JPH038515B2 - - Google Patents
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- JPH038515B2 JPH038515B2 JP57081776A JP8177682A JPH038515B2 JP H038515 B2 JPH038515 B2 JP H038515B2 JP 57081776 A JP57081776 A JP 57081776A JP 8177682 A JP8177682 A JP 8177682A JP H038515 B2 JPH038515 B2 JP H038515B2
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- human
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- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/575—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
- G01N2333/914—Hydrolases (3)
- G01N2333/978—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
- G01N2333/986—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5) acting on amide bonds in cyclic amides (3.5.2), e.g. beta-lactamase (penicillinase, 3.5.2.6), creatinine amidohydrolase (creatininase, EC 3.5.2.10), N-methylhydantoinase (3.5.2.6)
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は臨床医学的に有用な神経組織あるいは
神経内分泌細胞から遊出されるヒト由来の神経組
織特異的エノラーゼを定量する方法に関する。
神経内分泌細胞から遊出されるヒト由来の神経組
織特異的エノラーゼを定量する方法に関する。
エノラーゼは２−ホスホグリセリン酸，ホスホ
エノールピルビン酸の反応を触媒する酵素で、２
量体構造をもち、分子量約４万〜５万の３種類の
サブユニツト（α，β，γ）より成る〔フレツチ
ヤーら（L.FIetcherら）：バイオチミカ バイオ
フイジカ アクタ（Biochim.Biophys.Acta）第
452巻，245〜252ページ，1976年〕。
エノールピルビン酸の反応を触媒する酵素で、２
量体構造をもち、分子量約４万〜５万の３種類の
サブユニツト（α，β，γ）より成る〔フレツチ
ヤーら（L.FIetcherら）：バイオチミカ バイオ
フイジカ アクタ（Biochim.Biophys.Acta）第
452巻，245〜252ページ，1976年〕。
これらのうち、γγ型及びαγ型が神経組織特異
的エノラーゼ（neuron−specificenolase、以下
NSEと略す。）である。このNSEは免疫組織化学
的に神経細胞体，軸索，シナツプスに存在し正常
のグリア細胞内には存在しない。グリア細胞内に
存在するエノラーゼはαα型で非神経組織特異的
エノラーゼ（non−neuronalenolase、以下NNE
と略す。）である。
的エノラーゼ（neuron−specificenolase、以下
NSEと略す。）である。このNSEは免疫組織化学
的に神経細胞体，軸索，シナツプスに存在し正常
のグリア細胞内には存在しない。グリア細胞内に
存在するエノラーゼはαα型で非神経組織特異的
エノラーゼ（non−neuronalenolase、以下NNE
と略す。）である。
NSEは神経組織ではその可溶性蛋白の１％以
上を占め、神経細胞の分化に伴つて増量し、特に
シチツプス形成時期に急激に、増加することが知
られている。このようにNSEは神経細胞に多量
に存在し、しかも細胞体の分化とともに増量する
こと等神経細胞の高次機能との密接な関連が示唆
される。最近神経内分沁組胞などの神経組織に起
源を有する細胞及びそれから発生する腫瘍細胞中
にもNSEが存在することが確認された〔マラン
ゴスら（P.J.Marangosら）：ジヤーナル オブニ
ユーロケミストリー（J.Neurochem.）第33巻，
319〜329ページ，1979年〕及び〔タピアら（P.J.
Tapiaら）：ザ ランセツト（TheLancet）第１
巻，808〜811ページ，1981年〕。このことは神経
組織の損傷あるいはそれらの腫瘍細胞の崩壊や細
胞分列にともなつてNSEが体液（血液，脳脊髄
液など）中に遊出してくることが予想される。
上を占め、神経細胞の分化に伴つて増量し、特に
シチツプス形成時期に急激に、増加することが知
られている。このようにNSEは神経細胞に多量
に存在し、しかも細胞体の分化とともに増量する
こと等神経細胞の高次機能との密接な関連が示唆
される。最近神経内分沁組胞などの神経組織に起
源を有する細胞及びそれから発生する腫瘍細胞中
にもNSEが存在することが確認された〔マラン
ゴスら（P.J.Marangosら）：ジヤーナル オブニ
ユーロケミストリー（J.Neurochem.）第33巻，
319〜329ページ，1979年〕及び〔タピアら（P.J.
Tapiaら）：ザ ランセツト（TheLancet）第１
巻，808〜811ページ，1981年〕。このことは神経
組織の損傷あるいはそれらの腫瘍細胞の崩壊や細
胞分列にともなつてNSEが体液（血液，脳脊髄
液など）中に遊出してくることが予想される。
本発明はこのような背景のもとに完成されたも
のであつて、その目的とするところは、ヒト体液
中の微量のNSEを酵素免疫測定法により高感度
に定量することにより癌，腫瘍の診断あるいは治
療効果の判定、予後の判定の一手段とすることに
ある。ただし本発明の定量方法は上記に限定され
るものではなく体液以外の組織中のNSEの定量
も可能である。
のであつて、その目的とするところは、ヒト体液
中の微量のNSEを酵素免疫測定法により高感度
に定量することにより癌，腫瘍の診断あるいは治
療効果の判定、予後の判定の一手段とすることに
ある。ただし本発明の定量方法は上記に限定され
るものではなく体液以外の組織中のNSEの定量
も可能である。
従来エノラーゼの定量法としては、限られた組
織材料で各種のエノラーゼアイソザイムを分離操
作なく、区別して特異的に定量するために、それ
ぞれの抗血清を用いたラジオイムノアツセイ
（Radioimmunoassay、以下RIAと略す。）法が
用いられて来た。例えば〔マランゴスら（P.J.
