JPH0387171A - 回流式培養装置 - Google Patents

Abstract

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め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 この発明は、ヒト細胞を含む動物細胞、植物細胞、藻類
等の微生物細胞を大量に培養し、しかも高密度で長時間
にわたって保持できる培養装置に関する。また分泌物質
生産並びに細胞物質生産用の培養装置、物質代謝用バイ
オリアクター、並びに体外用の人工臓器等として使用で
きる細胞培養並びに細胞保持装置に関する。

〔従来技術〕

ヒト細胞を含む動物細胞が生産する各種インターフェロ
ン、各種モノクローナル抗体、各種増殖因子、プラスミ
ノーゲン活性化因子のほか、ウィルス感染細胞にあって
はウィルス抗原蛋白質なとの有用物質は産業上きわめて
価値の高いものてあリ、医薬品及び試薬として広く利用
されていることは、よく知られているところである。

また、皮膚ケラチノサイト、血管内皮細胞、肝細胞、膵
臓ランゲルハンス細胞を培養して、皮膚移植、ハイブリ
ッド型人工血管、人工臓器、並びに移植に使用すること
か実験段階では成功している。中でも人工肝臓は、大量
の肝細胞を培養した体外培養装置を人工血管を通じて生
体と結合させ、急性期の肝機能障害を克服しようとする
ものである。

このようなヒト細胞を含む動物細胞等の微生物の培養に
おいては、該微生物を大量に培養することが必要であり
、しかも高密度で長時間にわたって保持しなければなら
ない。

そこで、物質生産を対象とする動物細胞の培養に例をと
って、その従来技術をみると以下のようなものがある。

（１）静置単層培養法 この方法は、壁付着性のある細胞をガラス、プラスチッ
ク等の平坦な基質の表面に付着させた状態で静置培養す
る技術であって、中でもプラスチック培養瓶は、用途が
広い。そして、この方法によって大量の細胞を培養する
技術としては、多層のプラスチック平板を直方体内に１
ジユール化して広い表面を付与した培養容器か代表的技
術である（Ｗｅｉｓｓ、　Ｒ，Ｓ、　＆　５ｃｈｌｅｉ
ｃｈｅｒ、　Ｊ、Ｂ、、　Ｂｉｏｔｅｃｈ。

Ｂｉｏｅｎｇ、　１０：６０１−６１６　（１９６８）
）　、この方法は、培養液の一部、或いは全部をある一
定期間ごとに交換し、必要に応じて培養細胞も回収或い
は更新する培養方法、即ち回分培養法によって操作する
のか普通である。付着性細胞培養の最も基本的な形であ
るが、培養装置自体当たりの細胞数か小さく、培養液の
交換に多大の人力を要するなど、大規模な培養には限界
があると共に、ディスポーザブルな装置であるためにコ
ストが高い。

（２）可動式単層培養法 静置単層培養法の限界となる培養液の供給特性、ガス交
換特性、細胞付着面積についての問題を一部解決したの
がこの方法であって、細胞が付着している薄板を様々な
動的な手段で培養液や気相に接触させる工夫かなされた
。円筒状の培養瓶（ローラーボトル）の内部側面に細胞
を付着させて回転させつつ培養する技術（回転瓶培養法
）はその代表的な例である。更にローラーボトルの内部
に波状のプラスチック薄板と平面のプラスチ・ツク薄板
を交互に巻き込んだタイプ（Ｓｔｅｒｉｌｉｎ。

Ｂｕｌｋ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｖｅｓｓｅｌ、　５ｔｅｒ
ｉｌｉｎ　Ｌｔｄ、、　Ｔｅｄｄｉｎｇｔｏｎ、　Ｍｉ
ｄｄｌｅｓｅｘ）など、基質表面積を増大させる工夫が
様々になされてきた。可動式単層培養法は、培養装置自
体、或いは培養基質を回転させることによって、細胞と
培養液並びに気相との接触を図る装置であって、基質を
固定した状態で培養液を流動させる培養法に関する本発
明に関連するものではない。

（３）微粒子担体培養法 この方法は、細胞付着性のある浮遊性の微粒子を培養液
内に分散し、機械力によってこの微粒子を懸垂状態とし
て、ここに細胞を付着あるいは捕捉増殖せしめる培養法
（マイクロキャリアー培養）てあって、これに使用され
る多種の微粒子担子（マイクロキャリアー）が開発され
、また付着性の弱い細胞を付着させ、あるいは捕捉する
微粒子担体も開発されている（Ｖａｎ　Ｗｅｚｅｌ、　
Ａ、Ｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ。

２１６：６４−６５　（１９６７）、　Ｖａｎ　Ｗｅｚ
ｅｌ、　Ａ、Ｌ、　ｉｎ　ＡｎｉｍａｌＣｅｌｌ　Ｂｉ
ｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、　ｅｄ、　ｂｙ　５ｐｉｅｒ
、　Ｒ，′ＰＪ、　＆　Ｇｒｉｆｆｉｔｈ、　Ｊ、Ｂ、
、　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｌｏｎｄｏｎ、
　Ｖｏｌ、１゜２６５−２８２　（１９８５））。この
方法は上記の単層培養と比較して、培養容器の容積あた
り高い細胞付着表面積を得ることが可能であるため、付
着性細胞に対する標準的な大量細胞培養技術である。そ
して、微粒子を懸垂状態に維持するために、インペラー
回転子、気泡などが用いられている。微粒子担体培養法
は細胞に与える損傷や攪拌技術などに一部困難があるに
も拘らず、付着性細胞について汎用されている大量培養
技術の一つであるが、本発明に関連するものではない。

即ち、微粒子担体培養においては基質そのものを浮遊攪
拌せしめるか、本発明ではそのような微粒子基質を利用
することもできるか、培養液のみを流動させるものであ
る。

（４）中空糸型細胞培養法 この方法は、透析に使用する人工腎臓に類似した装膜を
使用する培養法てあって、中空糸を多数束ねた管の間隙
に細胞を閉じ込め、中空糸内には培養液を還流させて、
細胞に栄養分を供給し、またガス交換を図りつつ増殖さ
せるもので、これによって生体内に近い細胞密度を達成
することができるものである（Ｋｎａｚｅｋ、　Ｒ，Ａ
、、　Ｇｕ！１ｉｎｏ、　Ｐ、Ｍ。

Ｋｏｈｌｅｒ、　Ｐ、Ｏ，＆　５ｃｉｅｎｃｅ、　１７
８：６５−６６　（１９７２）、　Ｔｙｏ。

Ｍ、Ａ、、　Ｂｕｌｂｕｌｉａｎ　Ｂ、、Ｊｌ、　Ｍｅ
ｎｋｅｎ　Ｂ、Ｚ、、　Ｍｕｒｐｈｙ。

Ｔ、、　Ｊ、Ａｎｉｍａｌ　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｔｅｃｈ
、　３：３５７−３７１　ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ
、　Ｌｏｎｄｏｎ　（１９８８））　ｏまた、中空糸に
付着しない細胞についても中空糸の束の間に捕捉するこ
とによって培養が可能である。本培養方法も多用される
現代技術の−っであるが、本発明と関連するものではな
い。即ち、中空糸培養法は細胞か存在する側と培養液を
供給する側とが半透性を有する膜面によって隔てられ、
そのような膜面か細管状の中空糸をなすことを特徴とす
る培養法であって、本発明においてはそのような中空糸
を利用することもてきるが、中空糸の半透性に拘りなく
、他の基質も利用することが可能である。

（５）不動化細胞培養法 この方法は、通水性及び細胞付着性或いは細胞不動化さ
せる性質のある基質に細胞を付着、不動化させ、ここに
培養液を通液して、栄養を与えると共にガス交換並びに
老廃物の除去を図る培養法であって、マトリックスとし
て、ガラス繊維、セラミックモジュール等が使用され、
付着性の弱い細胞も捕捉することから応用範囲が広いも
のである。この培養技術に属するもののうち、有孔セラ
ミックモジュールを内装するジャケットにポンプを用い
て培養液を流通させ、流通した培養液を更にガス交換器
、新鮮培養液供給装置、使用する培養回収装置等を回路
に接続した潅流培養装置（Ｏｐｔｉｃｅｌｌ培養装置）
が汎用されている（　Ｌｙｄｅｒｓｅｎ、　Ｂ、に、、
　Ｐｕｇｈ、　Ｇ、Ｇ、、　Ｐａｒｉｓ、　Ｍ、Ｓ、、
　Ｓｈａｒｍａ。

