JPH0387177A - アルカリプルラナーゼｚ―ｉ、これを生産する微生物及びアルカリプルラナーゼｚ―ｉの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は新規なアルカリプルラナーゼＺ−１に関する。

〔従来の技術〕

プルラナーゼは、プルラン分子中に存するα１．６グル
コシド結合のみを切断し、最終的にマルトトリオースを
生成する酵素で、１９６１年ＢｅｎｄｃｒとＷａｌｌｅ
ｎｆｅｌｓ　［［］ｉｏｃｈｅｍ、　Ｚ、　　３３　／
ｌ　、　　７９（１９６１）’ｌにより、アエロハクタ
ー　アエロゲ不ス（八ｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ａｅｒｏｇ
ｅｎｅｓ）の−菌株から初めて発見されたものである。

近年、バチルス　エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ、
）　　［’、１．　Ｊｐｎ、Ｓｏｃ、　５ｔａｒｃｈ　
Ｓｃｉ。

３０　２００　（１９８３）　、バチルス　アシドプル
リティクス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｃｉｄｏｐｕｌｌｕ
ｌｙｔｉｃｕｓ）〔八ｇｒｉｃ、　　Ｂｉｏｌ、　　Ｃ
ｈｅｍ、、　　　５　２．　２２９３（１９８４））　
　、　バチルス　ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）　　　
［Ｂｕｒ、　　Ｊ、　　八ｐｐｌ。

Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、、　　１
７　、　２４　（１９８３）：］、ストレプトコッカス
　ミティス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｍｉｔｉｓ）
　Ｉ：Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、、　１０８　、３３　（
１９６８）：］　、う　− ？　２　（１９８１））等の微生物がプルラナーゼを生
産することが報告されている。

また、プルラナーゼはプルランのみならず、澱粉、グリ
コーゲン、アミロペクチンやこれらの部分分解により生
じた分岐オリゴ糠中のα−１，６グルコシド結合に対し
ても氷解活性を有することが知られており、「枝切り酵
素」と呼ばれている。

一方、プルラナーゼは、エンド型アミラーゼ及びエキソ
型アミラーゼと併用することにより、澱粉からグルコー
スやマルトース、マルトトリオース、マルトテトラオー
ス、マルトペンタオース、マルトヘキサオースなどのマ
ルトオリゴ糖を高収量で生産することも、見出されてお
り、近年注目されつつある。

そこで、斯かるプルラナーゼの性質を利用して、プルラ
ナーゼをアミラーゼと共に食器用洗浄剤や衣料用洗浄剤
に配合する事により、主に澱粉汚れに対して洗浄力が飛
躍的に向上する事が明らかとなり、その利用が期待され
ている（特願昭６３２８５４２４号）。

しかしながら、自然界に於いて従来見出されているプル
ラナーゼのほとんどが、中性乃至酸性領域に於いて最大
且つ安定な酵素活性を示す、所謂中性若しくは酸性プル
ラナーゼに分類されるものであるため、食器用洗浄剤及
び衣料用洗浄剤組成物の必要条件である、アルカリ領域
において最大活性を示すか、あるいはアルカリ耐性を有
するプルラナーゼ、所謂アルカリプルラナーゼ及びアル
カリ耐性プルラナーゼの存在は、極めて少ないのが実情
である。尚、ここでアルカリプルラナーゼとは、至適ｐ
ｎをアルカリ領域に有するものを言い、アルカリ耐性プ
ルラナーゼとは、至適ｐＨは中性から酸性領域に有する
が、アルカリ領域に於いても至適ｐＨに於ける活性に比
較して充分な活性を有し且つ安定性を保持するものを言
う。また、中性とは１１１６〜８の範囲を言い、アルカ
リ性とはそれ以上のｐＨ範囲を言う。

従来、知られているアルカリプルラナーゼ及びアルカリ
耐性プルラナーゼの生産方法としては、好アルカリ性バ
チルス属細菌の培養によってアルカリプルラナーゼを生
産する方法が堀越等により報告されているのみである［
　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ。

八ｃｔａ、　　３９７　、　１８８　（１９７５）、特
公昭５３−２７７８６号公報〕。

〔発明が解決しようとする課題〕

しかしながら、堀越らによって得られたプルラナーゼは
、アルカリ領域に至適ｐＨを有する酵素であり、従来知
られているプルラナーゼより基質特異性が広い等の特徴
を有しているが、至適ｐｌ（が８〜９と弱アルカリ領域
にあるため、洗浄剤組成物として使用するには適さない
という問題があった。

