JPH0643167A - 癌マーカーであるテネイシン及びその定量法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】本発明は、癌マーカーとしてのテネイシン及び
該テネイシンを測定する方法に関する。 【構成】体液中のテネイシンを免疫学的方法により測定
し、対照水準と比較し、高水準の存在を確認し、癌とし
ての診断的指示を示す癌マーカーとしてのテネイシン及
び該免疫学的測定によるテネイシンの測定方法に関す
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、癌マーカーとしてのテ
ネイシン及び該テネイシンを定量する方法に関する。よ
り詳細には、体液中のテネイシンを定量し、対照水準と
比較し、高水準の存在を確認し、癌としての診断的指示
を示す癌マーカーとしてのテネイシン及び免疫学的測定
によるテネイシンの定量方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】テネイシンは、細胞外物質である糖蛋白
質で、1984年にChiquetとFambroughによって、Ｖ型コラ
ーゲンに対するモノクローナル抗体を作製する過程で、
Ｖ型コラーゲンとは異なる特異な染色性を示す抗体の抗
原として発見された〔ジャーナル オブ セル バイオ
ロジー（J. Cell Biol.）98巻，1926−1936頁，1937−1
946頁，（1984）〕。

【０００３】今日、テネイシンの様々な生理作用は、明
らかにされつつある。初期に発見されたテネイシンの機
能としては血球凝集活性があり、それはフィブロネクチ
ンよりも強い活性を有することから、組織形成の場にお
いて制御的に作用することが示唆されている〔生体の科
学，39巻，８月号（1988）〕。

【０００４】また、他の分子との非共有結合的相互作用
としてフィブロネクチン〔セル（Cell），53巻，383−3
90頁（1988）〕やプロテオグリカン〔ジャーナル オブ
セル バイオロジー，98巻，1926−1936頁（1984）〕
が報告されている。

【０００５】更には、細胞接着活性〔ジャーナル オブ
セル バイオロジー，105巻，138a〕や増殖促進活性
〔セル，４７巻，131−139頁（1986）〕などの生理活性
が明らかにされており、細胞増殖や形態形成に重要な役
割を担っていると考えられる。

【０００６】テネイシンは、最初は癌胎仔抗原と考えら
れ、その後、ヒトテネイシンに対するいくつかのモノク
ローナル抗体がとられ、種々の癌におけるテネイシンの
発現が調べられた。

【０００７】また、最近になって、血清中にテネイシン
が存在することも明らかにされている〔キャンサー リ
サーチ（Cancer Res.），51巻，4853−4858頁（199
1）〕。テネイシンを定量する方法には従来より数々の
方法が報告されている。例えば、

【０００８】 抗ニワトリテネイシンに対するモノク
ローナル抗体とウサギポリクローナル抗体を使用したＥ
ＬＩＳＡ法により、ヒト骨肉腫組織及びニワトリ胚脳中
のテネイシンを測定〔アナルズ ニューヨーク アカデ
ミー オブ サイエンス（Annals New York Academy of
science）,580巻,260−275頁（1990）〕

【０００９】 メラノーマ患者血清とモノクローナル
抗体を混合し、引き続き固相に結合させたテネイシンと
反応させることより、反応終了後に固相上のテネイシン
に結合するモノクローナル抗体量をＲＩＡ法で測定〔キ
ャンサー リサーチ（Cancer Res.）51巻，4853−4858
頁（1991）〕が報告されている。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、これら
には多くの問題点があった。即ち、の方法における問
題点は以下のような点が挙げられる。 （ａ） ニワトリのテネイシンに対する抗体を使用して
いるため、ヒト組織のテネイシンを測定する場合、交差
率が求められていないため、正確な値とは断定できな
い。 （ｂ） 組織抽出液と正常ヒト血漿の測定結果だけで癌
患者を対象としてテネイシン量の測定は行われていな
い。

【００１１】また、の方法における問題点は以下のよ
うな点が挙げられる。 （ａ） 血清中のテネイシンによる抗体の固相に結合さ
せたテネイシンへの阻害が、相対的に阻害％として示さ
れているだけで正確にテネイシン量が求められていな
い。 （ｂ） 測定値がメラノーマの一種で正常人に比べて高
い阻害率が認められているが、他の癌ではあまり差は認
められない。