Ｂ、Ｐ、、　＆　Ｎｏ１ｌ、　Ｌ、Ａ、Ｐ　Ｂｉｏｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｙ　３：６３−６７（１９８５））。本
発明は不動化細胞培養法の範嗜に属するものであるが、
０ｐｔｉｃｅｌｌ培養法を始めとする従来技術と関連す
るものではない。即ち、本発明では有孔セラミックモジ
ュール、ガラス繊維を始めとするあらゆる素材を通水性
及び細胞を不動化し得る形態に加工した素材を基質とし
て内包し得る培養装置並びに培養方法に関するものであ
って基質を特定するものではない。

（６）浮遊培養法 この方法は、付着性の少ない細胞を培養液内に浮遊させ
た状態で培養する方法であって、原理的には微生物の懸
濁培養法と同じである。そして、動物細胞では培養液を
攪拌するとき剪断力を受は細胞が障害を受けるため、さ
まざまな工夫がされている。本技術も現代的な大量培養
における汎用技術であるが、不動化細胞培養技術に関す
る本発明とは関連しないものである。

〔発明が解決しようとする課題〕

以上のような従来の細胞培養法には、下記のような問題
点がある。すなわち、 （１）細胞の損傷 細胞を浮遊状態に維持する目的で外部から負荷する機械
力によって、細胞が受ける機械的損傷がある。細胞壁を
持たない動物細胞を浮遊培養、あるいは微粒子担体培養
する場合に特に問題となる点であって、細胞密度を高め
たり、また培養装置のスケールアップを妨げる重要な要
因の一つとなっている。

（２）培養の長期維持 培養容器、基質、機械要素の疲労細胞の増殖と死、並び
に物質生産に伴う培養環境の変化によって培養の長期維
持が困難となる。単層培養にあっては細胞層の剥離、浮
遊培養にあっては細胞分離装置やガス交換装置の目詰ま
り、微粒子担体培養にあっては微粒子の団塊化や細胞の
剥離、中空糸培養や不動化培養なとの潅流培養にあって
はポンプＡの負荷の増大などが問題となる。

（３）培養方法の一般性 細胞の付着性のあるなし、あるいは強弱により、従来の
培養方法はそれぞれ限られた細胞種にしか適用できない
場合が多い。例えば微粒子担体培養法、多層式培養法の
場合では付着性の強い細胞種てないと培養が困難である
。逆に、浮遊培養では０ 付着性細胞を培養することは困難である。

（４）ガス交換 細胞の代謝に伴って消費される酸素を供給し、産生され
る炭酸ガスを除去する能率は細胞培養の密度を高める上
で、一つの重要な制限因子である。

静置単層培養法においては、表面通気の効率か低いこと
が細胞増殖の大きな制限因子である。

気泡を培養液にスパージングする方法は、能率の高いガ
ス交換法であるか、動物細胞の培養については、いくつ
かの問題点がある。すなわち、培養液に生ずる泡の処理
、気泡によって生じる培養液中のタンパク質の界面変性
、或いは細胞障害である。

これらの問題点は、ガス透過性のチューブを培養液内に
配置して、ガスを供給する方法によって、一部解決され
、このチューブ法によってきわめて効率の高いガス交換
が可能となった。しかし、このチューブ法では、培養容
器内でのチューブ表面の目つまりによる交換能率の変化
かあり、長期間の連続培養では問題となる。

１ （５）細胞と培養液の分離及び培養液供給浮遊細胞培養
法、微粒子担体培養法における細胞分離には、自然沈降
、遠心分離あるいは膜分離か行われる。また大量培養法
においては沈澱管を装置し、細胞、あるいは細胞の付着
した微粒、子と培養液の密度差を利用して、細胞、ある
いは細胞の付着した微粒子を回収しつつ、使用済み培養
液を除去する方法もしばしば使用されている。

平面単層培養法あるいはマトリックスに細胞を付着させ
た状態での培養法では、この点あまり問題とならないが
、浮遊細胞培養法あるいは微粒子担体培養法では分離装
置の目詰まり或いは分離能力が重要な問題となる。また
、培養システムが高密度の細胞培養に進むにつれて、細
胞と培養液の分離、さらには培養液の供給能力において
問題か生じており、これら分離装置に高い処理能力と耐
用能力か求められている。

（６）精製工程への影響 細胞の生産物か培養液中に放出されるタイプの培養では
培養液か生産物以外にどのような物質を２ 含むかによって精製工程の負担が大きく異なってくる。

例えば細胞損傷の大きな培養法では損傷細胞から細胞蛋
白質やＤＮＡが多量に培養液中に放出されこれらが精製
の負担を増大させる。

（７）装置の信頼性 細胞培養装置の高性能化に伴い、装置の運転のためにさ
まざまなパーツが必要となってきている。

培養容器と培養基質以外の主要なものを挙げても、機械
的なものとして、回転子、インペラーあるいはバイブレ
ータ−、ポンプとそれらの駆動部分、コック類、チュー
ブ、脱着装置があり、モニター装置として、酸素電極、
ｐＨ電極、炭酸ガス電極、圧力センサー、温度センサー
がある。その他、ガスの供給装置、排出ガスのコンデン
サーとフィルター、定温水供給装置、培養液供給装置が
あり、さらにはシステムの滅菌装置、及び全体をつなぐ
システムの自動制御装置がある。これらの制御装置の複
雑化はやむをえないことであるが、その結果、装置のコ
スト高、機械的信頼性の低下、長期運転への不安及び汚
染の問題等が生している。そ３ して、新規な技術開発にあたっても、結果として装置の
信頼性を増すものであるかどうかが決定的な役割を果す
。

（８）培養の経済性 物質生産を目的とする細胞培養を例にとってみると、培
養の経済性には培養装置の信頼性とコスト、培養の規模
が重要な因子である。しかし、やはり達成できる細胞密
度は一つの重要な技術的課題であることは確かである。

ちなみに、達成できる細胞密度は、通常の浮遊培養、あ
るいは単層培養ではｎＸ１０’個／　ｃｒｄの水準であ
り、微粒子担体培養ではｎＸ１０７個／　ｃｉの水準で
あり、また中空糸培養の培養では１０８個／　ｃｒｄが
達成されている。

パイブリドーマ細胞の培養のように、動物に移植して物
質生産できる場合と比較して考えれば１０８個／　ｃｒ
ｄに近い高密度を達成することが一つの目標となる。

（本発明の目的） この発明の目的は、ヒト細胞を含む動物細胞、植物細胞
、藻類等の微生物細胞の機械的損傷を防４ ぎ、培養を長期安定に維持てき、広範な微生物に適用で
き、微生物と培養液間の栄養物及び老廃物の交換、並び
にガス交換を容易にしかも高効率で行うことができ、混
入物の少ない培養上清を得ることかでき、さらには高い
容積当り微生物の培養密度を達成でき、長期運転でも信
頼性のある培養装置を提供することにある。

〔課題を解決するための手段〕

この発明の回流式培養装置は次のように構成されている
。

脱着可能な蓋を上面に有する培養容器と、該培養容器内
の所定場所に適宜な基質支持体により設置された、微生
物か付着状態あるいは不動化状態で増殖するための空間
を有する基質と、基質に培養液を回流するための回転手
段を収納する回流誘導室と、必要により前記基質の外周
を覆うように形成された回流誘導筒と、基質上面に設置
された気流誘導板よりなる培養器を基本部分とし、その
他必要に応じて公知の或いは本発明のために工夫された
内圧維持装置、排出ガスフィルター乾燥装置５ 置、培養液供給装置、回転手段の駆動装置、ガス供給装
置、定温水供給装置、各種モニター・センサー装置並び
にシステムの自動詞′御装置等とから構成されている。

