終アミ
ノ酸として採用した。各結合段階が完了したかどうかを
ニンヒドリン試験によって調べた。

１．０６ｇの樹脂を２−５ｍ１のチオアニソール、２．
５ｍｌのエタンジチオールおよび１５ｓｌのトリフルオ
ロ酢酸とともに３５℃で４時間攪拌して、濾過した。酸
溶液をエーテル中に注いで、沈澱したペプチドを濾過し
て、セファデックスＧ２５カラム（３Ｘ１００ｃｍ、０
．５％酢酸）上のクロマトグラフィーに供した。ペプチ
ドブールを凍結乾燥した。収量は２３０　ｍｇであった
。

ｂ）スルフヒドリル基の遊離 ７０ｍｇのペプチドを、７ｍｌのトリフルオロエタノー
ルおよび３５０　）ｔ　ｌの水に溶解して、Ｎ−メチル
モルフォリンでｐＨを７．３に調整した。反応器を窒素
で充満させて、４０μｍのトリー〇−ブチルホスフィン
を加えた。混合物を室温で１時間攪拌して、５０ｍ１の
水で希釈して、Ｉ）Ｈを４９．Ｏに調整した。水相を１
０ｎ＋ｌのジメチルエーテルで３回抽出して、１０ｍ１
に濃縮してから、セファデックス０２５　（３Ｘ３００
ｃｍ、０−５％酢酸）上でｗｉ製した。２Ｎ［結乾燥後
、５６ｍｇのペプチドが得られた。

Ｃ）抱合体調製 ３０ｍｇのＫ　Ｌ　Ｈ（ｋｅｙｈｏｌｅ　Ｉｉｍｐｅｔ
　ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）を、０−０５１１１ＲＩＯ１
／ｌの燐酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８，０）に溶解して
、：３ｎｇのＣＢＭＳで１時間活性化した。タンパク質
をセファデックス０５０カラム（２Ｘ３０ｃｍ）（０，
１ｍｏｌ／Ｉ燐酸ナトリウム、０．５ｍｍｏｌ／ＩＥＤ
ＴＡ％　ｐＨ６，０）上でのクロマトグラフィーに供し
た。タンパク質プールを６ｍｌまでに濃縮して、スルフ
ヒドリル基を含むペプチド３０ｍ８とともに１時間イン
キュベートした。透析および凍結乾燥の結果、３８ｍ８
のペプチド抱合体が得られた。

肚２ ウサギの免疫化 ウサギを、動物当り１．７＋ａｇの抗原で各々５週間の
期間免疫化した。最初の免疫化時に、各動物のリンパ節
近傍の８箇所の免疫化部位に、完全フロインドアジュバ
ント（ＣＦＡ）中の０．４ｍｇの抗原を皮下接種した。

続いて２週ｒｒＩ後に、ＣＦＡに溶かした抗体０．８ｍ
ｇ／動物で皮下免疫化した。さらに２週間後、各動物に
０　、１　ｍｇのＡｅｒｏｓｉｌ中の抗原を各々５日間
連続して静脈注射した。３日後に、放血させて、各抗血
清が得られた。

作りよ ペプチドを有する免疫吸着体（ｉｍｗ＋ｕｎｏａｄｓｏ
ｒｂａｎｔｓ）のＷＪＲ製 アフィニティクロマトグラフィーによる粗抗血清のＭ！
１のために、２０ｍｇの、例えば、ペンタデカペプチド
（ｐ２／１）： Ｈ−Ｌｙｇ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｌａｕ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ
−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−人１ａ−Ｃｙｓ−人ｒｇ−Ｔｈｒ−
Ｇｌｙ−Ａｊｐ−ｋｇ：ｑ−ＯＨ を共有結合で固相に固定化した。結合反応は、記述され
た方法（Ａｘｅｎら：　Ｎａｔｕｒｅ　２１４．１３０
２．１９６７）によって、臭化シアンで活性化されたセ
ファ０−スを用いて行った０次いで免疫吸着体を各々燐
酸緩衝生理食塩水（Ｐ　Ｂ　Ｓ、　０．１５ＩＩｏｌ／
Ｉ、ｐＨ７，２）および酢酸（０，５ｍｏｌ／ｌ、ｐＨ
２，！５）で洗浄した。使用の前に、吸着物を３倍量の
ＰＢＳで平衡化した。