また、酵素の生産性が悪いという欠点も有しており、工
業発酵生産に適うものではなかった。そこで更に高アル
カリ領域に至適ｐＨを有するプルラナーゼの開発が望ま
れていた。

〔課題を解決するための手段〕

一般に、食器及び衣類の洗浄は中性から高アルカリ性の
広範なｐ＋＋条件下で行われる為、高アルカリ性側に至
適ｐ＋＋を有し、且つ食器洗浄用並びに衣料洗浄用酵素
としての機能を有するアルカリプルラナーゼを生産する
微生物を自然界から探索し、取得することは極めて意義
のあることである。

斯かる実情において、本発明者は、アルカリプルラナー
ゼを生産する微生物を自然界に求め、鋭意探索を続けて
きたが、神奈川県横浜市の土壌より採取した好アルカリ
微生物の一種であるバチルス属に属する微生物のバチル
ス　エスピ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ、）　ＫＳＭ−Ａ
Ｐ１８７６が、食器洗浄剤組成物ならびに衣料用洗浄剤
ｕｉ或物の添加成分として有効な、新規なアルカリプル
ラナーゼＺ−１を生産することを見出し、本発明を完１
＆、した。

したがって、本発明は新規なアルカリプルラナーゼＺ、
Ｉを提供するものである。

本発明のアルカリプルラナーゼＺ−Ｉを生産する上記微
生物は、次のような菌学的性質を有する。

尚、以下において菌株の分類に用いた培地は次の培地１
〜２１の２１種類であり、これらは何れも別滅菌した炭
酸す）　ＩＪウム（Ｎａ２ＣＯ３）を０．５重量％（以
下、単に％という）含有する。

使用した培地の組成（表示は％）： 只 培地１．　ニュートリエンドブロス、０．８；寒天末（
和光紬薬製）、１．５ 培地２．　ニュートリエンドブロス、０．８培地３．　
ニュートリエンドブロス、０．８．ゼラチン、２ｏ、ｏ
；寒天末（和光紬薬製）、１．５培地４．　バタトリト
マスミルク、１０．５培地５．　ニュートリエンドブロ
ス、　０．８　　；　ＫＮ［１３゜０．１ 培地６．　バクトペプトン、　０．７　；　Ｎａｌ、　
０．５　；ブドウ糖、０．５ 培地７゜　８１Ｍ寒天培地（栄研化学製）、指示量培地
８．　　ＴＳＩ寒天培地（栄研化学製）、指示量培地９
．　酵母エキス、０，５；バクトペプトン。

１．５　　；　Ｋ２１１ＰＯ−、０，１：　ＭｇＳＯ４
・７Ｈ２０゜０、０２　；可溶性澱粉、　２．０　；寒
天末（和光紬薬製）、１．５ 培地１０．コーサー培地（栄研化学製〉、指示量培地１
１．　クリステンセン培地（栄研化学製）、指示量 培地１２．■酵母エキス、　０．０５；　Ｎａ２ＳＯ４
，０，１；培地１３゜ 培地１４゜ 培地１５゜ 培地１６゜ 培地１７゜ に）Ｉ２ＰＯ４，０，１；ブドウ糖、１．０■酵母エキ
ス、ｏ、　０５　：　Ｎａ２ＳＯ４，ｏ、　１　　：Ｋ
ＩＩ２ＰＯ，、０，１；ブドウ糖、　　１．０　　；Ｃ
ａＣＪ！　２・２１１２０．　０．０５　；　Ｍｎ５Ｏ
，・／ｌ　〜６Ｈ２０，０，０１；　Ｆｅ５Ｏ＝・７１
１゜０．　０．００１　　；Ｍｇ５Ｏ＜・７１１゜０．
　０．０２ 窒素源としては、硝酸ナトリウム、亜硝酸ナトリウム、
塩化アンモニウム及びリン酸アンモニウムをそれぞれ０
．２５％、０、２０２５％、０．１５８％、０．１９５
％となるように上記の及び■の培地に加えて用いた。