【００１２】上記に述べたような問題点に対し、本発明
者らはヒト細胞の培養液よりヒトテネイシンを調製し、
得られたヒトテネイシンを抗原としてラット及びウサギ
に免疫した。これより抗ヒトモノクローナル抗体及び抗
ヒトポリクローナル抗体を作製し、更にこれらの抗体を
使用して免疫測定試薬を調製し、初めてヒト血清中のテ
ネイシンの濃度を正確に定量すると共に、これまで明ら
かでなかった上皮癌以外の様々な癌患者血清中にもテネ
イシン量が正常人に比べ高値になる割合が著しく高くな
ることを発見し、新しくテネイシンを癌マーカーとして
利用できることを見い出して本発明を完成した。

【００１３】

【課題を解決するための手段】本発明は生体体液中の癌
マーカーとしてのテネイシンを検定することにより、人
間における癌の存在及び状態を検出する方法を提供する
ものである。即ちテネイシンを癌マーカーとして定量す
る本発明により、診断において癌の検出或いは各種癌治
療の状態変化乃至予後の再発又は転移の可能性を検出す
ることが可能である。

【００１４】本発明は上記に述べたヒトテネイシンの定
量法も提供する。例えば、好適な定量法であるヒトテネ
イシンに対する特異的抗体を用いる免疫測定法に関し、
その一例を詳細に説明する。

【００１５】ヒトテネイシンは、例えば特開平２−5649
9号公報に記載の方法によりヒト細胞から調製、精製す
ることができる。このようにして調製されたヒトテネイ
シンを用い、例えば特開平２−219590号公報に記載の方
法に従ってヒトテネイシン抗体を得ることができる。即
ち、ヒトテネイシンをそのまま若しくは適当なアジュバ
ンドと混合して動物の皮内、腹腔内などに注射する。こ
の操作を１〜２週間隔で繰り返して免疫する。免疫した
動物の細胞を骨髄腫細胞と細胞融合しヒトテネイシン抗
体を産生するハイブリドーマを得ることができる。ポリ
クローナル抗体は上記と同様に動物にヒトテネイシンを
免疫後、抗体産生の確認された動物の血清中より得るこ
とができる。

【００１６】使用する抗体は調製したイムノグロブリン
分画そのものでも使用できるが、更にヒトテネイシンと
の結合部位のみを分離した F(ab')₂, Fab', Fab などの
分画として使用することもできる。

【００１７】一方、高度に精製したヒトテネイシンを用
いて、検出可能な標識物質と結合させた標識ヒトテネイ
シンを作成する。検出可能な標識物質としては、その検
出感度がヒトテネイシンの定量法に必要とされる検出感
度に充分なものを選択する必要がある。具体的には各種
放射性同位元素、各種酵素、蛍光物質、金属イオンなど
があり、更に好ましくは ¹²⁵Ｉ、¹³¹Ｉ、β−Ｄ−ガラ
クトシダーゼ、パーオキシダーゼ、アルカリホスファタ
ーゼ、グルコースオキシダーゼ、マレートデヒドロゲナ
ーゼ、フルオレセイン、メチルウンベリフェロン、マグ
ネシウムなどがあげられる。

【００１８】これら検出可能な物質とヒトテネイシンと
の結合は、既知の方法が用いられる。例えば、放射性同
位元素を用いる場合にはクロラミンＴ、ヨードゲン（ピ
アス社製・登録商標）などの試薬が用いられ、酵素の場
合には二官能性試薬によるカップリング法、過沃素酸酸
化法などが応用できる。

【００１９】このようにして得られた標識ヒトテネイシ
ン中には、本来目的とする標識ヒトテネイシンの他に、
検出可能な物質とヒトテネイシンとの結合数の異なるも
の、検出可能な物質がヒトテネイシンへの結合操作中に
一部変化し本来の活性を失ったもの、結合反応に関与し
なかった検出可能な物質そのもの、あるいは検出可能な
物質がヒトテネイシンに結合しなかったヒトテネイシン
そのものなどが混入していることがある。そこで定量の
感度を上げるためには目的とする標識ヒトテネイシンの
みを上記の混合物から分離することが好ましい。このた
めの方法としてはイオン交換クロマトグラフィー、ゲル
ろ過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラ
フィーなどが利用できる。

【００２０】上記以外にヒトテネイシンの定量に必要な
試薬としては、抗体を直接結合させた水不溶性担体があ
る。更に水不溶性担体に不溶化させる抗体に結合する因
子があり、抗体はイムノグロブリンであるから結合する
因子としては抗イムノグロブリン抗体、即ち第二抗体を
用いることができる。その他イムノグロブリン結合蛋白
質である微生物由来のプロテインＡ、プロテインＧなど
も用いることができる。これら結合する因子は抗体の結
合量を上げるためにアフィニティークロマトグラフィー
等の手段により高度に精製しておくことが好ましい。結
合する因子を不溶化するための水不溶性担体としては、
各種の多糖ゲル、ポリスチレンなどの合成樹脂で作られ
た粒子、ビーズ、試験管、その他の小容器、同様の形態
のガラス、金属などの他、ニトロセルロース、ナイロン
などの合成薄膜などが適している。