収率：ｒＪ２０ｍｌのペプチド−セファ０−ス。

他のペプチドも同様にして免疫吸着体の調製に用いた。

肚ム 抗体の調製 １００ｍ１の粗抗血清を、ＰＢＳ−平衡ペブチドーセフ
７０−ス（１〜５Ｘ１５ｃｍ）に供して、次いで、２８
０ｎｍでの吸光度が０．０１になるまでＰＢＳで洗浄し
た。続いて、ＩＭ　ＮａＣ１（ｐＨ７，０）および水（
ｐＨ７，０）で各回ゲル容量の３倍量を用いて洗浄した
。抗体を、免疫吸着体から水（ｐＨ２，５）で溶出して
、抗体溶液をｐＨ７，０に固体燐酸ナトリウム（０，０
０１ｍｏｌ／ｌ）で調整して、濃縮して（アミコン膜）
、−７０℃で保存した。

収率：３５ＩＩ＋８の抗体。

量五 抗体の試験・ ａ）ＥＰＯ−またはペプチド−被覆マイクロタイタープ
レートの調製 ２０μｇ／ｍｌのＥＰＯ−またはＥＰＯ−特異性ペプチ
ドを炭酸緩衝液中でプラスチックマイクロタイタープレ
ート中で４℃で一晩で結合させた。分析を行う前に、プ
レートをＰＢＳで２回洗浄して、ＰＢＳｌｏ、５％ＢＳ
Ａで３０分間飽和させてから、ＰＢＳで３回洗浄した。

ｂ）ｉｔ素イムノアッセイ工程 ＢＳＡで飽和させたプレートを、抗ＥＰＯウサギ抗血清
または精製抗体画分の希釈物とともに２時間インキュベ
ートした。その後、これらをＰＢＳで洗浄して、アルカ
リホスファターゼに結合させた抗つサギＩｇ抗血清とと
もに２時間インキュベートした。次いで、ＰＢＳで２回
、次に０．２Ｍ）リス−ＨＣｌ　（ｐＨ９，５）で２回
、次いで１Ｍトリス−ＨＣｌ　（ｐＨ９，５）で簡単に
、各々洗浄した。１時間後に、反応をＩＭ　ＮａＯＨで
停止させて、４０５　ｍｇでの吸光度を測定した。

Ｃ）ウェスタンプロット工程 ＥＰＯ標準物をポリアクリルアミドゲル電気泳動で分画
して、ニトロセルロースに移した（Ｔｏｗｂｉｎら：　
Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳ
Ａ、　７６．４３５０−４３５４．１９７９）。フィル
ターをＰＢＳｌｏ、５％ＢＳＡ中で飽和させて、次いで
抗体とともに一晩インキスベートした。次いでフィルタ
ーを３回ＰＢＳで洗浄して、アルカリホスファターゼに
抱合させた抗つサギＩｇ抗血清とともに２時間インキュ
ベートした。ＰＢＳで３回、０．２Ｍ）リス−ＨＣｉ　
（ｐＨ９，５）で１回、ＩＭ）リス−ＨＣＩ（ｐＨ９，
５）で簡単に、各々洗浄した後に、１Ｍトリス−ＨＣｌ
　　（ｐＨ９，５）中の４−ニトロテトラゾリウムクロ
リドブルーハイドレート（５０゜μｇ／ｍ　Ｉ　）およ
び５−ブロモ−４−クロロ−インドキシルホスフェート
　ｐ−）ルイジニウム塩（２００μｇ／ｍｌ）を用いて
プロットの展開を行った。２０分後に反応を水で終結さ
せた。

鮮且 抗体を有する免疫吸着体の調製 アフィニティークロマトグラフィーによって精製した２
０〜５０ｍｇの抗体を、臭化シアンで活性化したセファ
−ロースに標準工程（Ａｘｅｎら：Ｎａｔｕｒｅ　２１
４．１３０２．１９６？）を用いて結合させて、ざらに
例３に記載のように処理した。

敢ヱ アフィニティークロマトグラフィーによるエリスロポイ
エチンのＭ！！ ＥＰＯ特異性抗体を含む免疫吸着体を、上記のようにア
フィニティークロマトグラフィーによるＥＰＯおよびＥ
ＰＯ変異体の精製に採用した。

