JPH038196B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の背景〕 技術分野 本発明は、タンパク質アルギニン残基脱イミノ
酵素（以下、PADIase＝peptidylarginine
deiminaseという）の精製法に関する。換言すれ
ば、本発明は、精製されたPADIaseの製造法に
関する。 PADIaseは、種々の動物組織、例えば脳、骨
格筋など、に広くその存在が確認されている可溶
性酵素であり、ペプチド鎖中のアルギニン残基に
特異的に作用して脱イミノ反応によりこれをシト
ルリン残基に変換する活性を有する有用なタンパ
ク質修飾酵素である。PADIaseの酵素学的性質
に関しては、ウサギ骨格筋由来のものについて本
発明者により〔ジヤーナル・オブ・バイオケミス
トリー（J.Biochem.）94、1945（1983）〕、またウ
シ脳由来のものについてクビルス（Joseph
Kubilus）らにより（ビオキミカ・エ・ビオフイ
ジカ・アクタ（Biochimica et Biophysica
Acta）745（1983）、285〜〕それぞれ詳細に報告
されている。 先行技術 PADIaseの精製法については、既にいくつか
の提案がなされている。クビルスらは、前記報告
中で、牛の脳由来のPADIaseを五段階のカラム
クロマトグラフイー（DEAE−セルロース、
DEAE−セフアデツクス、ハイドロキシアパタイ
ト、アルギニン・アガロース・リシン・アガロー
ス）により、SDS−PAGEで単一バンドとなるま
で精製しているが、このときの収率は高々４％で
あり、酵素比活性〔タンパク質単位重量当りの酵
素活性（以下同じ）〕の濃縮度は1100倍であつた。
さらに、グビルスらは、牛の表皮組織より
PADIaseを三段階のカラムクロマトグラフイー
（DEAE−セルロース、SP−セフアデツクス、ア
ルギニン・アガロース）で精製する方法について
も報告〔ザ・ジヤーナル・オブ・インベステイゲ
ーテイブ・ダーマトロジー（The Journal of
Investigative Dermatology）85：232−234
（1985）〕している。この方法の収率は26％であ
り、酵素比活性の濃縮度は472倍であつた。 一方、本発明者らは、先にウサギの骨格筋中の
PADIaseを基本的に六段階からなる精製法につ
いて報告〔ジヤーナル・オブ・バイオケミストリ
ー（J.Biochem.）94、1945〜1953（1983）〕して
いるが、この方法の収率は16％であり、酵素比活
性の濃縮度は879倍であつた。また、この精製法
においては、ダイズのトリプシン・インヒビター
をリガンドとするアフイニテイークロマトグラフ
イーが一つの段階として採用されており、この段
階においてリガンドに結合したPADIaseは水酸
化ナトリウム水溶液により溶出されていて、この
アフイニテイークロマトグラフイーによる
PADIaseの収率は49％で、酵素比活性の濃縮度
は3.8倍であつた。 以上のように、PADIase精製法としては種々
の方法が提案されているが、いずれも操作が煩雑
で収率も低く、未だ満足しうる精製法が提案され
ていないのが現状である。 〔発明の概要〕 要 旨 本発明者らは、上記諸問題を解決し、比較的簡
便かつ高収率でPADIaseを精製し得る方法を提
供することを目的として種々研究した結果、溶液
中のPADIaseを特定のペプチドないしタンパク
質に特定の条件下で吸着・溶離させることが有効
であることを見出して、本発明を完成させた。 すなわち、本発明によりPADIaseの精製法は、
溶液中のタンパク質アルギニン残基脱イミノ酵素
を、カルシウムイオンの存在下に、トリプシンイ
ンヒビターを不溶性担体に担持させてなる吸着剤
に吸着させ、この吸着剤をカルシウムイオンを含
む洗浄液で洗浄したのち、カルシウムイオンとの
キレート形成能を有するキレート剤水溶液を用い
てこの吸着剤よりタンパク質アルギニン残基脱イ
ミノ酵素を溶離させること、を特徴とするもので
ある。 発明の効果 本発明の精製法によれば、一段階処理で溶液中
のPADIaseを60％以上の収率で、その酵素比活
性を20倍以上に濃縮することができる。さらに、
本発明の好ましい実施態様の一つとして、本発明
の精製法をイオン交換クロマトグラフイーと組み
合わせて用いれば、二段階からなる簡便な操作に
より、動物組織の抽出液よりPADIaseを非常に
効率よく（収率：50％以上、酵素比活性の濃縮
率：1790倍、得られたPADIaseはSDS−PAGE
で単一バンド）精製することできる（実施例２参
照）。 本発明によつて一段階で高い収率と高い濃縮率
とを得ることができたことは多段階の処理を必要
としていた従来の精製法からみて予想外のことで
あり、特にトリプシンインヒビターをリガンドと
するアフイニテイークロマトグラフイーからなる
単位精製工程で溶離剤として水酸化ナトリウムを
使用した場合の収率および濃縮度、特に後者、と
比較したときの本発明カルシウムキレート剤によ
る溶離の特異さは思いがけなかつたことというこ
とができよう。 〔発明の具体的説明〕 吸着剤 本発明で吸着剤の吸着基として使用するペプチ
ドないしタンパク質は、上位概念的にいえばその
分子表面にアルギニン残基を突出させて有するも
のである。このようなペプチドないしタンパク質
としては活性部位残基としてアルギニン残基を有
するトリプシン・インヒビターがあり、その具体
例としては、ダイズ・クニツツ・トリプシン・イ
ンヒビター（以下、STI＝Soybean Trypsin
Inhibitorという）、タマネギ・トリプシン・イン