【００２１】これら水不溶性担体への結合する因子の不
溶化法としては、物理的吸着、共有結合などの化学的結
合が利用できる。例えば物理的吸着法では、一定濃度の
結合する因子の溶液にポリスチレンビーズ等を入れ、一
定時間放置することによりポリスチレンビーズ等に結合
する因子を物理的に不溶化することができる。この際、
不溶化に際して結合する因子の溶液を絶えず動かすこと
により水不溶性担体表面に結合する因子を均一に不溶化
することができる。又、結合する因子の溶液を15〜40℃
に保つことにより短時間に不溶化することができる。化
学的結合法では、各種カップリング用試薬、例えば臭化
シアン、グルタルアルデヒド、過沃素酸ナトリウム、カ
ルボジイミド誘導体、シラン剤、マレイミド誘導体、サ
クシニイミドエステル、オキシラン化合物、トシルクロ
ライド、カルボニルイミダゾール等々が用いられる。

【００２２】このようにして調製された水不溶性担体に
不溶化された該抗体に結合する因子は、ヒトテネイシン
の定量に際してそのまま用いるのは好ましくない。即
ち、そのまま用いた場合、水不溶性担体の表面、あるい
は結合する因子の不溶化のために利用された化学的に活
性な反応基が定量に際して反応液成分を非特異的に吸着
結合し測定感度の悪化をもたらすのである。これを防止
するためには、結合する因子を不溶化した後の水不溶性
担体の表面を処理することが好ましい。この処理法とし
ては、結合する因子を不溶化した後の水不溶性担体を十
分に洗浄した後、水不溶性担体の表面を不活性化する方
法が好ましい。水不溶性担体の表面を不活性化するため
には、アルブミン、ゼラチン、その他の蛋白を１種以上
含む溶液、各種アミノ酸、その他のアミノ基を持つ化合
物の溶液、還元剤、酸化剤などが各々単独もしくは組み
合わせて用いることができる。

【００２３】このようにして調製された試薬を用いてヒ
トテネイシンを定量する。まず、生体体液（例えば髄
液、血清、血漿、組織抽出液、細胞抽出液等）の一定量
と抗体を結合させた水不溶化担体と緩衝液の一定量を反
応させる。この時の全反応液量は50〜1000μlが好まし
い。緩衝液としてはアルブミン、ゼラチンなどの一種以
上の蛋白質を0.01〜１％含むpH４〜pH8.5の緩衝液が好
ましく、反応温度は２℃〜40℃が好ましい。

【００２４】反応時間は測定感度に影響する重要な因子
であり、操作性も考慮すると10分〜４日が好ましい。次
いでこの反応液に検出可能な物質で標識されたヒトテネ
イシンを加え、更に反応を行う。反応温度及び時間は上
と同じく２℃〜40℃、10分〜４日が好ましい。

【００２５】反応後、水不溶性担体を水又は適当な緩衝
液で洗浄し、水不溶性担体に結合した検出可能な物質を
測定する。上記操作を既知濃度のヒトテネイシンを含む
標準液についても行い、標準液の測定値と生体体液の測
定値を比較することにより生体体液中のヒトテネイシン
の濃度を定量することができる。

【００２６】上記以外の公知の免疫学的測定方法を利用
してヒトテネイシンを定量することも、もちろん可能で
ある。

【００２７】このようにして定量した生体体液中のテネ
イシン量を指標としてヒトにおける癌の存在を検出する
ために使用することができる。そのためには臨床的に確
立した癌患者、正常な患者及び良性腫瘍を有する患者か
ら統計的に有意な数の生体体液試料を本発明の方法で定
量し、これらの測定で得られるヒトテネイシン濃度を正
常な試料に見いだされた水準と癌患者のそれとを比べる
と癌患者においては著しく高いことが見いだされた。従
って、正常状態と癌患者のテネイシン量の間に任意の対
照水準線を引くことが可能である。次いで未知の試料に
ついて本発明の方法の１つの方法に従ってヒトテネイシ
ンを定量し、そのテネイシン量が対照水準より過剰の濃
度で存在するかどうかを決定することにより、被検体の
癌の可能性について評価を下すことが可能である。