キンク穐培地パ栄研”　（栄研化学製）指示量 キングＢ培地゛栄研”　（栄研化学製）。

指示量 尿素培地゛栄研゛′（栄研化学製）、指示量 チトクローム・オキシダーゼ試験用濾紙（日永製薬製） ３％過酸化水素水 培地１８．バクトペプトン、０．５．酵母エキス。

０．５　　；　Ｋ２１＋ＰＧ、、　０．１　　；ブドウ
糖、　　１．［ｌ　　；ＭｇＳＯ４・７）１２０．０．
０２ 培地１９．バタトペプトン、　２．７　　；　ＮａＣｊ
！、　５．５　；に、ＨＰＯ，、０，３；ブドウ糖＋０
．５；ブＤ−［−チモールブルー、０．０６；寒天束（
和光紬薬製）、１．５ 培地２０．　　（ＮＨ，）２１１ＰＯ，、０，１；　Ｋ
ＣＡ、　０．０２；Ｍｇ５Ｏ。

・７Ｈ２０，０，０２；酵母エキス、０．０５；糖。

１．０ 培地２１．カゼイン、　０．５　；酵母エキス、０．５
；ブドウ糖、　　１．０　　；　Ｋ２ＨＰＯ４，０，１
；　ＭｇＳＯ４・７Ｈ２０，０，０２；寒天束（和光紬
薬製）。

１．５ （菌学的性質） （ａ）顕微鏡的観察結果 菌体の大きさは、１．０〜２．２μｍ×２．２〜４．４
μｍの桿菌であり、菌体の一端に楕円形の内生胞子（０
，８〜１．０μｍ　Ｘｉ、ｏ　〜１．８　μｍ　）を作
る。

周鞭毛を有し運動性がある。ダラム染色は不定。

−ｌ　１− 抗酸性はない。

（ｂ）各種培地に於ける生育状態 ■肉汁寒天平板培養（培地１） 生育状態は良い。集落の形状は円形であり、表面は円滑
、周縁は円滑又は波状である。又集落の色調は乳白色半
透明で光沢がある。

■肉汁寒天斜面培養（培地１） 生育する。その状態は拡布状で光沢が有り、乳白色半透
明である。

■肉汁液体培養（培地２） 生育する。

■肉汁ゼラチン穿刺培養（培地３） 生育状態は良い。ゼラチンの液化が認められる。

■リドマスミルク培地（培地４） ミルクの凝固、ペプトン化は認められない。

リドマスの変色は培地がアルカリ性のため判定できない
。

（Ｃ）生理学、曲性質 ■硝酸塩の還元及び脱窒反応（培地５）■ 硝酸塩の還元は陽性。脱窒反応は陰性。

■ＭＲテスト（培地６） 培地がアルカリ性のため判定できない。

■ｖＰテスト（培地６） 陰性。

■インドールの生！（培地７） 陰性。

■硫化水素の生成（培地８） 陰性。

■澱粉の加水分解（培地９） 陽性。

■クエン酸の利用 コーサー培地（培地１０）で陰性。クリステンセン培地
（培地１１）では陽性か陰性か判定できない。

■無機窒素源の利用（培地１２） 硝酸塩、アンモニウム塩、亜硝酸塩ともに利用する。

■色素の生成（培地１３．１４） 陰性。

［相］ウレアーゼ（培地１５） 陰性。

■オキシダーゼ（培地１６） 陽性、陰性のどちらとも判断できない。

■カタラーゼ（培地１７） 陽性。

［相］生育の範囲（培地１８） 生育の温度範囲は２０〜４０℃、生育最適温度範囲は３
０〜３５℃であった。

生育のｐＨ範囲は１１１７〜１０．５、生育最適ｐＨは
ｐＨ１０であった。

■酸素に対する態度 好気的。

［相］Ｏ−Ｐテスト（培地１９〉 アルカリ性のため変色は判定できない。

好気状態でのみ生育する。

［相］糖の利用性（培地２０） し−アラビノース、ローキシロース、Ｄ−グルコース、
ローマンノース、Ｄ−フラクトース、Ｄ−ｊｆフラクト
ース麦芽糖、ショ糖、乳糖、トレノ＼口−ス、Ｄ−ソル
ビット、Ｄ−マンニット、グリセリン、デンプン、サリ
シン、Ｄ−リボース及びデキストリンを利用する。