培養容器の形状は培養液の回流を効率よくするために、
高さに比して直径を大きく（例えばｌ：２程度）かつ培
養容器の底面と円筒状の側壁との接続面は緩やかな曲線
を描くように形成されることが好ましく、蓋の形状は平
板状でも円弧状でもよく、該蓋にはガスの供給口や排出
口、培養液供給口などの他、のぞき窓、酸素電極や温度
センサーの取付口等適宜設けてよい。培養容器の材質は
、内部を透視できるガラスやステンレス、ポリカーボネ
ー１〜等の耐熱性のプラスチックが使用できる。

前記基質は、通水性の多数の小さな空間を有する基質実
体部分と、該基質実体部分を上下方向に貫通する培養液
の流下孔よりなる円柱状或いは多角柱形状の構造体であ
る。本発明の基質の素材は、微生物を付着あるいは不動
化し得る表面を有しある程度の機械的強度を有するもの
であればよく６ 、織布や通水性多孔体よりなる素材例えば／Ｓニカム構
造のセラミック・モジュールの他、不織布状の繊維、多
孔質素材、細管の束、或いは蜂の巣状のもの等が使用て
き、例えばガラス繊維、動植物繊維、合成繊維等の繊維
や、ガラス、プラスチ・ンク等の多孔質素材やフィルム
あるいはハニカムセラミックモジュールが使用できる。

必要に応じて素材表面を処理して微生物の付着性あるい
は不動化性を高めてもよい。

基質素材に応じて基質の形状のバリエーションが考えら
れるが後述するように回流装置との連携て、培養液が、
基質内の空間に付着増殖している微生物に接触しつつ基
質内を上方に向って均一にしかも高速に移動できるよう
な形状に作成する事か肝要て、このことから次に述べる
培養液の回流装置との組合せて当業者なら考えつくであ
ろう基質の形状のバリエーションは本発明に妥当に包含
されてよいことは明らかである。基質の上面は培養容器
内の上部に設けられた気流誘導板の下に位置するように
、基質の下面は前記培養液の流下孔７ が培養容器の底部に設置した回転手段を収納する回流誘
導室の上部開口部と接続するように、基質の外周側壁は
培養容器内周側壁に近接して配置するように、基質支持
体によって培養容器内に保持される。

基質を前記のように培養容器内に支持固定する基質支持
体は、基質を構成する素材によって適宜選択可能であり
限定されない。

基質素材に織布を用いた場合、該織布を帯状に裁断し、
その基端部を中空円筒状の筒体或いはスペーサー（後述
）に固定したのち、中空円筒状の外周を織布と不織布の
間を所定間隔に保ちながら渦巻き状に巻いていき、最終
的には培養容器の内周側壁に近接するまで巻いていって
基質を形成する。この時織布と織布の渦巻き間隔を一定
に保持するために、例えば中空円筒状の筒体の外周壁の
上端部および下端部に放射状に一定間隔に複数個のアー
ムを配設し、このアームに設けられたスペーサー挿入孔
にスペーサーを挿入し、挿入されたスペーサーの上から
織布を巻きつけ、−巻きした８ ところで次のスペーサーを挿入し織布を巻きつけ、順次
スペーサーを挿入しなから織布を巻いていく方法をとる
ことかできる。この場合渦巻き状に巻かれた織布と織布
の間隙や織布の織目か前記基質の小さな多数の空間に相
当し、中空円筒状の筒体が前記培養液の流下孔に相当す
る。培養容器の内周側壁と基質外周側壁との間に生した
空隙には後述する筒状回流誘導筒を設ける。巻き込んた
織布を緊張させるためにスペーサーをアームの上て外周
方向に引き寄せるための螺子を設けてもよい。

基質素材に通水性多孔体よりなる素材例えばハニカム状
のセラミックモジュールを使用する場合は、ハニカムを
構成する小空間か上下方向に通しるように円柱状に基質
を形成し、基質の水平断面の形状は培養容器の内壁側壁
に若干の空間を有するように形成するのが好ましいか接
していてもよい。基質の一部には培養液流下用の筒状の
空間か設けられる。或いはセラミックスをそれぞれ径の
異なる中空筒体に形成し、最も径の大きな中空筒体に順
次径の小さいものを挿入していって同心円９ 状の基質としてもよい。培養容器の内周側壁と基質外周
側壁との間に生した空隙には後述する筒状回流誘導筒を
設けることが望ましいが、空隙がない場合は省略しても
よい。基質支持体は前記セラミックモジュールを培養容
器内、回転誘導室上に固定するための構造体だけでもよ
い。

基質は適当な基質支持体により培養容器内に前記のよう
に収納固定されるが、回流誘導質も前記培養液流下孔の
下端に一体的に接続して形成してもよい。

培養液下孔の下端と接続した回流誘導室はその下端が培
養容器の底面に密着或いは近接して設置されており、回
転手段を収容する小室の役割を果たしている。回流誘導
室の形状は室内の液が高速の回転に適したものが用いら
れる。例えば、水平断面が円形で全体として円錐台形、
椀を倒立させた形状或いはロートを倒立させた形状など
をとり得る。回流誘導室には培養液流出用の孔が複数箇
所所定間隔で設けられている。この回流誘導室の材質は
ステンレス、ポリカーボネートその他の耐０ 熱性のプラスチック等である。そしてこの中には回転手
段が水平方向に回転自在に収納されており、培養容器の
外部の対応位置に設置した駆動部に接続して直接的に或
いはマグネットにより間接的に回転させられる。回転手
段の形状は羽根型のインペラー、棒状回転子、先細棒状
回転子、円盤状回転子など多用の形状のものが使用でき
る。回転子が培養器底面に接触する場合にはガラスある
いはステンレスなどの薄板を挿入して培養器底面を保護
することができる。

培養容器の内側壁と基質外周との間に設けた空隙に回流
誘導筒を設ける。該回流誘導筒は基質外周側壁を覆い、
その大きさは該回流誘導筒の上端部は、培養容器の内側
壁と該回流誘導筒の間に存在する培養液が前記上端部か
ら基質上の運動時に形成される培養液面にオーバーフロ
ーして流入しない程度の高さに位置し、その下端が培養
容器の基質の少なくとも底部近くに位置するような大き
さとする。回流誘導筒の上部には培養液の液面に対応す
る位置に複数個の孔か設けられている。

１ 培養液面と培養容器の蓋との間の気相空間にはガスの導
通孔を有する気流誘導板が配置され、該気流誘導板は培
養液面をある間隔をおいて覆う。

その垂直断面は前記気相空間の垂直断面形状に対応した
バリエーションを取り得る。小型の培養容器にあっては
気流誘導板を省略することも可能である。

以上の他、排気ガスから水分を回収するコンデンサー、
或いは逆に排気ガス並びに排気ガスフィルターを保温す
ることによって水蒸気の凝縮を防ぐ保温ジャケット、培
養液を供給・排出するチューブ並びにポンプ、培養容器
内に時として発生する泡を除去するためのチューブ並び
にポンプ、微生物を供給するチューブ並びにポンプ、サ
ンプルを取得するチューブ並びにポンプ、酸素電極、ｐ
Ｈ電極、表面通気だけでなく膜通気で酸素ガスを供給す
べく培養容器内の底部或いは外部に設置した通気性チュ
ーブ、或いは通気性チューブを装備するガス交換器、培
養容器に必要に応じ取付する保温ジャケットとそれへの
温水等の供給装置、加２ 圧した酸素ガス、炭酸ガスおよび空気供給源と供給を調
節する電磁弁並びにそれらを接続するチューブ、容器内
圧センサー並びに圧力超過防止装置、新培養液のタンク
、使用済み培養液のタンク、以上のものを結合する各種
チューブ類、コネクター類、スイッチ類、更にはそれら
を総合的に制御する電子制御装置等か培養目的や規模等
に応じて本発明の培養装置に適宜取付けできる。また、
透明な容器でない場合に培養容器内を観察できる小窓や
必要に応して培養容器内でのガスの回流を助ける目的で
エアポンプ或いは外部駆動式のファンを設置することが
できる。本培養装置の付属装置の一つとして培養細胞サ
ンプリング装置を設置することができる。例として基質
と同質の素材の小片をガラス、プラスチック、セラミッ
ク或いは金属の棒の一端に付着または挟み込んで基質内
部に押入し、他の一端を培養器に取り付けたフックに懸
架し、細胞を付着させて培養すると共に、適当な時期に
フックから外して無菌的に培養器外に取り出すことがで
きる。