Marangosら）：ジヤーナル オブ ニユーロケ
ミストリー（J.Neurochem.）第33巻，319〜329
ページ，1979年〕はラツト，サル，ヒトの脳組織
中のNSE，NNEをRIA法によりngの単位で測定
している。〔ブラウンら（K.W.Brownら）：クリ
ニカ チミカ アクタ（CIinica、Chimica、
Acta）第101巻，257〜264ページ，1980年〕は
RIA法によりヒトの脳脊髄液及び血清中のNSE
を測定し、その感度の限界は150pgであると述べ
ている。また〔パーマら（A.M.Parmaら）：ジヤ
ーナル オブ ニユーロケミストリー（J.
Neurochem.）第36巻，1093〜1096ページ，1981
年〕はより高感度のRIA法により108pg〜2ngの
範囲でNSEを検出している。
織材料で各種のエノラーゼアイソザイムを分離操
作なく、区別して特異的に定量するために、それ
ぞれの抗血清を用いたラジオイムノアツセイ
（Radioimmunoassay、以下RIAと略す。）法が
用いられて来た。例えば〔マランゴスら（P.J.
Marangosら）：ジヤーナル オブ ニユーロケ
ミストリー（J.Neurochem.）第33巻，319〜329
ページ，1979年〕はラツト，サル，ヒトの脳組織
中のNSE，NNEをRIA法によりngの単位で測定
している。〔ブラウンら（K.W.Brownら）：クリ
ニカ チミカ アクタ（CIinica、Chimica、
Acta）第101巻，257〜264ページ，1980年〕は
RIA法によりヒトの脳脊髄液及び血清中のNSE
を測定し、その感度の限界は150pgであると述べ
ている。また〔パーマら（A.M.Parmaら）：ジヤ
ーナル オブ ニユーロケミストリー（J.
Neurochem.）第36巻，1093〜1096ページ，1981
年〕はより高感度のRIA法により108pg〜2ngの
範囲でNSEを検出している。
このようにRIA法では約100pgのレベルのエノ
ラーゼの定量が可能である。しかしRIA法では脳
組織などのように大量のエノラーゼの存在する定
量には十分であるが、細胞培養液中や体液（例え
ば脳脊髄液，血液，尿等）中の微量のエノラーゼ
の定量には適さない。さらにRIA法の不利な点と
して放射性同位元素を使用するため特別な施設，
設備を必要とすること及び使用するアイソトープ
の半減期の問題から安定性が低い点があげられ
る。
ラーゼの定量が可能である。しかしRIA法では脳
組織などのように大量のエノラーゼの存在する定
量には十分であるが、細胞培養液中や体液（例え
ば脳脊髄液，血液，尿等）中の微量のエノラーゼ
の定量には適さない。さらにRIA法の不利な点と
して放射性同位元素を使用するため特別な施設，
設備を必要とすること及び使用するアイソトープ
の半減期の問題から安定性が低い点があげられ
る。
そこで、本発明者らは大腸菌のβ−Ｄ−ガラク
トシダーゼを標識酵素として用いた酵素免疫測定
法（Enzymeimmunoassay法、以下EIA法と略
す。）によつてヒトエノラーゼの定量を試みたと
ころ、約3pgの微量のエノラーゼが測定できるこ
とを知り本発明を完成したものである。本発明の
方法によればRIA法の約30倍の感度でヒトエノラ
ーゼの定量が可能で、しかも特別な設備を必要と
せず、反応に用いる試薬は長期間安定である。
トシダーゼを標識酵素として用いた酵素免疫測定
法（Enzymeimmunoassay法、以下EIA法と略
す。）によつてヒトエノラーゼの定量を試みたと
ころ、約3pgの微量のエノラーゼが測定できるこ
とを知り本発明を完成したものである。本発明の
方法によればRIA法の約30倍の感度でヒトエノラ
ーゼの定量が可能で、しかも特別な設備を必要と
せず、反応に用いる試薬は長期間安定である。
即ち、本発明は抗エノラーゼ抗体結合固相に検
体中のヒトエノラーゼを反応せしめて得られる反
応物に酵素標識抗エノラーゼ抗体を作用せしめる
か又は検体中のヒトエノラーゼと酵素標識抗エノ
ラーゼ抗体を反応せしめて得られる反応物を抗エ
ノラーゼ抗体結合固相に作用せしめることによつ
て抗エノラーゼを介してヒトエノラーゼ及び酵素
標識抗エノラーゼ抗体を固相に固定化せしめた
後、固定化固相中の該標織酵素活性を測定するこ
とにより検体中のヒトエノラーゼ量を求める方法
において抗エノラーゼ抗体としてヒト以外の動物
由来のエノラーゼに対する抗エノラーゼ抗体を用
いることを特徴とするヒトエノラーゼの定量方法
に関する。
体中のヒトエノラーゼを反応せしめて得られる反