０食塩含有培地に於ける生育（培地１を改変）食塩濃度
が５％では生育するが、７％で生育できない。

［相］カゼインの分解（培地２１） 陽性。

以上の菌学的性質に関する検討に基づき、バーシーズ・
マニュアル・オブ・ディタミネイティブ・バクテリオロ
ジー（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｎｕａｌ　ｏｆ口ｅｔ
ｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）第
８版及びザ・ジーナス・バチルス（“Ｔｈｅ　Ｇｅｎｕ
ｓ　Ｂａｃｉｌｌｕｓ″Ｒｕｔｈ。

Ｂ、　　Ｇｏｒｄｏｎ、　　八ｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ　
　Ｈａｎｄｂｏｏｋ　　Ｎｏ、　　４　２　７＋Ａｇｒ
ｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　５ｅｒｖｉｃ
ｅ、　Ｕ、　Ｓ。

Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　　ｏｆ　　八ｇｒｉｃｕｌｔｕ
ｒｅ　　Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ　　Ｄ、　　Ｃ，。

（１９７３））を参照し、比較検索した結果、本菌株は
有胞子桿菌であるバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属の一
種であると認められる。しかし、本菌株は中性領域では
生育できず、専ら高アルカリ領域で良好な生育を示すこ
とから、最近、Ｈｏｒｉｋｏｓｈｉと八ｋｉｂａ（“八
Ｉｋａｌｏｐｈｉｌｉｃ　　Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓ
ｍ　　、　　ＪａｐａｎＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　５ｏｃ
ｉｅｔｙ　Ｐｒｅｓｓ（Ｔｏｋｙｏ）、　１９８２年刊
）の主張している、所謂好アルカリ性 （Ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｉｃ）微生物に属し、暫定的に
従来の中性で生育するバチルス属細菌とは区別される。

更に、本菌株の菌学的性質は公知の好アルカリ性バチル
スのいずれとも一致しないので、これを新規菌株と判断
してバチルス　エスピー　ＫＳＭ−ＡＰ１８７６と命名
し、微工研菌寄第１０８８７号（１’ＢＲＭ　Ｐ−１０
８８７）として通産省工業技術院微生物工業技術研究所
に寄託した。

上記の本発明微生物を用いて本発明のアルカリプルラナ
ーゼＺ−Ｉを得るには、培地に微生物を接種し、常法に
従って培養すればよい。また、培地中には、資化し得る
炭素源及び窒素源を適当量含有せしめておくことが好ま
しい。この炭素源及び窒素源は特に制限されないが、例
えば、窒素源としては、コーングルテンミール、大豆粉
、コーンスチープリカー、カザミノ酸、酵母エキス、フ
一　Ｍ］ アーマメディア、肉エキス、トリプトン、ソイトン、バ
イブロ、アジパワー、ソイビーンミール、綿実油粕、カ
ルチベーター、アジプロン、ゼストなどの有機窒素源及
び硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、リン酸アンモ
ニウム、炭酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、酢酸アン
モニウム等の無機窒素源が挙げられる。また炭素源とし
ては、可溶性澱粉、不溶性澱粉、アミロペクチン、グリ
コーゲン、プルラン及びこれらの部分分解により生じた
分岐オリゴ糖に加え、資化し得る炭素源、例えばグリコ
ース、マルトース、アラビノース、キシロース、リボー
ス、マンノース、フラクトース、ガラクトース、麦芽糖
、ショ糖、乳糖、トレハロース、マンニット、ソルビッ
ト、グリセリンや資化し得る有機酸、例えば酢酸などが
挙げられる。

またその他、りん酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩
、マンガン塩、亜鉛塩、コバルト塩、ナトリウム塩、カ
リウム塩等の無機塩や、必要であれば、無機、有機微量
栄養源を培地中に適宜添加することもできる。

１ｊ 斯くして得られた培養物中からの目的物質であるアルカ
リプルラナーゼｌ−１の採取及び精製は一般の酵素の採
取及び精製の手段に準じて行うことができる。即ち、遠
心分離または濾過等の通常の固液分離手段により菌体を
培養液から除去すれば、粗酵素液を得ることができる。

この粗酵素液は、そのまま使用することもできるが、必
要に応じて、塩析法、沈澱法、限外濾過法等の分離手段
により粗酵素を得、更に公知の方法により精製結晶化す
ることにより精製酵素として使用することも可能である
。