肚旦 モノクローナル抗体の調製 モノクローナル抗体の調製のために、組換えＤＮＡ技術
によって得られたＥＰＯおよびさらに上記のペプチドを
抗原として用いた。ペプチドは予めＫＬＨ（ｆｆ穴アオ
ガイヘモシアニン）と結合させておいた。

Ｂａ　ｌ　ｂ／ｃマウス（＋１！ｉ）に、腹腔内または
皮下に１０７１ｇを免疫化し、数週間ブースター投与（
ｂｏｏｓｔｅ）　ｂた。実際の融合の直前に、４日間続
けて実験動物に静脈内に追加的にブースター投与した。

融合当日、牌臓を無菌的に除去して、単一（ｓｉｎｇｌ
ｅ）細胞を得るために懸濁させた。１０８個の牌ａｍ胞
と２Ｘ１０’個のミエローマ細胞系（ＳＰ２１０）の細
胞との融合によって、バイブリド細胞を作出して、これ
を次いで、２４穴ブレート（コスタ−社製）上の選択培
地（ＤＭＥＭ（ダルベツコのミニマル必須培地〉＋２０
％ＦＣＳ　（胎児ウシ血清）、０　、１　ｍＭヒボキサ
ンチン、０．４ｍＭアミノプテリン、１６ｍＭチミジン
）中に１０６細胞／ウエルの濃度で分注した。２〜３週
間後、単一細胞コロニーをウェルから単離して、新しい
培養プレート（２４穴、コスタ−社製）の他のウェルに
各々移した。さらに２〜３日後、これら培養上清を、酵
素イムノアッセイで抗ＥＰＯ抗体の存在についてスクリ
ーニングした。特異性抗体を産生ずるバイブリドを選択
して、単一細胞マニピュレーターを用いてクローニング
した。

徴ユ 抗イディオタイプ抗体の調製および決定ＥＰＯ／ＥＰＯ
ペプチドに対する所望の特異性を有する同系（ｓｙｎｇ
ｅｎｉｃ）モノクローナル抗体を免疫化に用いた。全抗
体の代わりに、Ｆａｂ’断片をＢＳＡまたはＫＬＨに結
合させて、ＣＦＡ（完全フロインドアジュバント）に溶
かして雌Ｂａ１ｂ／ｃマウスの腹腔内または皮下に注射
した。モノクローナル抗イディオタイプ抗体のさらなる
調製は、例８の工程と同様である。

免疫化に採用した抗体をペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）に
抱合させて用いる酵素イムノアッセイにおいて、培養上
清を抗イディオタイプ抗体の存在について試験して、さ
らに別の酵素イムノアッセイにおいてこれら抗イディオ
タイプ抗体が抗原によって阻害され得るかどうかを試験
した。抗原によって阻害される得る抗イディオタイプ抗
体を産生ずるバイブリドを選択して、単一細胞マニピュ
レーターを用いてクローニングした。