応物に酵素標識抗エノラーゼ抗体を作用せしめる
か又は検体中のヒトエノラーゼと酵素標識抗エノ
ラーゼ抗体を反応せしめて得られる反応物を抗エ
ノラーゼ抗体結合固相に作用せしめることによつ
て抗エノラーゼを介してヒトエノラーゼ及び酵素
標識抗エノラーゼ抗体を固相に固定化せしめた
後、固定化固相中の該標織酵素活性を測定するこ
とにより検体中のヒトエノラーゼ量を求める方法
において抗エノラーゼ抗体としてヒト以外の動物
由来のエノラーゼに対する抗エノラーゼ抗体を用
いることを特徴とするヒトエノラーゼの定量方法
に関する。
本発明の方法の特徴、即ち抗ヒトエノラーゼ抗
体に代えて動物由来のエノラーゼに対する抗エノ
ラーゼ抗体を用いることがいかにして可能である
かについて以下に述べる。
体に代えて動物由来のエノラーゼに対する抗エノ
ラーゼ抗体を用いることがいかにして可能である
かについて以下に述べる。
まず本発明者らは、ヒトエノラーゼ定量におい
て、抗体結合固相、酵素標識抗体の調製に用いら
れるエノラーゼのγサブユニツトには、動物の種
類によつてヒトのものと免疫化学的に共通な部分
の多いもの（例えばヒトのγサブユニツトは牛，
豚のものと共通部分が多い）とそうでないもの
（例えばラツト，ウサギのγサブユニツトは共通
部分が少ない）があることを見い出した。
て、抗体結合固相、酵素標識抗体の調製に用いら
れるエノラーゼのγサブユニツトには、動物の種
類によつてヒトのものと免疫化学的に共通な部分
の多いもの（例えばヒトのγサブユニツトは牛，
豚のものと共通部分が多い）とそうでないもの
（例えばラツト，ウサギのγサブユニツトは共通
部分が少ない）があることを見い出した。
そこで本発明のヒトエノラーゼ定量において抗
エノラーゼ抗体として牛，豚のエノラーゼを用い
て得られるポリクローナル抗体即ち牛，豚由来の
エノラーゼを用いて得られる抗エノラーゼ抗体を
使用するときには、このものはヒトエノラーゼに
対して抗ヒトエノラーゼ抗体とほぼ同等の反応性
を有する場合が多いので、ヒトエノラーゼに対し
て抗ヒトエノラーゼ抗体と同等の反応性を有する
ロツトを選択しそれをそのまま代用することとし
た。
エノラーゼ抗体として牛，豚のエノラーゼを用い
て得られるポリクローナル抗体即ち牛，豚由来の
エノラーゼを用いて得られる抗エノラーゼ抗体を
使用するときには、このものはヒトエノラーゼに
対して抗ヒトエノラーゼ抗体とほぼ同等の反応性
を有する場合が多いので、ヒトエノラーゼに対し
て抗ヒトエノラーゼ抗体と同等の反応性を有する
ロツトを選択しそれをそのまま代用することとし
た。
一方、ラツト及びウサギのγサブユニツトは、
ヒトのγサブユニツトと共通する部分が少なく、
ラツト及びウサギのエノラーゼを用いて得られる
ポリクローナル抗体即ち抗エノラーゼ抗体を使用
するときには、このものはヒトエノラーゼに対し
て抗ヒトエノラーゼ抗体と同等の反応を示さな
い。従つてこのままではラツト及びウサギ由来の
抗エノラーゼ抗体を抗ヒトエノラーゼ抗体の代用
として用いることはできない。
ヒトのγサブユニツトと共通する部分が少なく、
ラツト及びウサギのエノラーゼを用いて得られる
ポリクローナル抗体即ち抗エノラーゼ抗体を使用
するときには、このものはヒトエノラーゼに対し
て抗ヒトエノラーゼ抗体と同等の反応を示さな
い。従つてこのままではラツト及びウサギ由来の
抗エノラーゼ抗体を抗ヒトエノラーゼ抗体の代用
として用いることはできない。
しかしながら、本発明者らはラツト，ウサギ由
来のγサブユニツトにおいてもヒトのものと共通
する部分を選択的に利用する手段を用いれば牛，
豚の場合と同様にヒトエノラーゼ抗体の代用とし
て使用できるものと考えた。そこで、本発明者ら
は、このために次のような手段を試みた。(1)ラツ
ト，ウサギ由来のγサブユニツトに由来する抗エ
ノラーゼ抗体をヒトエノラーゼを用いたアフイニ
テイークロマトグラフイーで精製すること。(2)ラ
ツト及びウサギのγサブユニツトに由来する何匹
かの免疫動物の中からヒトエノラーゼに対して抗
ヒトエノラーゼ抗体と同等の反応性を有するロツ
トを選択すること。(3)ヒトエノラーゼに対して抗
ヒトエノラーゼ抗体と同等の反応性を有するラツ
ト及びウサギ由来のエノラーゼを用いて抗エノラ
ーゼモノクローナル抗体を分離する等である。
来のγサブユニツトにおいてもヒトのものと共通
する部分を選択的に利用する手段を用いれば牛，
豚の場合と同様にヒトエノラーゼ抗体の代用とし
て使用できるものと考えた。そこで、本発明者ら
は、このために次のような手段を試みた。(1)ラツ