ヒビター、ウシ膵臓分泌型トリプシン・インヒビ
ター、およびこれらと相同性を示すポリペプチド
を例示することができる。 本発明においては、これらのペプチドないしタ
ンパク質を不溶性担体に担持させてすなわち固定
化して使用する。固定化法としては、合目的的な
任意の公知方法を使用することができる。具体的
には、不溶性担体としてはアガロース、デキスト
ラン、セルロース、ポリアクリルアミド等を、ま
た固定化はアミノ基、カルボキシル基等を官能基
とする共有結合法、不溶性担体のマトリツクス中
への物理的封じ込め法等によることができる。な
お、このようにしてペプチドないしタンパク質を
固定化（担持）させた不溶性担体からなる吸着剤
は、精製操作上取扱いが容易であるような粒状物
として調製されるのがふつうである。 PADIase 本発明において精製の対象となるPADIaseと
しては特に限定はなく、本発明で吸着基として使
用するペプチドないしタンパク質に吸着し得る任
意のものが用いられる。このようなPADIaseの
具体例としては、例えば、前記の文献に報告され
ている酵素（ウサギの骨格筋、牛の脳、牛の上皮
等に由来するもの）などがあげられる。 なお、本発明で「PADIase」とは、タンパク
質またはペプチド分子中のアルギニン残基に作用
してこれをシルトリン残基に変換する活性を有す
る酵素を意味する。 PADIaseの精製 本発明においては、PADIase水溶液を精製の
対象とするが、動物組織中のPADIaseを精製す
る場合には、該組織を水溶液中で均質化する等の
処理に付すことによりPADIaseを予め抽出して
から、該抽出液を本発明により精製すればよい。
また、PADIaseを高純度に精製する場合は、溶
液中のPADIaseを、予め陰イオン交換クロマト
グラフイーにより精製（予備精製）してから、本
発明の方法により精製するのが効果的である。こ
の予備精製のための陰イオン交換クロマトグラフ
イーにおいては、陰イオン交換体としては陰イオ
ン交換基としてDEAE基（ジエチルアミノエチ
ル）、AH基（アミノヘキシル）、等を有するもの
が好適であり、溶液中のPADIaseを好ましくは
PH６〜９においてこれらの陰イオン交換体に吸着
させ、これを適当な洗浄液で洗浄した後、塩化ナ
トリウム、塩化カルシウム等の塩類溶液を用いて
PADIaseを溶出させればよい。なお、この陰イ
オン交換クロマトグラフイーの具体的実施様態に
ついては、ジヤーナル・オブ・バイオケミストリ
ー（J.Biochm.）94、1945（1983）にも報告され
ている。 PADIaseの水溶液を本発明により精製するに
は、まず該水溶液をカルシウムイオンの共存下で
前記吸着剤と接触させ、該水溶液中のPADIase
を該吸着剤上の吸着基としてのペプチドないしタ
ンパク質に吸着させる。共存させるカルシウムイ
オンの濃度は0.2ｍＭ以上、特に0.6ｍＭ以上、が
好ましい。カルシウムイオンの供給源としては、
水溶性カルシウム化合物、例えば塩化カルシウ
ム、その他がある。なお、精製中のPADIaseの
変性ないし分解を抑えるため、必要に応じて、
DTT、２−メルカプトエタノール等の還元剤、
プロテアーゼ・インヒビターその他を共存させて
おくのが好ましい。また、この吸着工程はカルシ
ウムイオンのみの存在下に行なうものではないの
であつて、カルシウムイオンの効果を阻害しない
限り、他の金属イオン、例えばアルカリ金属イオ
ンが、共存していてもよい。 次いで、PADIaseを吸着した吸着剤をカルシ
ウムイオンを含む洗浄液で洗浄する。この洗浄液
は、好ましくは0.2ｍＭ以上のカルシウムイオン
を含むものであつて、PADIaseを溶離すること
なく吸着剤に非特異的に吸着ないし付着している
物質を除去できるものが用いられ、具体的にはカ
ルシウムイオン供給源（その具体例については上
記参照）は別として塩化ナトリウム、塩化カリウ
ム等の水溶液を例示することができる。この洗浄
液はカルシウムイオンを含むものであり、従つて
これはカルシウム供給源（たとえば、塩化カルシ
ウム）の水溶液そのものであつてもよい。 その後、カルシウムイオンとキレート形成能を
有するキレート剤の水溶液を用いて吸着剤に吸着
したPADIaseを溶離させる。この目的のために
使用することのできるキレート剤としては、エチ
レングリコール・ビス（β−アミノエチル・エー
テル）−Ｎ、Ｎ、N′、N′−四酢酸（EGTA）、エ
チレンジアミン四酢酸（EDTA）、クエン酸等を
例示することができる。また、キレート剤の濃度
については特に制限はないが、数ｍＭ以上の濃度
で使用するのが普通である。さらに、このキレー
ト剤の水溶液は必要に応じて塩化ナトリウム、塩
化カリウム等の塩酸を含んでいてもよい。 本発明で精製に供するPADIase溶液、洗浄液
およびキレート剤水溶液（溶離液）のPHは酵素を
失活させないPHであれば適宜選択し得るが、酵素
の回収率から特に６〜９の範囲にあることが望ま
しい。また、精製操作温度も、PADIaseを失活
させない温度であれば適宜選択し得るが、吸着剤
を繰り返し使用するためには低温、特に５℃以
下、で操作することが好ましい。 本発明精製法の実施態様としてはバツチ法とカ
ラムクロマトグラフイー（＝アフイニテイークロ
マトグラフイー）法の二つが考えられるが、いず
れによつてもPADIaseの精製が可能である。こ
れらの具体的な操作手順そのものはタンパク精製
の分野において慣用されているものでありうるの
で、本発明において特記したところ以外のものに
ついてはこれらの慣用技術に準じて実施すればよ
い。 実験例 以下の実験例において、PADIaseの活性測定
はジヤーナル・オブ・バイオケミストリー（J.