【図面の簡単な説明】

第１図は、直接エリスロポイエチン結合分析の結果を示
すグラフ図である。エピトープ特異性またはＰ２／１特
異性ウサギ抗血清の血清希釈物をＥＰＯ（２０μｇａｐ
　ｌ　）被覆マイクロタイタープレート上に吸着させて
、結合抗体を酵素標識抗ウサギ抗体で検出した。図中、
血清３３６１．３４６．３４７および３４．８を全ＥＰ
Ｏ分子に対して調製し、血清５５６．５５７および５５
８をペプチドＰ２に対して調製し、血清４４４はウサギ
免疫前血清である。 第２図は、組換えヒトエリスロポイエチン（ｒｈｕＥＰ
ｏ）の生物学的活性のｒｈｕＥ　Ｐ　Ｏ−特異性抗血清
による阻害を示すグラフ図である。ウサギをｒｈｕＥ　
Ｐ　Ｏまたはペプチド配列物Ｐ２、Ｐ４およびＰ５で免
疫化して得てから鍵穴アオガイヘモシアニンに結合させ
ておいた抗血清を、ｒｈｏＥ　Ｐ　Ｏとともに、濃厚富
化した赤血球前駆細胞のＫｒｙｓｔａｌ法（Ｅｘｐ、　
Ｈｅｌ１ｌａｔｏ１．７．６４９−６６０）による増殖
試験に採用した。Ｐ２−ＫＬＨまたはＥＰＯ−ＫＬＨで
免疫化して得られた抗体は、ｒｈｕＥ　Ｐ　Ｏによって
誘導される赤血球前駆細胞の増殖を阻害する。 第３図は、抗ＥＰＯ−Ｐ２−ＫＬＨ血清による阻害の復
帰を示す、グラフ図である。血清は、にｒｙｓｔａ１分
析（上記を参照されたい）において前駆細胞をｒｈｕＥ
Ｐｏおよび抗Ｐ２−ＫＬＨ抗血清とともにインキュベー
トする前に５回までＰ２−セファロースに予め吸着させ
ておいた。血清の阻害活性は、 ペプチドＰ２への予備吸着によって完全に除去すること
ができる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、天然エリスロポイエチンのアミノ酸位置番号に対応
   するアミノ酸位置１〜３５、７〜２３、４４〜７８、５
   ２〜６３、７４〜１０９、８４〜９５、９３〜１３７、
   １１０〜１２３、１４２〜１６６または１５２〜１６６
   を本質的に含む、エリスロポイエチンペプチド。 ２、合成起源である、請求項１に記載のエリスロポイエ
   チンペプチド。 ３、次のアミノ酸配列の一つを有する、請求項１または
   ２に記載のエリスロポイエチンペプチド。 【遺伝子配列があります】 または 【遺伝子配列があります】 ４、次のアミノ酸配列の一つを有する、請求項１または
   ２に記載のエリスロポイエチンペプチド。 【遺伝子配列があります】または 【遺伝子配列があります】 ５、エピトープ特異性抗エリスロポイエチン抗体の調製
   のための、請求項１〜４のいずれか１項に記載のエリス
   ロポイエチンペプチドの使用であって、該エピトープが
   、一つまたはそれ以上のペプチド、またはペプチド配列
   の一つまたはそれ以上の部分からなると定義されるエリ
   スロポイエチンペプチドの使用。 ６、エピトープ特異性抗エリスロポイエチン抗体がモノ
   クローナル抗体である、請求項５に記載の使用。 ７、１〜４のいずれか１項に記載のエリスロポイエチン
   ペプチドに対する、および／または請求項５に記載のエ
   リスロポイエチンエピトープに対する、エピトープ特異
   性抗エリスロポイエチン抗体。 ８、モノクローナル抗体である、請求項６に記載のエピ
   トープ特異性抗エリスロポイエチン抗体。 ９、エリスロポイエチンの生物学的活性を中和する、請
   求項７または８に記載のエピトープ特異性抗エリスロポ
   イエチン抗体。 １０、請求項９に記載のエリスロポイエチン中和抗体の
   結合領域に対する抗イディオタイプ抗体。 １１、エリスロポイエチン、エリスロポイエチン誘導体
   またはエリスロポイエチンペプチドの精製のための、請
   求項７〜９のいずれか１項に記載のエピトープ特異性抗
   エリスロポイエチン抗体の使用。 １２、エリスロポイエチンの検出、好ましくはエリスロ
   ポイエチンのエピトープ特異性の検出のための、請求項
   ７〜９のいずれか１項に記載のエピトープ特異性抗エリ
   スロポイエチン抗体を含む診断補助物。 １３、抗エリスロポイエチン抗体の検出のための、請求
   項１〜４のいずれか１項に記載のエリスロポイエチンペ
   プチドを含む診断補助物。 １４、請求項１〜４のいずれか１項に記載の少なくとも
   一つのエリスロポイエチンペプチドまたは請求項９に記
   載のエピトープ特異性抗エリスロポイエチン抗体および
   、適宜、薬剤学的に許容される補助剤および添加剤を含
   む、医薬物。 １５、請求項１０に記載の抗イディオタイプ抗体および
   、適宜、薬剤学的に許容される補助剤および添加剤を含
   む、医薬物。 １６、造血調節の障害の治療のための、請求項１４また
   は１５に記載の医薬物。 １７、中和抗体またはエリスロポイエチンリセプターの
   検出のための、請求項１０に記載の抗イディオタイプ抗
   体を含む診断補助物。