ト，ウサギ由来のγサブユニツトに由来する抗エ
ノラーゼ抗体をヒトエノラーゼを用いたアフイニ
テイークロマトグラフイーで精製すること。(2)ラ
ツト及びウサギのγサブユニツトに由来する何匹
かの免疫動物の中からヒトエノラーゼに対して抗
ヒトエノラーゼ抗体と同等の反応性を有するロツ
トを選択すること。(3)ヒトエノラーゼに対して抗
ヒトエノラーゼ抗体と同等の反応性を有するラツ
ト及びウサギ由来のエノラーゼを用いて抗エノラ
ーゼモノクローナル抗体を分離する等である。
こうして、抗ヒトエノラーゼを用いることな
く、動物由来の抗エノラーゼを用いてもヒトエノ
ラーゼを定量することが可能となつたのである。
く、動物由来の抗エノラーゼを用いてもヒトエノ
ラーゼを定量することが可能となつたのである。
このように、本発明の方法においてはヒトエノ
ラーゼを定量するに際して、入手困難な抗ヒトエ
ノラーゼ抗体を用いるのではなく、ヒト以外の動
物より得られるエノラーゼを用いて作成した抗エ
ノラーゼ抗体を代用することができるため定量に
用いる試薬類を安定して製造でき広く臨床医学に
応用することが大きな特徴である。
ラーゼを定量するに際して、入手困難な抗ヒトエ
ノラーゼ抗体を用いるのではなく、ヒト以外の動
物より得られるエノラーゼを用いて作成した抗エ
ノラーゼ抗体を代用することができるため定量に
用いる試薬類を安定して製造でき広く臨床医学に
応用することが大きな特徴である。
本発明に使用される標織酵素としてはできるだ
け高感度の活性測定ができればよく、例えばβ−
Ｄガラクトシダーゼ，アルカリホオスフアター
ゼ，パーオキシダーゼ，グルコースオキシダー
ゼ，リンゴ酸脱水素酵素等通常用いられる酵素で
あればいずれでもよいが、特にβ−Ｄ−ガラクト
シダーゼが測定感度が高いので高感度測定のため
に好ましい。
け高感度の活性測定ができればよく、例えばβ−
Ｄガラクトシダーゼ，アルカリホオスフアター
ゼ，パーオキシダーゼ，グルコースオキシダー
ゼ，リンゴ酸脱水素酵素等通常用いられる酵素で
あればいずれでもよいが、特にβ−Ｄ−ガラクト
シダーゼが測定感度が高いので高感度測定のため
に好ましい。
酵素標識抗エノラーゼ抗体の調製に際して用い
られる酵素とエノラーゼ抗体との結合法は、酵
素，抗エノラーゼ抗体の各々の活性（触媒活性，
抗体結合能）が失われないような方法であればど
のような方法でもよい、具体的にはグルタルアル
デヒト，カルボジイミド，Ｎ，N′−Ｏ−フエニ
レンジマレイミド，ｍ−マレイミドベンゾイル−
Ｎ−ハイドロキシサクシニミドエステル（ｍ−
Maleimidoben−zoyl−Ｎ−
HydroxysuccinimideEster）等の既知の二官能
性試薬が使用できる。
られる酵素とエノラーゼ抗体との結合法は、酵
素，抗エノラーゼ抗体の各々の活性（触媒活性，
抗体結合能）が失われないような方法であればど
のような方法でもよい、具体的にはグルタルアル
デヒト，カルボジイミド，Ｎ，N′−Ｏ−フエニ
レンジマレイミド，ｍ−マレイミドベンゾイル−
Ｎ−ハイドロキシサクシニミドエステル（ｍ−
Maleimidoben−zoyl−Ｎ−
HydroxysuccinimideEster）等の既知の二官能
性試薬が使用できる。
固相（不溶性担体）としてはアガロース，デキ
ストラン，セルロースなどの多糖類、ポリスチレ
ン等の合成樹脂、あるいは、ガラス、ポリアクリ
ルアミド等が用いられ、形態としてはビーズ状，
繊維状であることが好ましい。抗エノラーゼ抗体
と固相との結合は物理的吸着を利用してもよい
が、通常蛋白質あるいは酵素等を不溶化するのに
用いられる方法を利用してもよい。例えば不溶化
するのに用いられる方法を利用してもよい。例え
ば不溶性多糖を用いる場合であれば不溶性多糖を
臭化シアン，過沃素酸ナトリウム，エピクロルヒ
ドリン，１，1′−カルボニルジイミダゾール，ｐ
−トルエンスルフオニルクロリド等で活性化して
結合反応を行わせる。
ストラン，セルロースなどの多糖類、ポリスチレ
ン等の合成樹脂、あるいは、ガラス、ポリアクリ
ルアミド等が用いられ、形態としてはビーズ状，
繊維状であることが好ましい。抗エノラーゼ抗体
と固相との結合は物理的吸着を利用してもよい
が、通常蛋白質あるいは酵素等を不溶化するのに
用いられる方法を利用してもよい。例えば不溶化
するのに用いられる方法を利用してもよい。例え
ば不溶性多糖を用いる場合であれば不溶性多糖を
臭化シアン，過沃素酸ナトリウム，エピクロルヒ
ドリン，１，1′−カルボニルジイミダゾール，ｐ