以下、本発明のアルカリプルラナーゼＺ−Ｉの精製法の
一例を挙げ、更に詳しく説明する。

アルカリ性バチルス属細菌ＫＳＭ−へＰ１８７６株を１
％プルラン、０６２％　トリプトン、０．１％　酵母エ
キス、０．０３％ＫＮ２Ｐ１．．０．０２％ＣａＣｌ１
２・２１１２０゜０．１％　（Ｎ１１４）２ＳＯ，，０
，００１％　Ｆｅ５Ｏｎ　・７Ｈ２０、ｏ、　ｏｏｏｉ
％ＭｎＣｊ！　２　’　４１１２０．０．０２％　Ｍｇ
５Ｏ，・７１１２０及び０．５％炭酸す）　Ｕラムを含
む培地で、３０℃にて３日間好気的に振盪培養し、得ら
れる培養液から菌体を除き、上澄液を得る。次いで、該
上澄液にＤＢＡＢ−セルロース粉末を加え、上澄液中の
プルラナーゼを完全にＤＢＡＢ−セルロースに吸着させ
る。

次いで、１０ｍＭ）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ１８）で樹
脂を洗浄した後、０．６Ｍの食塩を含む１０ｍＭＩＪス
塩酸緩衝液（ｐＨ８）で酵素を溶出する。更に、１０ｍ
Ｍ）ＩＪスス−酸緩衝液（ｐＨ１８）に対して透析濃縮
後、同緩衝液で平衡化したＤＥＡＢ−セルロース０８５
２に吸着させ、１０ｍＭ）Ｕスー塩酸緩衝液（ｐＨ８）
を用いて０〜ＩＭの食塩の濃度勾配により溶出し、その
活性画分を集め、平均分画分子量１０、０００の限外濾
過膜を用いて濃縮した後、０．１Ｍ食塩を含む１０ｍＭ
ＩＪスー塩酸緩衝液（ｐＨ８）を用いて一夜透析する。

これを濃縮し、次いで透析後、０、１Ｍ食塩を含む１０
ｍＭ）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ８）で平衡化したセファ
クリルＳ−２００カラムに吸着後、０．１Ｍ食塩を含む
同緩衝液で溶出し、その活性画分を集め、更にＤＲＡＢ
　）コパール６５０８カラムに吸着させる。吸着した酵
素を、１０ｍＭ）ＩＪスス−酸緩衝液（ｐＨ８）中、０
．１−ＬＭの食塩の濃度勾配により溶出し、その活性画
分を集める。

集められた活性画分を、限外濾過膜を用いて濃縮した後
、２Ｍ硫酸アンモニウムを含む１０ｍＭ）ＩＪスス−酸
緩衝液（ｐＨ８）で平衡化したブチル　トヨパール６５
０８カラムに吸着させ、１０ｍＭ）！Ｊスス−酸緩衝液
（ｐＨ８）を用いて２〜ＯＭの硫酸アンモニウムの濃度
勾配により溶出し、その活性画分を集める。集められた
活性画分を、限外濾過膜を用いて濃縮した後、１０ｍＭ
）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ８）を用いて一夜透析する。

斯くして得られる精製酵素はポリアクリルアミドゲル電
気泳動くゲル濃度１５％〉及びソジウムドデシル硫酸（
ＳＯ３）電気泳動で単一のバンドを与え、活性収率は約
４％であった。

斯くして得られる、本発明アルカリプルラナーゼＺ−Ｉ
の酵素化学的諸性質について、以下に説明する。

尚、酵素活性の測定は次の緩衝液（各々１０ｍＭ宛）を
用い、以下の方法に従って行った。

ｐｔ１４〜６　　　酢酸緩衝液 ｐ１１６〜８　　　　リン酸緩衝液 ｐＨ８〜１１　　グリシン−食塩−水酸化ナトリウム緩
衝液 ｐＨ１１〜１２　塩化カリウム−水酸化ナトリウム緩衝
液 酵素活性測定法： 各種緩衝液中にプルラン（反応系に於ける最終濃度は０
．２５％〉を溶解させた基質溶液０．９−に、酵素液０
．１−を加え、４０℃で、３０分間反応させた。反応後
、３，５−ジニトロ−サリチル酸（３，５−ｄｉｎｉｔ
ｒｏ−ｓａｌｉｃｙｌｉｃ　ａｃｉｄ（ＤＮＳ）　）法
にて、還元糖の定量を行った。即ち、反応液１．０−＋
、ｍＤＮＳ試薬１．０−を加え、５分間、１ｏｏｔで加
熱発色させ、冷却後、４．０−の脱イオン水を加えて希
釈し、波長５３５ｎｍで比色定量した。酵素の力価は、
１分間に１μｍｏ１のグルコースに相当する還元糖を生
成する酵素量を１単位（１ｏ）とした。