３ 〔作　用〕 回流誘導室の中に収納されている回転手段は培養容器の
外部の駆動力により回転する。この時、回流誘導室か回
転手段の周辺の培養液の回転速度を効率的に高め培養液
に遠心力を付与する。このようにして高速になった回流
誘導室内の培養液は回流誘導室に設けられた多数の孔を
通過して基質下面から高速かつ均一に基質内に流入して
上昇し培養液の回流を促進することとなる。

更に、回流誘導筒の上端が、本培養装置の運転時形成さ
れる培養液面よりも高く形成しであるのでこの回流誘導
筒と培養容器内側壁との空隙にある培養液面は、基質上
の培養液面より高く回流誘導筒の上部孔より通過した培
養液のみが回流に参加する。これは培養液が前記空隙に
滞留することにより培養容器内の諸条件が不均一となる
のを避けるためである。従って、殆どの空隙内の培養液
は基質内に流入することとなり培養液の効率的な回流が
行われることとなる。

基質の外周側壁が培養容器の内側壁に密着して４ いる場合は回流誘導室から高速で流出した培養液は、基
質下面の全面に均一に導かれる。

以上のようにして基質内の空間に流入した培養液は該空
間を形成する基質に付着或いは巻き込まれて不動化した
微生物に栄養物を供給し、微生物によって産出された有
用物質や老廃物を運びだしつつ基質内の空間を上昇し基
質の上面に達し基質上にある高さの培養液面が形成され
る。次いて基質内の一部に設けられた培養液流下孔に流
入し流下孔を下降して再び回流誘導室内に流入し前記の
ことを繰り返しながら基質内を一定方向に回流する。そ
の結果基質の多数の空間に付着あるいは不動化した微生
物は培養されることとなる。基質に形成された多数の空
間により微生物の大量培養が可能となり、又微生物にか
かる剪断力が小さくなることにより微生物の損傷が減少
する。また細胞は常に一定方向の液流中にある基質の表
面或いは凹凸面に付着或いは不動化させられているから
、培養液中に細胞の断片や死骸更にはそれらの構成成分
など、培養上清からの有用物質の抽出の妨げ５ となるような物質が培養上清に浮遊して混入する機会が
減少する。本培養装置では繊維或いは表面に多数の凹凸
面のある素材を基質として使用することにより、これら
の基質素材に一旦付着或いは不動化した細胞は剥離する
機会が少なくなる。これらの特性は培養の長期維持を可
能とさせるものである。また、付着性の弱い細胞も容易
に基質内にとどまることが可能となる。

基質に多数の連通ずる空間があり、細胞か基質に付着或
いは不動化している本培養装置では、培養液を連続的に
交換することは勿論、短時間のうちに使用済み培養液を
回収し、新しい培養液に更新する回分培養も可能となる
。

気流誘導板の作用は次の通りである。

本発明においては培養容器の底部或いは外部に通気性の
チューブ（例えば、シリコンチューブや有孔テフロンチ
ューブ等）或いは通気性チューブを内装したガス交換モ
ジュールを配設して培養液のガス交換を行ってもよいが
、気流誘導板をそのガス導通孔と基質内の培養液流下孔
とが対応する６ ように設置することにより上面通気のみても相当ガス交
換が可能であり、小型の培養装置にあってはこれら付属
ガス交換装置を必要としないほどの能力を持たせること
ができる。すなわち培養容器の蓋に設けられたガス供給
口より培養容器内に流入したガスは培養液の表面に当た
り気流誘導板と培養液の液面との間を培養液とガス交換
しながら培養液の流れに沿って流れ、気流誘導板に設け
られた孔に達し、この孔から抜けたガスは蓋に当り、周
辺に拡散して一部か蓋に設けた排出口により排出され、
残りは培養容器」二部内面と気流誘導板との間を外周方
向に流れ培養容器内側面にぶつかり再び気流誘導板と培
養液の液面との間をガス交換してから気流誘導板の孔に
向って流れる。このようにガスは気流誘導板をはさんで
回流することとなり、ガス交換が能率的に行われる。エ
アポンプ或いは駆動式のファンを使用して強制的にガス
の回流を加速した場合には液面の流れとガスの流れに流
れの差が生じ更にガス交換の効率が高められる。

７ 本発明にある培養装置はその機械的な信頼性について従
来技術を超える作用を行うことができる。

装置の基本となる機能要素、すなわち培養液の供給、排
出、細胞と培養液の分離、ガス交換、培養液の循環を、
補助的に外部付属装置を使用して行うことももちろんで
きるか、すへて−個の容器を中心として行うことが可能
である。また、可動部分すなわち液送ポンプや回転子の
駆動体にそれぞれフレキシブルなチューブやマグネット
を介して行うタイプのものを採用することかでき、完全
な閉鎖系として汚染の機会を排除することかできる。

さらに、本培養装置においてはその細胞と培養液の分離
やガス交換にしばしば信頼性に欠けるフィルター類を使
用しないことが可能である。採用している表面ガス交換
法や培養液回流法はフィルターに比較するとはるかにそ
の信頼性並びに耐用性が大きい。また、本培養装置にあ
っては培養液の輸送、ガスの輸送あるいは細胞の供給に
わたるチューブ／ポンプシステムの全般にわたって高圧
負荷を避けることか可能であり、チューブ／ポンプ８ システムの全般にわたって高い耐久性を付与することが
できる。以上に要約したように、本発明による培養装置
にあっては装置の細部から全般にわたるあらゆる部分て
高い機械的な信頼性を期待することができる。

本発明にある培養装置はその経済性において従来技術を
超える作用を行うことができる。経済性にかかわる信頼
性についてはすでに述べた。細胞密度についての試算を
行うと以下のようである。

本発明による装置で、基質にガラス繊維を使用する場合
を例にとり、基質内で繊維の間隔を２ｍｍに保つとする
と、Ｉｃｎｆ当りの表面積は繊維の面が平滑面であると
仮定したときにｌ０ｃｎｆである。比較・例として多層
型の静置培養装置の一例であるセルフアクドリー■ては
、培養器１基の容積か１２１、その表面積か６，０００
ｃｉである。本発明によって同容積の基質で培養する場
合には１１あたり１２０、０００ｃｎｆ、すなわち培養
容積換算でセルフアクドリーの２０個分の能力を有する
。本発明による培養装置では基質を収納するための容器
や付属装置か９ あるために、実際の装置の容積は基質容積より大きくな
る。一方で上の試算ては繊維面を平滑としているが実際
の繊維はさらに数倍の表面積を有している。結局、本装
置が容積当り高い付着面積を提供するものであることが
明らかである。本発明による培養装置では消耗する部分
がガラス繊維等きわめて安価な素材であり、セルフアク
ドリーがディスポーザブルであることと比較すると維持
コストはきわめて安い。回流培養装置を無菌的な閉鎖系
から解放系にまで拡大して藻類細胞等を培養する場合を
想定すると数百立方メートルにまで拡大することになん
ら原理的な困難はない。以上のように本発明による培養
装置はその経済性にかかわるさまざまな要素について従
来技術を超える作用を示すものである。

〔実施例〕

○培養装置作製の実施例 以下、４種の培養装置の作製実施例、即ち培養装置実施
例１〜４について述べる。培養装置作製実施例１及び４
　　（８００ｍ（！培養装置）では、容器の０ 内径が１０．５ｃｍ、内容積１．０００ｍ１’のステン
レス製上蓋付きガラス容器を培養容器とした。培養装置
作製実施例２　（ＩＯＡ培養装置）では、内径３０ｃｍ
、内容積１０Ａのステンレス製上蓋付きポリカーボネー
トプラスチック容器を培養容器とした。培養装置作製実
施例３　（５０ｊ７培養装置）では内径６０ｃｍ、内容
積５０ｊｌ’のステンレス製上蓋付きステンレス製容器
を培養容器とした。