−トルエンスルフオニルクロリド等で活性化して
結合反応を行わせる。
また、固相に適当なスペーサーを導入した後、
スペーサーを介して抗エノラーゼ抗体を結合させ
てもよい。更に抗エノラーゼ抗体と固相の結合を
可逆的な結合、例えばＳ−Ｓ結合にした場合に
は、測定後固相に結合した免疫反応物を固相より
切断、除去し（例えばＳ−Ｓ結合の場合還元剤に
より切断される。）、固相をくり返し使用すること
もできる。カラムを用いる場合には固相に不溶化
する抗体の量は不溶性担体１ml当り0.1〜20mgが
適当であるが、可能ならば更に多量の抗エノラー
ゼ抗体を不溶化することによつて測定感度，測定
精度を向上させることが可能である。
スペーサーを介して抗エノラーゼ抗体を結合させ
てもよい。更に抗エノラーゼ抗体と固相の結合を
可逆的な結合、例えばＳ−Ｓ結合にした場合に
は、測定後固相に結合した免疫反応物を固相より
切断、除去し（例えばＳ−Ｓ結合の場合還元剤に
より切断される。）、固相をくり返し使用すること
もできる。カラムを用いる場合には固相に不溶化
する抗体の量は不溶性担体１ml当り0.1〜20mgが
適当であるが、可能ならば更に多量の抗エノラー
ゼ抗体を不溶化することによつて測定感度，測定
精度を向上させることが可能である。
ここで使用される抗エノラーゼ抗体タンパクは
そのままでもよいが、抗原結合部位のみを分離し
たものでもよい。例えば、パパイン，ペプシンな
どのプロテアーゼで処理して得られるFab部分，
Fab′部分，Ｆ（ab′）2部分などを使用することもで
きる。Fab′部分の調製法については石川らの報
告がある〔スカンジナビアン ジヤーナル オブ
ザ イムノロジー（Scand.J.Immunol.）第８
巻，43ページ，1978年）。
そのままでもよいが、抗原結合部位のみを分離し
たものでもよい。例えば、パパイン，ペプシンな
どのプロテアーゼで処理して得られるFab部分，
Fab′部分，Ｆ（ab′）2部分などを使用することもで
きる。Fab′部分の調製法については石川らの報
告がある〔スカンジナビアン ジヤーナル オブ
ザ イムノロジー（Scand.J.Immunol.）第８
巻，43ページ，1978年）。
生体体液成分による干渉作用を抑制あいは除去
するために用いる疎水性緩衝液としてはゼラチン
など、塩類としては、食塩などが用いられる。
するために用いる疎水性緩衝液としてはゼラチン
など、塩類としては、食塩などが用いられる。
本発明によればこのように、測定しようとする
ヒトエノラーゼを生体体液成分による影響も受け
ず、高感度で精度の高い測定が可能となり更に、
自動測定系への応用も容易である。
ヒトエノラーゼを生体体液成分による影響も受け
ず、高感度で精度の高い測定が可能となり更に、
自動測定系への応用も容易である。
本発明によるヒトエノラーゼの定量方法を利用
して体液（例えば血液，能脊髄液，尿など）中の
NSEを定量することにより神経組織あるいは発
生学的に神経細胞に近い細胞、例えば神経内分泌
細胞を含む組織（脳下垂体前葉，甲状腺，膵臓ラ
ンゲルハンス氏島，副腎など）の破壊を伴う疾患
及びそれらの組織から発生する腫瘍などの疾患の
早期診断，治僚効果の判定及び予後の良否の判定
に有効である。
して体液（例えば血液，能脊髄液，尿など）中の
NSEを定量することにより神経組織あるいは発
生学的に神経細胞に近い細胞、例えば神経内分泌
細胞を含む組織（脳下垂体前葉，甲状腺，膵臓ラ
ンゲルハンス氏島，副腎など）の破壊を伴う疾患
及びそれらの組織から発生する腫瘍などの疾患の
早期診断，治僚効果の判定及び予後の良否の判定
に有効である。
又、ある種の癌（例えば食道癌，腎臓癌，直腸
癌，膵臓癌，肝臓癌など）のうち悪性の未分化癌
患者の体液中にNSEが多量に存在すること及び
良性の癌ではNSEレベルが上昇しないことがわ
かり、このような疾患の診断などにも本発明の方
法は有用である。
癌，膵臓癌，肝臓癌など）のうち悪性の未分化癌
患者の体液中にNSEが多量に存在すること及び
良性の癌ではNSEレベルが上昇しないことがわ
かり、このような疾患の診断などにも本発明の方
法は有用である。
本発明のヒトエノラーゼの定量方法は従来の定
量法よりも数十倍の感度で、微量のヒトエノラー
ゼが定量できるため前記目的のためには極めて有
用である。
量法よりも数十倍の感度で、微量のヒトエノラー
ゼが定量できるため前記目的のためには極めて有
用である。
以下実施例により詳細に説明する。
実施例 １
(1) 抗血清の調製
抗γ血清はウシ脳より鈴木らの方法〔F.