（酵素化学的諸性質） ■作用 プルランのα−１，６グルコシド結合を分解し２０ てマルトトリオースを生成する。また、澱粉、アミロペ
クチン、グリコーゲンまたはこれらの部分分解物のα−
１，６グルコシド結合も加水分解する。

■基質特異性 本酵素は表１に示す如く、α−１，６グルコシド結合で
分岐した枝分かれ糖のうち、マルトース以上の重合度を
有する枝分かれ構造を加水分解する。

以下余白 表１ ■作用ｐＨ及び至適ｐ＋＋ 作用ｐＨをｐＨ５〜１１の範囲に有し、至適ｐ＋＋をｐ
Ｈ９．５〜１１の範囲に有する。

尚、各ｐＦ１におけるプルラナーゼ活性を０．２５％プ
ルラン、１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４〜６　）　、リン
酸緩衝液（ｐＨ６〜８）、グリシン−食塩−水酸化ナト
リウム緩衝液（ｐＨ１１〜１２）および塩化カリウム−
水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ１１〜１２）の反応系を
用い、４０℃３０分間反応させて測定した結果を第１図
に示す。

■ｐＨ安定性 ｐＨ８〜１０で極めて安定であり、ｐＨ１１〜１２．５
に於いても約５０％以上の活性を維持する。

尚、各ｐＨにおけるプルラナーゼ活性を０．２５％プル
ラン、１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐ１１４〜６）、リン酸緩
衝液（ｐＨ６〜８〉、グリシン−食塩−水酸化ナトリウ
ム緩衝液（ｐＨ１１〜１２）及び塩化カリウム−水酸化
ナトリウム緩衝液（ｐＨ１１〜１２）の反応系を用い、
４５℃で１０分間反応させて測定した結果を第２図に示
す。

３ ■作用温度範囲及び最適温度 １０〜６０℃の広範囲で作用し、その最適作用温度は約
５０℃に認められる（第３図）。

■温度安定性 本酵素についてｐＨ９，５の条件で温度を変化させ、各
温度で３０分間処理することにより失活の条件を調べる
と４０℃までは極めて安定であり、また、５０℃に於い
ても約５０％以上の残存活性を有する（第４図〉。

■分子量 ＳＯ３電気泳動法（ゲル濃度７．５％）による分子量は
１２０．０００±５．０００である。

■金属イオンの影響 １ｍＭのＨｇ　２　＋、Ｃｄ２＋及びＭｎ２＋で強く阻
害され、Ｐｂ２＋で若干阻害され、Ｃｏ”＋により活性
化が認められる。

■界面活性剤の影響 線状アルキルベンゼンスルフォン酸ナトリウム、アルキ
ル硫酸エステルナトリウム塩、ポリオキシエチレンアル
キル硫酸エステルナトリウム塩、α４ 一オレフィンスルフォン酸ナトリウム、α−スルフオニ
／　化脂肪ｉ１２エステルナトリウム、アルキルスルフ
ォン酸ナトリウム、ＳＯ３、石鹸及びソフタノール等の
各種界面活性剤の０．０５％溶液で４０℃にて１５分間
処理しても殆ど活性阻害を受けない。

［相］キレート剤の影響 キレート剤であるＢＤＴ八（１０ｍＭ＞　、ＢＧＴ八（
１０ｍＭ）　、クエン酸（０，０５％〉及びゼオライト
　（０，０５％）は殆ど活性を阻害しない。

■プロテアーゼ耐性 ＡＰＩ−２１（昭和電工製）、マクサターゼ（ＩＢＩＳ
ｆＭ）　、サビナーゼ、了ルカラーセ゛、エスペラーゼ
（ノボ製）等のアルカリプロテアーゼを活性測定時に共
存（０，２ＡＵ＃！　）させても、何れのプロテアーゼ
に対しても強い耐性を有する。