以下、この発明の回流式培養装置作製の４実施例を図面
に基づいて詳述する。４実施例とも培養容器の形状はほ
ぼ類似しているのでまとめて述へることとする。第１図
において、■は、培養容器てあり、上部に蓋２を取付す
ることにより密閉容器となっている。この培養容器ｌの
形状は、培養液３を効率よく回流させる都合上、高さに
比して直径が大きく、略ｌ：２程度の円筒状のもので、
底面外周辺と円筒状の側壁とは緩やかな曲線を描いたも
のとし、培養液の回流をスムーズにしている。蓋２には
図示するガス供給口１９及びガス排出口２０が設けられ
ている。培養容器１の外周部に必１ 要に応しジャケット（図示していない）を取付して培養
容器１を保温できるものとする。

培養装置作製実施例１．　２及び３ではガラス繊維の織
布を基質素材とした。ガラス繊維は厚み０．１３ｍｍ、
３０本の単繊維をまとめた繊維束を１ｍｍ間隔に平織り
とした織布であって、重量７５ｇ／ｒｒｆのものを使用
した。

培養容器ｌ内には、織布９が第３図（１）に示すように
基質支持体ＩＯに渦巻き状に多層に巻付けられ基質を形
成している。この基質支持体１ｏは、第２図（１）、　
（２）に示すように、中央部の円筒状の筒体５の外側上
端部及び下端部外側の対応位置に放射方向に伸びるアー
ム６．６′　が一定間隔で取付けられており、前記下端
の末端には、リング８が取付けられている。上、下のア
ーム６．６°にはスペーサ７が挿入可能なガイド孔か穿
設されている。

筒体５、上、下のアーム６．６’、スペーサ７およびリ
ング８にて構成されたものを基質支持体ｌ。

という。基質支持体１０を培養容器ｌ内の所定位置に安
定に保持し、かつ、基質支持体１ｏの下端（す２ ング８の位置）と培養容器】の底面との間に一定間隔（
後述する、円錐状回流誘導室１３と回転子１５を設ける
ことができる間隔）を確保するためにリング８の下端と
適合する支脚１１を設ける。

本実施例では、織布は第３図（１）に示すような基質支
持体１０に次のように取付されている。対応する上下の
アーム６．６°の間隔とほぼ同じ長さの幅を有するシー
１へ状の織布９をまず、筒体５にその一端を固定して巻
き付け、次に対応する上、下アーム６．６′　の孔に第
４図に示すような構造のスペーサー７を差し込み、巻き
付けた織布９上に位置させた後、織布９をこの差し込ん
だスペーサー７を巻き込むようにして巻く。これを繰り
返すことによって第３図（１）に示すように、基質支持
体１０にはスペーサー７によって一定間隔に保たれた渦
巻き状の多層の織布９よりなる基質４が形成される。

基質支持体１０の筒体５の下部には、この筒体５の直径
と同じ直径の開口部を上部に有する円錐状の回流誘導室
１３が取付されている。この回流誘導３ 室１３には、その側壁に数個の孔１４が等間隔に設けら
れ、回転子１５を覆うようにして培養容器１の底部にそ
の下端か接するように設けられている。回流誘導室１３
内の回転子１５は外部のマグネチックスクーラー（図示
せず）によって駆動回転させられる。基質４の外周には
基質４を覆う回流誘導筒１２が設けられその上端は培養
液３の液面より突出し、かつ、その下端は、基質４の底
部近くまでの長さを有するように形成されている。回流
誘導筒１２の上部円周には培養液３の液面に対応する位
置に複数個の孔１６が穿設されている。

培養液３と培養容器の蓋２の間の気相空間には培養液上
面に気相を能率よく接触させるべく、これらの間に、中
央部に孔１８を有する円盤状の気流誘導板１７が配置さ
れている。

培養装置作製実施例４では基質４の素材としてハニカム
状セラミックを用いた（第５図）。使用したハニカム状
セラミックは組成がＭｇＯ：Ａ１２０３ＳＩ０２＝　２
　：　２　：　５のものである。断面か１辺２ｍｍの正
四角型をなすハニカムが高さ５ｃｍの円柱状の４ 素材内を密に並行して上下方向に貫通した構造で、円柱
の中心線を軸とする直径４．０ｃｍの円柱状の穴を穿っ
た形状の物を使用した。この基質４の内孔に直径３．８
ｃｍ、高さ５．５ｃｍのステンレス製の筒体５を内装す
る（第２図（３））。筒体５の下部に水平方向に長さ３
．２ｃｍの８本のステンレス製の支持棒（６”　）をそ
れぞれ円周を８等分する間隔て張りたさせ、さらに支持
棒の先端に高さ２ｃｍのステンレス製の支柱を設けた基
質支持体１０を設けた。筒体５の下部には円錐状回流誘
導質１３を培養装置作製実施例１と同様に取り付けた。

培養装置作製実施例１から４にわたって、その大きさに
は大小あるものの、それぞれに以下のような付属装置を
蓋にあるいは側面から取り付けた。

即ちポーラログラフイータイブの酸素電極釜１基ならび
に酸素分圧の数値をコンピューターに送るインターフェ
イス各１基、酸素分圧の数値によってコンピューターで
制御する電磁弁ならびにマニュアルフローメーターによ
って流量を調節可能とする酸素ガス供給用チューブ並び
に無菌フィルタ５ ．５％ＣＯ２を含む空気を流量を調節可能として供給す
るマニュアルフローメーター、チューブなよびに無菌フ
ィルター、マグネチックスターラー細胞浮遊液供給チュ
ーブならびにペリスタルティックポンプ、培養液供給チ
ューブならびにペリスタルテツィクポンプ、培養液排出
チューブならびにペリスタルテツィクポンプ、排気ガス
排出チューブ、フィルターならびに排気チューブとフィ
ルターを併せて保温し、乾燥状態に保つ温風供給器、な
らびに培養容器をジャケットに通水することによって保
温するための恒温水槽と水流ポンプである。また、チュ
ーブの無菌的着脱を行うためのステンレス製コネクター
を必要箇所に配置した。その他の条件については培養実
施例にも一部記載している。

以上のようにこの発明の実施例は構成されているので、
培養装置作製実施例１〜４を通じて共通して、次のよう
に作用する。すなわち、回転子１５の回転により、培養
容器１底部の培養液３は回転し遠心力が与えられる。そ
して、円錐状回流誘導６ 室１３か、回転子１５を覆うようにして設けられている
ため、回転子１５の周辺で培養液３の回転速度を効率的
に高めることができ、このようにして高速になった培養
液３は、この円錐状回流誘導室１３の側壁にある多数の
孔１４より矢印イ方向に流出することによって、基質４
内へ均一に流入することになる。

そして、基質内へ流入した培養液３は、基質４に付着し
た細胞への栄養物供給と細胞の老廃物排出を行いつつ、
基質４内を上昇し、基質４の上面に達し、オーバーフロ
ーして筒体５内へ矢印口のごとく流入し、筒体５内を下
降して、円錐状回流誘導室１３内へ戻り、再び回転子１
５に作用されて、上記のことを繰り返しながら、基質４
内を回流する。ところて、回流誘導筒ｌＯの上端は、運
転時、培養液３が達する高さより更に上部に出る高さに
形成されているため運転時この回流誘導筒１２と培養容
器ｌの間隙にある培養液面は基質上の培養液面より高く
押し上げられるが回流誘導筒１２にもうけられた孔１６
より通過したもののみが回流に参加７ するようになっている。この一部回流に参加するように
したのは、上記間隙の培養液３が滞留することによって
培養容器１内の諸条件が不均一となるのを避けるためで
ある。

次に、気流誘導板１７の作用について説明する。

ガス供給口１９より培養容器１内へ流入したガスは、培
養液３の表面に当たり中央方向に流れながら培養液３と
ガス交換を行っていく。そして中央部へきたガスは、気
流誘導板１７の中央部に設けられた孔１８をぬけ蓋２に
当たり、周辺に放散して矢印二の方向へ流れ、一部ガス
排出口２０より排出される。

この矢印二の方向へ流れたガスは、気流誘導板１７の端
部へ来ると、ガス供給口１９よりのガスの流れ及び培養
容器ｌの内側部に当たることによって中心に向けて矢印
ハのごとく流れることとなり、ガスは気流誘導板１７を
はさんで、回流することとなる。その際ガスの培養液３
の表面上の流れは、培養液３上面の流れと同じになる。

このようにガスに回流を与えて培養液３上面とガスとは
能率よく接触し、ガス交換の能率が高められる。ポンプ
を８ 使用して強制的にガスの回流を加速した場合には、更に
ガス交換の効率が高められる。