Suzuki，（ジヤール オブ ザ バイオケミスト
リー（J.Biochem.）第87巻，1587〜1594ページ，
1980年）に従い精製したγγエノラーゼでウサギ
を免疫して作成した。
Suzuki，（ジヤール オブ ザ バイオケミスト
リー（J.Biochem.）第87巻，1587〜1594ページ，
1980年）に従い精製したγγエノラーゼでウサギ
を免疫して作成した。
(2) エノラーゼ特異抗体及びそのＦ（ab′）2フラグ
メントの調製 ウサギ３匹より得た抗血清100mlに冷却下（４
℃）硫酸アンモニウムを50％飽和になるように加
え1gG（イムノグロブリンＧ）画分を沈澱させた。
沈澱を遠心分離（10000×ｇ，15分，４℃）して
集め、0.1％NaN3を含む0.1Mリン酸緩衝液（PH
7.0）に溶解し、室温で同じ緩衝液に透析した。
次にこれを抗原結合セフアロース4B
（Sepharose4B、フアルマシア社製）カラム（1.0
×20cm）に通した。カラムに吸着した抗体の溶離
は1MNaCIを含む0.1Mグリシン−塩酸緩衝液
（PH2.5）により行つた。溶離して来た精製抗体画
分を集め、中和したのち、減圧下コロジオンバツ
ク（SM13200、ザートリウス社製）で濃縮し、
約15mgの抗体IgGを得た。これにペプシン1.6mg
（ブタ腸粘膜由来、シグマ社製）を加えて、37℃、
16時間処理しＦ（ab′）2フラグメントを得た。
メントの調製 ウサギ３匹より得た抗血清100mlに冷却下（４
℃）硫酸アンモニウムを50％飽和になるように加
え1gG（イムノグロブリンＧ）画分を沈澱させた。
沈澱を遠心分離（10000×ｇ，15分，４℃）して
集め、0.1％NaN3を含む0.1Mリン酸緩衝液（PH
7.0）に溶解し、室温で同じ緩衝液に透析した。
次にこれを抗原結合セフアロース4B
（Sepharose4B、フアルマシア社製）カラム（1.0
×20cm）に通した。カラムに吸着した抗体の溶離
は1MNaCIを含む0.1Mグリシン−塩酸緩衝液
（PH2.5）により行つた。溶離して来た精製抗体画
分を集め、中和したのち、減圧下コロジオンバツ
ク（SM13200、ザートリウス社製）で濃縮し、
約15mgの抗体IgGを得た。これにペプシン1.6mg
（ブタ腸粘膜由来、シグマ社製）を加えて、37℃、
16時間処理しＦ（ab′）2フラグメントを得た。
(3) 抗体Fab′−Gal複合体の調製
抗体Ｆ（ab′）2フラグメントを２−メルカプトエ
チルアミンで還元しFab′（SH）フラグメントと
してから、過剰のＮ，N′−ｏ−フエニレンジマ
レイミド（Ｎ，N′−ｏ−Phenylendimaleimide、
アルドリツヒ社製）溶液中に加えて反応させ、マ
レイミド−Fab′を得、これをβ−Ｄ−ガラクト
シダーゼ（以下Galと略す・ベ−リンガー社）と
を反応結合させた。Fab′−Gal複合体量はGal活
性で表わし、1unit活性＝1μmole生成物／minで
ある。こうして10mgのＦ（ab′）2から調製された酵
素標織抗体は約７万〜８万検体分の測定に使用で
きる。
チルアミンで還元しFab′（SH）フラグメントと
してから、過剰のＮ，N′−ｏ−フエニレンジマ
レイミド（Ｎ，N′−ｏ−Phenylendimaleimide、
アルドリツヒ社製）溶液中に加えて反応させ、マ
レイミド−Fab′を得、これをβ−Ｄ−ガラクト
シダーゼ（以下Galと略す・ベ−リンガー社）と
を反応結合させた。Fab′−Gal複合体量はGal活
性で表わし、1unit活性＝1μmole生成物／minで
ある。こうして10mgのＦ（ab′）2から調製された酵
素標織抗体は約７万〜８万検体分の測定に使用で
きる。
(4) 抗体結合固相の調製
ポリスチレンビーズ（径6.5mm、セキスイ化学
株式会社製）に抗体Ｆ（ab′）2フラグメントを物理
的吸着させた。即ち適当に希釈した上記Ｆ（ab′）2
溶液（PH7.0、A280≒0.5）中に、ポリスチレンビ
ーズ片を浸し、４℃で一夜放置し、抗体溶液を回
収した後、固相を0.01Mリン酸緩衝液（PH7.0）、
次いでＡ液〔0.01Mリン酸緩衝液、PH7.0、含
0.1MNaCl，1mMMgCI2，0.1％牛血清アルブリ
ン（BSA），0.1％NaN3）でよく洗つて、Ａ液中
４℃で２日間以上保存後測定に用いた。抗体Ｆ
（ab′）2溶液は反復使用が可能で、抗体結合固相は
少なくとも一ケ年は安定であつた。
株式会社製）に抗体Ｆ（ab′）2フラグメントを物理
的吸着させた。即ち適当に希釈した上記Ｆ（ab′）2
溶液（PH7.0、A280≒0.5）中に、ポリスチレンビ
ーズ片を浸し、４℃で一夜放置し、抗体溶液を回
収した後、固相を0.01Mリン酸緩衝液（PH7.0）、
次いでＡ液〔0.01Mリン酸緩衝液、PH7.0、含
0.1MNaCl，1mMMgCI2，0.1％牛血清アルブリ
ン（BSA），0.1％NaN3）でよく洗つて、Ａ液中
４℃で２日間以上保存後測定に用いた。抗体Ｆ
（ab′）2溶液は反復使用が可能で、抗体結合固相は
少なくとも一ケ年は安定であつた。
(5) 測定操作
標準エノラーゼを含むＧ液（0.01Mリン酸緩衝
液、PH7.0、含0.3MNaCI，1mMMgCI2，0.1％
BSA，0.5％ゼラチン，0.1％NaN3）0.5mlに抗体
結合ビーズを一個ずつ入れ、30℃で振盪した。５
時間後に反応液を吸引除去して、試験管内で固相