【００２８】検体としての生体体液に髄液を用いた場合
には、グリオーマ（Glioma）等の悪性腫瘍患者の髄液中
にテネイシンが見いだされ、悪性腫瘍以外の疾患におい
ては髄液にテネイシンが実質的に検出されないことが判
明した。即ち、悪性腫瘍であるアストロサイトーマ（As
trocytoma）患者、グリオブラストーマ（Glioblastom
a）患者、脳幹グリオーマ患者、脳腫瘍患者等の髄液中
には検出され、良性疾患である脳梗塞患者、脳出血患
者、髄膜炎患者、頸椎症変形性脊椎症患者等の髄液には
テネイシンが実質的に検出されない。これにより、患者
の髄液中のテネイシンを測定することにより、癌の可能
性について評価を下すことが可能である。

【００２９】このような検定を行うことによって、癌患
者の治療の有効性などの判断資料とすることも可能であ
り、再発或いは転移の判断資料としても活用することが
可能である。

【００３０】以下、本発明の実施例について更に詳細に
説明する。尚、本発明はこれらに限定されるものではな
い。また、本実施例で用いた抗原及び抗体は以下のよう
にして調製した。

【００３１】抗原 ヒトメラノーマ細胞の10％牛胎児血
清を含むダルベッコ変法イーグル培地／ハムＦ１２培地
における培養液から精製したものを用いた（特開平２−
56499）。

【００３２】抗体 ポリクローナル抗体としては、ま
ずヒトメラノーマ細胞由来テネイシンをウサギの皮下に
0.5mg／neadずつ週１回、３週間投与し、最終投与３週
間後より毎週耳静脈より採取し、抗血清を得た。

【００３３】次に得られた抗血清を50％飽和硫安塩析，
DEAE−celluloseによるイオン交換クロマトグラフィ
ー、更にCNBr−活性化Sepharose4B（ファルマシア製）
に抗原を結合させたアフィニティーカラムによるクロマ
トグラフィーで精製したものを使用した。

【００３４】モノクローナル抗体としては、ヒトフィブ
ロブラスト細胞由来テネイシンを免疫したラットから取
り出したリンパ球とX63Ag8，653ミエローマ細胞を融合
して得られたハイブリドーマHTN2-8C9及びHTN2-9B2の培
養液を45％を飽和硫安塩析、Protein G アフィニティー
クロマトグラフィーにより精製したものを使用した（特
開平２−219590）。

【００３５】

【実施例】

実施例１ （１）抗体結合固相の作製 ポリクローナル抗体、又はモノクローナル抗体をpH7.0
のリン酸緩衝液に溶解し、固相としてのポリスチレンビ
ーズを浸漬することにより、その表面に結合させた。

【００３６】（２）各種標識物結合抗体及び標識物結合
テネイシンの作製 抗体又はテネイシンへの標識酵素としては酵素免疫測定
法で一般的に使用されているパーオキシダーゼ、β−Ｄ
−ガラクトシダーゼ又はアルカリフォスファターゼで標
識した。

【００３７】抗体は、IgG，IgGをペプシン処理すること
により得られるF(ab')₂、更にF(ab')₂を還元剤により還
元することにより得られるFab'、IgGをパパイン処理す
ることにより得られるFabを使用した。放射能ラベルの
場合は、¹²⁵ＩをクロラミンＴを用いた方法により抗体
又はテネイシンに標識した。

【００３８】（３）標識酵素活性測定法 酵素活性を発色法、蛍光法、発光法につき測定した。用
いた標識酵素及び基質を表１に示した。

【００３９】

【表１】

【００４０】尚、表中でAMPGDは3-(4-Methoxyspiro[1,2
-dioxetane-3,2'-tricyclo[3.3.1.^3,7]decan]-4-yl)phe
nyl-β-glactopyranosideを示し、AMPPDは3-(4-Methoxy
spiro[1,2-dioxetane-3,2'-tricyclo[3.3.1.^3,7]decan]
-4-yl)phenyl-phosphateを示す。 （４）免疫測定法 免疫測定法はサンドイッチ法と競合法を実施した。

【００４１】サンドイッチ法 検体10μｌに抗体結合ポリスチレンビーズ（直径6.5m
m）１ケ、10mMリン酸ナトリウム緩衝液0.5ml（0.1％ B
SA，0.1M NaCl）を加え、37℃で３時間反応させた。反
応終了後、ビーズを洗浄し、各種標識抗体溶液0.5mlを
加え、４℃で一夜反応させた。

【００４２】反応終了後、ビーズを洗浄し、ビーズ上に
結合した標識物を測定した。酵素活性は37℃で測定し、
発色法は60分、蛍光法は30分、発光法は30秒で測定し
た。放射能は放射活性をシンチレーションカウンターを
用いて測定した。