次に、具体的に細胞培養の実験例について述へる。

以下の培養実施例において装置作製実施例１〜４をそれ
ぞれ１型培養装置〜４型培養装置と記した。また、培養
装置は組み立た状態でオートクレブ滅菌して使用した。

○　培養実施例１−−ガラス繊維織布を用いたＩ型培養
装置による各種細胞の培養 培養容器１は、内径１０．５ｃｍ、深さ１０．５ｃｍの
ジャケット付き、ステンレス蓋付きのものである。基質
支持体１０は、直径２ｍｍのステンレス線を加工したラ
ック状のものて、アーム８，８　　は上下８本ずつ放射
状に配置したものであり、筒体５もステンレスとし、筒
体５の下端と培養容器１の底面とは３．５　ｃｍの間隙
を設けている。基質４は幅４７ｍｍのガラス繊維織布９
を２ｍｍ間隙で８角型に巻き込んであり、その長さは３
ｍで、表面積は布面の面積に換算して２８２０ｃｉとな
るか、ガラス繊維織布６を９ 使用するため実効表面積はこれより大である。円錐状回
流誘導室１３及び回流誘導筒１２は、ポリカーボネート
のフィルムを使用した。気流誘導板１７は直径８ｃｍで
、孔１８の大きさを直径３ｃｍとしたポリカーボネート
円盤とした。また、回転子１５は毎分８００回転程度の
速度で回転する。また、培養容器１の蓋２を通じてガス
供給チューブ、ガス排出チューブのほか、培養液供給チ
ューブ、培養液排出チューブ、細胞液浮遊供給兼サンプ
ル培養液採集チューブの合計５本のステンレスチューブ
を配しており、ｐＨ電極、酸素電極も配備されている。

そして、ｈｕｔ（−１培養ヒト肝癌細胞の一系統（Ｈｕ
ｈ。

Ｎ、　＆　［Ｊｔａｋｏｊｉ、　Ｔ、、　Ｇａｎｎ、　
７２．１７８−１７９　（１９８１））を、ＤＭ１６０
培養液に牛胎児血清（ＦＢＳ）５％添加した増殖培養液
中、プラスチックデイツシュで単層培養し、トリプシン
処理して、１．５Ｘ１０８個の種細胞を得、この細胞を
上記培養容器ｌに８００ｍ１の増殖培養液を満たした中
に入れ、回転子１５を回転させて培養液３を回流させ、
基質４に細胞を付着させた。最初の２日間は培養液を更
新せず、０ 以降は全培養期間２０日間のうちに、半量ずつ培養液を
随時交換し、グルコースレベルを３００ｍｇ　／　１以
上、乳酸レベルを５００ｍｇ／　Ｉｌ以下に維持した。

この間、５％炭酸ガス含有空気を５〜１０ｍ１１分間通
気し、加えて酸素を随時補給した。培養期間中、実体顕
微鏡によって培養容器１の外から細胞か基質４に付着し
つつ増殖していることを確認した。

培養後は、織布９を基質支持体ｌＯから剥離し、その各
所を切り取って、クエン酸クリスタルバイオレット法で
裸核を計数した。細胞数は、織布９片面あたりに換算し
て１．０５　Ｘ　１０’／ｃｎｒであった。面積当たり
の細胞数はセルフアクドリー■（Ｎｕ１ｇｅｎ社製）に
よる単層培養の場合の約２倍である。基質４の容積重た
りの細胞密度に換算すると、１．０５Ｘ１０７／ｃｄで
ある。

ガラス繊維基質装置の１型培養装置で、」二記ヒト肝癌
細胞系統のほかに、壁付着性の細胞系統であるＣ１２７
　Ｉ　マウス乳ガン細胞（Ｌｏｗｙ、　Ｄ、Ｒ，、Ｒｅ
ｎａｌ。

Ｅ、、　５ｃｏｌｎｉｃｋ、　Ｅ、Ｍ、　：　、Ｊ、Ｖ
ｉｒｏｌ、　２６．２９１−２９８（１９７８））の１
系統、浮遊培養に適する細胞系統である１ か、若干の壁付着性を有するＫＹＭ−Ｉヒト横絞筋肉腫
細胞（Ｓｅｋｉｇｕｃｈｉ、　Ｍ、、　５ｈｉｒｏｋｏ
、　Ｙ、、　５ｕｓｕｋｉ。

Ｔ、、　Ｉｍａｄａ、　Ｍ、、　Ｍｉｙａｈａｒａ、　
Ｍ、、　Ｆｕｊｉｉ、　Ｇ、：　Ｂｉｏ−ｍｅｄ、Ｐｈ
ａｒａｍａｃｏｔｈｅｒ、、　３９．３７２　（１９８
５））の１系統、ならびに壁付着性の殆どないマウスハ
イブリドーマ細胞の一系統（Ｘ６３−Ａｇ８−６．５．
３．株マウスミエローマを母細胞とするハイブリドーマ
、Ｍ、　Ｍｉｙａｈａｒａ。

ｕｎｐｕｂｌｉｓｈｅｄ）の培養を行った。培養装置の
組立て、細胞の播種法、細胞数の測定法は上記のｈｕＨ
−１細胞に準じた。

Ｃｌ２７Ｉ細胞の１系統はガラス繊維の表面片面当りに
換算して１．ｌＸｌ０’個／　ｃｎｆ　）をダルベツコ
変法イーグル培養液（ＤＭＥ）に牛胎児血清５％添加し
た増殖培養液中で培養した。この間培養液の交換率を徐
々に増加させて、１０日以降は毎日全量交換した。

グルコースの消費速度は培養１４日まで増加し、培養装
置あたり６０ｍｇ／時に達し、以降安定に推移した。培
養２３日で、ガラス繊維の表面片面当りに換算して５．
７Ｘ　１０５個／　ｃｎｆの細胞密度を得た。

ＫＹＭ−Ｉヒト肉腫細胞の１系統はガラス繊維の片２ 面表面を平面と見なして１．６Ｘ１０５個／　ｃｎｒの
細胞密度で播種し、ＲＰＭＩ−１６４０を基礎培養液と
し、微量成分ならびに０．１％ウシ血清アルブミンを添
加した無血清培養液を増殖培養液として培養した。この
細胞は付着性のきわめて弱い細胞で、浮遊培養で継代維
持してきた系統であるが、培養開始後１７時間での測定
では浮遊細胞率から換算して、この時点で約４５％の細
胞が基質内に不動化したものと推算された。培養中、培
養液の交換率を徐々に増加させて、１７日以降は毎日１
０１００Ｏ交換し、グルコス濃度を６００ｍｇ／ｆｆｌ
水準に維持した。３０日間培養後、織布表面積換算で５
．９Ｘ　１０５／　ｃｌの細胞収量を得た。

マウスハイブリドーマは培養装置あたり２．２ＸＩＯ’
個（ガラス繊維片面換算て細胞密度７．３Ｘ］０８／ｃ
ｄに相当）を播種した。ＲＰＭＩ−１６４０培養液に１
０％ＦＢＳを添加した培養液中で３３日間連続培養した
。この間、培養液を培養ｌ１日まで０．５９９容器、以
降は０．８９容７日交換して、グルコース濃度を１．１
ないし１．５ｇ／１２に維持した。グルコースの３ 消費量からみて、この培養は１１日以降はぼは定常の状
態を維持した。この間排出される培養液に含まれる浮遊
細胞の密度は５Ｘ１０’／ｍ１前後であった。培養終了
時に測定した細胞密度は基質部分の容積あたり６．３Ｘ
　１０”／ｍｌ　（ガラス繊維片面換算で細胞密度６．
３Ｘ１０５／ｃｒ＃）てあり、浮遊している細胞密度の
約１０倍の密度の細胞が基質内に滞留していることが示
された。走査電子顕微鏡による観察では、ハイブリドー
マ細胞はガラス繊維の表面に付着し、あるいははさまれ
た状態で不動化して存在しており、繊維の広範な部分に
比較的均等に分布していた。

上記の結果はガラス繊維を基質の素材に採用した本発明
による細胞培養装置（１型装置）は付着性の強い細胞か
ら付着性の殆どない細胞にまで広い範囲で細胞を不動化
し、細胞を増殖させ、また細胞培養を維持することが可
能であることを示している。