を洗つた（Ａ液１ml×２回）。Ａ液で希釈した酵
素標識抗体（３ｍunits／0.2ml）中に固相を移
し、４℃で一夜静置した。翌日反応液を吸引除去
し、Ａ液で固相を洗つてから、固相上に結合した
Gal活性を測つた。Gal活性は、ｏ−ニトロフエ
ニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ｏ−
nitrophenyl−β−Ｄ−galactopyranoside）を基
質とし、生成したｏ−ニトロフエニール（ｏ−
nitrophenyl）を分光高度計で測定した。
液、PH7.0、含0.3MNaCI，1mMMgCI2，0.1％
BSA，0.5％ゼラチン，0.1％NaN3）0.5mlに抗体
結合ビーズを一個ずつ入れ、30℃で振盪した。５
時間後に反応液を吸引除去して、試験管内で固相
を洗つた（Ａ液１ml×２回）。Ａ液で希釈した酵
素標識抗体（３ｍunits／0.2ml）中に固相を移
し、４℃で一夜静置した。翌日反応液を吸引除去
し、Ａ液で固相を洗つてから、固相上に結合した
Gal活性を測つた。Gal活性は、ｏ−ニトロフエ
ニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ｏ−
nitrophenyl−β−Ｄ−galactopyranoside）を基
質とし、生成したｏ−ニトロフエニール（ｏ−
nitrophenyl）を分光高度計で測定した。
使用した４種類のエノラーゼ標準品は前に述べ
た鈴木らの方法によつて調製した。最終標品は
SDSゲル電気泳動的に他の蛋白は検出されなかつ
た。精製エノラーゼの含量はバイオ ラド プロ
テイン アツセイ法〔M.M.Bradford：アナリテ
イカル バイオケミストリー（Anal.Biochem.）
第72巻，248〜254ページ，1976年）に従つて測定
した。
た鈴木らの方法によつて調製した。最終標品は
SDSゲル電気泳動的に他の蛋白は検出されなかつ
た。精製エノラーゼの含量はバイオ ラド プロ
テイン アツセイ法〔M.M.Bradford：アナリテ
イカル バイオケミストリー（Anal.Biochem.）
第72巻，248〜254ページ，1976年）に従つて測定
した。
これらエノラーゼ標準品（約１mg／ml）は
2.5mMMgCI2，50％グリセリンを含む30mMリ
ン酸緩衝液（PH6.8）中で、−30℃において少なく
とも３ケ月間免疫活性的に安定である。
2.5mMMgCI2，50％グリセリンを含む30mMリ
ン酸緩衝液（PH6.8）中で、−30℃において少なく
とも３ケ月間免疫活性的に安定である。
４種のエノラーゼの検量線を第１図に示す。図
中−●−はウシγγエノラーゼを、−○−はヒトγγ
エノラーゼを、−▲−はヒトαγエノラーゼを−◇
−はヒトααエノラーゼを、−△−はヒトββエノラ
ーゼを表わす。γγエノラーゼ測定系は最少約50p
ｇの感度で測定でき、ウシγγエノラーゼをウサ
ギに免疫することにより作成した抗体を用いた測
定系にヒトγγエノラーゼは100％交差反応した。
ヒトααエノラーゼ，ヒトββエノラーゼの交差反
応は認められなかつた。
中−●−はウシγγエノラーゼを、−○−はヒトγγ
エノラーゼを、−▲−はヒトαγエノラーゼを−◇
−はヒトααエノラーゼを、−△−はヒトββエノラ
ーゼを表わす。γγエノラーゼ測定系は最少約50p
ｇの感度で測定でき、ウシγγエノラーゼをウサ
ギに免疫することにより作成した抗体を用いた測
定系にヒトγγエノラーゼは100％交差反応した。
ヒトααエノラーゼ，ヒトββエノラーゼの交差反
応は認められなかつた。
ハイブリツト型ヒトαγエノラーゼは約30％交差
反応した。
反応した。
実施例 ２
ラツトの脳より精製したγγエノラーゼでウサ
ギを免疫して作成した抗体をヒトエノラーゼを用
いるアフイニテイークロマトグラフイーで精製
し、これを用い実施例１と同様に燥作し、検量線
を求めた。本実施例では抗体結合固相にはシリコ
ン片（径３mmのひも）を長さ４mmに切つた円柱を
使用し、固相上に結合した酵素活性の測定には４
−メチルウンベリフエリル−β−Ｄ−ガラクトシ
ド（４−methylumbelliferyl−β−Ｄ−
galactoside）を基質とし、生成した４−メチル
ウンベロリフエロン（４−methylumbelliferon）
を螢光光度計で測定した。結果を第２図に示す。
本実施例の方法では、実施例１と同様に極微量の
ヒトNSEが定量可能である。
ギを免疫して作成した抗体をヒトエノラーゼを用
いるアフイニテイークロマトグラフイーで精製
し、これを用い実施例１と同様に燥作し、検量線
を求めた。本実施例では抗体結合固相にはシリコ
ン片（径３mmのひも）を長さ４mmに切つた円柱を
使用し、固相上に結合した酵素活性の測定には４
−メチルウンベリフエリル−β−Ｄ−ガラクトシ
ド（４−methylumbelliferyl−β−Ｄ−
galactoside）を基質とし、生成した４−メチル
ウンベロリフエロン（４−methylumbelliferon）
を螢光光度計で測定した。結果を第２図に示す。
本実施例の方法では、実施例１と同様に極微量の
ヒトNSEが定量可能である。
第１図はウシ脳のγγエノラーゼをウサギに免
疫して作成した抗体を反応系に使用した場合のエ
ノラーゼアイソザイムの検量線を示す。第２図は
ラツト脳のγγエノラーゼを免疫して作成した抗