【００４３】競合法 検体10μｌに抗体結合ポリスチレンビーズ（直径6.5m
m）１ケ、各種標識物で標識したテネイシンを溶解した1
0mMリン酸ナトリウム緩衝液 0.5mlを37℃で３時間反応
させた。反応終了後、ビーズを洗浄し、ビーズ上に結合
した標識物を測定した。酵素活性は37℃で測定し発色法
は60分、蛍光法は30分、発光法は30秒で測定した。放射
能は放射活性をシンチレーションカウンターを用いて測
定した。

【００４４】（５）標準テネイシンの測定 標準ヒトテネイシン溶液10μｌにウサギ抗ヒトテネイシ
ンポリクローナル抗体F(ab')₂を結合させた直径6.5mmポ
リスチレンビーズ１ケ、10mMリン酸ナトリウム緩衝液
（pH7.0、0.1% BSA，0.1M NaCl）0.5mlを加え、37℃
で３時間反応させた。

【００４５】反応終了後、ビーズを洗浄し、β−Ｄ−ガ
ラクトシダーゼで標識したラット抗ヒトモノクローナル
抗体F(ab')₂溶液0.5mlを加えて、４℃、一夜反応させ
た。反応後、基質として発色基質はクロロフェノールレ
ッド−β−Ｄ−ガラクトピラノシド溶液0.5mlを加え、
蛍光基質は４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラ
クトピラノシド溶液0.5mlを加えて、それぞれ37℃、１
時間及び30分の酵素反応を行い、酵素反応停止液として
発色法は１％ガラクトース溶液２ml、蛍光法は0.1Mグリ
シン−NaOH緩衝液（pH10.3）２mlを加えて酵素反応を停
止した。発色法は575nmで吸光度を、蛍光法は励起波長3
90nm、測定波長460nmで蛍光強度を測定した。標準ヒト
テネイシンの測定結果を図１に示した。発色法の測定感
度は、１ng／Tube、蛍光法は0.1ng／Tubeであった。

【００４６】（６）血清中のテネイシン量の定量 正常人と癌患者の血清中のテネイシン量を定量した。測
定系での血清使用量は10μｌで（５）と同じ方法で測定
し、酵素活性は蛍光法により測定し、それぞれの検体の
蛍光強度を標準線の蛍光強度から読み取り、テネイシン
量として求めた。

【００４７】正常人に比べ癌患者の血清中のテネイシン
量に高値を示す割合が著しく高くなることが確認され
た。その結果を図２に示す。

【００４８】実施例２ 実施例１と同様にして、各種脳腫瘍患者の随液中におけ
るテネイシン量を測定した。その結果を表２に示す。

【００４９】

【表２】

【００５０】その結果、悪性腫瘍であるグリオーマ患者
の随液中にはテネイシンが検出された。また、頸椎症変
形性脊椎症患者の髄液（11検体）、髄膜炎患者の髄液
（10検体）、脳梗塞患者の髄液（９検体）、脊椎小脳変
形症患者の髄液（６検体）、脳硬化症患者の髄液（３検
体）、神経症患者の髄液（２検体）、脳出血患者の髄液
（１検体）、多発性神経炎患者の髄液（１検体）、パー
キンソン症患者の髄液（１検体）、痴呆症患者の髄液
（１検体）、ハンチントン症患者の髄液（１検体）、脊
椎空洞症患者の髄液（１検体）、球脊髄筋萎縮症患者の
髄液（１検体）等の他の良性疾患の患者の髄液からは、
検出されなかった。

【発明の効果】本発明により、ヒトテネイシンを精度良
く定量することが可能となり、定量された生体体液中の
テネイシン量を、対照水準と比較することにより、テネ
イシンの高水準の存在を確認し、癌としての診断的指示
を示すことが可能となった。

【図面の簡単な説明】

【図１】標準ヒトテネイシンの検量線を示すものであ
り、図中で黒丸は蛍光法、白丸は発色法の結果を示す。

【図２】正常人及び癌患者の血清の中のテネイシンの定
量結果を示すものである。図中の癌患者血清の結果で黒
丸は肺癌、黒四角は膵臓癌、白丸は肝臓癌、白四角は大
腸癌、黒三角は胃癌の各患者血清の測定結果を示す。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】生体体液中のヒトテネイシンを生体外で癌
   マーカーとして定量する方法。
2. 【請求項２】ヒトテネイシンを含む生体体液試料を、ヒ
   トテネイシン特異的抗体との交差反応を利用し、該ヒト
   テネイシンを生体外で免疫学的に定量することを特徴と
   するヒトテネイシンの定量法。
3. 【請求項３】対照水準より高濃度のヒトテネイシンの存
   在が癌の診断的指示である請求項２記載の定量法。