○　培養実施例２−−セラミック基質を用いた４型培養
装置による培養実施例 ４ マウスハイブリドーマの系統ならびに培養液条件は１型
培養装置での実施例と同様である。本実施例で使用した
セラミック基質はその容積４００ｍ１、単位容積あたり
の表面積はセラミックの１面を平面と換算して２０ｃｎ
ｆ　／　ｍｌてあり、この表面密度はｌ−３型装置で使
用しているガラス繊維ての換算表面密度の２倍である。

本装置に対して２．２Ｘ１０８個のハイブリドーマ繊維
（セラミック表面を平面と換算して３．７ＸＩＯ’　／
ｃｄに相当する）を播種した。ＲＰＭＩ−１６４０培養
液にｌＯ％ＦＢＳを添加した培養液中で３４日間連続培
養した。この間、培養液の交換量を培養１０日まで徐々
に上昇させ、１０日以降は３．５容器日交換して、グル
コース濃度を１．１ないし１．５ｇ／１２に維持した。

グルコースの消費量からみて、この培養は１１日以降は
ほぼ定常の状態を維持した。この間排出される培養液に
含まれる浮遊細胞の密度は５　Ｘ　ｌｏ５／ｒｎ（１前
後てあった。本実施例については培養終了時の細胞密度
の正確な数値を得ていないが、そのモノクローナル抗体
の生産量からみて、１型培養装置による実施例の約５ ４倍の細胞密度を得ているものと推定した。以上の結果
は本発明による培養装置の基質としてハニカム状のセラ
ミックは基質として使用でき、しかもハイブリドーマの
ような壁付着性のきわめて弱い細胞も不動化しうること
を示している。

○　培養実施例３−−ガラス基質を用いた２、３型培養
装置によるスケールアップ ヒト肝癌細胞ｈｕＨ−１の一系ならびにヒト樅紋筋肉腫
細胞ＫＹＭ−Ｉの一系を用いて、２型培養装置（１０１
スケール）ならびに３型培養装置（５０１スケール）へ
の拡大試験を以下のように行った。２型培養装置は基本
的には前記のｌ型培養装置と同様のパーツ構成よりなり
、培養容器ｌは内径３０ｃｍ、深さ１７ｃｍのポリカー
ボネート製であり、外側にポリカーボネート製の保温ジ
ャケットを設けており、蓋２はステンレス製の円盤で１
型培養装置と同様に７個の開口部か設けられ、これらの
開口部に接続するステンレスチューブ、各電極は、前記
のものと同様である。基質支持体１０はステンレス製で
高さは１０ｃｍ、中心部の筒体５の内径は７ｃｍであり
、６ 筒体５の上、下部に８本のガイド８か放射状に配置され
ている。基質４は、前記のものと同様に、！Ｉ（質支持
体１０に巻き込んで取付けられており、８．５ｃｍＸ３
０ｍのガラス繊維織布９を２ｍｍ間隔て巻き込み、表面
積は布の両面をそれぞれ平面とみなしたとき面積に換算
して５１，０００ｃｎ？である。円錐状回流誘導室１３
は、ステンレス製とした。なお、回転子１５の配置は前
記ｌ型培養装置の例と同様である。

また、通気性テフロンチューブ１９ｍをコイル状に巻い
たガス交換ユニットを基質支持体１ｏの底面に張り付け
、これによっても培養液３のガス交換かできるようにし
た。

ｈｕＨ−１細胞を用いた試験では、細胞、増殖培養液等
の条件は、前記１型培養装置の場合と同様にして細胞培
養を行った。但し、種細胞の培養にはマイクロキャリア
ー培養を採用し、２．０Ｘ１０９個の種細胞を得た。こ
の細胞を、１０ｆｆの培養液を満たした培養容器１に播
種して、以降２８日間、５００乃至８００ｒ、　ｐ、　
ｍ、て攪拌しつつ培養液を回流させて培養した。この間
、５％炭酸ガス含有空気を通気し、７ 加えて、酸素を前記Ｉ型の培養装置の要領で補給した。

最初の４日間は培養液を更新せず本実施例においては、
以降は全培養期間２７日間のうちに、全量の培養液を随
時交換し、グルコースレベルを４００ｍｇ／　１以上、
乳酸レベルを８００ｍｇ／　１２以下に維持した。細胞
の収量は面積あたり３．６４　Ｘ　１０５／ｃｒ＆であ
った。この値はセルフアクドリーでの数値にほぼ匹敵す
るものである。

３型培養装置（５０１培養装置）では幅１０ｃｍ、長さ
１８０ｍのガラス繊維を２ｍｍ間隔に中央に円筒型の空
間を設けた直径６０ｃｍの１２角形ステンレス支柱に巻
き込んだ基質を使用した。培養容器は直径６０ｃｍ、蓋
を除いた容器の深さ２０ｃｍ、内容積は５０１、基質部
分の容積は２５ｎである。Ｉ、２型装置（８００ｒｎｌ
ならびにＩＯＡ装置）の基質支持体では並行した２本の
ステンレス棒よりなるアームとその間にははさむように
して並へるピン型のスペイサ−の組合せを採用したが、
３型装置ては１本のステンレス棒よりなるアームに幅５
ｍｍ、厚み２ｍｍ、長さ１１ｃｍのステンレス角材の両
端近くにそれぞれ１個ずっ８ の穴を設けたスペーサーを、ガラス繊維を巻き進むごと
に挿入して基質を作成した。さらに、織布をすへて巻き
込んた後、巻き込んだ織布を緊張させるために、スペイ
サ−を外縁にむけて固定する補助的な締め具を付属させ
たガラス繊維の表面積は片面を平面とみなして３６０．
０００ｃｉである。

本実施例ではヒト横絞筋肉腫細胞（ＫＹＭ−Ｉ　）を用
い、浮遊培養した細胞３Ｘ１０１０個を播種した。

２４時間培養後算定した浮遊細胞数は４．７Ｘ　１０７
個てあり、９８％以上の細胞が基質に付着したものと推
定された。さきに述べた無血清増殖培養液を使用して１
６日間連続的に培養液を交換しながら培養を続けた。こ
の間、グルコースのレベルを５００〜１０００ｍｇ／　
１２に維持し、７２０１の培養液を供給した。

培養終了時の細胞の総数は１．８７Ｘ　１０”個である
。

この数値はガラス繊維の片面あたりに換算して５、２Ｘ
　１０５／　ｃｎｆであり、単層培養における細胞密度
と匹敵する。培養終了時に培養液に浮遊していた細胞は
細胞総数の０．２％以下であった。本実施例において詳
細には触れていないか、ＫＹＭ−Ｉ細胞は９ 有用物質を培養上清に分泌生産している。細胞ＤＮＡは
有用物質の分離精製の段階で負担のかかる混入物質であ
るが、本培養装置で生産した培養上清には浮遊培養から
細胞を分離して得た培養上清に含まれるＤＮＡ含量のｌ
／１０以下しか細胞ＤＮＡが含まれていなかった。この
ことは、本装置において細胞に与える損傷が少ないこと
、ならびに細胞物質が培養上清に混入する機会が少ない
ことを示すものである。

なお、ヒＩ・肝癌細胞ｈｕＨ−１細胞についての実施例
は次項にある長期培養によって行い成功している。

以上の実施例にあるように、本発明にある培養装置は５
０Ｉ！まで容易に拡張することが可能であった。

○　培養実施例４−一長期培養試験 細胞、増殖培養液等の条件は、前記８００ｍ１培養装置
での細胞培養の場合と同様で、ｈｕＨ利細脳細胞系統の
種培養はプラスティックデイツシュで単層培養し、トリ
プシン処理して、３．０Ｘ１０８個の種０ 細胞を得、これを８００ｍ１の増殖培養液を満たした培
養容器１に播種し、回転子１５を回転させて培養液３を
回流させて細胞を基質４に付着させた。最初の２日間は
培養液を更新せず、以降は増殖期１９日間のうち（こ、
　６５０ｙｎｌ／日から１，９５０ｙＪ／日までの量で
連続的に培養液を更新した。１９日目板降はウィリアム
Ｅ培養液を主成分とする無血清培養液に変更し、６ケ月
間維持培養した。この間、５％炭酸ガス含有空気を９０
〜９５ｍ１／分の割合で通気し、加えて、酸素を随時補
給した。培養期間中、実体顕微鏡によって培養容器１の
外から細胞が基質４に密に付着しつつ増殖していること
を確認した。