体を反応系に使用した場合のγγエノラーゼの検
量線を示す。 第１図，第２図において−●−はウシγγエノ
ラーゼを、−○−はヒトγγエノラーゼを、−▲−
はヒトαγエノラーゼを、−◇−はヒトααエノラー
ゼを、−△−はヒトββエノラーゼをそれぞれ表わ
す。
疫して作成した抗体を反応系に使用した場合のエ
ノラーゼアイソザイムの検量線を示す。第２図は
ラツト脳のγγエノラーゼを免疫して作成した抗
体を反応系に使用した場合のγγエノラーゼの検
量線を示す。 第１図，第２図において−●−はウシγγエノ
ラーゼを、−○−はヒトγγエノラーゼを、−▲−
はヒトαγエノラーゼを、−◇−はヒトααエノラー
ゼを、−△−はヒトββエノラーゼをそれぞれ表わ
す。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 抗エノラーゼ抗体結合固相に検体中のヒトエ
ノラーゼを反応せしめて得られる反応物に酵素標
識抗エノラーゼ抗体を作用せしめるか又は検体中
のヒトエノラーゼと酵素標識抗エノラーゼ抗体を
反応せしめて得られる反応物を抗エノラーゼ抗体
結合固相に反応せしめることによつて抗エノラー
ゼ抗体を介してヒトエノラーゼ及び酵素標識抗エ
ノラーゼ抗体を固相に固定化せしめた後、固相に
結合した該標識酵素活性を測定することにより検
体中のヒトエノラーゼ量を求める方法において、
抗エノラーゼ抗体として霊長類を除く動物由来の
エノラーゼに対する抗体で、かつヒトエノラーゼ
に対する反応性が抗ヒトエノラーゼ抗体と同等で
ある抗エノラーゼ抗体、あるいは必要に応じて精
製した、ヒトエノラーゼに対する反応性が抗ヒト
エノラーゼ抗体と同等である抗エノラーゼ抗体を
用いることを特徴とするヒトエノラーゼの定量方
法。 ２ 動物由来のエノラーゼに対する抗体が牛又は
豚のエノラーゼを用いて作成した抗エノラーゼ抗
体である特許請求の範囲第１項記載のヒトエノラ
ーゼの定量方法。 ３ 動物由来のエノラーゼに対する抗体がヒトエ
ノラーゼを用いるアフイニテイークロマトグラフ
イーで精製されたラツト又はウサギ由来のエノラ
ーゼを用いて作成した抗エノラーゼ抗体である特
許請求の範囲第１項記載のヒトエノラーゼの定量
方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57081776A JPS58198758A (ja) | 1982-05-15 | 1982-05-15 | ヒトエノラーゼの定量方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57081776A JPS58198758A (ja) | 1982-05-15 | 1982-05-15 | ヒトエノラーゼの定量方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS58198758A JPS58198758A (ja) | 1983-11-18 |
| JPH038515B2 true JPH038515B2 (ja) | 1991-02-06 |
Family
ID=13755876
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP57081776A Granted JPS58198758A (ja) | 1982-05-15 | 1982-05-15 | ヒトエノラーゼの定量方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS58198758A (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100910962B1 (ko) * | 2008-09-22 | 2009-08-05 | 한국생명공학연구원 | Ｅｎｏ１―특이적인 인간항체 |
| JP5872285B2 (ja) * | 2011-12-28 | 2016-03-01 | 株式会社島津製作所 | 腎がん血中マーカー |
| WO2016155652A1 (en) * | 2015-04-01 | 2016-10-06 | Sy-Jye Leu | Antibodies against infectious diseases |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5347518A (en) * | 1976-10-07 | 1978-04-28 | Mochida Pharm Co Ltd | Immunologically measuring method |
| JPS56118671A (en) * | 1980-02-22 | 1981-09-17 | Amano Pharmaceut Co Ltd | Measuring method of specific enzyme immunity of hybrid type protein |
-
1982
- 1982-05-15 JP JP57081776A patent/JPS58198758A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS58198758A (ja) | 1983-11-18 |
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