〔発明の効果〕

本発明のアルカリプルラナーゼＺ−Ｉは、従来のプルラ
ナーゼに比較して高アルカリ性側（ｐｆ１９．５〜１１
）に至適ｐＨを有し、且つ広いｐ＋＋範囲に於いて極め
て安定である。まｔこ、至適温度も５０℃であり、熱安
定性も４０℃まで極めて安定である。更に、界面活性剤
、キレート剤、洗剤用プロテアーゼ等の洗浄剤配合成分
によっても殆ど阻害を受けない。従って、本酵素は洗浄
剤組成物の配合成分として、有利に使用することができ
るものであり、工業的に極めて大きな意義を有するもの
である。

〔実施例〕

以下に実施例を挙げて本発明を更に説明する。

参考例１ 神奈川県横浜市の土壌薬匙−杯（約０．５ｇ）、滅菌生
理食塩水に懸濁し、８０℃で１５分間熱処理した。この
熱処理液の上清を適当に希釈して、分離用寒天培地（培
地Ａ）に塗布した。次いで、これを３０℃にて３日間培
養し、集落を形成させた。集落の周囲にプルランの溶解
に基づく透明帯を形成するものを選出し、プルラナーゼ
生産菌を取得した。更に、取得菌を培地Ｈの液体培地に
接種し、３０℃で３日間振盪培養した。培養後、遠心分
離した上清液についてプルラナーゼ活性を、ｐＩＩＩＯ
にて測定し、アルカリプルラナーゼ生産菌をスクリーニ
ングした。

上述の方法により、本発明のアルカリブルラナーセＺ−
Ｉ生産菌バチルス　エスピーＫＳＭへＰ１８７６（ＦＢ
ＲＭ　Ｐ−１０８８７）を取得することが出来た。

培地Ａ　プルラン　　　　０．８％ 着色プルラン　　０．２％ ポリペプトン　　０．２％ 酵母エキス　　　０．１％ Ｋ）Ｉ２ＰＯ，０，０３％ （Ｎｉ１．）　２ＳＯ，０，１％ Ｍｇ５Ｏｉ・７Ｈ２００，０２％ ＣａＣｊ！　２・２Ｈ２００，０２％ ＦｅＳ、０＝　・７ｆ（２００，００１％ＭｎＣｊ！　
２・４Ｈ−００，０００１％寒天　　　　　　１．５％ Ｎａ２ＣＯ３０，５％ ｐＨ１０，０ 培地Ｂ　プルラン　　　　１％ トリプトン　　　　０．２％ 　７− 酵母エキス　　　０．１％ に８２Ｐ０４０．０３％ （＃Ｌ）　２ＳＱ、　　　　０．１％ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２００，０２％ ＣａＣＡ　２　・２Ｎ２０　　０．０２％ＦｅＳＯ４・
７ｔ１２０　　０．００１％ＭｎＣｊ！　２　・４Ｈ２
００，０００１％Ｎａ２ＣＯｓ　　　　　　０．５％ ｐＨ１０，０ 実施例１ アルカリプルラナーゼＺ−１生産菌、バチルスエスピー
　ＫＳＭ−ＡＰＩ８７６株を参考例１の液体培地日に接
種し、３０℃で３日間振盪培養した。培養後、菌体を遠
心分離して除き、粗プルラナーゼ酵素液とした。更に、
通常の方法に従って、エタノール乾燥粉末とし、以下の
表２に示ず粗酵素標品を得た。（酵素活性はＩ］Ｈ９に
於ける測定値である。）以下余白 ２８ 表２ 実施例２ 参考例１の液体培地Ｂに於いて、プルランに代えてマル
トースを１％添加した培地に、アルカリプルラナーゼＺ
−Ｉ生産菌、バチルス　エスピＫＳＭ−へＰ１８７６株
を接種し、３０℃で２乃至３日間振盪培養した。遠心分
離上清についてプルラナーゼ活性を測定した結果、培養
液１１あたり、２１１Ｕの活性を有してした。

実施例３ 実施例１で得られた粗酵素液について、■ＤＢ八Ｂへル
ロース吸着、■ＤＲＡＢ　　セルロース（ワットマン社
製〉クロマトグラフィー、■セファクリル（ファルマシ
ア社製）クロマトグラフィー、■ＤＢ八Ｂへトヨパール
（東洋曹達社製）クロマトグラフィー、■ブチル　トヨ
パール（東洋曹達社製）クロマトグラフィーをすること
によって精製を行い、アルカリプルラナーゼＺ−Ｉを得
た。