６ケ月の培養期間中、細胞の生育状態の安定性が確認さ
れた。培養終了後、測定した細胞数を基質４の部分の容
積あたりの細胞密度に換算すると、４、４　Ｘ　１０７
／　ｃ１以上の細胞密度に達していた。また、基質４に
使用した布の両面の面積から布の単位面積当りの細胞密
度を計算すると、５．８　Ｘ　１０６／　ｃｎ？の細胞
密度となり、このイ直はセルフアクドリーを用いた場合
に達成される細胞密度の１０倍である。こ１ のことは本発明の培養装置が物質生産システムとして極
めて有用であることを示している。

ヒト乾癌ｈｕｔ（−１細胞を用い、３型培養装置（５０
１）にスケールアップして長期培養試験を行った。

３型培養装置の仕様は前述のものと同様であるが、さら
にガス交換の効率を固める目的で直径２ｃｍ長さ２６ｃ
ｍのシリコン中空糸よりなるカラム２基を直列につない
だガス交換筒を外装し、ペリスタルティックポンプを用
いて培養液の一部がガス交換筒を循環するように接続し
た。シリコン中空糸には１００％酸素を供給できるよう
に装置した。この外装ガス交換装置は培養の初期には使
用せず、細胞数が増殖して培養液の酸素分圧が低下した
後に使用を開始した。本実施例では５．９Ｘ１０”個の
細胞を接種し、２０９日間培養を継続した。最初の２６
日間は５％牛脂児血清を含むＤＭ　１６０培養液を使用
して細胞を増殖させ、その後はＷｉｌｌｉａｍ　Ｅ培養
液を主成分とする無血清培養液に変更したことは１型培
養装置での実施例と同様である。総計２０９日間、培養
装置には何等故障を認めなかった。回収した２ 細胞は２．２Ｘ　１０”個であった。この密度は基質容
積あたりに換算すると９　Ｘｌ０６／ｃｒｄである。ま
たガラス繊維片面あたりに換算すると９Ｘ１０５個／ｃ
ｎｒの密度である。この数値はｌ型装置での達成密度よ
り低いがセルフアクドリーての達成密度の１．８倍であ
る。本実施例では詳細について触れてないが、使用して
いる細胞系統は有用物質を生産している。その生産性を
セルフアクドリーでの価と比較すると、本培養装置ｌ基
は培養表面積６０００ｃｎｆ、培養液１１を搭載できる
セルフアクドリー１３０台ないし１４０台分に相当する
能力を示した。

○　液表面におけるガス交換能の測定 ３型培養装置（５０Ａ）を使用して液表面における酸素
の透過能力を実測した。５０４７培養装置にガラス繊維
基質を装填し、蒸留水を充してスターラーで循環させた
。測定の直前に亜硫酸ソーダを添加し、酸素分圧を０と
して、装置に蓋をし、以降、空気、あるいは空気と酸素
ガスの混合ガスを液の上面に通気しながら酸素分圧の上
昇を酸素電極を用いて測定した。本測定においては、表
面通気を３ ファン等を用いてとくに積極的に回流させることは行わ
なかったが、１００％酸素ガスを通気した状態に外波し
た見かけ上の酸素吸収の最大効率は１時間あたり約８０
０ｍｇであった。この数値から、通常の細胞の酸素消費
速度を２μｇ／１０’細胞／時間と仮定すると、とくに
加速しない条件で表面通気を行った場合の培養装置あた
りの最大細胞数は４ｘｌＱ＋１個、基質体積あたりで１
．６Ｘ　１０７／ｃｎｒ、ガラス繊維表面を平面とみな
した場合の面積あたりで１、６Ｘ　１０’／ｃｎｒの細
胞密度が期待できる最大密度となる。ガス交換の補助装
置をもうけない場合の本本培養装置における最大細胞密
度の一つの目安を与えるものである。２型装置ならびに
ｌ型装置では相対的に回流の速度か早いのでさらに高い
細胞密度が期待できる。

なお、実施例において詳細に説明していないが、ガラス
繊維に付着増殖させた細胞を無菌的に回収することは可
能である。ヒト肝癌細胞ｈｕＨ−１での例では、トリプ
シン処理後に培養容器の外から繊維基質に機械的にショ
ックを数回与えることにょ４ って、９６％の細胞を浮遊液に回収している。

〔発明の効果〕

この発明の回流式培養装置は、（１）従来の微粒子担体
培養法、浮遊培養におけるように細胞に機械的損傷を与
えることがなく培養できる、（２）単層培養法や微粒子
担体培養法におけるように細胞の剥離や移動、あるいは
不均化をもたらすことがなく、長期安定に維持すること
ができる、（３）細胞のイ」着性の強弱に関わらず、さ
まざまな細胞を培養できる、（４）微粒子担体培養法、
浮遊培養法、中空糸培養法に必要であるような酸素の供
給装置を付設することを前提とせずに培養できる、（５
）浮遊培養法、微粒子担体培養法に必要であるような細
胞と培養液の分離装置を付設せずに培養できる、（６）
浮遊培養法や微粒子担体培養法で問題となるような培養
上清中の混入細胞物質か少ない、（７）中空糸培養法に
おけるようなポンプへの大きな負担、あるいは微粒子担
体培養法や浮遊培養法におけるようなガス交換装置や細
胞分離装置の信頼性への心配がなく、また、微粒子担体
培養装置、浮遊培養装置、５ 中空糸培養装置において必要であるような培養培養装置
外の培養液循環システムを構築せずとも一体的な装置と
して機能させることができるため、生物学的封じ込めの
信頼性が高く、結局全体として培養装置の信頼性が高い
、（８）付着性細胞の培養についてしばしば問題となる
細胞数あたりの培養装置の容積がコンパクトで制御しや
すく、装置の信頼性が高く、また装置の耐久性が高いこ
とによって培養装置としての経済性が高い、等の多くの
特徴点を有することが示された。

【図面の簡単な説明】

第１図は、この発明による回流式培養装置の一実施例の
概略断面図、第２図（１）、　（２）、　（３）は、基
質支持体の一実施例の概略図、第３図（１）、　（２）
は、基質を取付した基質支持体の一実施例の概略平面図
、第４図は、基質素材を一定間隔に保持するスペーサー
の一実施例の側面図及び第５図は、基質の他の実施例を
示す斜視図である。 １・・・培養容器 ２・・・培養容器の蓋 ６ ３・・・培養液 ４・・・基質 ５・・・筒体 ６・・・アーム ７・・・スペーサー ８・・・リング ９・・・織布 １０・・・基質支持体 １１・・・支脚 １２・・・回流誘導筒 １３・・・円錐状回流誘導室 １４・・・孔 １５・・・回転子 １６・・・孔 １７・・・気流誘導板 １８・・・孔 １９・・・ガス供給口 ２０・・・ガス排出口

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 動植物細胞を含む微生物が付着状態あるいは不動化状態
   で増殖し、培養液が到達するための多数の小さな連通す
   る空間、および別に培養液が流下するための流下孔、を
   有する基質と、培養液を回流させるための液流回転手段
   を内蔵する回流誘導室と、前記基質および回流誘導室を
   収納する密閉型容器とからなり、容器内で、その内底面
   に設置された前記回流誘導室の上端開口部に連通するよ
   うに前記基質の培養液流下孔の下端が接続されており、
   前記基質の上面部には培養液面とのガス交換のための気
   相空間が設けられており、前記回転手段の回転により回
   流誘導室内で回転遠心力を付与された培養液が回流誘導
   室に設けられた複数個の培養液排出口を介して前記基質
   下面の多数の小さな連通する空間に流入し、該空間内を
   上方向に向かって移動し、基質上面に達した培養液が気
   相空間のガスとガス交換しながら前記培養液流下孔に向
   かって流れ、該流下孔を流下して再び前記回流誘導室内
   に流入し前記と同様の培養液回流を生じさせることによ
   り微生物を培養することを特徴とする培養装置。