Biochm.）、94 1945（1983）に記載の方法を用い
た。 参考例 （試料の調製） 新鮮なウサギの骨格筋を５倍量の緩衝液Ａ（20
ｍＭトリス塩酸PH7.6、10ｍM2−メルカプトエタ
ノール、１ｍMEDTA、0.43ｍＭフエニルメチル
スルホニル・フルオライド）中でホモジナイザー
にて均一化し、得られたホモジネートをナイロン
ガーゼで炉過し、炉液を10000×ｇで30分間遠心
分離した。この上清を、予め0.1MNaClを含む緩
衝液Ａで平衡化された「DEAE−セフアセル」
（フアルマシア社製）カラムにかけた。このカラ
ムを流出液のA280nｍが0.05以下となるまでこの
緩衝液で洗浄した後、緩衝液Ａ中のNaClの直線
的な濃度勾配（0.1→0.5M）によりPADIaseを溶
出させた。得られた活性画分をプールし、これに
等量の飽和硫酸アンモニウム水溶液を加えて
PADIaseを沈澱させて50％飽和硫酸アンモニウ
ム水溶液中にサスペンシヨンとして保存した。 実施例 １ 参考例により得られたPADIase（約470U、
25U／mg−タンパク質）を遠心分離して集め、10
ｍMCaCl₂を含む緩衝液Ｂ（20ｍＭトリス塩酸
（PH：7.6）、10％グリセロール、0.1MNaCl、10ｍ
M2−メルカプトエタノール、10ｍMDTT）に溶
解し、多量の同緩衝液に対して透析した後、同緩
衝液で予め平衡化された「STI−セフアロース」
カラム（1.0×12cm）〔ジヤーナル・オブ・バイオ
ロジカル・ケミストリー（j.Biol.Chem.）、245、
3059（1970）〕にかけた。次いで、このカラムを同
緩衝液で洗浄後、10ｍMEGTAを含む緩衝液Ｂ
でカラムよりPADIaseを溶出させた。このとき
のタンパク質および酵素活性の溶出パターンは、
添付の図面に示す通りであつた。なお、タンパク
質はリードおよびノースコート（Read＆
Northcote）法〔アナリテイカル・バイオケミス
トリー（Anal.Biochem.）、166、53（1981）〕によ
り測定した。この操作で得られたPADIaseの比
活性は560U／mgタンパク質であつてその濃縮度
は22.4倍であり、収率は60％であつた。また、得
られたPADIaseは、SDS−PAGEで単一バンド
（電気泳動的に均一）であつた。 実施例 ２ 新鮮なウサギの骨格筋3.0Kgを用いて、参考例
並びに実施例１と同一の条件でPADIaseの精製
を行なつた。このときの精製結果は、下表に示す
通りであつた。なお、このとき得られた
PADIaseもSDS−PAGEで単一バンドであつた。 【表】

【図面の簡単な説明】

図面は、実施例１でのタンパク質および酵素活
性の溶出パターンを示すグラフである。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ 溶液中のタンパク質アルギニン残基脱イミノ
   酵素を、カルシウムイオンの存在下に、トリプシ
   ンインヒビターを不溶性担体に担持させてなる吸
   着剤に吸着させ、この吸着剤をカルシウムイオン
   を含む洗浄液で洗浄したのち、カルシウムイオン
   とのキレート形成能を有するキレート剤水溶液を
   用いてこの吸着剤よりタンパク質アルギニン残基
   脱イミノ酵素を溶離させることを特徴とする、タ
   ンパク質アルギニン残基脱イミノ酵素の精製法。