得られたアルカリプルラナーゼｌ−１についてデービス
（Ｄａｖｉｓ　Ｄ、　Ｊ、、八ｎｎ、　Ｎ、Ｙ、Ａｃａ
ｄ、　Ｓｃｉ、。

１２１、　４０４　（１９６４））の方法に従って電気
泳動を行った後、コマシー・ブリリアント・ブルーで染
色して単一のバンドを与える事を確認した（第５図）。

実施例４ 実施例３で得られたアルカリプルラナーゼＺＩについて
、常法に従いＳＯ３電気泳動を行った（第６図）。この
結果から、本酵素の分子量は１２０、０００±５．００
０であった。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明のアルカリプルラナーゼＺＩの反応９
Ｈと相対活性との関係を示す図面である。 第２図は、本発明のアルカリプルラナーゼＺ■の処理ｐ
Ｈと残存活性との関係を示す図面である。 第３図は、本発明のアルカリプルラナーゼＺＩの反応温
度（ｐＨ９，５）と相対活性との関係を示す図面である
。 第４図は、本発明のアルカリプルラナーゼＺ■の処理温
度（ｐＨ９，５）と残存活性との関係を示す図面である
。 第５図は、本発明のアルカリプルラナーゼＺ■の電気泳
動の結果を示す図面である。 第６図は、本発明のアリカリプルラナーゼＺＩのＳＯ８
電気泳動の結果を示す図面である。 以上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　次の酵素化学的性質を有するアルカリプルラナーゼ
   Ｚ−Ｉ。 １）作用 プルランのα−１，６グルコシド結合を分解してマルト
   トリオースを生成する。また、澱粉、アミロペクチン、
   グリコーゲンまたはこれらの部分分解物のα−１，６グ
   ルコシド結合を加水分解する。 ２）基質特異性 α−１，６グルコシド結合で分岐した枝分かれ構造を有
   する糖のうち、マルトース以上の重合度を有する枝分か
   れ構造を加水分解する。 ３）作用 ｐＨ及び至適ｐＨ 作用ｐＨはｐＨ５〜１１の範囲であり、至適ｐＨは９．
   ５〜１１の範囲である。 ４）ｐＨ安定性 ｐＨ８から１０の範囲で極めて安定であり、ｐＨ７〜１
   ０．５の範囲に於いても、５０％以上の相対活性を有す
   る（４５℃、１０分間処理による）。 ５）作用温度範囲及び最適温度 １０〜６０℃の範囲で作用し、その最適作 用温度は約５０℃である。 ６）温度安定性 ４０℃までは極めて安定である（ｐＨ９．５の１０ｍＭ
   グリシン−食塩−水酸化ナトリウム緩衝液中、３０分間
   処理による）。 ７）分子量 ソジウムドデシル硫酸電気泳動法による分 子量は１２０，０００±５，０００である。 ８）金属イオンの影響 Ｈｇ＾２＾＋、Ｃｄ＾２＾＋、Ｍｎ＾２＾＋及びＰｂ＾
   ２＾＋で阻害される。 ９）界面活性剤の影響 線状アルキルベンゼンスルフォン酸ナトリウム、アルキ
   ル硫酸エステルナトリウム塩、ポリオキシエチレンアル
   キル硫酸エステルナトリウム塩、α−オレフィンスルフ
   ォン酸ナトリウム、α−スルフォン化脂肪酸エステルナ
   トリウム、アルキルスルフォン酸ナトリウム、ソジウム
   ドデシル硫酸、石鹸及びソフタノール等の界面活性剤に
   よって殆ど活性阻害を受けない。 １０）キレート剤の影響 ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、クエン酸及びゼオライトで殆ど活
   性阻害を受けない。 １１）プロテアーゼ耐性 アルカリプロテアーゼに対して強い耐性を有する。 ２　バチルスエスピー（￥Ｂａｃｉｌｌｕｓ￥ｓｐ．）
   ＫＳＭ−ＡＰ１８７６と命名され、微工研菌寄第１０８
   ８７号として寄託された微生物の培養物より分離取得さ
   れたものである請求項１記載のアルカリプルラナーゼＺ
   −Ｉ。